JP5419138B2 - Detection method of detection object and detection kit used therefor - Google Patents

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本発明は、検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キットに関する。   The present invention relates to a detection method for a detection target and a detection kit used therefor.

検体中の検出対象物を検出する方法として、例えば、抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法が利用されており、特に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が汎用されている（非特許文献１）。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、例えば、検出対象物が抗原の場合、前記抗原に結合可能な一次抗体と、前記抗原に結合可能であり且つ酵素で標識化された二次抗体を使用して、以下のように行うことができる。まず、前記一次抗体を固定化した反応容器に、前記抗原を含む検体を添加する。すると、前記固定化一次抗体と前記抗原との間で抗原抗体反応が起こり、前記固定化一次抗体に前記抗原が結合する。そして、前記未反応の抗原を除去した後、さらに、前記反応容器に、前記標識化二次抗体を添加する。この標識化二次抗体と前記固定化一次抗体に結合した前記抗原との間で抗原抗体反応が起こり、前記抗原に前記標識化二次抗体が結合して、複合体が形成される。この複合体では、抗原を前記一次抗体と前記二次抗体とが挟み込む状態となる。そして、前記未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記標識化二次抗体における標識酵素の基質を添加して、酵素反応を行う。この酵素反応による発色や発光のシグナルを検出することで、前記複合体形成に関与した前記抗原を検出することができる。前記シグナルは、前記複合体を構成する前記抗原の量と相関性を示すことから、間接的に、前記固定化一次抗体と前記標識化二次抗体とにより複合体形成に関与した抗原量を算出できる。   As a method for detecting a detection target in a specimen, for example, an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method using an antigen-antibody reaction is used, and in particular, a sandwich ELISA method is widely used (Non-Patent Document 1). ). For example, when the detection target is an antigen, the sandwich ELISA method uses a primary antibody that can bind to the antigen and a secondary antibody that can bind to the antigen and is labeled with an enzyme. Can be done as follows. First, a specimen containing the antigen is added to a reaction container in which the primary antibody is immobilized. Then, an antigen-antibody reaction occurs between the immobilized primary antibody and the antigen, and the antigen binds to the immobilized primary antibody. Then, after removing the unreacted antigen, the labeled secondary antibody is further added to the reaction container. An antigen-antibody reaction occurs between the labeled secondary antibody and the antigen bound to the immobilized primary antibody, and the labeled secondary antibody binds to the antigen to form a complex. In this complex, the antigen is sandwiched between the primary antibody and the secondary antibody. Then, after removing the unreacted labeled secondary antibody, a substrate of a labeled enzyme in the labeled secondary antibody is added to perform an enzyme reaction. The antigen involved in the complex formation can be detected by detecting a color development or luminescence signal due to the enzyme reaction. Since the signal correlates with the amount of the antigen constituting the complex, the amount of the antigen involved in complex formation is indirectly calculated by the immobilized primary antibody and the labeled secondary antibody. it can.

しかしながら、このＥＬＩＳＡ法は、検出限界が、ｎｍｏｌ／Ｌからｐｍｏｌ／Ｌオーダーである。また、工程数も多く、操作が煩雑である。このため、例えば、ｆｍｏｌ／Ｌオーダーの低量の検出対象物を検出可能な検出感度に優れる簡便な検出系の開発が望まれている。   However, this ELISA method has a detection limit on the order of nmol / L to pmol / L. In addition, the number of steps is large and the operation is complicated. For this reason, for example, development of a simple detection system excellent in detection sensitivity capable of detecting a detection object of a low amount of the fmol / L order is desired.

そこで、前述のＥＬＩＳＡ法と核酸増幅法とを組み合わせた新たな検出系として、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法が注目されている（非特許文献２）。Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲは、前記酵素で標識化した二次抗体に代えて、核酸で標識化した標識化二次抗体を使用する方法である。具体的には、前述のＥＬＩＳＡ法と同様に、固定化一次抗体に検出対象物である抗原を結合させた後、前記固定化一次抗体に結合した抗原に、前記標識化二次抗体を結合させ複合体を形成させる。そして、未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記標識化二次抗体の核酸を、ＰＣＲによって増幅させる。前記複合体における前記標識化二次抗体の核酸は、前記複合体を構成する前記抗原の量と対応するため、前記核酸の増幅産物を検出することで、前記抗原を検出することができる。このＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法によれば、例えば、前述のＥＬＩＳＡ法と比較して、例えば、感度が１０〜１０，０００倍に向上し、ｆｍｏｌ／Ｌオーダー以下の検出が可能である（非特許文献３）。   Therefore, the Immuno-PCR method has attracted attention as a new detection system that combines the aforementioned ELISA method and nucleic acid amplification method (Non-patent Document 2). Immuno-PCR is a method in which a labeled secondary antibody labeled with a nucleic acid is used instead of the secondary antibody labeled with the enzyme. Specifically, in the same manner as in the ELISA method described above, after the antigen as the detection target is bound to the immobilized primary antibody, the labeled secondary antibody is bound to the antigen bound to the immobilized primary antibody. A complex is formed. Then, after removing the unreacted labeled secondary antibody, the nucleic acid of the labeled secondary antibody is amplified by PCR. Since the nucleic acid of the labeled secondary antibody in the complex corresponds to the amount of the antigen constituting the complex, the antigen can be detected by detecting the amplification product of the nucleic acid. According to this Immuno-PCR method, for example, compared with the above-mentioned ELISA method, for example, the sensitivity is improved 10 to 10,000 times, and detection of fmol / L order or less is possible (Non-Patent Document 3). ).

しかしながら、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの場合、実用化するには、核酸で標識化した二次抗体の準備が、非常に煩雑で困難であるという問題がある。前記標識化二次抗体は、例えば、検出対象物を抗原とする二次抗体に、増幅用の核酸を、化学結合等で結合することにより調製する。しかし、前記二次抗体に前記核酸を標識化するにあたっては、両者が結合するように、例えば、予め、前記核酸をビオチンで修飾し、前記二次抗体をアビジンやストレプトアビジンで修飾する必要があり、煩雑である。また、この修飾化の条件設定自体が、非常に手間がかかるという問題もある。さらに、調製した前記標識化核酸が前記二次抗体に結合しても、実際の核酸増幅の段階において、前記標識化二次抗体における核酸の増幅反応が確認できない場合がある。また、前記核酸で標識化された二次抗体と標識化できなかった二次抗体とが混在するため、例えば、核酸増幅反応の検出において、バックグラウンドが高くなるという問題がある。そして、このバックグラウンドの問題を回避するには、前記標識化二次抗体と前記未標識二次抗体との混合物から、前記標識化二次抗体を精製する必要があるが、前記両者は、核酸の有無が異なるのみであって、分離が困難である。さらに、前記標識化二次抗体は、前記検出対象物ごとに調製する必要がある。このため、前記検出対象物に応じた二次抗体ごとに、前述のような核酸増幅の問題がない標識化、および、未標識二次抗体との分離が必要であり、様々な検出対象物に利用することが困難である。また、化学修飾や試薬によって、抗体の有する結合活性が減少または消失するおそれもある。   However, in the case of Immuno-PCR, there is a problem that preparation of a secondary antibody labeled with a nucleic acid is very complicated and difficult for practical use. The labeled secondary antibody is prepared by, for example, binding a nucleic acid for amplification to a secondary antibody having a detection target as an antigen by chemical bonding or the like. However, in order to label the nucleic acid on the secondary antibody, for example, it is necessary to modify the nucleic acid with biotin in advance and to modify the secondary antibody with avidin or streptavidin so that the two bind to each other. It ’s cumbersome. In addition, there is a problem that the modification condition setting itself is very time-consuming. Furthermore, even if the prepared labeled nucleic acid binds to the secondary antibody, the nucleic acid amplification reaction in the labeled secondary antibody may not be confirmed in the actual nucleic acid amplification stage. Moreover, since the secondary antibody labeled with the nucleic acid and the secondary antibody that could not be labeled coexist, for example, there is a problem that the background becomes high in the detection of the nucleic acid amplification reaction. In order to avoid this background problem, it is necessary to purify the labeled secondary antibody from the mixture of the labeled secondary antibody and the unlabeled secondary antibody. Separation is difficult because only the presence or absence is different. Furthermore, the labeled secondary antibody needs to be prepared for each detection target. For this reason, for each secondary antibody corresponding to the detection target, it is necessary to label without the nucleic acid amplification problem as described above and to be separated from the unlabeled secondary antibody. It is difficult to use. In addition, the binding activity of the antibody may be reduced or eliminated by chemical modification or reagents.

他方、抗体に代わる分子として、検出対象物に結合可能な核酸からなる核酸アプタマーが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。この核酸アプタマーを利用する検出方法としては、例えば、ＥＬＯＮＡ法（非特許文献５、６、７）等がある。前記ＥＬＯＮＡ法は、前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、前記標識化二次抗体に代えて、酵素で標識化した核酸アプタマーを使用する方法である。しかしながら、前記核酸アプタマーを酵素で標識化するには、前述のＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲと同様に、例えば、予め、前記核酸アプタマーをビオチンで修飾し、前記酵素をアビジン等で修飾する必要があり、標識二次抗体の調製自体が煩雑であり、修飾化の条件設定に手間がかかるという問題がある。また、前記核酸アプタマーのビオチン化により、例えば、アプタマーの結合能が減少または消失する問題がある。また、前記固定化一次抗体に結合した検出対象物に、十分量の核酸アプタマーを添加する必要があるため、コスト高が問題となる。   On the other hand, nucleic acid aptamers composed of nucleic acids that can bind to a detection target have been reported as molecules that can replace antibodies (Non-patent Documents 3 and 4). As a detection method using this nucleic acid aptamer, for example, there is an ELONA method (Non Patent Literatures 5, 6, and 7). The ELONA method uses a nucleic acid aptamer labeled with an enzyme instead of the labeled secondary antibody in the sandwich ELISA method. However, in order to label the nucleic acid aptamer with an enzyme, it is necessary to previously modify the nucleic acid aptamer with biotin and the enzyme with avidin or the like, as in the above-described Immuno-PCR. The preparation of the secondary antibody itself is complicated, and there is a problem that it takes time to set the modification conditions. In addition, biotinylation of the nucleic acid aptamer has a problem that, for example, aptamer binding ability is reduced or eliminated. Further, since it is necessary to add a sufficient amount of nucleic acid aptamer to the detection target bound to the immobilized primary antibody, high cost becomes a problem.

Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９７１）８，８７１−４．Immunochemistry. (1971) 8, 871-4. Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９２）２５８，１２０−１２２．Science. (1992) 258, 120-122. Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９０）２４９，５０５−５１０．Science. (1990) 249, 505-510. Ｎａｔｕｒｅ．（１９９０）３４６，８１８−８２２．Nature. (1990) 346, 818-822. Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２００４）７６，５６０５−５６１０．Anal Chem. (2004) 76, 5605-5610. Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０，４７３−４７７．Nat Biotechnol. (2002) 20, 473-477. Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２００８）３９０，９８９−１００７．Anal Bioanal Chem. (2008) 390, 989-1007.

そこで、本発明の目的は、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な新たな検出方法、ならびに、それに用いる検出キットを提供することにある。   Therefore, an object of the present invention is to provide a new detection method excellent in detection sensitivity and easy to operate, and a detection kit used therefor.

本発明の検出方法は、検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする。 The detection method of the present invention comprises a complex of a detection target in a sample, a primary reagent that can bind to the detection target, and a secondary reagent that can bind to the detection target at a site different from the primary reagent. Forming a complex,
A binding step of binding a nucleic acid aptamer capable of binding to the secondary reagent to the secondary reagent in the complex;
An amplification step of amplifying by a nucleic acid amplification method using the nucleic acid aptamer bound to the secondary reagent as a template, and
The method includes a detection step of detecting the detection target by detecting an amplification product of the nucleic acid aptamer.

本発明の検出用キットは、検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、本発明の検出方法に使用することを特徴とする。   The detection kit of the present invention includes a nucleic acid aptamer that can bind to a reagent that can bind to a detection target, and is characterized by being used in the detection method of the present invention.

本発明によれば、優れた感度で、検出対象物の検出を行うことができる。また、本発明によれば、前記検出対象物に結合可能な二次試薬について、標識化が不要である。このため、操作も簡便に行うことができる。したがって、本発明によれば、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な検出対象物の検出を実現できる。   According to the present invention, a detection target can be detected with excellent sensitivity. In addition, according to the present invention, the secondary reagent that can bind to the detection target does not need to be labeled. For this reason, operation can also be performed simply. Therefore, according to the present invention, it is possible to realize detection of a detection object that is excellent in detection sensitivity and easy to operate.

図１は、本発明の検出方法の一例において、各工程の概略を示す概略図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing an outline of each step in an example of the detection method of the present invention. 図２は、本発明の実施例１において、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＰＣＲにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）とＣｔ値との関係を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the relationship between the number of molecules (copy number) of RNA aptamer R18 and the Ct value in real-time PCR using an RNA aptamer in Example 1 of the present invention. 図３は、本発明の実施例１において、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの測定結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the measurement results of anti-actin rabbit IgG by Immuno-PCR using RNA aptamer in Example 1 of the present invention. 図４は、本発明の実施例２において、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによるヒトＶＥＧＦの測定結果を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the results of measurement of human VEGF by sandwich immuno-PCR using RNA aptamers in Example 2 of the present invention. 図５は、本発明の実施例３において、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける血清中ヒトＶＥＧＦの測定結果を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the measurement results of human VEGF in serum by sandwich immuno-PCR using RNA aptamer in Example 3 of the present invention. 図６は、本発明の実施例４において作成した検量線を示すグラフであり、同図（Ａ）は、実施例１におけるＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの測定値を用いた検量線のグラフであり、同図（Ｂ）は、実施例２におけるサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによるヒトＶＥＧＦの測定値を用いた検量線のグラフである。FIG. 6 is a graph showing a calibration curve prepared in Example 4 of the present invention. FIG. 6 (A) uses the measured value of anti-actin rabbit IgG by Immuno-PCR using the RNA aptamer in Example 1. (B) is a graph of a calibration curve using the measured values of human VEGF by sandwich immuno-PCR in Example 2. 図７は、比較例において、ＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦの測定値を用いた検量線のグラフである。FIG. 7 is a graph of a calibration curve using measured values of human VEGF by ELISA in a comparative example. 図８は、配列番号４の塩基配列からなる核酸アプタマーの推定二次構造を示す模式図である。FIG. 8 is a schematic diagram showing the predicted secondary structure of the nucleic acid aptamer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4.

本発明の検出方法は、前述のように、検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする。 As described above, the detection method of the present invention includes a detection target in a sample, a primary reagent that can bind to the detection target, and a secondary that can bind to the detection target at a site different from the primary reagent. A complex forming step for forming a complex with the reagent;
A binding step of binding a nucleic acid aptamer capable of binding to the secondary reagent to the secondary reagent in the complex;
An amplification step of amplifying by a nucleic acid amplification method using the nucleic acid aptamer bound to the secondary reagent as a template, and
The method includes a detection step of detecting the detection target by detecting an amplification product of the nucleic acid aptamer.

本発明においては、前記検出対象物に結合した前記二次試薬に、前記核酸アプタマーを結合させ、前記核酸アプタマーの増幅によって検出対象物を検出することがポイントである。したがって、検出対象物の種類、一次試薬および二次試薬の種類、核酸アプタマーの種類は、何ら制限されない。   In the present invention, the point is that the nucleic acid aptamer is bound to the secondary reagent bound to the detection target, and the detection target is detected by amplification of the nucleic acid aptamer. Therefore, the type of detection target, the type of primary reagent and secondary reagent, and the type of nucleic acid aptamer are not limited at all.

本発明の検出方法において、前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は一次抗体であることが好ましく、また、前記検出対象物が抗体の場合、前記一次試薬は一次抗原であることが好ましい。   In the detection method of the present invention, when the detection target is an antigen, the primary reagent is preferably a primary antibody, and when the detection target is an antibody, the primary reagent is preferably a primary antigen. .

本発明の検出方法において、前記二次試薬は二次抗体であることが好ましい。   In the detection method of the present invention, the secondary reagent is preferably a secondary antibody.

本発明の検出方法において、前記一次試薬は、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましい。   In the detection method of the present invention, the primary reagent is preferably an immobilized reagent immobilized on a solid phase.

本発明の検出方法において、前記固相は、プレートまたはビーズであることが好ましい。   In the detection method of the present invention, the solid phase is preferably a plate or a bead.

本発明の検出方法は、前記増幅工程に先立って、さらに、前記複合体における前記二次試薬に未結合の核酸アプタマーを除去する工程を含むことが好ましい。   Prior to the amplification step, the detection method of the present invention preferably further includes a step of removing a nucleic acid aptamer unbound to the secondary reagent in the complex.

本発明の検出方法において、前記複合体形成工程は、前記一次試薬に、前記検出対象物を反応させる工程と、前記検出対象物に、前記二次試薬を反応させる工程とを含むことが好ましく、前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程の後に、前記検出対象物に、前記二次試薬を反応させる工程を行うことが好ましい。   In the detection method of the present invention, the complex formation step preferably includes a step of reacting the detection target with the primary reagent and a step of reacting the secondary reagent with the detection target. It is preferable that after the step of reacting the detection target with the primary reagent, the step of reacting the secondary reagent with the detection target.

本発明の検出方法において、前記アプタマーは、イムノグロブリンＧに結合可能なアプタマーであることが好ましく、前記イムノグロブリンＧは、ウサギ由来イムノグロブリンＧであることが好ましい。   In the detection method of the present invention, the aptamer is preferably an aptamer capable of binding to immunoglobulin G, and the immunoglobulin G is preferably rabbit-derived immunoglobulin G.

本発明の検出方法において、前記核酸は、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましく、また、配列番号３および配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましい。   In the detection method of the present invention, the nucleic acid preferably has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. It is preferable to have.

本発明の検出方法において、前記核酸増幅方法は、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）であることが好ましい。   In the detection method of the present invention, the nucleic acid amplification method is preferably a polymerase chain reaction method (PCR method).

以下に、本発明の検出方法について詳細に説明する。   Below, the detection method of this invention is demonstrated in detail.

本発明において、「結合」とは、例えば、会合、吸着等の意味も含む。また、「ポリヌクレオチド」とは、例えば、オリゴヌクレオチドの意味も含む。   In the present invention, “binding” includes, for example, the meanings of association, adsorption and the like. “Polynucleotide” also includes, for example, the meaning of oligonucleotide.

（核酸アプタマー）
前記核酸アプタマーとは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子であり、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸や、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。前記核酸アプタマーが、後者の二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造としては、例えば、ステムループ構造があげられる。 (Nucleic acid aptamer)
The nucleic acid aptamer is a nucleic acid molecule that can specifically bind to a specific target substance. For example, single-stranded nucleic acid such as single-stranded RNA and single-stranded DNA, double-stranded RNA and double-stranded DNA. And the like. When the nucleic acid aptamer is the latter double-stranded nucleic acid, it is preferably made into a single strand by denaturation or the like before use, for example. The nucleic acid aptamer may have, for example, a secondary structure by self-annealing, and examples of the secondary structure include a stem-loop structure.

本発明において、前記核酸アプタマーは、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよい。合成方法は、何ら制限されず、例えば、ＤＮＡ合成機やＲＮＡ合成機により、ｄＮＴＰ等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記核酸アプタマーとしては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等があげられ、また、例えば、ＰＮＡ等のペプチド核酸を含んでもよい。前記核酸アプタマーは、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然核酸（非人工核酸）を含んでもよいし、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等の人工核酸を含んでもよい。   In the present invention, the nucleic acid aptamer may be, for example, a naturally derived nucleic acid sequence or a synthesized nucleic acid sequence. The synthesis method is not limited at all, and examples thereof include a method of chemically synthesizing from a terminal base using dNTP or the like as a material with a DNA synthesizer or an RNA synthesizer. Examples of the nucleic acid aptamer include DNA and RNA, and may include a peptide nucleic acid such as PNA. The nucleic acid aptamer may include, for example, natural nucleic acids (non-artificial nucleic acids) such as A, C, G, T, and U, 2′-fluorouracil, 2′-aminouracil, 2′-O-methyluracil, An artificial nucleic acid such as 2-thiouracil may be included.

本発明において、前記核酸アプタマーは、前述のように、前記二次試薬に特異的に結合できればよいが、特に、前記一次試薬および検出対象物よりも、前記二次試薬に特異的に結合できることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、前記二次試薬の種類に応じて適宜調製できる。   In the present invention, the nucleic acid aptamer only needs to be able to specifically bind to the secondary reagent as described above. In particular, the nucleic acid aptamer can specifically bind to the secondary reagent rather than the primary reagent and the detection target. preferable. The nucleic acid aptamer can be appropriately prepared according to, for example, the type of the secondary reagent.

前記核酸アプタマーの前記二次試薬に対する結合力は、特に制限されないが、例えば、解離定数（ＫＤ）が、１０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、特に好ましくは１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。 The binding force of the nucleic acid aptamer to the secondary reagent is not particularly limited. For example, the dissociation constant (K D ) is preferably 10 μmol / L or less, more preferably 100 nmol / L or less, and particularly preferably. Is 1 nmol / L or less.

前記核酸アプタマーが結合する前記二次試薬の種類は、特に制限されないが、後述するように、例えば、抗体が好ましい。前記抗体としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の各種サブクラス（アイソタイプ）のイムノグロブリン（Ｉｇ）があげられる。また、前記抗体は、例えば、抗原を特異的に認識する、抗体の一部分または部分断片（以下、「抗体の機能的断片」ともいう）であってもよく、前記各種Ｉｇを酵素処理して得られる活性フラグメントがあげられる。前記活性フラグメントとしては、例えば、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、およびこれらの重合体等があげられる。前記抗体は、その由来も特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラクダ、ロバ、ハムスター、モルモット等の哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等があげられる。 The type of the secondary reagent to which the nucleic acid aptamer binds is not particularly limited. For example, an antibody is preferable as described later. Examples of the antibody include immunoglobulins (Ig) of various subclasses (isotypes) such as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. The antibody may be, for example, a part or partial fragment of an antibody that specifically recognizes an antigen (hereinafter also referred to as “functional fragment of an antibody”), and is obtained by enzymatic treatment of the various Igs. Active fragments. Examples of the active fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, disulfide bond Fv, single chain Fv, and polymers thereof. The origin of the antibody is not particularly limited, for example, mammals such as human, rabbit, rat, mouse, goat, sheep, horse, pig, camel, donkey, hamster, guinea pig, chicken, pigeon, duck, quail, etc. Of birds.

前記核酸アプタマーが結合する前記二次抗体における結合部位は、特に制限されないが、例えば、Ｉｇの定常領域（Ｃ領域）内が好ましく、前記定常領域としては、例えば、可変領域（Ｖ領域）以外のＦａｂ領域やＦｃ領域等があげられる。前記定常領域は、例えば、Ｉｇのクラスごと、および、Ｉｇの由来生物ごとで、構造が類似している。したがって、具体例として、前記ウサギ由来ＩｇＧに結合可能な核酸アプタマーは、例えば、前記二次抗体における結合部位が定常領域であれば、異なる検出対象抗原に対する二次抗体であっても、同じ核酸アプタマーの使用が可能である。このため、検出対象物の種類ごとに、例えば、二次抗体だけでなく、核酸アプタマーを準備することが不要であり、より一層簡便、低コスト化を実現し、汎用性の高い検出が可能となる。なお、前記核酸アプタマーが結合する二次抗体は、一方で、検出対象物に特異的に結合可能であることが必要である。そこで、前記検出対象物が結合する前記二次抗体における結合部位は、例えば、Ｉｇの可変領域（Ｖ領域）内であることが好ましい。   The binding site in the secondary antibody to which the nucleic acid aptamer binds is not particularly limited. For example, the constant region (C region) of Ig is preferable, and the constant region is, for example, other than the variable region (V region). Examples include Fab region and Fc region. The constant region has a similar structure, for example, for each Ig class and each Ig-derived organism. Therefore, as a specific example, the nucleic acid aptamer capable of binding to the rabbit-derived IgG is, for example, the same nucleic acid aptamer even if it is a secondary antibody against a different detection target antigen if the binding site in the secondary antibody is a constant region. Can be used. For this reason, for example, it is not necessary to prepare not only a secondary antibody but also a nucleic acid aptamer for each type of detection target, and it is possible to realize a simpler, lower cost and highly versatile detection. Become. On the other hand, the secondary antibody to which the nucleic acid aptamer binds needs to be able to specifically bind to the detection target. Therefore, the binding site of the secondary antibody to which the detection target binds is preferably within, for example, an Ig variable region (V region).

前記核酸アプタマーの具体例を以下に例示するが、これらの例示によって、本発明は、何ら制限されない。前記二次試薬が、ウサギ由来のＩｇＧの場合、前記核酸アプタマーとしては、例えば、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を含む核酸があげられる。配列番号１および配列番号２の塩基配列において、両配列の異なる塩基のみに下線を付した。
（配列番号１）
5’- uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc‐3’
（配列番号２）
5’- uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac‐3’ Although the specific example of the said nucleic acid aptamer is illustrated below, this invention is not restrict | limited at all by these illustrations. When the secondary reagent is rabbit-derived IgG, examples of the nucleic acid aptamer include a nucleic acid containing a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. In the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, only the different bases of both sequences are underlined.
(SEQ ID NO: 1)
5'- uucgauacgc cgugggguga cguuggcu g c-3 '
(SEQ ID NO: 2)
5'- uucgauacgc cgugggguga cguuggcu a c-3 '

また、前記核酸アプタマーとしては、前記配列番号１で表される塩基配列を含む核酸として、配列番号３で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸、前記配列番号２で表わされる塩基配列を含む核酸として、配列番号４で表わされる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。下記配列番号３および配列番号４の塩基配列において、下線部は、それぞれ、前記配列番号１および配列番号２の塩基配列に相当する。また、下記配列４に示す核酸アプタマーの推定二次構造を、図８に示す。
（配列番号３）
5’- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc ccuuuccucu cuccuccuuc uucu‐3’
（配列番号４）
5’- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac ccuuuccucu cuccuccuuc uucu‐3’ The nucleic acid aptamer includes a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid comprising the base sequence, and a base represented by SEQ ID NO: 2. Examples of the nucleic acid containing the sequence include the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 4 or the nucleic acid containing the base sequence. In the base sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, the underlined portions correspond to the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. In addition, the predicted secondary structure of the nucleic acid aptamer shown in the following sequence 4 is shown in FIG.
(SEQ ID NO: 3)
5'- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc ccuuuccucu cuccuccuuc uucu-3 '
(SEQ ID NO: 4)
5'- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac ccuuuccucu cuccuccuuc uucu-3 '

これらの他に、前記核酸アプタマーとしては、例えば、下記配列番号５〜９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列または前記塩基配列を含む核酸があげられる。下記配列番号５の塩基配列において、下線部は、前記配列番号１の塩基配列に相当する。なお、これらの配列番号１〜９の塩基配列において、ＵはＴであってもよい。
（配列番号５）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaaga aguucgauac gccguggggu gacguuggcu gcccuuuccu cucuccuccu ucuucu‐3’
（配列番号６）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu uuuuaaaccg cgccuuggaa gcguacguug gccuuuccuc ucuccuccuu cuucu‐3’
（配列番号７）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc aaauugccgg gccuuggaag ccaagucgcu uuccucucuc cuccuucuuc u‐3’
（配列番号８）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc gcaagccggc ccuuggaagg cuagucgguc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3’
（配列番号９）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu ucgauacgcc guggggugac guuggcuacc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3’ In addition to these, examples of the nucleic acid aptamer include a base sequence represented by at least one sequence number selected from the group consisting of the following SEQ ID NOs: 5 to 9, or a nucleic acid containing the base sequence. In the base sequence of SEQ ID NO: 5, the underlined portion corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 1. In these base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9, U may be T.
(SEQ ID NO: 5)
5'-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaaga ag uucgauac gccguggggu gacguuggcu gc ccuuuccu cucuccuccu ucuucu-3 '
(SEQ ID NO: 6)
5'-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu uuuuaaaccg cgccuuggaa gcguacguug gccuuuccuc ucuccuccuu cuucu-3 '
(SEQ ID NO: 7)
5'-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc aaauugccgg gccuuggaag ccaagucgcu uuccucucuc cuccuucuuc u-3 '
(SEQ ID NO: 8)
5'-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc gcaagccggc ccuuggaagg cuagucgguc uuuccucucu ccuccuucuu cu-3 '
(SEQ ID NO: 9)
5'-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu ucgauacgcc guggggugac guuggcuacc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3 '

前記ウサギ由来ＩｇＧに対する核酸アプタマーは、例えば、前記ウサギＩｇＧに特異的に結合可能である限りにおいて、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなる核酸であってもよい。置換、付加、挿入もしくは欠失した前記塩基の数は、例えば、数個、好ましくは、１個〜２０個の範囲である。また、前記核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、前記各塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。また、前記核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、前記各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であってもよい。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。   The nucleic acid aptamer for the rabbit-derived IgG is, for example, a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NOs: (1) to (9) or a nucleic acid comprising the base sequence as long as it can specifically bind to the rabbit IgG. It may be a nucleic acid having a base sequence in which one or several bases are substituted, added, inserted or deleted. The number of the substituted, added, inserted or deleted bases is, for example, several, preferably in the range of 1 to 20. The nucleic acid aptamer is, for example, a nucleic acid consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: (1) to (9) or a nucleic acid containing the base sequence, and a base sequence having 60% or more homology with each base sequence. Or a nucleic acid. The homology is, for example, 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more. The homology can be calculated, for example, by calculating under default conditions using BLAST or the like. The nucleic acid aptamer is, for example, a nucleic acid sequence that hybridizes with each of the nucleotide sequences under stringent conditions in a nucleic acid comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: (1) to (9) or a nucleic acid containing the nucleotide sequence. The nucleic acid which consists of may be sufficient. “Hybridize under stringent conditions” is, for example, well-known experimental conditions for hybridization in those skilled in the art. Specifically, “stringent conditions” refers to, for example, hybridization at 60 to 68 ° C. in the presence of 0.7 to 1 mol / L NaCl, and then 0.1 to 2 times the SSC solution. Used refers to conditions that can be identified by washing at 65-68 ° C. 1 × SSC consists of 150 mmol / L NaCl and 15 mmol / L sodium citrate.

また、前記ウサギ由来ＩｇＧに対する核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸と、実質的に同一な推定構造または構造モチーフを有する核酸であってもよい。前記「実質的な推定構造または構造モチーフを有する」とは、例えば、核酸の二次構造および二次構造のモチーフを予測するプログラムを使用し、複数の配列を含む配列群に見出される一定の同一性を有することを意味する。一定の同一性とは、例えば、配列間の相同性が７０以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上であり、特に好ましくは９９％以上である。前記プログラムとしては、例えば、Ｚｕｋｅｒｆｏｌｄプログラム等があげられる。   In addition, the nucleic acid aptamer for the rabbit-derived IgG has a deduced structure or a structural motif substantially the same as, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence of SEQ ID NOs: (1) to (9) or a nucleic acid containing the base sequence. It may be a nucleic acid. The term “having a substantial putative structure or structural motif” means, for example, a certain identity that is found in a sequence group including a plurality of sequences by using a program that predicts a secondary structure of a nucleic acid and a motif of a secondary structure. It means having sex. For example, the homology between sequences is preferably 70 or more, more preferably 80% or more, 90% or more, and 95% or more, and particularly preferably 99% or more. Examples of the program include a Zukerfold program.

前記核酸アプタマーの製造方法は、特に制限されず、例えば、公知のＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等があげられる。   The method for producing the nucleic acid aptamer is not particularly limited, and examples thereof include a known SELEX (Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) method.

ＳＥＬＥＸ法による核酸アプタマーの調製は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、複数の核酸を含む核酸プールを準備し、前記核酸ライブラリーと標的物質である二次試薬とを結合（会合）させ、前記核酸プールと前記二次試薬との複合体を形成する。そして、前記複合体から、前記複合体の形成に関与した核酸プローブのみを回収することにより、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製できる。以下に、一例として、ＳＥＬＥＸ法を用いて、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製する方法をあげるが、本発明は、これらには何ら制限されない。   The preparation of the nucleic acid aptamer by the SELEX method is not particularly limited, but can be performed, for example, as follows. First, a nucleic acid pool containing a plurality of nucleic acids is prepared, and the nucleic acid library and a secondary reagent as a target substance are bound (associated) to form a complex of the nucleic acid pool and the secondary reagent. Then, by collecting only the nucleic acid probe involved in the formation of the complex from the complex, a nucleic acid aptamer that can specifically bind to the secondary reagent can be prepared. As an example, a method for preparing a nucleic acid aptamer that can specifically bind to the secondary reagent using the SELEX method will be described below, but the present invention is not limited thereto.

前記核酸プールとは、例えば、ランダム領域を有する核酸のライブラリー（混合物）である。前記ライブラリーにおける前記核酸は、例えば、ＲＮＡやＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記ランダム領域とは、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、および、ＵまたはＴの塩基をランダムに連結した領域であり、その長さは、例えば、２０〜１２０ｍｅｒである。前記核酸プールは、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２種類）の核酸を含むことが好ましく、より好ましくは、４３０〜４６０種類（約１０１８〜１０３６種類）である。 The nucleic acid pool is, for example, a library (mixture) of nucleic acids having random regions. Examples of the nucleic acid in the library include polynucleotides such as RNA and DNA. The random region is, for example, a region in which bases of A, G, C, and U or T are randomly connected, and the length thereof is, for example, 20 to 120 mer. The nucleic acid pool preferably includes, for example, 4 20 to 4 120 types (about 10 12 to 10 72 types) of nucleic acids, and more preferably 4 30 to 4 60 types (about 10 18 to 10 36 types) is there.

前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記ランダム領域を有していればよく、その他の構造は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドは、前記ランダム領域に加えて、例えば、前記ランダム領域の５’末端および３’末端の少なくとも一方に、後述する核酸増幅で利用するプライマー領域、ポリメラーゼが認識するポリメラーゼ認識領域等を有することが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、アプタマー調製における後述の核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、前記ポリメラーゼの認識領域は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識領域であるＴ７プロモーター等があげられる。前記ＲＮＡプールの具体例としては、例えば、５’末端側から、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と前記プライマー領域（以下、「５’末端側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で連結し、前記５’末端側プライマー領域の３’末端側に、前記ランダム領域を連結し、さらに、前記ランダム領域の３’末端側にプライマー領域（以下、「３’末端側プライマー領域」ともいう）を連結した構造があげられる。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー領域とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、さらに、標的物質である二次試薬への結合を補助する領域を有してもよい。また、前記核酸プールに含まれるポリヌクレオチドは、それぞれ、異なるランダム領域を有してもよいし、一部の配列が共通するランダム領域を有してもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各領域は、例えば、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。   The polynucleotide included in the nucleic acid pool may have, for example, the random region, and other structures are not particularly limited. In addition to the random region, the polynucleotide has, for example, at least one of the 5 ′ end and the 3 ′ end of the random region, a primer region used for nucleic acid amplification described later, a polymerase recognition region recognized by a polymerase, and the like. It is preferable. The polymerase recognition region can be appropriately determined according to, for example, the type of polymerase used in nucleic acid amplification described later in aptamer preparation. When the nucleic acid pool is an RNA pool, the polymerase recognition region is preferably, for example, a DNA-dependent RNA polymerase recognition region (hereinafter also referred to as “RNA polymerase recognition region”), and specific examples include T7 RNA polymerase recognition region. Examples of the region include the T7 promoter. As a specific example of the RNA pool, for example, from the 5 ′ end side, the RNA polymerase recognition region and the primer region (hereinafter also referred to as “5 ′ end side primer region”) are linked in this order, The random region was linked to the 3 ′ end side of the 5 ′ end side primer region, and the primer region (hereinafter also referred to as “3 ′ end side primer region”) was linked to the 3 ′ end side of the random region. Structure. The 5 ′ terminal primer region in the RNA is, for example, a sequence complementary to the 3 ′ end of a DNA antisense strand synthesized using the RNA as a template, that is, bound to the 3 ′ end of the antisense strand. The sequence is preferably the same as possible primers. In addition, the RNA pool may further include a region that assists in binding to a secondary reagent that is a target substance, for example. In addition, the polynucleotides contained in the nucleic acid pool may have different random regions, or may have random regions that share some sequences. In the polynucleotide, the regions may be directly adjacent to each other, for example, or may be indirectly adjacent via an intervening sequence.

前記核酸プールの調製方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＤＮＡを含む初期プールを使用し、前記ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、核酸プールのＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記ＤＮＡを含む初期プールとしては、例えば、前記ＲＮＡプールにおける前記ランダム領域の相補鎖のＵをＴに置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記ランダム領域のＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。この初期プールのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製できる。   The method for preparing the nucleic acid pool is not particularly limited, and a known method can be adopted. When the nucleic acid pool is an RNA pool, for example, an initial pool containing DNA can be used and the DNA can be prepared as a template. Hereinafter, a DNA strand that serves as a template for RNA in a nucleic acid pool is also referred to as an antisense strand, and a DNA strand having a sequence in which U of the RNA is replaced with T is also referred to as a sense strand. The initial pool containing the DNA has, for example, DNA (antisense strand) in which the U of the random region in the RNA pool is replaced with T (antisense strand), and a sequence in which the U in the random region is replaced with T It is preferable that any one of DNA (sense strand) is included. After performing nucleic acid amplification using DNA of this initial pool as a template and using DNA-dependent DNA polymerase, transcription reaction using DNA-dependent RNA polymerase is performed using the obtained DNA amplification product as a template. Nucleic acid pools can be prepared.

また、前記ランダム領域のＵをＴに置換したＤＮＡを含む初期プールを準備し、これを鋳型として、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、前記５’末端側プライマー領域に相補的な配列とを含むプライマーをアニーリングさせ、核酸増幅を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製することもできる。   In addition, an initial pool containing DNA in which U in the random region is replaced with T is prepared, and using this as a template, a primer containing the RNA polymerase recognition region and a sequence complementary to the 5′-end primer region A nucleic acid pool of RNA can also be prepared by annealing and nucleic acid amplification.

そして、前記核酸プールと標的物質とを反応させ、前記核酸と前記標的物質との複合体を形成する。本発明においては、前記核酸アプタマーとして、前記二次試薬に特異的に結合する核酸アプタマーを使用することから、前記標識物質は、二次試薬が好ましい。前記アプタマーの調製において、前記核酸プールと反応させる前記二次試薬は、例えば、二次試薬そのものであってもよいし、二次試薬の分解物であってもよい。具体例としては、前記二次試薬が、後述するような抗体の場合、例えば、Ｉｇ等の抗体そのものであってもよいし、前記各種Ｉｇを酵素処理して得られる、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の前記Ｉｇの活性フラグメント等であってもよい。前記核酸プールと前記二次試薬との結合形式は、特に制限されず、例えば、水素結合等の分子間力等があげられる。前記核酸プールと前記二次試薬との結合処理は、例えば、前記両者を溶媒中で一定期間インキュベートする方法があげられる。前記溶媒としては、特に制限されないが、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、例えば、各種緩衝液があげられる。 Then, the nucleic acid pool and the target substance are reacted to form a complex of the nucleic acid and the target substance. In the present invention, since the nucleic acid aptamer that specifically binds to the secondary reagent is used as the nucleic acid aptamer, the labeling substance is preferably a secondary reagent. In the preparation of the aptamer, the secondary reagent to be reacted with the nucleic acid pool may be, for example, the secondary reagent itself or a degradation product of the secondary reagent. As a specific example, when the secondary reagent is an antibody as described later, for example, an antibody such as Ig itself may be used, or Fab, Fab ′, F obtained by enzymatic treatment of the various Igs. (Ab ′) 2 may be an active fragment of the Ig. The binding format between the nucleic acid pool and the secondary reagent is not particularly limited, and examples thereof include intermolecular forces such as hydrogen bonding. Examples of the binding treatment between the nucleic acid pool and the secondary reagent include a method of incubating the both in a solvent for a certain period of time. The solvent is not particularly limited, but is preferably one that retains the binding between the two, and examples thereof include various buffer solutions.

続いて、前記核酸プールと標的物質との複合体を回収する。なお、前記複合体形成のために前記両者を反応させた反応液には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない核酸プール（以下、「未反応核酸プール」という）が含まれる。このため、例えば、前記反応液から、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを、分離することが好ましい。前記分離方法としては、特に制限されないが、例えば、前記標的物質と前記核酸プールとの吸着性の違いや、前記複合体と前記核酸プールとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。   Subsequently, the complex of the nucleic acid pool and the target substance is recovered. In addition, in the reaction solution obtained by reacting the two for forming the complex, in addition to the complex, for example, a nucleic acid pool that does not participate in the complex formation (hereinafter referred to as “unreacted nucleic acid pool”). included. Therefore, for example, it is preferable to separate the complex and the unreacted nucleic acid pool from the reaction solution. The separation method is not particularly limited, and examples thereof include a method using a difference in adsorptivity between the target substance and the nucleic acid pool and a method using a difference in molecular weight between the complex and the nucleic acid pool.

前者の吸着性の違いを利用する方法としては、例えば、以下の方法が例示できる。すなわち、まず、前記標的物質に吸着性を有する担体と、前記複合体を含む前記反応液とを接触させる。この際、前記未反応核酸プールは、前記担体に吸着せず、他方、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体は、前記担体に吸着する。これによって、前記未反応核酸プールと前記複合体とを分離することができる。そして、前記未反応核酸プールを除去後、前記担体に吸着した前記複合体を回収すればよい。また、前記担体から前記複合体を回収する前に、例えば、前記未反応核酸プールを十分に除去するため、前記担体を洗浄することが好ましい。前記標的物質に吸着性を有する担体としては、特に制限されず、例えば、標的物質である二次試薬の種類に応じて適宜選択できる。前記標的物質である二次試薬が、例えば、抗体等のタンパク質の場合、前記吸着性を有する担体としては、例えば、ニトロセルロース膜等があげられる。   Examples of the method using the former difference in adsorptivity include the following methods. That is, first, a carrier having adsorptivity to the target substance is brought into contact with the reaction solution containing the complex. At this time, the unreacted nucleic acid pool is not adsorbed on the carrier, while the complex of the target substance and the nucleic acid pool is adsorbed on the carrier. Thereby, the unreacted nucleic acid pool and the complex can be separated. Then, after removing the unreacted nucleic acid pool, the complex adsorbed on the carrier may be recovered. Moreover, before recovering the complex from the carrier, for example, it is preferable to wash the carrier in order to sufficiently remove the unreacted nucleic acid pool. The carrier having adsorptivity to the target substance is not particularly limited, and can be appropriately selected according to, for example, the type of secondary reagent that is the target substance. When the secondary reagent as the target substance is, for example, a protein such as an antibody, examples of the adsorptive carrier include a nitrocellulose membrane.

後者の分子量の違いを利用する方法としては、例えば、担体を使用する方法が例示できる。前記担体としては、例えば、前記核酸プールが通過し且つ前記複合体が通過できないようなサイズのポアを有する担体があげられる。このような担体を利用して、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを分離できる。前記分離は、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気的な分離であってもよい。   Examples of the method using the latter difference in molecular weight include a method using a carrier. Examples of the carrier include a carrier having a pore of a size that allows the nucleic acid pool to pass through and the complex cannot pass through. By using such a carrier, the complex and the unreacted nucleic acid pool can be separated. The separation may be electrical separation using, for example, an agarose gel or a polyacrylamide gel.

この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化した二次試薬を使用する方法もあげられる。すなわち、前記二次試薬を予め担体に固定化し、前記担体と前記核酸プールとを接触させ、前記固定化二次試薬と核酸プールとの複合体を形成させる。そして、前記固定化二次試薬に結合していない未反応の核酸プールを除去した後、前記担体から、前記二次試薬と前記核酸プールとの複合体を解離させればよい。前記二次試薬の担体への固定化方法は、何ら制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、前記二次試薬にタグを結合しておき、前記タグとの結合基を有する担体に、前記タグを結合した二次試薬を接触させる方法があげられる。前記タグとしては、例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ等があげられ、前記結合基としては、例えば、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）等の金属イオンがあげられる。前記担体の具体例としては、例えば、前記金属イオンをベースとするＮｉ−アガロース、Ｎｉ−セファロース等があげられる。 In addition to this, for example, a method of using a secondary reagent immobilized on a carrier at the time of forming the complex can be mentioned. That is, the secondary reagent is immobilized on a carrier in advance, the carrier and the nucleic acid pool are brought into contact with each other, and a complex of the immobilized secondary reagent and the nucleic acid pool is formed. Then, after removing the unreacted nucleic acid pool not bound to the immobilized secondary reagent, the complex of the secondary reagent and the nucleic acid pool may be dissociated from the carrier. The method for immobilizing the secondary reagent on the carrier is not limited at all, and a known method can be adopted. Specific examples include a method in which a tag is bound to the secondary reagent, and the secondary reagent bound to the tag is brought into contact with a carrier having a binding group with the tag. Examples of the tag include His-tag, and examples of the binding group include metal ions such as nickel ions (Ni 2+ ) and cobalt ions (Co 2+ ). Specific examples of the carrier include Ni-agarose and Ni-Sepharose based on the metal ions.

つぎに、回収した前記複合体から、前記複合体形成に関与した核酸プールを回収する。前記複合体形成に関与した核酸プールは、例えば、前記複合体について、前記標的物質と核酸プールとの結合を解除することによって回収できる。   Next, the nucleic acid pool involved in the complex formation is recovered from the recovered complex. The nucleic acid pool involved in the complex formation can be recovered, for example, by releasing the binding between the target substance and the nucleic acid pool for the complex.

続いて、回収した前記複合体形成に関与した核酸プールについて、核酸増幅を行う。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、核酸プールの種類に応じて、公知の方法により行うことができる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られた増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの転写を行うことができる。これによって、前述の前記複合体形成に関与したＲＮＡプールの増幅を行うことができる。   Subsequently, nucleic acid amplification is performed on the collected nucleic acid pool involved in the complex formation. The nucleic acid amplification method is not particularly limited, and can be performed by a known method, for example, depending on the type of the nucleic acid pool. When the nucleic acid pool is an RNA pool, for example, cDNA is prepared by a reverse transcription reaction using an RNA-dependent DNA polymerase, DNA nucleic acid amplification is performed by PCR or the like using the cDNA as a template, and the obtained amplification product is used as a template. In addition, RNA can be transcribed using a DNA-dependent RNA polymerase. As a result, the RNA pool involved in the complex formation described above can be amplified.

前記ＲＮＡプールが、例えば、前述のように、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域、前記５’末端側プライマー領域、前記ランダム領域および前記３’末端側プライマー領域を有する場合、これらの領域を利用する増幅方法があげられる。前記ＲＮＡを鋳型として前記ｃＤＮＡを調製するための逆転写反応では、例えば、プライマーとして、前記ＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、前記ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡの増幅には、例えば、プライマーとして、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。得られたＤＮＡの増幅産物を鋳型とするＲＮＡの増幅には、前記ＤＮＡ増幅産物を鋳型として、前記ＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域および３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う。この際、プライマーとしては、例えば、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。そして、得られた増幅産物を鋳型として、前記増幅産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応を行うことによって、前記複合体形成に関与するＲＮＡプールの核酸増幅を行うことができる。増幅産物のうち、例えば、アンチセンス鎖のＤＮＡは、その３’末端側に、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有するため、この領域に前記ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが結合し、前記アンチセンス鎖を鋳型として、前記ＲＮＡを合成できる。前記逆転写反応に使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されないが、例えば、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等が使用できる。   For example, as described above, when the RNA pool has the RNA polymerase recognition region, the 5′-end primer region, the random region, and the 3′-end primer region, an amplification method using these regions can be used. can give. In the reverse transcription reaction for preparing the cDNA using the RNA as a template, for example, it is preferable to use a polynucleotide containing a sequence complementary to the 3'-end primer region of the RNA pool as a primer. For amplification of DNA using the cDNA as a template, for example, as a primer, a polynucleotide containing the 5′-end primer region and a polynucleotide containing a complementary strand of the 3′-end primer region are used. It is preferable. The former polynucleotide preferably further has, for example, the RNA polymerase recognition region on the 5 'end side and the 5' end side primer region on the 3 'side. For amplification of RNA using the obtained DNA amplification product as a template, the DNA amplification product is used as a template and the 5′-end primer region and the 3′-end primer region contained in the DNA are used. Nucleic acid amplification such as PCR is performed using a sex DNA polymerase. In this case, it is preferable to use, for example, a polynucleotide containing the 5'-end primer region and a polynucleotide containing a complementary strand of the 3'-end primer region. The former polynucleotide preferably further has, for example, the RNA polymerase recognition region on the 5 'end side and the 5' end side primer region on the 3 'side. Then, using the obtained amplification product as a template, using the RNA polymerase recognition region contained in the amplification product, a DNA-dependent RNA polymerase is used to perform an in vitro transcription reaction, thereby forming the complex. Nucleic acid amplification of RNA pools involved in Among the amplification products, for example, the antisense strand DNA has an RNA polymerase recognition region on the 3 ′ end side thereof, so that the DNA-dependent RNA polymerase binds to this region, and the antisense strand as a template, RNA can be synthesized. The RNA-dependent DNA polymerase used for the reverse transcription reaction is not particularly limited. For example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV Reverse Transscriptase) can be used.

なお、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法や、各種等温増幅法等が採用できる。また、その条件も、特に制限されない。   The nucleic acid amplification method is not particularly limited, and for example, a polymerase chain reaction (PCR) method, various isothermal amplification methods, and the like can be employed. Also, the conditions are not particularly limited.

このように、標的物質と複合体を形成した核酸プールを回収し、さらに、前述と同様にして、標的物質を用いた複合体の形成、複合体の回収、前記複合体形成に関与した核酸プールの分離、前記分離した核酸プールの増幅等を繰り返し行うことで、最終的に、標的物質である二次試薬に結合性を有する核酸アプタマーを得ることができる。   In this way, the nucleic acid pool that has formed a complex with the target substance is recovered, and in the same manner as described above, the formation of the complex using the target substance, the recovery of the complex, and the nucleic acid pool involved in the complex formation The nucleic acid aptamer having a binding property to the secondary reagent as the target substance can be finally obtained by repeatedly performing the separation of the above and the amplification of the separated nucleic acid pool.

（一次試薬および二次試薬）
本発明において、前述のように、前記一次試薬は、前記検出対象物と結合可能な試薬であり、前記二次試薬は、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な試薬である。前記一次試薬および二次試薬は、それぞれ前記検出対象物と結合可能であればよく、その種類は、何ら制限されない。また、前記検出対象物の種類も、何ら制限されない。 (Primary reagent and secondary reagent)
In the present invention, as described above, the primary reagent is a reagent capable of binding to the detection target, and the secondary reagent is a reagent capable of binding to the detection target at a site different from the primary reagent. is there. The primary reagent and the secondary reagent are only required to be able to bind to the detection target, and the types thereof are not limited at all. Further, the type of the detection object is not limited at all.

本発明において、前記検出対象物と前記一次試薬との組み合わせ、および、前記検出対象物と前記二次試薬との組み合わせは、それぞれ特に制限されず、前記検出対象物と前記一次試薬および前記二次試薬とがそれぞれ結合可能であればよい。このような結合可能な組合せとしては、特に制限されないが、例えば、抗原と抗体、リガンドとレセプター、レクチンとそのレセプター、レクチンと糖鎖等の組み合わせがあげられ、いずれが検出対象物であってもよく、いずれが前記一次試薬および二次試薬であってもよい。また、前記一次試薬および前記二次試薬は、例えば、非核酸物質であることが好ましい。これらの中でも、組み合わせとしては、抗原と抗体との組み合わせが好ましく、例えば、前記検出対象物と前記一次試薬、前記検出対象物と前記二次試薬とが、それぞれ、抗原抗体反応で結合し、前記複合体を形成することが好ましい。このように、抗原と抗体との組み合わせであれば、いわゆる抗原抗体反応に基づくサンドイッチ法を利用することができる。なお、抗原とは、例えば、抗体に結合可能な抗原性を有する物質である。このため、本発明における抗原は、例えば、他の抗体に結合可能な抗原性を有していれば、他の抗原に結合可能な抗体であってもよい。   In the present invention, the combination of the detection object and the primary reagent and the combination of the detection object and the secondary reagent are not particularly limited, and the detection object, the primary reagent, and the secondary reagent are not particularly limited. What is necessary is just to be able to couple | bond with a reagent, respectively. Such binding combinations are not particularly limited, and include, for example, a combination of an antigen and an antibody, a ligand and a receptor, a lectin and its receptor, and a lectin and a sugar chain. Any of these may be the primary reagent and the secondary reagent. The primary reagent and the secondary reagent are preferably non-nucleic acid substances, for example. Among these, as a combination, a combination of an antigen and an antibody is preferable, for example, the detection target and the primary reagent, the detection target and the secondary reagent are respectively bound by an antigen-antibody reaction, It is preferable to form a complex. Thus, if it is a combination of an antigen and an antibody, the sandwich method based on what is called an antigen antibody reaction can be utilized. In addition, an antigen is a substance which has the antigenic property which can be couple | bonded with an antibody, for example. For this reason, the antigen in the present invention may be, for example, an antibody capable of binding to another antigen as long as it has antigenicity capable of binding to another antibody.

前記検出対象物と前記一次試薬との組み合わせ、および、前記検出対象物と前記二次試薬との組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせの場合、前記一次試薬および前記二次試薬は、例えば、前記検出対象物の種類に応じて、以下の組み合わせがあげられる。前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は、前記検出対象物である前記抗原と結合可能な一次抗体が好ましく、前記二次試薬は、前記一次抗体とは別の部位で前記検出対象物である前記抗原と結合可能な二次抗体があげられる。一方、前記検出対象物が抗体の場合、前記一次試薬は、前記検出対象抗体と結合可能な一次抗原が好ましく、前記二次試薬は、前記検出対象抗体を抗原として結合可能な二次抗体があげられる。このような組合せによれば、例えば、前記検出対象物と前記一次試薬とが結合し、さらに、前記結合物における前記検出対象物に前記二次試薬が結合することで、複合体を形成できる。   When the combination of the detection target and the primary reagent, and the combination of the detection target and the secondary reagent are a combination of an antigen and an antibody, the primary reagent and the secondary reagent are, for example, Depending on the type of detection object, the following combinations can be mentioned. When the detection target is an antigen, the primary reagent is preferably a primary antibody capable of binding to the antigen that is the detection target, and the secondary reagent is the detection target at a site different from the primary antibody. And a secondary antibody capable of binding to the antigen. On the other hand, when the detection target is an antibody, the primary reagent is preferably a primary antigen that can bind to the detection target antibody, and the secondary reagent is a secondary antibody that can bind to the detection target antibody as an antigen. It is done. According to such a combination, for example, a complex can be formed by binding the detection target and the primary reagent, and further binding the secondary reagent to the detection target in the binding.

本発明において、前記抗原とは、例えば、ハプテン等の意味も含む。   In the present invention, the antigen includes the meaning of, for example, a hapten.

本発明において、前記抗体とは、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のＩｇがあげられる。また、本発明において、前記抗体は、例えば、前記Ｉｇには制限されず、例えば、Ｉｇを酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の活性フラグメントであってもよい。本発明において、前記抗体は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。 In the present invention, the antibody is not particularly limited, and examples thereof include IgG such as IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. In the present invention, the antibody is not limited to Ig, for example, and may be an active fragment such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 obtained by enzymatic treatment of Ig, for example. . In the present invention, the antibody may be, for example, one type or a combination of two or more types.

また、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。前記検出対象物が抗原の場合、例えば、検出精度を向上できることから、前記一次抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、前記二次抗体は、例えば、検出精度を向上できることから、モノクローナル抗体であることが好ましい。   The antibody may be, for example, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. When the detection target is an antigen, for example, the detection accuracy can be improved, so that the primary antibody is preferably a monoclonal antibody. The secondary antibody is preferably a monoclonal antibody because it can improve detection accuracy, for example.

前記一次抗体および二次抗体の調製方法は、特に制限されず、公知の方法があげられる。前記方法としては、例えば、動物への免疫感作を行う方法が一般的である。免疫感作させる宿主動物の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラクダ、ロバ、ハムスター、モルモット等の哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等が使用できる。また、前記宿主動物に対する抗原の投与方法も、特に制限されず、例えば、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が採用できる。そして、例えば、血清や腹水を回収することによって、目的の抗体を得ることができる。前記抗体は、例えば、前記血清や腹水をそのまま使用してもよいが、公知の方法により精製して使用することが好ましい。前記精製方法としては、特に制限されず、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウム等を用いる塩析法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、分子ふるいクロマトグラフィー法、電気泳動法等があげられる。   The method for preparing the primary antibody and the secondary antibody is not particularly limited, and examples thereof include known methods. As the method, for example, a method of immunizing animals is common. The type of host animal to be immunized is not particularly limited. For example, mammals such as humans, rabbits, rats, mice, goats, sheep, horses, pigs, camels, donkeys, hamsters, guinea pigs, chickens, pigeons, ducks Birds such as quail can be used. The method for administering the antigen to the host animal is not particularly limited, and for example, intradermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be employed. For example, the target antibody can be obtained by collecting serum or ascites. As the antibody, for example, the serum or ascites may be used as it is, but it is preferable to use the antibody after purification by a known method. The purification method is not particularly limited, and examples thereof include salting out method using sodium sulfate, ammonium sulfate, etc., gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method, molecular sieve chromatography method, electrophoresis method and the like. .

前記一次抗体または二次抗体としてポリクローナル抗体を調製する場合は、前述のような免疫感作を行うことが好ましい。他方、前記一次抗体または二次抗体としてモノクローナル抗体を調製する場合は、例えば、免疫した宿主動物における脾臓細胞やリンパ球様細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを融合してハイブリドーマを調製することが好ましい。そして、前記ハイブリドーマを増殖させ、特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。   When a polyclonal antibody is prepared as the primary antibody or secondary antibody, it is preferable to perform immunization as described above. On the other hand, when preparing a monoclonal antibody as the primary antibody or secondary antibody, for example, fusion of antibody producing cells such as spleen cells and lymphoid cells and myeloma cells (myeloma cells) in the immunized host animal. It is preferred to prepare hybridomas. A monoclonal antibody can be obtained by growing the hybridoma and isolating a hybridoma cell that produces an antibody having specificity.

前記一次試薬は、例えば、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましい。前記一次試薬を固定化することで、例えば、前記固定化された一次試薬に検出対象物を結合させた後、未反応の検出対象物の除去、不純物の除去、洗浄等が容易である。また、固定化された前記一次試薬に、さらに、前記二次試薬を結合させた後も、同様に、未反応の二次試薬の除去や洗浄が容易である。これによって、本発明の検出方法の精度を、さらに向上できる。   The primary reagent is preferably an immobilized reagent immobilized on a solid phase, for example. By immobilizing the primary reagent, for example, after the detection target is bound to the immobilized primary reagent, it is easy to remove the unreacted detection target, remove impurities, wash, and the like. Similarly, after the secondary reagent is further bound to the immobilized primary reagent, it is easy to remove and wash the unreacted secondary reagent. Thereby, the accuracy of the detection method of the present invention can be further improved.

前記固相の形態としては、特に制限されず、例えば、ウェルプレート、マイクロプレート等のプレート、セルロース膜等のメンブレン、フィルム、試験管やマイクロチューブ等のチューブ、マイクロスフェアやビーズ等の粒子等があげられる。   The form of the solid phase is not particularly limited, and examples thereof include plates such as well plates and microplates, membranes such as cellulose membranes, films, tubes such as test tubes and microtubes, and particles such as microspheres and beads. can give.

前記固相は、例えば、不溶性であることが好ましい。前記不溶性材料としては、特に制限されないが、例えば、有機樹脂材料、無機材料等があげられる。前記有機樹脂材料は、例えば、天然物でもよく、合成物でもよく、具体例としては、アガロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリフッ化ビニル、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、６−ナイロン、６，６−ナイロン、ラテックス等があげられる。前記無機材料としては、例えば、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂等があげられる。前記固相は、例えば、前記不溶性材料のいずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。   The solid phase is preferably insoluble, for example. The insoluble material is not particularly limited, and examples thereof include organic resin materials and inorganic materials. The organic resin material may be, for example, a natural product or a synthetic product. Specific examples include agarose, crosslinked agarose, crosslinked dextran, polyacrylamide, crosslinked polyacrylamide, cellulose, microcrystalline cellulose, crosslinked agarose, polystyrene, polyester. Polyethylene, polypropylene, ABS resin, polyvinyl fluoride, polyamine methyl vinyl ether-maleic acid copolymer, 6-nylon, 6,6-nylon, latex and the like. Examples of the inorganic material include glass, silica gel, diatomaceous earth, titanium dioxide, barium sulfate, zinc oxide, lead oxide, and silica sand. For example, the solid phase may include any one of the insoluble materials, or may include two or more types.

前記固相が前記粒子の場合、例えば、磁性粒子が好ましい。前記固相が磁性粒子であれば、例えば、磁力によって、固定化された前記一次試薬に前記検出対象物が結合した前記磁性粒子や、前記検出対象物にさらに前記二次試薬が結合した前記磁性粒子を、容易に回収できる。   When the solid phase is the particle, for example, a magnetic particle is preferable. When the solid phase is a magnetic particle, for example, the magnetic particle in which the detection target is bound to the immobilized primary reagent by magnetic force, or the magnetic in which the secondary reagent is further bound to the detection target. The particles can be easily recovered.

前記一次試薬は、例えば、前記固相に、直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。また、前記一次試薬の前記固相への固定化は、例えば、物理的な結合でも化学的な結合でもよく、具体例としては、吸着、共有結合等の化学結合等があげられる。   For example, the primary reagent may be directly or indirectly bound to the solid phase. The immobilization of the primary reagent on the solid phase may be, for example, physical bonding or chemical bonding, and specific examples include chemical bonding such as adsorption and covalent bonding.

前記固相への前記一次試薬の固定化方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記方法としては、例えば、前記一次試薬を含む液体に、前記固相を浸漬する方法があげられる。前記液体は、例えば、前記一次試薬を溶媒に、溶解、分散または懸濁することによって調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液、ホウ酸緩衝液等があげられる。前記一次試薬を含む液体のｐＨは、特に制限されないが、例えば、７〜１０であることが好ましく、より好ましくは９．５である。浸漬条件は、特に制限されないが、例えば、温度４〜３７℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。   A method for immobilizing the primary reagent on the solid phase is not particularly limited, and a known method can be employed. Examples of the method include a method of immersing the solid phase in a liquid containing the primary reagent. The liquid can be prepared, for example, by dissolving, dispersing or suspending the primary reagent in a solvent. Examples of the solvent include, but are not limited to, water, physiological saline, buffer, and the like. Examples of the buffer include phosphate buffer, Tris-HCl buffer, Good's buffer, boric acid, and the like. Examples include a buffer solution. The pH of the liquid containing the primary reagent is not particularly limited, but is preferably 7 to 10, for example, and more preferably 9.5. Although the immersion conditions are not particularly limited, for example, the temperature is 4 to 37 ° C, and preferably 25 to 37 ° C.

前記固相は、例えば、固定化させる一次試薬の種類に応じて、前記一次試薬を効率よく固定化するための前処理を施してもよい。前記前処理としては、例えば、前記一次試薬の官能基と結合可能な官能基を前記固相に付加する処理があげられる。また、前記一次試薬についても、例えば、前記固相の種類に応じて、効率良く固定化するための前処理を施してもよい。前記前処理としては、例えば、前記固相の官能基と結合可能な官能基を前記一次試薬に付加する処理があげられる。   For example, the solid phase may be subjected to pretreatment for efficiently immobilizing the primary reagent according to the type of the primary reagent to be immobilized. Examples of the pretreatment include a treatment of adding a functional group capable of binding to the functional group of the primary reagent to the solid phase. The primary reagent may also be subjected to pretreatment for efficient immobilization, for example, depending on the type of the solid phase. Examples of the pretreatment include a treatment of adding a functional group capable of binding to a functional group of the solid phase to the primary reagent.

また、前記固相は、例えば、前記一次試薬を固定化した後、必要に応じてブロッキング処理を施してもよい。前記固相の表面をブロッキング処理することによって、例えば、前記固相に対する前記二次試薬の非特異的な結合を抑制し、検出精度をさらに向上することができる。前記ブロッキングに使用する試薬は、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳等のブロッキング剤があげられる。   Further, the solid phase may be subjected to a blocking treatment as necessary after immobilizing the primary reagent, for example. By blocking the surface of the solid phase, for example, nonspecific binding of the secondary reagent to the solid phase can be suppressed, and detection accuracy can be further improved. The reagent used for the blocking is not particularly limited, and examples thereof include blocking agents such as bovine serum albumin, casein, and nonfat dry milk.

本発明においては、前記二次試薬としては、前述のＥＬＩＳＡ法やＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法とは異なり、例えば、未標識二次試薬が使用できる。このため、例えば、前記二次試薬の標識化処理や、未標識二次試薬と標識化二次試薬との分離等が不要である。これにより、例えば、より簡便な試薬調製が可能であり、未標識二次試薬の混在によるバックグラウンドの上昇を防止できる。   In the present invention, as the secondary reagent, unlike the above-described ELISA method or Immuno-PCR method, for example, an unlabeled secondary reagent can be used. For this reason, for example, the labeling process of the secondary reagent, the separation of the unlabeled secondary reagent and the labeled secondary reagent, and the like are unnecessary. Thereby, for example, simpler reagent preparation is possible, and an increase in background due to the mixing of unlabeled secondary reagents can be prevented.

（検出対象物）
本発明においては、前記一次試薬と検出対象物と二次試薬との複合体に前記核酸アプタマーを結合させ、その核酸増幅により、前記検出対象物を間接的に検出することが特徴である。このため、本発明において、前記検出対象物の種類は、何ら制限されず、例えば、イオン、低分子化合物、無機化合物、有機化合物、ホルモン、ペプチド、タンパク質、糖類、脂質、ウィルス、細菌、細胞、生体組織等があげられる。 (Detection target)
The present invention is characterized in that the nucleic acid aptamer is bound to a complex of the primary reagent, the detection target and a secondary reagent, and the detection target is indirectly detected by nucleic acid amplification. For this reason, in the present invention, the type of the detection target is not limited at all. For example, ions, low molecular compounds, inorganic compounds, organic compounds, hormones, peptides, proteins, saccharides, lipids, viruses, bacteria, cells, Examples thereof include living tissue.

（核酸増幅法）
本発明において、核酸増幅法は、何ら制限されず、前記核酸アプタマーを増幅できる方法が採用できる。前記核酸アプタマーが、例えば、ＲＮＡアプタマーの場合、前記ＲＮＡアプタマーを鋳型として、逆転写反応によりＤＮＡを合成し、前記ＤＮＡを鋳型として増幅する方法があげられる。また、前記核酸アプタマーが、例えば、ＤＮＡアプタマーの場合、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅する方法があげられる。前記核酸増幅法の具体例としては、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法や、等温増幅法等があげられる。また、前記核酸増幅反応の条件も何ら制限されない。 (Nucleic acid amplification method)
In the present invention, the nucleic acid amplification method is not limited at all, and a method capable of amplifying the nucleic acid aptamer can be employed. For example, when the nucleic acid aptamer is an RNA aptamer, a method of synthesizing DNA by reverse transcription reaction using the RNA aptamer as a template and amplifying the DNA using the DNA as a template can be mentioned. In addition, when the nucleic acid aptamer is, for example, a DNA aptamer, a method of amplifying using the DNA aptamer as a template can be mentioned. Specific examples of the nucleic acid amplification method include a polymerase chain reaction (PCR) method, a reverse transcription PCR (RT-PCR) method, and an isothermal amplification method. Further, the conditions for the nucleic acid amplification reaction are not limited at all.

つぎに、本発明の検出方法について、抗原抗体反応を利用する形態の例を以下に示す。なお、本発明は、これらには何ら制限されない。   Next, an example of a form using an antigen-antibody reaction in the detection method of the present invention is shown below. The present invention is not limited to these.

（第１の実施形態）
本実施形態は、検出対象物が抗原であり、一次試薬が固定化一次抗体、二次試薬が二次抗体である形態の一例である。なお、前述のように、前記一次抗体は、前記抗原に特異的に結合可能な抗体であり、前記二次抗体は、前記一次抗体とは異なる部位で前記抗原に特異的に結合可能な抗体である。 (First embodiment)
This embodiment is an example of a form in which the detection target is an antigen, the primary reagent is an immobilized primary antibody, and the secondary reagent is a secondary antibody. As described above, the primary antibody is an antibody that can specifically bind to the antigen, and the secondary antibody is an antibody that can specifically bind to the antigen at a site different from the primary antibody. is there.

本実施形態について、図１を用いて説明する。図１は、本実施形態における検出方法の一例を示す概略図である。   This embodiment will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of a detection method in the present embodiment.

まず、図１（Ａ）に示すように、固定化した一次抗体１１を準備する。前記固定化一次抗体１１は、前述のように、固相１に一次抗体１１が固定化されていればよく、例えば、前記固相の種類、固相への一次抗体の結合方法等は、何ら制限されない。   First, as shown in FIG. 1A, an immobilized primary antibody 11 is prepared. As described above, the immobilized primary antibody 11 only needs to have the primary antibody 11 immobilized on the solid phase 1. For example, the kind of the solid phase, the method of binding the primary antibody to the solid phase, etc. Not limited.

つぎに、前記固定化一次抗体に検体を接触させる。前記検体が検出対象抗原を含む場合、図１（Ｂ）に示すように、前記固定化一次抗体１１に前記検体中の検出対象抗原１２が結合する。なお、本発明において、前記固定化一次抗体１１は、前記検出対象抗原１２に対する抗体であればよく、所望の検出対象物に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の抗体を使用することができる。   Next, a specimen is brought into contact with the immobilized primary antibody. When the specimen contains a detection target antigen, the detection target antigen 12 in the specimen is bound to the immobilized primary antibody 11 as shown in FIG. In the present invention, the immobilized primary antibody 11 may be an antibody against the detection target antigen 12, and may be appropriately prepared or a commercially available antibody may be used depending on the desired detection target. it can.

前記固定化と検出対象抗原との処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。   The treatment conditions of the immobilization and detection target antigen are not particularly limited, but the treatment temperature is, for example, 4 to 37 ° C, preferably 25 to 37 ° C, and the treatment time is, for example, 5 to 120. Minutes, preferably 15-60 minutes.

１反応系における前記一次抗体の量は、特に制限されず、例えば、添加する検体の量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記一次抗体は、例えば、０．１ピコモル〜１０ピコモルであることが好ましく、より好ましくは０．２ピコモル〜５ピコモルであり、特に好ましくは０．４ピコモル〜２ピコモルである。   The amount of the primary antibody in one reaction system is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the amount of the sample to be added. As a specific example, when a microplate having a well volume of 200 μL is used, the primary antibody per well is, for example, preferably 0.1 pmol to 10 pmol, more preferably 0.2 pmol to 5 pmol. It is picomolar, particularly preferably 0.4 picomolar to 2 picomolar.

前記検体としては、特に制限されず、前記検出対象抗原を含有すると考えられる検体があげられる。前記検体としては、例えば、生物由来検体や、環境由来検体、人為的な検体等があげられる。前記生物由来検体としては、例えば、ヒト等の哺乳類、鳥類、魚類、昆虫類、細菌や菌類等の微生物類等があげられる。前記環境由来検体としては、例えば、海水、土壌、下水等の排水等があげられる。人為的な検体としては、例えば、食品、飲料、合成物等があげられる。また、前記検体は、例えば、希釈された検体であってもよい。前記検体の形態は、特に制限されず、例えば、液体状、ゲル状、固体状、粉末状等があげられるが、前記一次抗体との接触性に優れることから、液体であることが好ましい。   The sample is not particularly limited, and examples include samples considered to contain the detection target antigen. Examples of the specimen include biological specimens, environmental specimens, and artificial specimens. Examples of the biological specimen include mammals such as humans, birds, fish, insects, microorganisms such as bacteria and fungi, and the like. Examples of the environment-derived specimen include wastewater such as seawater, soil, and sewage. Examples of artificial specimens include foods, beverages, and synthetic products. Further, the sample may be a diluted sample, for example. The form of the specimen is not particularly limited, and examples thereof include a liquid form, a gel form, a solid form, and a powder form. However, since the contact property with the primary antibody is excellent, a liquid form is preferable.

前記検体を希釈する場合、その溶媒は、特に制限されないが、例えば、蒸留水等の水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液としては、例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられる。また、前記溶媒は、例えば、界面活性剤、塩等の添加剤を含んでもよい。前記界面活性剤としては、特に制限されず、例えば、Ｔｗｅｅｎ系等の非イオン性界面活性剤等があげられ、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等があげられる。   In the case of diluting the specimen, the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water such as distilled water, physiological saline, and buffer solution. Examples of the buffer solution include Hepes buffer solution and phosphate buffer solution. Liquid, Tris buffer, and the like. The solvent may contain additives such as a surfactant and a salt. The surfactant is not particularly limited, and examples thereof include nonionic surfactants such as Tween series. Examples of the salt include sodium chloride and magnesium chloride.

つぎに、前記一次抗体に結合した前記検出対象抗原に、さらに、二次抗体を接触させる。これにより、図１（Ｃ）に示すように、前記検出対象抗原１２に前記二次抗体１３が結合し、前記一次抗体１１と検出対象抗原１２と前記二次抗体１３とが結合した複合体２１が形成される。なお、本発明において、前記二次抗体は、前記検出対象抗原に対する抗体であればよく、所望の検出対象抗原に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の抗体を使用することができる。   Next, a secondary antibody is further brought into contact with the antigen to be detected bound to the primary antibody. As a result, as shown in FIG. 1C, the secondary antibody 13 is bound to the detection target antigen 12, and the primary antibody 11, the detection target antigen 12, and the secondary antibody 13 are combined. Is formed. In the present invention, the secondary antibody may be an antibody against the detection target antigen, and can be appropriately prepared or a commercially available antibody can be used according to the desired detection target antigen.

前記二次抗体と検出対象抗原との処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。また、前記二次抗体は、例えば、前記検出対象抗原との接触性に優れることから、前記二次抗体を含む液体として添加することが好ましい。前記液体は、例えば、前記二次抗体を溶媒に添加することで調製でき、前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、前述と同様の、水や緩衝液等の溶媒が使用できる。   The treatment conditions for the secondary antibody and the antigen to be detected are not particularly limited, but the treatment temperature is, for example, 4 to 37 ° C, preferably 25 to 37 ° C, and the treatment time is, for example, 5 to 5 ° C. 120 minutes, preferably 15 to 60 minutes. In addition, the secondary antibody is preferably added as a liquid containing the secondary antibody, for example, because it is excellent in contact with the antigen to be detected. The liquid can be prepared, for example, by adding the secondary antibody to a solvent, and the solvent is not particularly limited, and for example, a solvent such as water or a buffer similar to the above can be used.

１反応系における前記検体の添加量は、特に制限されないが、具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記検体の添加量は、例えば、１０〜１８０μＬであることが好ましく、より好ましくは２０〜１００μＬであり、特に好ましくは４０〜６０μＬである。   The amount of the sample to be added in one reaction system is not particularly limited. As a specific example, when a microplate having a well volume of 200 μL is used, the amount of the sample to be added per well is, for example, 10 to 180 μL. It is preferable to be, more preferably 20 to 100 μL, and particularly preferably 40 to 60 μL.

続いて、前記複合体に、前記二次抗体に特異的に結合可能な核酸アプタマーを接触させる。これにより、図１（Ｄ）に示すように、前記複合体２１における前記二次抗体１３に、前記核酸アプタマー１４が結合する。なお、本発明において、前記核酸アプタマーは、前記二次抗体に結合可能な抗体であればよく、所望の二次抗体に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の核酸アプタマーを使用することができる。   Subsequently, the complex is brought into contact with a nucleic acid aptamer that can specifically bind to the secondary antibody. Thereby, the nucleic acid aptamer 14 is bound to the secondary antibody 13 in the complex 21 as shown in FIG. In the present invention, the nucleic acid aptamer may be any antibody that can bind to the secondary antibody. For example, the nucleic acid aptamer may be appropriately prepared or a commercially available nucleic acid aptamer may be used depending on the desired secondary antibody. it can.

前記複合体と前記核酸アプタマーとの処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。   The treatment conditions of the complex and the nucleic acid aptamer are not particularly limited, but the treatment temperature is, for example, 4 to 37 ° C, preferably 25 to 37 ° C, and the treatment time is, for example, 5 to 120. Minutes, preferably 15-60 minutes.

１反応系における前記核酸アプタマーの量は、特に制限されず、例えば、前記一次抗体および前記二次抗体の添加量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記核酸アプタマーの添加量は、例えば、６×１０８〜６×１０１１分子（コピー数）であることが好ましく、より好ましくは６×１０９〜６×１０１０分子であり、特に好ましくは６×１０９分子である。 The amount of the nucleic acid aptamer in one reaction system is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the amount of the primary antibody and the secondary antibody added. As a specific example, when a microplate having a well capacity of 200 μL is used, the addition amount of the nucleic acid aptamer per well is preferably 6 × 10 8 to 6 × 10 11 molecules (copy number), for example. The molecular weight is more preferably 6 × 10 9 to 6 × 10 10 molecules, and particularly preferably 6 × 10 9 molecules.

前記核酸アプタマーには、例えば、前記複合体への接触に先立って、変性処理を施してもよい。これによって、例えば、核酸同士のアニーリングを解除し、再び自己アニーリングして、目的の二次構造を形成することができる。前記変性処理の条件は、特に制限されないが、核酸アダプターの自己アニーリングを解除し、一本鎖核酸となる条件が好ましく、具体例としては、処理温度は、例えば、６５〜９５℃であり、好ましくは、７０〜９５℃であり、処理時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜５分である。   For example, the nucleic acid aptamer may be subjected to a denaturation treatment prior to contact with the complex. Thereby, for example, annealing between nucleic acids can be released and self-annealing can be performed again to form a target secondary structure. The conditions for the denaturation treatment are not particularly limited, but the conditions for releasing the self-annealing of the nucleic acid adapter to become a single-stranded nucleic acid are preferred. As a specific example, the treatment temperature is, for example, 65 to 95 ° C., preferably Is 70 to 95 ° C., and the treatment time is, for example, 1 to 30 minutes, preferably 2 to 5 minutes.

続いて、前記核酸アプタマーの増幅を行い、増幅産物を検出することで、検体中の検出対象物の検出を行う。前述のように、前記一次抗体と検出対象物と前記二次抗体との複合体が形成された場合、前記複合体の二次抗体には核酸アプタマーが結合している。このため、核酸増幅反応を行えば、図１（Ｅ）に示すように、前記二次抗体１３を介して前記複合体２１に結合した前記核酸アプタマー１４が増幅し、前記核酸アプタマー１４の増幅産物１５が得られる。前記核酸アプタマーの増幅は、前記検出対象物の存在を示し、前記増幅の程度が、前記検出対象物の量を示す。このため、本実施形態によれば、前記複合体における前記二次抗体に結合した核酸アダプターの増幅のみで、検出対象物の検出が可能であることから、操作を簡便に行うことができる。   Subsequently, the nucleic acid aptamer is amplified and the amplification product is detected to detect the detection target in the sample. As described above, when a complex of the primary antibody, the detection target, and the secondary antibody is formed, a nucleic acid aptamer is bound to the secondary antibody of the complex. Therefore, when a nucleic acid amplification reaction is performed, as shown in FIG. 1E, the nucleic acid aptamer 14 bound to the complex 21 via the secondary antibody 13 is amplified, and the amplification product of the nucleic acid aptamer 14 is amplified. 15 is obtained. The amplification of the nucleic acid aptamer indicates the presence of the detection target, and the degree of amplification indicates the amount of the detection target. For this reason, according to this embodiment, since the detection target can be detected only by amplification of the nucleic acid adapter bound to the secondary antibody in the complex, the operation can be easily performed.

前述のように、核酸アプタマーの増幅方法は、何ら制限されず、前記核酸アプタマーの種類に応じて適宜決定することができる。前記核酸アプタマーがＲＮＡアプタマーの場合、逆転写反応の後、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲがあげられる。前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーの場合には、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、ＰＣＲがあげられる。   As described above, the method for amplifying a nucleic acid aptamer is not limited at all, and can be appropriately determined according to the type of the nucleic acid aptamer. When the nucleic acid aptamer is an RNA aptamer, it is preferable to carry out amplification using the obtained cDNA as a template after the reverse transcription reaction, and specific examples include RT-PCR. When the nucleic acid aptamer is a DNA aptamer, it is preferable to perform amplification using the DNA aptamer as a template, and a specific example is PCR.

前記核酸増幅は、例えば、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を用いて行うことができる。前記プライマーは、例えば、核酸アプタマーの種類や配列等に応じて適宜決定できる。前記ポリメラーゼは、例えば、核酸アプタマーの種類に応じて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等が使用できる。また、その他にも、核酸増幅に使用できる各種試薬を使用できる。   The nucleic acid amplification can be performed using, for example, a primer, a polymerase, dNTP or the like. The primer can be appropriately determined according to, for example, the type and sequence of the nucleic acid aptamer. As the polymerase, for example, a DNA-dependent DNA polymerase, an RNA-dependent DNA polymerase, or the like can be used depending on the type of nucleic acid aptamer. In addition, various reagents that can be used for nucleic acid amplification can be used.

前記増幅産物の検出は、その目的に応じて、例えば、増幅産物の有無の検出（いわゆる定性）でもよいし、増幅産物の量の測定（いわゆる定量）であってもよい。   The detection of the amplification product may be, for example, detection of the presence or absence of an amplification product (so-called qualitative) or measurement of the amount of amplification product (so-called quantification) depending on the purpose.

前記増幅産物の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。検出方法としては、例えば、得られた増幅産物そのものを直接的に検出する方法と、得られた増幅産物を間接的に検出する方法とがあげられる。前記直接的な検出方法としては、例えば、反応系について、核酸に特異的な波長（２６０ｎｍ）における吸光度を測定する方法、反応系の電気泳動等を行う方法があげられる。前者の場合、例えば、反応開始から所定期間経過後に、反応系について前記波長の吸光度上昇が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、吸光度の大きさによって、増幅産物の量を判断できる。また、後者の場合、反応開始から所定期間経過後に、反応液について、前記核酸アプタマーに対応する増幅産物の大きさを示す部分にバンドが検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、バンドの強度によって、増幅産物の量を判断できる。他方、間接的な検出方法としては、例えば、インターカレーターを使用する方法、５’末端が蛍光色素および３’末端がクエンチャーで標識化されたプローブを使用する方法等があげられる。前者の方法において、前記インターカレーターは、例えば、二本鎖核酸に挿入されて蛍光発光する化合物であり、具体例としては、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎＩ等があげられる。この方法によると、鋳型の相補鎖が合成されると、前記鋳型と相補鎖とが二本鎖を形成し、前記二本鎖に前記インターカレーターが挿入し、蛍光を発する。したがって、例えば、反応開始から所定期間経過後に、反応系について、蛍光の発光が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、蛍光強度によって、増幅産物の量を判断できる。また、後者の方法において、前記プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブ等があげられる。一例として、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いた方法によると、例えば、前記プローブが鋳型に結合している際は、前記プローブの５’末端側の前記蛍光色素は３’末端側の前記クエンチャーにより蛍光が消光されている。しかし、鋳型にプライマーが結合し、伸長反応が進むことによって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼが前記プローブに近づくと、前記プローブは、５’末端側から切断され、５’末端側の蛍光色素が遊離する。このため、前記クエンチャーによる消光効果が解除され、前記蛍光色素が発光する。したがって、前記蛍光色素の発光が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、蛍光強度によって、増幅産物の量を判断できる。   The method for detecting the amplification product is not particularly limited, and a known method can be adopted. Examples of the detection method include a method of directly detecting the obtained amplification product itself and a method of indirectly detecting the obtained amplification product. Examples of the direct detection method include a method of measuring absorbance at a wavelength (260 nm) specific to the nucleic acid, a method of performing electrophoresis of the reaction system, and the like for the reaction system. In the former case, for example, if an increase in absorbance at the wavelength is detected for the reaction system after a lapse of a predetermined period from the start of the reaction, it can be confirmed that amplification has occurred, and the amount of amplification product can be determined based on the magnitude of absorbance. . In the latter case, if a band is detected in the portion indicating the size of the amplification product corresponding to the nucleic acid aptamer after a predetermined period from the start of the reaction, it can be confirmed that amplification has occurred. The amount of amplification product can be determined by the intensity of the. On the other hand, the indirect detection method includes, for example, a method using an intercalator, a method using a probe labeled with a fluorescent dye at the 5 'end and a quencher at the 3' end. In the former method, the intercalator is, for example, a compound that is inserted into a double-stranded nucleic acid and emits fluorescence, and specific examples include SYBR (trademark) GreenI. According to this method, when the complementary strand of the template is synthesized, the template and the complementary strand form a double strand, and the intercalator is inserted into the double strand and emits fluorescence. Therefore, for example, if fluorescence emission is detected in the reaction system after a predetermined period from the start of the reaction, it can be confirmed that the reaction system has been amplified, and the amount of amplification product can be determined from the fluorescence intensity. In the latter method, examples of the probe include TaqMan (trademark) probe, Molecular Beacon, and cycling probe. As an example, according to a method using a TaqMan ™ probe, for example, when the probe is bound to a template, the fluorescent dye on the 5 ′ end side of the probe is transferred by the quencher on the 3 ′ end side. The fluorescence is quenched. However, when the primer binds to the template and the extension reaction proceeds, when the polymerase having 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity approaches the probe, the probe is cleaved from the 5 ′ end, and the 5 ′ end Is released. For this reason, the quenching effect by the quencher is canceled and the fluorescent dye emits light. Therefore, if the emission of the fluorescent dye is detected, it can be confirmed that the fluorescent dye has been amplified, and the amount of the amplified product can be determined from the fluorescence intensity.

前記増幅産物の検出において、前記増幅産物量は、例えば、増幅産物量そのものであってもよいし、前述のような、前記増幅産物量と相対関係を示す、吸光度（吸収強度）、蛍光強度等であってもよい。   In the detection of the amplification product, the amount of the amplification product may be, for example, the amount of the amplification product itself, or as described above, the absorbance (absorption intensity), the fluorescence intensity, and the like showing a relative relationship with the amount of the amplification product. It may be.

前記増幅産物の検出は、例えば、経時的な検出（いわゆるリアルタイム検出）が好ましい。前記リアルタイム検出は、例えば、断続的に行ってもよいし、連続的に行ってもよい。前記断続的な検出としては、例えば、増幅反応の開始時と、開始時から所望の一定時間経過時とにおける検出があげられる。この検出によれば、開始時から一定時間の間に得られた増幅産物を検出することができる。また、前記連続的な検出は、例えば、一定時間経過ごとに検出するコンスタントな検出であってもよいし、ランダムな検出であってもよい。中でも、例えば、一定時間ごとの増幅産物の増加程度が確認できることから、コンスタントな検出であることが好ましい。本発明においては、具体例として、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等が好ましい。   The amplification product is preferably detected, for example, over time (so-called real-time detection). For example, the real-time detection may be performed intermittently or continuously. Examples of the intermittent detection include detection at the start of an amplification reaction and when a desired fixed time has elapsed from the start. According to this detection, it is possible to detect an amplification product obtained during a certain time from the start. In addition, the continuous detection may be, for example, constant detection detected every elapse of a fixed time or random detection. Among these, constant detection is preferable because, for example, the degree of increase in amplification products at regular intervals can be confirmed. In the present invention, real-time PCR, real-time RT-PCR and the like are preferable as specific examples.

以上のように、前記複合体に結合した前記核酸アプタマーの増幅を検出することによって、間接的に、前記複合体における検出対象抗原の有無または量を判断することができる。   As described above, by detecting the amplification of the nucleic acid aptamer bound to the complex, the presence or amount of the antigen to be detected in the complex can be determined indirectly.

本実施形態は、例えば、さらに、各結合反応の後、未反応物質を除去する工程を含んでもよい。具体的には、例えば、前記一次抗体と検体との反応後、未反応の検出対象抗原を除去する工程を有してもよく、前記一次抗体に結合した検体と二次抗体との反応後、未反応の前記二次抗体を除去する工程を有してもよく、また、前記二次抗体と核酸アプタマーとの反応後、未反応の前記核酸アプタマーを除去する工程を有してもよい。本実施形態においては、前記一次抗体が固相に固定化されているため、例えば、前記固相の洗浄により、容易に、未反応物質を除去することができる。このように、未反応物質を除去することにより、例えば、本発明の検出精度をさらに向上することができる。   This embodiment may further include, for example, a step of removing unreacted substances after each binding reaction. Specifically, for example, after the reaction between the primary antibody and the specimen, it may have a step of removing unreacted antigen to be detected. After the reaction between the specimen bound to the primary antibody and the secondary antibody, There may be a step of removing the unreacted secondary antibody, and a step of removing the unreacted nucleic acid aptamer after the reaction between the secondary antibody and the nucleic acid aptamer. In this embodiment, since the primary antibody is immobilized on a solid phase, unreacted substances can be easily removed by washing the solid phase, for example. Thus, by removing unreacted substances, for example, the detection accuracy of the present invention can be further improved.

前記洗浄用の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、前述と同様の水や緩衝液等が使用できる。洗浄条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、洗浄回数は、例えば、３回以上であり、好ましくは３〜１０回である。洗浄１回あたりの前記洗浄用溶媒の量は、特に制限されないが、例えば、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記洗浄用溶媒の量は、例えば、１００〜２００μＬであることが好ましい。   The washing solvent is not particularly limited, and for example, the same water or buffer as described above can be used. The cleaning conditions are not particularly limited, but the processing temperature is, for example, 4 to 37 ° C, preferably 25 to 37 ° C, and the number of cleanings is, for example, 3 times or more, preferably 3 to 10 times. It is. The amount of the washing solvent per washing is not particularly limited. For example, when using a microplate having a well volume of 200 μL, the amount of the washing solvent per well is, for example, 100 to 200 μL. It is preferable that

前記洗浄方法は、特に制限されず、例えば、前記一次抗体が固定化された固相の種類に応じて適宜決定できる。前記固相が有底凹状の反応器の場合、例えば、前記凹状の内部に前記洗浄用溶媒を添加した後、除去すればよい。また、前記固相がビーズ状の固相の場合、例えば、前記洗浄用溶媒中に前記固相を浸漬した後、前記固相を回収すればよい。この際、例えば、ろ過により、前記固相と前記洗浄用溶媒とを分離してもよいし、前記固相が磁性を有する場合は、例えば、磁石等により前記固相を回収して、前記固相と前記洗浄用溶媒とを分離してもよい。   The washing method is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of solid phase on which the primary antibody is immobilized. When the solid phase is a bottomed concave reactor, for example, the washing solvent may be added to the concave interior and then removed. Further, when the solid phase is a bead-like solid phase, for example, the solid phase may be recovered after the solid phase is immersed in the washing solvent. At this time, for example, the solid phase and the washing solvent may be separated by filtration. When the solid phase has magnetism, the solid phase is recovered by, for example, a magnet, and the solid phase is recovered. The phase and the washing solvent may be separated.

なお、前記一次抗体が、固定化されていない一次抗体であっても、例えば、電気泳動法、透析膜または限界ろ過膜等を用いたろ過方法等によって、前記未反応物質を除去することはできる。   Even if the primary antibody is a non-immobilized primary antibody, the unreacted substance can be removed by, for example, electrophoresis, a filtration method using a dialysis membrane, a ultrafiltration membrane, or the like. .

（第２の実施形態）
本実施形態は、検出対象物が抗体であり、一次試薬が一次抗原であり、二次試薬が二次抗体である形態の一例である。なお、前述のように、前記一次抗原は、検出対象抗体に特異的に結合可能な抗原であり、前記二次抗体は、前記検出対象抗体に特異的に結合可能な抗体である。本実施形態においては、特に示さない限り、前記第１の実施形態と同様に行うことができる。 (Second Embodiment)
This embodiment is an example of a form in which the detection target is an antibody, the primary reagent is a primary antigen, and the secondary reagent is a secondary antibody. As described above, the primary antigen is an antigen that can specifically bind to the antibody to be detected, and the secondary antibody is an antibody that can specifically bind to the antibody to be detected. In the present embodiment, unless otherwise indicated, it can be performed in the same manner as in the first embodiment.

本実施形態において、前記反応系における前記一次抗原の量は、特に制限されず、例えば、添加する検体の量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記一次抗原は、例えば、１〜１×１０１５分子であることが好ましく、より好ましくは１×１０２〜１×１０１４分子であり、特に好ましくは１×１０６〜１×１０１２分子である。 In the present embodiment, the amount of the primary antigen in the reaction system is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the amount of the sample to be added. As a specific example, when a microplate having a well volume of 200 μL is used, the primary antigen per well is preferably, for example, 1 to 1 × 10 15 molecules, more preferably 1 × 10 2 to 1 × 10 14 molecules, particularly preferably 1 × 10 6 to 1 × 10 12 molecules.

本実施形態において、前記一次抗原は、前述のように、固定化一次抗原であることが好ましい。前記一次抗原を固相に固定化すれば、例えば、前記第１の実施形態と同様に、前記一次抗原と未反応の検出対象抗体、前記一次抗原に結合した検出対象抗体に未反応の二次抗体、さらに、前記一次抗原と検出対象抗体と前記二次抗体との複合体に未反応の核酸アプタマーを、容易に除去することができる。これらの未反応物質を除去することにより、例えば、本発明の検出精度をさらに向上することができる。   In the present embodiment, the primary antigen is preferably an immobilized primary antigen as described above. If the primary antigen is immobilized on a solid phase, for example, as in the first embodiment, the detection target antibody that has not reacted with the primary antigen, and the secondary antibody that has not reacted with the detection target antibody bound to the primary antigen. The nucleic acid aptamer unreacted to the antibody and the complex of the primary antigen, the detection target antibody and the secondary antibody can be easily removed. By removing these unreacted substances, for example, the detection accuracy of the present invention can be further improved.

本発明において、前記一次抗体と検出対象物との反応、前記検出対象物と前記二次抗体との反応、および、前記二次抗体と前記核酸アプタマーとの反応は、例えば、同時に行ってもよいし、別個に行ってもよい。中でも、例えば、未反応物質の除去が容易であることから、各反応は、別個に行うことが好ましい。   In the present invention, the reaction between the primary antibody and the detection target, the reaction between the detection target and the secondary antibody, and the reaction between the secondary antibody and the nucleic acid aptamer may be performed simultaneously, for example. However, it may be performed separately. Among these, for example, since it is easy to remove unreacted substances, each reaction is preferably performed separately.

つぎに、本発明の検出用キットは、前述のように、検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、本発明の検出方法に使用することを特徴とする。   Next, as described above, the detection kit of the present invention includes a nucleic acid aptamer that can bind to a reagent that can bind to a detection target, and is characterized by being used in the detection method of the present invention.

本発明の検出用キットは、さらに、前記検出対象物と結合可能な前記試薬を含むことが好ましく、前記試薬は、前述の二次試薬であることが好ましい。   The detection kit of the present invention preferably further includes the reagent that can bind to the detection target, and the reagent is preferably the secondary reagent described above.

本発明の検出用キットは、さらに、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物に結合可能な二次試薬とを含み、前記核酸アプタマーは、前記二次試薬に結合可能な核酸アプタマーであることが好ましい。   The detection kit of the present invention further includes a primary reagent capable of binding to the detection target, and a secondary reagent capable of binding to the detection target at a site different from the primary reagent, and the nucleic acid aptamer includes It is preferably a nucleic acid aptamer that can bind to the secondary reagent.

本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬は、例えば、一次抗体または一次抗原である。   In the detection kit of the present invention, the primary reagent is, for example, a primary antibody or a primary antigen.

本発明の検出用キットにおいて、前記二次試薬は、例えば、二次抗体である。   In the detection kit of the present invention, the secondary reagent is, for example, a secondary antibody.

本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬は、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましく、前記固相は、例えば、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズ等があげられる。   In the detection kit of the present invention, the primary reagent is preferably an immobilized reagent immobilized on a solid phase, and examples of the solid phase include plates, membranes, tubes, chips, beads, and the like.

本発明の検出用キットにおいて、前記アプタマーは、例えば、ＩｇＧに結合可能なアプタマーであり、前記ＩｇＧは、ウサギ由来ＩｇＧであることが好ましい。   In the detection kit of the present invention, the aptamer is, for example, an aptamer that can bind to IgG, and the IgG is preferably a rabbit-derived IgG.

本発明の検出用キットにおいて、核酸は、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましく、また、配列番号３または配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましい。   In the detection kit of the present invention, the nucleic acid preferably has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. It is preferable to have.

本発明の検出用キットにおいて、前記核酸アプタマー、前記一次試薬および前記二次試薬および前記アプタマーは、前記本発明の検出方法で述べた通りであり、また、前記本発明の検出方法と同様にして使用できる。   In the detection kit of the present invention, the nucleic acid aptamer, the primary reagent, the secondary reagent, and the aptamer are as described in the detection method of the present invention, and in the same manner as the detection method of the present invention. Can be used.

本発明の検出用キットにおいて、前記核酸アプタマーと、前記一次試薬および前記二次試薬の少なくとも一方は、例えば、同じ容器に収容されてもよいが、それぞれ別個の容器に収容されていることが好ましい。本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬、前記二次試薬および前記核酸は、例えば、使用時に、前述のような添加割合となるように、それぞれ収容されていることが好ましい。   In the detection kit of the present invention, the nucleic acid aptamer and at least one of the primary reagent and the secondary reagent may be housed in the same container, for example, but are preferably housed in separate containers. . In the detection kit of the present invention, it is preferable that the primary reagent, the secondary reagent, and the nucleic acid are accommodated so that, for example, at the time of use, the aforementioned addition ratio is obtained.

本発明の検出用キットは、例えば、さらに、固相を有してもよく、前記固相に前記一次試薬が固定化されていることが好ましい。   The detection kit of the present invention may further have, for example, a solid phase, and the primary reagent is preferably immobilized on the solid phase.

本発明の検出用キットは、例えば、さらに、核酸増幅に必要な試薬を適宜備えてもよい。また、本発明の検出用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えることが好ましい。   For example, the detection kit of the present invention may further include a reagent necessary for nucleic acid amplification. Moreover, it is preferable that the detection kit of the present invention further includes an instruction manual, for example.

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。   Next, examples of the present invention will be described. However, the present invention is not limited by the following examples. Commercially available reagents were used based on their protocol unless otherwise indicated.

ウサギ抗体ＲＮＡアプタマーの調製
下記実施例で使用する抗アクチンウサギＩｇＧに特異的に結合可能なＲＮＡアプタマーＲ１８（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７５，２１７−２２２，（２００８）．）を調製した。具体的には、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の鋳型となるＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に用いた。前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、Ｔ７ ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅキット（商品名、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、３７℃で３時間行った。この反応産物を、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、目的のＲＮＡアプタマーＲ１８を精製回収した。なお、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の配列を配列番号４に示す。 Preparation of Rabbit Antibody RNA Aptamer RNA aptamer R18 (Anal. Biochem., 375, 217-222, (2008).) Capable of specifically binding to anti-actin rabbit IgG used in the following examples was prepared. Specifically, DNA used as a template for the RNA aptamer R18 was amplified by PCR, and the obtained PCR product was used for in vitro transcription. The in vitro transcription was performed at 37 ° C. for 3 hours using a T7 Ampliscribe kit (trade name, manufactured by Epicentre Biotechnology). This reaction product was fractionated by 10% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, and the target RNA aptamer R18 was purified and recovered. The sequence of the RNA aptamer R18 is shown in SEQ ID NO: 4.

［実施例１］
１．リアルタイムＰＣＲによるＲＮＡアプタマーの定量法
前記ＲＮＡアプタマーＲ１８をＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）で、所定濃度（６×１０２〜６×１０１０分子）に希釈し、標準サンプルを作製した。そして、これらの標準サンプルについて、リアルタイムＰＣＲを行った。前記リアルタイムＰＣＲは、ＯｎｅＳｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）およびＡＢＩ ７３００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。各標準サンプルについて、前記リアルタイムＰＣＲを３回行い、前記３回の反応の平均値から、スレッシュホールドサイクル（Ｃｔ）値を求めた。前記ＰＣＲは、９５℃を５秒、５５℃を１５秒、７２℃を３１秒のＰＣＲプログラムで行った。 [Example 1]
1. Quantification method of RNA aptamer by real-time PCR The RNA aptamer R18 was diluted with EASY Dilution (trade name, manufactured by TAKARA) to a predetermined concentration (6 × 10 2 to 6 × 10 10 molecules) to prepare a standard sample. Then, real-time PCR was performed on these standard samples. OneStep SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II (trade name, manufactured by TAKARA) and ABI 7300 Fast Real-Time PCR Systems (trade name, manufactured by Applied Biosystems) were used for the real-time PCR. For each standard sample, the real-time PCR was performed three times, and a threshold cycle (Ct) value was determined from the average value of the three reactions. The PCR was performed with a PCR program of 95 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 31 seconds.

これらの結果を、図２に示す。同図は、リアルタイムＰＣＲにおける前記標準サンプル中のＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）とＣｔ値との関係を示すグラフである。同図において、横軸は、前記標準サンプルにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）の常用対数値を示し、縦軸は、前記Ｃｔ値を示す。同図に示すように、前記標準サンプルにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８が、６×１０２分子〜６×１０１０分子の範囲内で、「ｙ＝−３．２２６５ｘ＋４０．７７３」で表される検量線が得られた。この検量線の相関係数は、Ｒ＝０．９９９９（決定係数Ｒ２＝０．９９９７）であることから、ＲＮＡアプタマーとＣｔ値との相関性が極めて優れることがわかった。さらに、前記検量線の傾きは、−３．２２６５であり、これは、増幅効率を１００％と仮定した傾きの理論値−３．１６２３に近似している。このことから、ＲＮＡアプタマーのリアルタイムＰＣＲによる定量は、精度の高い定量性を持った検出系であることがわかった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡアプタマーを十分に増幅することが可能であり、且つ、十分に優れた定量性を確保できることが確認できた。 These results are shown in FIG. The figure is a graph showing the relationship between the number of molecules (copy number) of RNA aptamer R18 in the standard sample and the Ct value in real-time PCR. In the figure, the horizontal axis represents the common logarithm of the number of molecules (copy number) of RNA aptamer R18 in the standard sample, and the vertical axis represents the Ct value. As shown in the figure, a calibration curve represented by “y = −3.2265x + 40.773” is obtained within the range of 6 × 10 2 molecules to 6 × 10 10 molecules of RNA aptamer R18 in the standard sample. It was. Since the correlation coefficient of this calibration curve was R = 0.9999 (determination coefficient R 2 = 0.9997), it was found that the correlation between the RNA aptamer and the Ct value was extremely excellent. Furthermore, the slope of the calibration curve is −3.2265, which approximates the theoretical value of −3.1623 of the slope assuming that the amplification efficiency is 100%. From this, it was found that the quantification of RNA aptamer by real-time PCR is a highly accurate detection system with quantitative properties. From the above results, it was confirmed that, in Immuno-PCR using an RNA aptamer, the RNA aptamer can be sufficiently amplified and a sufficiently excellent quantitative property can be ensured.

２．ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの検出
抗アクチンウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を所定濃度（１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）となるように、反応用バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸、ｐＨ９．４）で希釈した。前記ＩｇＧ希釈液を、ｅｘｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＣＲプレート（商品名、ＡｐｔａＲｅｓ社製）にウェルあたり４０μＬ添加し、４℃で終夜インキュベートした。前記プレートから液体を除去後、前記プレートをＨＢＳ−Ｔ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、さらに、前記プレートのウェルにブロッキング用バッファー１（０．１％ アセチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）および１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むＨＢＳ−Ｔ）を添加し、室温で６０分間インキュベートした。他方、１００ｐｍｏｌ／Ｌの前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を、９５℃、２分間の処理で変性させ、室温で５分間冷却した。そして、ブロッキング処理した前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、各ウェルに前記変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８を添加し、室温で４５分間インキュベートし、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した。続いて、前述のリアルタイムＰＣＲと同様にして、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の検出を行った。なお、抗アクチンウサギＩｇＧ未添加のサンプルのＣｔ値を１０として、各サンプルについて、得られたＣｔ値の正規化を行った。 2. Detection of anti -actin rabbit IgG by immuno-PCR using RNA aptamer Reaction buffer (50 mmol / L) so that anti-actin rabbit IgG (manufactured by Santa Cruz Biotechnology) has a predetermined concentration (10 ng / mL to 10 μg / mL). Diluted with boric acid, pH 9.4). The IgG dilution was added to an expoxy-activated PCR plate (trade name, manufactured by AptaRes) at 40 μL per well and incubated at 4 ° C. overnight. After removing the liquid from the plate, the plate was washed 3 times with HBS-T (20 mmol / L Hepes, pH 7.4, 150 mmol / L NaCl, 5 mmol / L MgCl 2 , 0.05% Tween 20), and Blocking buffer 1 (0.1% acetylated BSA (manufactured by Sigma) and HBS-T containing 1 × Denhardt's solution) was added to the wells of the plate and incubated at room temperature for 60 minutes. On the other hand, 100 pmol / L of the RNA aptamer R18 was denatured by treatment at 95 ° C. for 2 minutes and cooled at room temperature for 5 minutes. Then, after the blocking-treated plate was washed 3 times with HBS-T, the denatured RNA aptamer R18 was added to each well, incubated at room temperature for 45 minutes, and the plate was washed 3 times with HBS-T. . Subsequently, the RNA aptamer R18 was detected in the same manner as the above-mentioned real-time PCR. In addition, the Ct value of the sample to which anti-actin rabbit IgG was not added was set to 10, and the obtained Ct value was normalized for each sample.

他方、比較として、ＲＮＡアプタマーを使用しないＥＬＩＳＡにより、前記抗アクチンウサギＩｇＧを検出した。前記ブロッキング用バッファー１に代えてブロッキング用バッファー２（１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＨＢＳ−Ｔ）を用いた以外は、前述と同様にして、抗アクチンウサギＩｇＧをウェルプレートに結合させた。前記プレートから液体を除去後、ＨＢＳ−Ｔで３回洗浄し、さらに、０．５μｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ウサギＩｇＧ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をウェルあたり１００μＬ添加し、室温で６０分間インキュベートした。前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質としてウェルあたり１００μＬの１−ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ（商品名、ＰＩＥＲＣＥ社製）を添加し、室温でインキュベートして発色させた。そして、前記プレートについて、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、発色を波長域４０５ｎｍおよび６５０ｎｍで検出した。波長域６５０ｎｍのシグナル値をバックグラウンドとして、波長域４０５ｎｍのシグナル値の正規化を行った。   On the other hand, for comparison, the anti-actin rabbit IgG was detected by ELISA without using RNA aptamer. Anti-actin rabbit IgG was bound to a well plate in the same manner as described above except that blocking buffer 2 (HBS-T containing 1% BSA (manufactured by Sigma)) was used instead of blocking buffer 1. . After removing the liquid from the plate, the plate was washed 3 times with HBS-T. Further, 100 μL of 0.5 μg / mL HRP-conjugated anti-rabbit IgG (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was added per well, and the mixture was incubated at room temperature for 60 minutes. Incubated. After the plate was washed 3 times with HBS-T, 100 μL of 1-step Turbo TMB (trade name, manufactured by PIERCE) per well was added as a substrate, and the color was developed by incubation at room temperature. And about the said plate, color development was detected in wavelength range 405nm and 650nm using the ELISA plate reader (made by TECAN). The signal value in the wavelength region of 405 nm was normalized using the signal value in the wavelength region of 650 nm as the background.

抗アクチンウサギＩｇＧ測定結果を図３に示す。同図において、○は、ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定結果であり、□は、ＥＬＩＳＡの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりの抗アクチンウサギＩｇＧ添加量を示し、左の縦軸は、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける、正規化したＣｔ値を示し、右の縦軸は、前記ＥＬＩＳＡにおける、正規化したシグナル値を示す。その結果、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（○）によれば、ウェルあたり１０ｐｇ〜１，０００，０００ｐｇ（１μｇ）の抗アクチンウサギＩｇＧを検出できることがわかった。これに対して、ＥＬＩＳＡ（□）では、ウェルあたり１０００ｐｇの抗アクチンウサギＩｇＧが、検出限界であった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによれば、ＥＬＩＳＡの１００倍の感度でターゲット分子（抗アクチンウサギＩｇＧ）を検出できることがわかった。   The measurement results of anti-actin rabbit IgG are shown in FIG. In the figure, ○ is a measurement result by Immuno-PCR using RNA aptamer R18, and □ is a graph showing the measurement result of ELISA. In the same figure, the horizontal axis indicates the amount of anti-actin rabbit IgG added per well, the left vertical axis indicates the normalized Ct value in Immuno-PCR using the RNA aptamer R18, and the right vertical axis Indicates the normalized signal value in the ELISA. As a result, it was found that 10 pg to 1,000,000 pg (1 μg) of anti-actin rabbit IgG can be detected per well according to real-time Immuno-PCR (◯) using RNA aptamer. In contrast, in ELISA (□), 1000 pg of anti-actin rabbit IgG per well was the detection limit. From the above results, it was found that the target molecule (anti-actin rabbit IgG) can be detected with 100 times the sensitivity of ELISA according to real-time immuno-PCR using RNA aptamer.

３．抗体ＲＮＡアプタマーの特異性の確認
ＲＮＡアプタマーＲ１８が、ウサギＩｇＧに特異的に結合することを確認した。ウサギＩｇＧ以外は、サンドイッチ法で一般に用いられる下記ＩｇＧを使用した。
マウスＩｇＧ（＃Ｉ２８０６、サンタクルズ社製）
ヤギＩｇＧ（＃ＡＰ１２４、ケミコン社製）
ヒトＩｇＧ（＃Ｐ８０−１０４、ＢＥＴＨＹＬ社製）
ニワトリＩｇＧ（＃ＣＧＨＬ−１０Ａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）
ヒツジＩｇＧ（＃ＳＧＨＬ−１０Ａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）
ラットＩｇＧ（＃ＳＣ−２０２６、サンタクルズ社製）
ウサギＩｇＧ（＃ＡＢ３２８２、ケミコン社製） 3. Confirmation of specificity of antibody RNA aptamer It was confirmed that RNA aptamer R18 specifically binds to rabbit IgG. Except for rabbit IgG, the following IgG generally used in the sandwich method was used.
Mouse IgG (# I2806, manufactured by Santa Cruz)
Goat IgG (# AP124, manufactured by Chemicon)
Human IgG (# P80-104, manufactured by BETHYL)
Chicken IgG (# CGHL-10A, manufactured by Immunology consultants laboratory)
Sheep IgG (# SGHL-10A, manufactured by Immunology consultants laboratory)
Rat IgG (# SC-2026, manufactured by Santa Cruz)
Rabbit IgG (#AB 3282, manufactured by Chemicon)

各種生物由来のＩｇＧを、それぞれウェルあたり５０，０００ｐｇ（５０ｎｇ）となるように添加した以外は、実施例１と同様にして、各種生物由来ＩｇＧの検出を行った。なお、前記ＩｇＧ未添加のネガティブコントロール（ＮＣ）のシグナルをノイズとして、前記各種ＩｇＧ添加のシグナルに関して、シグナル／ノイズ比を算出した。   Various organism-derived IgGs were detected in the same manner as in Example 1 except that IgG derived from various organisms was added so as to be 50,000 pg (50 ng) per well. In addition, signal / noise ratio was calculated regarding the signal of said various IgG addition by making the signal of the negative control (NC) without said IgG into noise.

これらの結果を、下記表１に示す。下記表１に示すように、ウサギＩｇＧは、他の生物種由来ＩｇＧと比べて極めて高いシグナルを示した。この結果から、ＲＮＡアプタマーＲ１８は、極めて特異的にウサギＩｇＧに結合できることがわかる。

Figure 0005419138
These results are shown in Table 1 below. As shown in Table 1 below, rabbit IgG showed a very high signal compared to IgG derived from other species. This result shows that RNA aptamer R18 can bind to rabbit IgG very specifically.
Figure 0005419138

［実施例２］
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにより、ヒト血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を検出した。 [Example 2]
Human vascular endothelial cell growth factor (VEGF) was detected by sandwich immuno-PCR using RNA aptamer.

ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ
抗アクチンウサギＩｇＧに代えて、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＶＥＧＦヤギＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、抗ヒトＶＥＧＦヤギＩｇＧをＰＣＲプレートに結合させ、ブロッキング処理を行った。前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、所定濃度（１μｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ）の抗原ヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μＬ添加した。そして、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＶＥＧＦウサギＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μＬ添加した。さらに、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、実施例１と同様にして変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８をウェルあたり６×１０−１４分子となるようにウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。そして、実施例１と同様、リアルタイムＰＣＲおよびデータ解析を行った。 Sandwich Immuno-PCR using RNA aptamer
Instead of anti-actin rabbit IgG, 0.5 μg / mL anti-human VEGF goat IgG (manufactured by Peprotech) was used in the same manner as in Example 1 to bind anti-human VEGF goat IgG to the PCR plate. Blocking treatment was performed. After the plate was washed 3 times with HBS-T, 100 μL of antigen human VEGF (manufactured by Peprotech) at a predetermined concentration (1 μg / mL to 1 ng / mL) was added per well. Then, after the plate was washed 3 times with HBS-T, 100 μL of 0.5 μg / mL anti-human VEGF rabbit IgG (Peprotech) was added per well. Furthermore, after the plate was washed 3 times with HBS-T, RNA aptamer R18 denatured in the same manner as in Example 1 was added to the well so as to be 6 × 10 −14 molecules per well, and the mixture was incubated at room temperature for 45 minutes. Incubated. Then, as in Example 1, real-time PCR and data analysis were performed.

［比較例２］
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡキット（商品名、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いて、ヒトＶＥＧＦを検出した。発色の検出およびシグナル値の正規化は、前述したＥＬＩＳＡと同様に行った。なお、前記キットには、サンプルとして、所定濃度（１００ｆｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）のＶＥＧＦ溶液１００ｍＬを使用した。 [Comparative Example 2]
Human VEGF was detected using a Peprotech ELISA kit (trade name, manufactured by Peprotech). Color detection and signal value normalization were performed in the same manner as the ELISA described above. In the kit, 100 mL of a VEGF solution having a predetermined concentration (100 fg / mL to 100 ng / mL) was used as a sample.

ヒトＶＥＧＦ測定結果を、図４に示す。同図において、○は、実施例２におけるＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの測定結果を示すグラフであり、□は、比較例２におけるＥＬＩＳＡの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量を示し、左の縦軸は、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける、正規化したＣｔ値を示し、右の縦軸は、前記ＥＬＩＳＡにおける、正規化したシグナル値を示す。その結果、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（○）によれば、ウェルあたり０．１ｐｇ〜１００，０００ｐｇのヒトＶＥＧＦを検出できることがわかった。これに対して、ＥＬＩＳＡ（□）では、ウェルあたり１０ｐｇのヒトＶＥＧＦが、検出限界であった。   The results of human VEGF measurement are shown in FIG. In the figure, ◯ is a graph showing the measurement result of sandwich Immuno-PCR using RNA aptamer R18 in Example 2, and □ is a graph showing the measurement result of ELISA in Comparative Example 2. In the figure, the horizontal axis indicates the amount of human VEGF added per well, the left vertical axis indicates the normalized Ct value in Immuno-PCR using the RNA aptamer R18, and the right vertical axis indicates The normalized signal value in the ELISA is shown. As a result, it was found that according to sandwich immuno-PCR (◯) using RNA aptamer, 0.1 pg to 100,000 pg of human VEGF can be detected per well. In contrast, in ELISA (□), 10 pg of human VEGF per well was the limit of detection.

つぎに、実施例２のＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲについて、検出限界値を算出した。前記検出限界値は、独立した３回のバックグラウンドシグナル測定値から、標準偏差および平均値を求め、以下の計算式から算出した。
検出限界値＝（３×Ｓ０）＋Ｓ
Ｓ０：バックグラウンドシグナル標準偏差
Ｓ：バックグラウンドシグナル平均値 Next, the detection limit value was calculated for the sandwich Immuno-PCR using the RNA aptamer of Example 2. The detection limit value was calculated from the following calculation formula by obtaining a standard deviation and an average value from three independent background signal measurement values.
Detection limit value = (3 × S 0 ) + S
S 0 : Background signal standard deviation S: Background signal average value

実施例２のＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの検出限界値は、約０．１ｐｇであった。これに対して、比較例２のＥＬＩＳＡの検出限界値は、前述のように約１０ｐｇであった。この結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによれば、ＥＬＩＳＡの１００倍の感度でターゲット分子（ヒトＶＥＧＦ）を検出できることが確認された。   The detection limit of sandwich Immuno-PCR using the RNA aptamer of Example 2 was about 0.1 pg. On the other hand, the detection limit value of the ELISA of Comparative Example 2 was about 10 pg as described above. From this result, it was confirmed that sandwich immuno-PCR using RNA aptamer can detect the target molecule (human VEGF) with 100 times the sensitivity of ELISA.

［実施例３］
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにより、血清中のヒトＶＥＧＦを検出した。変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８をＰＣＲプレートウェルに添加する直前に、市販のヒトＶＥＧＦに代えて血清（ウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加した以外は、実施例２と同様にして、ヒトＶＥＧＦを検出した。 [Example 3]
Human VEGF in the serum was detected by sandwich immuno-PCR using RNA aptamer. Human VEGF was detected in the same manner as in Example 2 except that serum (bovine serum, manufactured by Invitrogen) was added instead of commercially available human VEGF immediately before the denatured RNA aptamer R18 was added to the PCR plate well. did.

ヒト血清中のＶＥＧＦの測定結果を図５に示す。同図は、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。同図に示すように、血清を使用しても、ウェルあたり０．１ｐｇ〜１０，０００ｐｇのヒトＶＥＧＦを検出できた。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲは、検体が血清であっても、同様の検出限界での測定が可能であることがわかった。   The measurement result of VEGF in human serum is shown in FIG. The figure is a graph showing the results of sandwich immuno-PCR measurement using RNA aptamers. In the figure, the horizontal axis represents the amount of human VEGF added per well, and the vertical axis represents the normalized Ct value. As shown in the figure, even when serum was used, 0.1 pg to 10,000 pg of human VEGF could be detected per well. From the above results, it was found that sandwich Immuno-PCR using RNA aptamers can be measured with the same detection limit even when the specimen is serum.

［実施例４］
実施例１および実施例２の測定値から、検量線を作成し、高精度定量が可能な検出対象物の濃度範囲を決定した。なお、高精度定量が可能と判断する基準は、所定の検出対象物の濃度範囲における検量線の決定係数Ｒ２が、０．９９以上であることとした。 [Example 4]
A calibration curve was created from the measured values of Example 1 and Example 2, and the concentration range of the detection target capable of high-precision quantification was determined. The reference for determining can be performed with high accuracy quantification coefficient of determination R 2 of the calibration curve in the concentration range of the predetermined detection target, was that 0.99 or more.

これらの結果を図６に示す。同図（Ａ）は、実施例１におけるＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定値を用いた検量線のグラフであり、同図（Ｂ）は、実施例２におけるサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定値を用いた検量線のグラフである。同図（Ａ）において、横軸は、ウェルあたりの抗アクチンウサギＩｇＧ添加量（常用対数）を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。また、同図（Ｂ）において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量（常用対数）を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。同図（Ａ）に示すように、抗アクチンウサギＩｇＧ濃度範囲１ｐｇ〜１００，０００ｐｇにおける検量線の決定係数は、Ｒ２＝０．９９５７であり、０．９９以上であった。この結果から、検出対象物の濃度範囲１ｐｇ〜１００，０００ｐｇにおいて、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる高精度定量が可能であることがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ヒトＶＥＧＦ濃度範囲１ｐｇ〜１０，０００ｐｇにおける検量線の決定係数は、Ｒ２＝０．９９２５であり、０．９９以上であった。この結果から、検出対象物の濃度範囲１ｐｇ〜１０，０００ｐｇにおいて、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる高精度定量が可能であることがわかった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いた検出法を用いると、例えば、４〜５オーダーの範囲で、高精度定量が可能であることがわかった。一方、ＥＬＩＳＡでは、図７に示すように、通常、２オーダーの範囲でしか高精度定量ができない。したがって、定量可能範囲の広さという点でも、ＲＮＡアプタマーを用いた検出方法は、ＥＬＩＳＡよりも優れていることがわかった。 These results are shown in FIG. FIG. 4A is a graph of a calibration curve using measurement values by Immuno-PCR using RNA aptamers in Example 1, and FIG. 4B shows measurement values by sandwich Immuno-PCR in Example 2. It is a graph of a calibration curve using. In FIG. 9A, the horizontal axis represents the amount of anti-actin rabbit IgG added per well (common logarithm), and the vertical axis represents the normalized Ct value. In FIG. 5B, the horizontal axis represents the amount of human VEGF added per well (common logarithm), and the vertical axis represents the normalized Ct value. As shown in FIG. 6A, the coefficient of determination of the calibration curve in the anti-actin rabbit IgG concentration range of 1 pg to 100,000 pg was R 2 = 0.9957, which was 0.99 or more. From this result, it was found that high-precision quantification by immuno-PCR using an RNA aptamer was possible in the concentration range of the detection target from 1 pg to 100,000 pg. Further, as shown in FIG. 5B, the determination coefficient of the calibration curve in the human VEGF concentration range of 1 pg to 10,000 pg was R 2 = 0.9925, which was 0.99 or more. From this result, it was found that high-precision quantification by sandwich immuno-PCR using RNA aptamer was possible in a concentration range of 1 pg to 10,000 pg of the detection target. From the above results, it was found that, when a detection method using an RNA aptamer is used, high-precision quantification is possible, for example, in the range of 4 to 5 orders. On the other hand, in ELISA, as shown in FIG. 7, high-precision quantification can usually be performed only in the range of two orders. Therefore, it was found that the detection method using the RNA aptamer is superior to the ELISA in terms of the wide range of quantification.

本発明によれば、優れた感度で、検出対象物の検出を行うことができる。また、本発明によれば、前記検出対象物に結合可能な二次試薬として、標識化された二次試薬の使用が不要である。このため、前記標識化二次試薬の調製が不要であり、さらに、操作も簡便である。したがって、本発明によれば、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な検出対象物の検出を実現できる。   According to the present invention, a detection target can be detected with excellent sensitivity. In addition, according to the present invention, it is not necessary to use a labeled secondary reagent as a secondary reagent capable of binding to the detection target. For this reason, the preparation of the labeled secondary reagent is unnecessary, and the operation is simple. Therefore, according to the present invention, it is possible to realize detection of a detection object that is excellent in detection sensitivity and easy to operate.

１ 固相
１１ 一次抗体
１２ 検出対象抗原
１３ 二次抗体
１４ 核酸アプタマー
１５ 増幅産物
２１ 複合体 1 solid phase 11 primary antibody 12 antigen to be detected 13 secondary antibody 14 nucleic acid aptamer 15 amplification product 21 complex

Claims (28)

検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする、検出対象物の検出方法。 Complex formation step of forming a complex of a detection target in a sample, a primary reagent capable of binding to the detection target, and a secondary reagent capable of binding to the detection target at a site different from the primary reagent ,
A binding step of binding a nucleic acid aptamer capable of binding to the secondary reagent to the secondary reagent in the complex;
An amplification step of amplifying by a nucleic acid amplification method using the nucleic acid aptamer bound to the secondary reagent as a template, and
A method for detecting a detection target, comprising: a detection step of detecting the detection target by detecting an amplification product of the nucleic acid aptamer. 前記検出対象物が抗原であり、前記一次試薬が一次抗体である、請求項１記載の検出方法。 The detection method according to claim 1, wherein the detection target is an antigen, and the primary reagent is a primary antibody. 前記検出対象物が抗体であり、前記一次試薬が一次抗原である、請求項１記載の検出方法。 The detection method according to claim 1, wherein the detection target is an antibody, and the primary reagent is a primary antigen. 前記二次試薬が二次抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 3, wherein the secondary reagent is a secondary antibody. 前記一次試薬が、固相に固定化された固定化試薬である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 4, wherein the primary reagent is an immobilized reagent immobilized on a solid phase. 前記固相が、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズである、請求項５記載の検出方法。 The detection method according to claim 5, wherein the solid phase is a plate, a membrane, a tube, a chip, or a bead. 前記増幅工程に先立って、
さらに、前記複合体における前記二次試薬に未結合の核酸アプタマーを除去する工程を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の検出方法。 Prior to the amplification step,
Furthermore, the detection method as described in any one of Claim 1 to 6 including the process of removing the nucleic acid aptamer which is not couple | bonded with the said secondary reagent in the said composite_body | complex. 前記複合体形成工程が、
前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程、および
前記検出対象物に前記二次試薬を反応させる工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の検出方法。 The complex forming step includes
The detection method according to claim 1, comprising a step of reacting the detection target with the primary reagent and a step of reacting the secondary reagent with the detection target. 前記複合体形成工程において、
前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程の後、
前記検出対象物に前記二次試薬を反応させる工程を行う、請求項８記載の検出方法。 In the complex forming step,
After the step of reacting the detection object with the primary reagent,
The detection method according to claim 8, wherein a step of reacting the detection target with the secondary reagent is performed. 前記核酸アプタマーが、イムノグロブリンＧに結合可能な核酸アプタマーである、請求項１から９のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 9, wherein the nucleic acid aptamer is a nucleic acid aptamer capable of binding to immunoglobulin G. 前記イムノグロブリンＧが、ウサギ由来イムノグロブリンＧである、請求項１０記載の検出方法。 The detection method according to claim 10, wherein the immunoglobulin G is a rabbit-derived immunoglobulin G. 前記核酸アプタマーが、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 11, wherein the nucleic acid aptamer has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. 前記核酸アプタマーが、配列番号３および配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 11, wherein the nucleic acid aptamer has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. 前記核酸アプタマーが、配列番号５〜配列番号９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 11, wherein the nucleic acid aptamer has a base sequence represented by at least one SEQ ID NO selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 9. 核酸増幅方法が、逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション法またはポリメラーゼチェーンリアクション法である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 14, wherein the nucleic acid amplification method is a reverse transcription polymerase chain reaction method or a polymerase chain reaction method. 検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検出用キット。 A nucleic acid aptamer capable of binding to a reagent capable of binding to the detection target,
A detection kit for use in the detection method according to any one of claims 1 to 15. さらに、前記検出対象物と結合可能な前記試薬を含む、請求項１６記載の検出用キット。 The detection kit according to claim 16, further comprising the reagent capable of binding to the detection target. さらに、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物に結合可能な二次試薬とを含み、
前記核酸アプタマーは、前記二次試薬に結合可能な核酸アプタマーである、請求項１６記載の検出用キット。 Furthermore, a primary reagent capable of binding to the detection target, and a secondary reagent capable of binding to the detection target at a site different from the primary reagent,
The detection kit according to claim 16, wherein the nucleic acid aptamer is a nucleic acid aptamer capable of binding to the secondary reagent. 前記一次試薬が一次抗体である、請求項１８記載の検出用キット。 The detection kit according to claim 18, wherein the primary reagent is a primary antibody. 前記一次試薬が一次抗原である、請求項１８記載の検出用キット。 The detection kit according to claim 18, wherein the primary reagent is a primary antigen. 前記二次試薬が二次抗体である、請求項１８から２０記載の検出用キット。 The detection kit according to claim 18, wherein the secondary reagent is a secondary antibody. 前記一次試薬が、固相に固定化された固定化試薬である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の検出用キット。 The detection kit according to any one of claims 18 to 21, wherein the primary reagent is an immobilized reagent immobilized on a solid phase. 前記固相が、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズである、請求項２２記載の検出用キット。 The detection kit according to claim 22, wherein the solid phase is a plate, a membrane, a tube, a chip, or a bead. 前記核酸アプタマーが、イムノグロブリンＧに結合可能な核酸アプタマーである、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の検出用キット。 The detection kit according to any one of claims 16 to 23, wherein the nucleic acid aptamer is a nucleic acid aptamer capable of binding to immunoglobulin G. 前記イムノグロブリンＧが、ウサギ由来イムノグロブリンＧである、請求項２４記載の検出用キット。 The detection kit according to claim 24, wherein the immunoglobulin G is a rabbit-derived immunoglobulin G. 前記核酸アプタマーが、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。 The detection kit according to any one of claims 16 to 25, wherein the nucleic acid aptamer has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. 前記核酸アプタマーが、配列番号３または配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。 The detection kit according to any one of claims 16 to 25, wherein the nucleic acid aptamer has a base sequence represented by at least one of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. 前記核酸アプタマーが、配列番号５〜配列番号９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。 The detection kit according to any one of claims 16 to 25, wherein the nucleic acid aptamer has a base sequence represented by at least one SEQ ID NO: selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 9.
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