KR101873318B1

KR101873318B1 - 세포 이미징 장치 및 그 방법

Info

Publication number: KR101873318B1
Application number: KR1020160125735A
Authority: KR
Inventors: 전병희
Original assignee: 주식회사 싸이토젠
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2018-07-03
Also published as: KR20170038726A

Abstract

본 발명의 일실시예는 세포 이미징 방법으로서, 표적세포(target cell)를 포함하는 생물학적 샘플의 일부 영역을 포커싱 영역으로 선정하는 단계와, 상기 포커싱 영역에서 렌즈 포커싱이 이루어지도록 대물렌즈가 제1 위치에 위치하도록 하는 단계와, 상기 대물렌즈와 상기 포커싱 영역 사이의 거리가 순차적으로 감소하도록, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키는 단계와, 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 포커싱 영역에서 셀 영역을 선정하는 단계와, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제2 방향으로 이동시켜 상기 대물렌즈가 제2 위치에 위치하도록 하는 단계와, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키는 단계와, 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 셀 영역 내의 표적세포에 대한 에지 디텍션(edge detection)을 하는 에지 디텍션 단계와, 상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정하는 최적 초점거리 선정 단계와, 상기 선정된 최적 초점거리에서 상기 생물학적 샘플의 전체 영역에 걸쳐 일시 또는 순차로 촬상을 하는 촬상 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법을 제공한다.

Description

세포 이미징 장치 및 그 방법{CELLL IMAGING DEVICE AND MEHTOD THEREFOR}

본 발명은 세포 이미징 장치 및 그 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 분석이 필요한 표적세포를 광 파장별로 촬영하고 이를 분석하여 표적세포를 카운팅할 수 있는 고식별성의 자동화된 세포 이미징 장치 및 그 방법에 관한 것이다.

형광 현미경은 생물, 화학, 의학 등의 분야에서 세포 영상 관찰을 위해 가장 널리 사용되는 장치이다. 사용자는 형광 현미경을 통해 광학 이미지를 얻은 후에 특정한 세포(표적세포)의 개수나 존재비율 등의 통계자료를 얻을 수 있다. 이를 위해서는 무엇보다 고품질의 광학 이미지를 얻는 것이 필수이다.

세포 이미징은 세포를 이용한 검사 또는 검진에도 응용된다. 유전자 해석, 암진단 등 바이오 기술의 발달에 따라 세포를 이용한 다양한 검사 또는 검진 방법이 개발되고 있다. 이를 위해 표적세포를 포함한 생물학적 샘플에 대해 형광 현미경을 통한 촬상 및 촬상된 이미지의 분석이 요구된다. 그러한 표적세포의 한 예로 혈중 암세포를 들 수 있다. 혈중 암세포(CTCs: Circulating Tumor Cells)는 1차적인 종양조직, 즉 원발암으로부터 떨어져 나와 혈액 속을 돌아다니는 소수의 종양세포로 전이암의 핵심요인으로 알려져 있다. 혈중 암세포는 혈구 성분 10⁸∼10⁹ 개당 약 1개 비율로 존재한다고 알려져 있다. 이러한 혈중 암세포의 개수나 비율을 정확히 판정하는 것은 암 검진이나 항암치료의 검증 등에 있어 매우 중요하다.

표적세포의 개수를 판단하고 이들의 종류를 판단하기 위해서는 각 세포의 크기와 형상을 특정해야 하며, 이를 위해서는 세포의 경계를 명확히 식별해야 한다. 따라서 세포의 경계를 명확히 식별할 수 있도록 세포 이미징을 할 수 있는 신뢰성과 경제성이 우수한 장치와 방법이 요구되고 있다.

또한, 다수개의 생물학적 샘플을 빠른 속도로 처리할 수 있는 자동화된 방식의 세포 이미징 장치와 방법이 요구되고 있다. 이러한 장치 및 방법은 특히 셀 카운팅(세포 계수) 기능이 포함된 디지털 영상 분석 분야에서 그 중요성이 더욱 크다.

미국공개특허 제2012-0148142호 (공개일 2012.06.14)

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 분석이 필요한 표적세포를 광 파장별로 촬영하고 이를 분석하여 표적세포를 카운팅할 수 있는 고식별성의 자동화된 세포 이미징 장치 및 그 방법를 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 세포 이미징 방법으로서, 표적세포(target cell)를 포함하는 생물학적 샘플의 일부 영역을 포커싱 영역으로 선정하는 단계와, 상기 포커싱 영역에서 렌즈 포커싱이 이루어지도록 대물렌즈가 제1 위치에 위치하도록 하는 단계와, 상기 대물렌즈와 상기 포커싱 영역 사이의 거리가 순차적으로 감소하도록, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키는 단계와, 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 포커싱 영역에서 셀 영역을 선정하는 단계와, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제2 방향으로 이동시켜 상기 대물렌즈가 제2 위치에 위치하도록 하는 단계와, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키는 단계와, 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 셀 영역 내의 표적세포에 대한 에지 디텍션(edge detection)을 하는 에지 디텍션 단계와, 상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정하는 최적 초점거리 선정 단계와, 상기 선정된 최적 초점거리에서 상기 생물학적 샘플의 전체 영역에 걸쳐 일시 또는 순차로 촬상을 하는 촬상 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제2 위치에서 상기 대물렌즈와 상기 생물학적 샘플 사이의 거리는, 상기 제1 위치에서 상기 대물렌즈와 상기 생물학적 샘플 사이의 거리보다 작을 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제2 피치는 상기 제1 피치보다 작을 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 최적 초점거리 선정 단계에서, 상기 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기(intensity) 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 상기 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 촬상 단계에서, 2개 이상의 파장영역에서 각각 상기 생물학적 샘플에 대한 광학 이미지를 얻을 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 표적세포를 포함하는 생물학적 샘플에 대한 세포 이미징 방법으로서, 대물렌즈를 제1 피치로 이동시키며 각 피치당 표적세포에 대한 제1차 광학 이미지를 얻고, 상기 제1차 광학 이미지를 통해 셀 영역을 선정하는 단계와, 상기 선정된 셀 영역에서 대물렌즈를 상기 제1 피치보다 작은 제2 피치로 이동시키며 각 피치당 표적세포에 대한 제2차 광학 이미지를 얻는 단계와, 상기 제2차 광학 이미지에서 표적세포에 대한 에지 디텍션을 통해 상기 대물렌즈와 상기 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 최적 초점거리를 선정하는 단계에서, 상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 최적 초점거리를 선정하는 단계에서, 상기 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 상기 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 표적세포는 혈중 암세포(CTC)일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 표적세포를 포함하는 생물학적 샘플을 위치시킨 플레이트와, 상기 플레이트 측으로 입사광을 조사하는 광원과, 상기 생물학적 샘플에서 여기된 광을 집광하는 대물렌즈와, 상기 대물렌즈를 통과한 광을 검출하는 촬상부와, 상기 대물렌즈 또는 상기 플레이트를 z축 방향으로 이동시키는 구동부와, 상기 촬상부에서 촬상된 광학 이미지를 분석하고, 상기 구동부에 대한 제어신호를 생성하는 제어부를 포함하며, 상기 제어부는, 상기 대물렌즈를 제1 위치에 위치시킨 후 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키면서 셀 영역을 선정하고, 상기 셀 영역 내에서 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제2 방향으로 이동시켜 상기 대물렌즈를 제2 위치에 위치시킨 후 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키면서 최적 초점거리를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 장치를 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제어부는 상기 표적세포에 대한 에지 디텍션을 통해 최적 초점거리를 선정할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제어부는 상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제어부는 상기 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 상기 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 분석이 필요한 표적세포를 광 파장별로 촬영하고 이를 분석하여 표적세포를 카운팅할 수 있는 고식별성의 자동화된 세포 이미징 장치 및 그 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 세포 이미징 장치 및 그 방법에 의하면, 세포의 경계를 명확히 구별하여 표적세포의 개수와 종류를 정확히 판단할 수 있도록 한다. 또한, 다수개의 생물학적 샘플을 빠른 속도로 처리할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 세포와 대물렌즈 사이의 거리에 따른 광학 이미지 샘플 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 세포 이미징 장치의 개략적인 구성도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 세포 이미징 방법을 나타낸 플로우 차트이다.
도 4는 생물학적 샘플 내에서 셀 영역을 나타낸 사진이다.
도 5 및 도 6은 하나의 표적세포에 대한 에지 디텍션의 실제 과정을 나타낸 참고도이다.
도 7은 초점거리에 따른 표적세포 광학 이미지를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 이미징 방법을 나타낸 플로우 차트이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 본 발명에 첨부된 도면에서 세포에 대한 광학 이미지는 실제 이미지에서 흑백 반전한 이미지를 사용하였다.

도 1은 세포와 대물렌즈 사이의 거리에 따른 광학 이미지 샘플 사진, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 세포 이미징 장치의 개략적인 구성도이다.

세포 이미징 시스템은 예컨대 슬라이드 글라스와 같은 플랫폼 상에 염색된 세포를 놓고 여러 파장별로 세포를 관찰하고 촬영하는 시스템이다. 세포 이미징 시스템은 자동 셀 카운팅(cell counting) 모듈, 형광 강도(intensity) 분석 모듈, 형질 주입(transfection) 효율 분석 모듈, 3D 디컨볼루션(deconvolution) 모듈, 세포학(cytology) 기반 셀 분류/인식(cell classification/cognition) 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 사용자 편의 기능으로서, 측정(Measurement) 기능, 리포트(Report) 자동 생성 기능, DB 관리 기능을 유저 인터페이스로 포함할 수 있다.

이러한 세포 이미징 시스템은 세포, 배양액, 데브리스(debris) 등을 구별하고, 사용자가 원하는 세포를 판별하고 계수하기 위한 디지털 영상분석 장비가 포함된다. 이러한 세포 이미징 시스템에서 세포의 경계를 정확히 판정하기 위한 고품질의 광학 이미지 추출 장치, 즉 세포 이미징 장치가 필요하다.

도 1의 (a) 내지 (f)는 표적이 되는 세포와 대물렌즈 사이의 거리에 대한 광학 이미지 샘플 사진으로서, 적절한 초점거리가 주어지는 경우에만 세포의 식별이 이루어짐을 알 수 있다. 예컨대 도 1 (d)의 광학 이미지를 통해서만 세포의 경계를 적절히 확정하여 세포의 크기나 형상을 판단하고, 이를 통해 세포의 종류를 판별하고 계수할 수 있다. 나머지 광학 이미지에서는 세포의 식별이나 경계 확정이 어렵다.

도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 세포 이미징 장치(10)는 플레이트(1), 광원(2), 대물렌즈(3), 촬상부(4), 구동부(5) 및 제어부(6)를 포함한다.

플레이트(1)에는 표적세포를 포함하는 생물학적 샘플(S)이 위치한다. 표적세포는 특정 시료에 의해 형광염색된 세포, 또는 특정 혈구세포, 또는 혈중 암세포(CTC) 등과 같은 특정 세포일 수 있으며, 그 종류에는 특별한 제한이 없다. 또한 생(live) 세포이든 죽은 세포이든 관계없다. 플레이트(1)는 슬라이드 글라스(slide glass)일 수 있으며, 슬라이드 글라스를 고정시키기 위한 지그가 포함될 수도 있다. 플레이트(1)에는 하나의 생물학적 샘플(S)이 위치하는 것도 가능하고, 하나의 플레이트에 복수개의 샘플이 배치되거나, 다수개의 독립된 플레이트가 병치되는 것도 가능하다. 또한 플레이트(1)는 챔버 내에 위치할 수도 있다.

광원(2)은 플레이트(1) 측으로 입사광을 조사한다. 광원(2)은 LED와 같은 조명일 수 있으며, 사용자의 선택 또는 제어부의 제어 동작에 따라 발광시간이 소정범위 내로 조정될 수 있다. 또한 광원(2)은 투과 광원(transmission light source)이거나 형광 광원(fluorescence light source)일 수 있다. 또한 광원(2)은 2개 이상의 모드를 가지도록 교체 가능하게 마련될 수도 있으며, 이 경우 예컨대 암시야 모드와 명시야 모드를 제공할 수 있다.

대물렌즈(3)는 생물학적 샘플에서 여기된 광을 집광한다. 대물렌즈(3)를 통해 유입된 광은 광학 요소(optical element)를 거쳐 촬상부(4)로 향한다. 광학요소에는 형광염료로 염색된 세포 또는 세포내 물질을 검출하기 위한 필터가 포함될 수 있다.

촬상부(4)는 대물렌즈(3)를 통과한 광을 검출하여 이미지화한다. 촬상부(4)는 예컨대 CCD 카메라일 수 있다.

구동부(5)는 대물렌즈(3) 또는 플레이트(1)를 z축 방향으로 이동시킨다. 여기서 z축 방향은 대물렌즈(3)와 플레이트(1)가 대향하는 방향을 나타내며, 일반적으로 중력방향을 의미하나, 반드시 그러한 것은 아니다. 대물렌즈(3) 또는 플레이트(1)가 z축 방향으로 이동함으로써, 대물렌즈(3)와 플레이트(1) 사이의 법선방향 거리가 커지거나 작아질 수 있다. 도면에서 대물렌즈(3)와 플레이트(1) 사이의 거리는 d로 표시되어 있으며, 구동부(5)의 동작에 따라 d가 변화될 수 있다.

제어부(6)는 촬상부(4)에서 촬상된 광학 이미지를 분석하며, 또한 구동부(5)에 대한 제어신호를 생성한다. 제어부(6)에는 마이크로프로세서, 메모리 등이 포함될 수 있다.

제어부(6)에서의 처리 및 신호 생성에 의해, 먼저 대물렌즈(3)를 제1 위치에 위치시킨다. 다음으로 대물렌즈(3) 또는 플레이트(1)를 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키면서 셀 영역(cell area)을 선정한다. 다음으로, 셀 영역 내에서 대물렌즈(3) 또는 플레이트(1)를 제2 방향으로 이동시켜 대물렌즈를 제2 위치에 위치시킨다. 다음으로 대물렌즈(3) 또는 플레이트(1)를 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키면서 최적 초점거리를 선정한다.

여기서, 제1 위치는 대물렌즈(3)와 플레이트(1) 사이의 거리가 최적 초점거리보다 상당히 큰 위치에 해당한다. 제1 방향은 대물렌즈(3)와 플레이트(1)가 서로 가까워지는 방향을 의미하며, 제2 방향은 제1 방향의 역방향이다. 예컨대, 도 2에서와 같이 대물렌즈(3)가 플레이트(1)의 하측에 위치하고, 대물렌즈(3)가 구동가능하고 플레이트(1)의 위치가 고정되어 있다고 할 경우, 제1 방향은 z축 상측 방향을 의미하고, 제2 방향은 z축 하측 방향을 의미한다.

이와 달리, 제1 위치가 대물렌즈(3)와 플레이트(1) 사이의 거리가 최적 초점거리보다 상당히 작은 위치에 해당하는 경우, 제1 방향은 대물렌즈(3)와 플레이트(1)가 서로 멀어지는 방향을 의미하며, 제2 방향은 제1 방향의 역방향이 된다.

한편, 제어부(6)는 표적세포에 대한 에지 디텍션(edge detection)을 통해 최적 초점거리(optimal focusing distance)를 선정하게 된다. 일반적으로 초점거리는 렌즈 또는 광학계에서 상수로 주어지나, 본 명세서에서는 대물렌즈와 플레이트 사이의 거리, 구체적으로 대물렌즈의 중심면과 플레이트 상의 생물학적 샘플 또는 표적세포 사이의 거리를 의미하는 것으로 한다.

제어부(6)는 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트(contrast) 차이가 최대가 되는 지점에서 대물렌즈(3)와 생물학적 샘플(S) 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정한다. 이를 위해, 제어부(6)는 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일(line profile) 상에서 인접한 두 픽셀(pixel) 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 이러한 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 대물렌즈(3)와 생물학적 샘플(S) 사이의 최적 초점거리를 선정할 수 있다.

이상에서 설명한 제어부(6)에서의 광학 이미지의 분석과 구동부(5)의 제어 과정에 대해서는 아래의 세포 이미징 방법과 관련하여 상술하기로 한다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 세포 이미징 방법을 나타낸 플로우 차트, 도 4는 생물학적 샘플 내에서 셀 영역을 나타낸 사진, 도 5 및 도 6은 하나의 표적세포에 대한 에지 디텍션의 실제 과정을 나타낸 참고도, 도 7은 초점거리에 따른 표적세포 광학 이미지를 나타낸 사진이다.

본 발명의 실시예에 따른 세포 이미징 방법에서는, 먼저 표적세포를 포함하는 생물학적 샘플의 일부 영역을 포커싱 영역으로 선정한다(S10 단계). 여기서 표적세포는 혈중 암세포(CTC)일 수 있다.

도 2를 참조하면, 플레이트(1)에 놓인 생물학적 샘플(S)의 일부 영역이 포커싱 영역(F)이 된다. 본 발명의 실시예에서는 생물학적 샘플에서 표적세포가 위치하는 영역의 일부를 포커싱 영역으로 선정하고, 이 포커싱 영역에서 최적 초점거리를 선정함으로서, 최종적으로 생물학적 샘플의 전체 영역에 대한 선명한 광학 이미지를 얻을 수 있게 된다.

다음으로, 포커싱 영역에서 렌즈 포커싱(즉, 최적 초점거리 선정)이 이루어지도록 대물렌즈가 제1 위치에 위치하도록 한다(S20 단계).

다음으로, 대물렌즈와 포커싱 영역 사이의 거리가 순차적으로 감소하도록 대물렌즈 또는 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제1 피치로 이동시킨다(S30 단계). 생물학적 샘플을 이동시키는 것은 플레이트 또는 표적세포를 z축 방향으로 이동시키는 것과 동일한 의미이다.

다음으로, 촬상된 광학 이미지를 통해 포커싱 영역에서 셀 영역을 선정한다(S40 단계). 도 4를 참고하면, 셀 영역은 포커싱 영역 내에서 최적 초점거리 선정을 위한 프로세싱의 대상이 되는 어느 하나 또는 복수의 세포가 존재하는 영역을 의미한다.

다음으로, 대물렌즈 또는 생물학적 샘플을 제2 방향으로 이동시켜 대물렌즈가 제2 위치에 위치하도록 한다(S50 단계). 여기서, 제2 위치에서 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리는, 앞서 S20 단계의 제1 위치에서 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리보다 작을 수 있다.

다음으로, 대물렌즈 또는 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제2 피치로 이동시킨다(S60 단계). 여기서, 제2 피치는 제1 피치보다 작을 수 있다.

이상의 설명에서 제1 위치, 제1 방향, 제2 방향의 의미는 앞선 실시예에서 설명한 바와 동일하다. 예컨대, 제1 위치는 대물렌즈와 플레이트 또는 생물학적 샘플 사이의 거리가 최적 초점거리보다 상당히 큰 위치에 해당할 수 있다. 제1 방향은 대물렌즈와 생물학적 샘플이 서로 가까워지는 방향을 의미하며, 제2 방향은 제1 방향의 역방향일 수 있다.

플레이트 또는 생물학적 샘플의 z축 위치는 고정되어 있고, 대물렌즈만이 z축 방향으로 이동하며, 대물렌즈가 플레이트의 하측에 위치한다고 가정하고, 구체적인 예를 들면 다음과 같다. 아래에서의 수치는 실험 또는 예시를 위한 것임에 유의해야 할 것이다.

먼저, S20 단계에서 대물렌즈는 -1000㎛ 되는 위치로 이동한다. 즉, 제1 위치는 -1000 ㎛가 된다.

다음으로, S30 단계에서 대물렌즈는 +10㎛ 간격으로 이동한다. 즉, 제1 방향은 z축 상측 방향이 되고, 제1 피치는 10㎛가 된다. 만약, z축 이동단위가 스텝이고, 스텝당 0.5㎛ 이동이 이루어진다고 하면, S30 단계에서는 1회 이동시 20스텝의 움직임이 일어나게 된다.

이와 같이 대물렌즈가 이동하면서 셀 영역의 측정이 이루어지는데, 소정 횟수만큼 대물렌즈를 이동한 후에 셀 영역의 선정이 이루어지게 된다(S40단계). 여기서 셀 영역의 선정이 이루어진다는 것은 광학 이미지 내에서 최적 초점거리 선정을 위한 프로세싱의 대상이 되는 어느 하나 또는 복수의 세포가 선정되었다는 것임과 동시에, 최적 초점거리에 근접하도록 대물렌즈가 이동했다는 것을 의미한다.

셀 영역의 선정이 이루어진 시점에서, 대물렌즈의 위치를 현 위치에서 -100㎛ 이동한다. 즉, S50 단계에서 z축 하측 방향으로 100㎛ 만큼 이동한 위치가 제2 위치가 된다.

다음으로, S60 단계에서 대물렌즈는 +2㎛ 간격으로 이동한다. 즉, 제2 피치는 2㎛가 되며, 1회 이동시 4 스텝의 움직임이 일어나게 된다. 위 S20 내지 S60 단계에서의 움직임은 결국 1차적으로 대물렌즈의 이동간격을 크게 해서(제1 피치) 후보가 되는 초점거리를 일단 선정하고, 이후 범위를 좁혀 2차적으로 대물렌즈의 이동간격을 작게 해서(제2 피치), 최적 초점거리를 탐색하는 과정이라고 할 수 있다. 이를 통해 최적 초점거리 도달에 이르기 위한 시간 소비를 줄일 수 있게 된다.

한편, 이상에서는 대물렌즈가 이동하는 것을 전제로 설명하였으나, 이와 달리 플레이트(또는 생물학적 샘플)가 이동하거나, 대물렌즈와 플레이트가 모두 이동하는 것도 가능하다. 이 경우, 제1 방향 및 제2 방향의 실제 의미가 달라질 수 있음은 물론이다.

다시 도 3을 참조하면, 촬상된 광학 이미지를 통해 셀 영역 내의 표적세포에 대한 에지 디텍션을 한다(S70 단계). 에지 디텍션은 이미지 내에 존재하는 특정 대상물의 경계를 확정하는 것으로, 세포 이미지에 대한 에지 디텍션은 탐지 대상이 되는 세포와 그 배경을 구별할 수 있도록 피처 콘트라스트(feature contrast)의 차이를 감지하는 것이다. 이러한 콘트라스트 차이를 증대시키기 위해 세포에 형광염료 염색을 하거나 마커에 의한 라벨링을 하게 된다.

도 5를 참조하면, 먼저 셀 영역 내에서 세포를 중심으로 A-A'선 상에서 픽셀 값을 측정하게 된다(도 5의 (a) 참조). 도 5의 (b)는 A-A'라인 프로파일을 따라 픽셀 값(intensity)의 분포를 나타낸다. 라인 프로파일을 따라 분포된 픽셀 값의 그래디언트(gradient) 정보가 도 5의 (c)에 나타나 있다. 그래디언트는 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이를 에지 강도(edge strength)로 나타낸 것으로, A-A'선 상에서 세포의 에지에 해당하는 E1 및 E2 지점에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이, 즉 에지 강도의 절대값이 가장 크게 된다. 즉, 에지 강도의 절대값이 가장 큰 지점을 세포 경계로 획정할 수 있게 된다.

다시 도 3을 참조하면, 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정한다(S80 단계).

여기서, 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 이러한 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정하게 된다.

도 6에는, 상이한 초점거리에서 촬상한 광학 이미지(a, b, c) 및 그에 따른 라인 프로파일 상에서의 에지 강도가 나타나 있다. 도시된 바와 같이 A 이미지가 B 및 C 이미지에 비해 선명한 에지를 보여주고 있음을 알 수 있으며, 이는 A 이미지에 대응하는 라인 프로파일 상에서의 에지 강도가, B 및 C 이미지에 대응하는 라인 프로파일 상에서의 에지 강도와 비교하여, 더 큰 값을 갖고 있음을 통해서 확인할 수 있다. 즉, 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이(에지 강도)가 가장 큰 구간을 검출하고, 이러한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 값을 갖고 있는 광학 이미지를 선택하면, 해당 광학 이미지를 촬상했을 때의 초점거리를 최적 초점거리로 선정할 수 있게 된다.

도 7은 제2 피치 간격으로 대물렌즈를 이동시키며 촬영한 셀 영역의 광학 이미지(총 63개의 광학 이미지)가 도시되어 있다. 해당 도면에서는, 라인 프로파일 상에서의 에지 강도 측정을 통해 48번 광학 이미지가 가장 선명한 에지를 갖고 있음을 확인할 수 있고, 따라서 48번 광학 이미지에 대응하는 초점거리를 최적 초점거리로 선정하게 된다.

마지막으로, 선정된 최적 초점거리에서 생물학적 샘플의 전체 영역에 걸쳐 일시 또는 순차로 촬상을 하게 된다(S90 단계). 2개 이상의 파장영역에서 각각 생물학적 샘플에 대한 광학 이미지를 얻을 수 있다. 예컨대 청색 파장영역에서 광학 이미지를 얻은 후, 이어서 녹색 파장영역 및 적색 파장영역에서의 광학 이미지를 얻는 것이 가능하다.

도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 이미징 방법을 나타낸 플로우 차트이다. 이 실시예에 따른 세포 이미징 방법의 구성단계는 앞선 실시예에서 개별적으로 설명한 구성단계와 유사하다.

본 실시예에 따른 표적 세포를 포함하는 생물학적 샘플에 대한 세포 이미징 방법에서는, 먼저 대물렌즈를 제1 피치로 이동시키며 각 피치당 표적세포에 대한 제1차 광학 이미지를 얻고, 이러한 제1차 광학 이미지를 통해 셀 영역을 선정한다(S100 단계).

다음으로, S100 단계에서 선정된 셀 영역에서 대물렌즈를 제1 피치보다 작은 제2 피치로 이동시키며 각 피치당 표적세포에 대한 제2차 광학 이미지를 얻는다(S200 단계).

마지막으로, S200 단계에서 얻은 제2차 광학 이미지에서 표적세포에 대한 에지 디텍션을 통해 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정한다(S300 단계). 여기서, 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정할 수 있다. 또한, 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 이러한 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정할 수 있다. 이에 대한 상세 구성은 전술한 실시예에서와 동일하다.

이상 설명한 본 발명의 실시예를 통해 분석이 필요한 표적세포를 광 파장별로 촬영하고 이를 통해 표적세포를 카운팅할 수 있게 된다. 특히 세포의 경계를 명확히 구별하여 표적세포의 개수와 종류를 정확히 판단할 수 있으며, 다수개의 생물학적 샘플을 빠른 속도로 처리할 수 있게 된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

10 세포 이미징 장치
1 플레이트
2 광원
3 대물렌즈
4 촬상부
5 구동부
6 제어부

Claims

세포 이미징 방법으로서,
표적세포(target cell)를 포함하는 생물학적 샘플의 일부 영역을 포커싱 영역으로 선정하는 단계와,
상기 포커싱 영역에서 렌즈 포커싱이 이루어지도록 대물렌즈가 제1 위치에 위치하도록 하는 단계와,
상기 대물렌즈와 상기 포커싱 영역 사이의 거리가 순차적으로 감소하도록, 상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키는 단계와,
상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키는 단계 이후 상기 생물학적 샘플을 촬영하고 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 포커싱 영역에서 셀 영역을 선정하는 단계와,
상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제2 방향으로 이동시켜 상기 대물렌즈가 제2 위치에 위치하도록 하는 단계와,
상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키는 단계와,
상기 대물렌즈 또는 상기 생물학적 샘플을 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키는 단계 이후 상기 생물학적 샘플을 촬영하고 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 셀 영역 내의 표적세포에 대한 에지 디텍션(edge detection)을 하는 에지 디텍션 단계와,
상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정하는 최적 초점거리 선정 단계와,
상기 선정된 최적 초점거리에서 상기 생물학적 샘플의 전체 영역에 걸쳐 일시 또는 순차로 촬상을 하는 촬상 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 위치에서 상기 대물렌즈와 상기 생물학적 샘플 사이의 거리는, 상기 제1 위치에서 상기 대물렌즈와 상기 생물학적 샘플 사이의 거리보다 작은 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 피치는 상기 제1 피치보다 작은 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
제1항에 있어서,
상기 최적 초점거리 선정 단계에서, 상기 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기(intensity) 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 상기 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
제1항에 있어서,
상기 촬상 단계에서, 2개 이상의 파장영역에서 각각 상기 생물학적 샘플에 대한 광학 이미지를 얻는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
표적세포를 포함하는 생물학적 샘플에 대한 세포 이미징 방법으로서,
대물렌즈를 제1 피치로 이동시키며 각 피치당 표적세포에 대한 제1차 광학 이미지를 얻고, 상기 제1차 광학 이미지를 통해 셀 영역을 선정하는 단계와,
상기 선정된 셀 영역에서 대물렌즈를 상기 제1 피치보다 작은 제2 피치로 이동시키며 각 피치당 표적세포에 대한 제2차 광학 이미지를 얻는 단계와,
상기 제2차 광학 이미지에서 표적세포에 대한 에지 디텍션을 통해 상기 대물렌즈와 상기 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정하는 단계
를 포함하고,
상기 최적 초점거리를 선정하는 단계에서, 상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정하거나, 또는,
상기 최적 초점거리를 선정하는 단계에서, 상기 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 상기 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
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제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적세포는 혈중 암세포(CTC)인 것을 특징으로 하는 세포 이미징 방법.
표적세포를 포함하는 생물학적 샘플을 위치시킨 플레이트와,
상기 플레이트 측으로 입사광을 조사하는 광원과,
상기 생물학적 샘플에서 여기된 광을 집광하는 대물렌즈와,
상기 대물렌즈를 통과한 광을 검출하는 촬상부와,
상기 대물렌즈 또는 상기 플레이트를 z축 방향으로 이동시키는 구동부와,
상기 촬상부에서 촬상된 광학 이미지를 분석하고, 상기 구동부에 대한 제어신호를 생성하는 제어부를 포함하며,
상기 제어부는, 상기 대물렌즈를 제1 위치에 위치시킨 후 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제1 방향으로 제1 피치로 이동시키면서 셀 영역을 선정하고, 상기 셀 영역 내에서 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제2 방향으로 이동시켜 상기 대물렌즈를 제2 위치에 위치시킨 후 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제1 방향으로 제2 피치로 이동시키면서 최적 초점거리를 선정하되,
상기 제어부는, 상기 대물렌즈 또는 플레이트를 제1 방향으로 제2 피치로 이동시킨 이후 상기 생물학적 샘플을 촬영하고, 촬상된 광학 이미지를 통해 상기 셀 영역 내의 표적세포에 대한 에지 디텍션(edge detection)을 하고, 상기 표적세포에 대한 에지 디텍션을 통해 최적 초점거리를 선정하며,
또한, 상기 제어부는 상기 에지 디텍션을 통해 표적세포와 배경 간의 콘트라스트 차이가 최대가 되는 지점에서 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 거리를 최적 초점거리로 선정하거나, 또는,
상기 제어부는 상기 셀 영역 내의 소정의 라인 프로파일 상에서 인접한 두 픽셀 사이의 크기 차이가 가장 큰 구간을 검출하고, 상기 두 픽셀 사이의 크기 차이를 이용하여 상기 대물렌즈와 생물학적 샘플 사이의 최적 초점거리를 선정하는 것을 특징으로 하는 세포 이미징 장치.
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