JP2006129866A - Method for detecting test substance using nucleic acid probe - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for determining a trace substance in high sensitivity compared with an immunological technique by using the complementarity of a base. <P>SOLUTION: The method for detecting a test substance comprises the formation of a complex (1st complex) of a labeled test substance and a 1st hybrid composed of a 1st nucleic acid probe hybridized with a nucleic acid ligand, the dissociation of a labeled test substance-nucleic acid ligand complex from the 1st complex, the separation and collection of the dissociated labeled test specimen-nucleic acid ligand complex and the detection of the test substance based on the label. As an alternative, the test substance is detected by forming a complex (2nd complex) of a collected labeled test substance-nucleic acid ligand with a 2nd probe fixed to a solid phase and detecting the test substance based on the label in the 2nd complex. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、核酸プローブを用いて、特異性の高い塩基の相補反応を利用することにより、非特異吸着による誤差を低減させ、微量でも高精度で検出、定量することができる被検物質の検出方法、当該検出方法に用いられる被検物質検出用試薬キット、及び微量成分の高感度測定のための前処理等に利用できる被検物質の採取方法に関する。   The present invention uses a nucleic acid probe to detect a test substance that can be detected and quantified with high accuracy even in a small amount by reducing the error due to non-specific adsorption by utilizing a complementary reaction of a highly specific base. The present invention relates to a method, a reagent kit for detecting a test substance used in the detection method, and a method for collecting a test substance that can be used for pretreatment for highly sensitive measurement of trace components.

微量の被検物質を高感度で検出、定量したいという要望は止まるところがない。また、近年の質量分析技術の発展から、微量タンパクの同定を質量分析を利用して行なわれることが多くなり、これに伴い、夾雑物から目的のタンパクを高精度に分離精製する必要が高まってきている。
このような事情から、高感度に標的物質を分離精製し、検出定量する方法が望まれている。 There is no end to the desire to detect and quantify trace amounts of analytes with high sensitivity. In addition, with the recent development of mass spectrometry technology, the identification of trace proteins is often performed using mass spectrometry, and accordingly, the necessity for high-precision separation and purification of the target protein from contaminants has increased. ing.
Under such circumstances, a method for separating and purifying a target substance with high sensitivity and detecting and quantifying it is desired.

特定の標的物質を検出定量する方法としては、特異性が高い免疫学的手法を利用した方法（イムノアッセイ）が一般に用いられている。
抗原−抗体反応を利用したイムノアッセイは、Ｂ／Ｆ分離を行うヘテロジーニアスなアッセイと、Ｂ／Ｆ分離を行わないホモジーニアスなアッセイに分類される。 As a method for detecting and quantifying a specific target substance, a method using a highly specific immunological technique (immunoassay) is generally used.
Immunoassays utilizing the antigen-antibody reaction are classified into heterogeneous assays that perform B / F separation and homogeneous assays that do not perform B / F separation.

ヘテロジーニアスなイムノアッセイとしては、例えば図９に示すようなＥＬＩＳＡが一般に用いられている。これは、固相上に固定した第１抗体１により被検物質２を捕捉した（図９（ａ））後、さらに被検物質２に特異的な第２抗体３を添加して、第２抗体３を被検物質２に結合させ（図９（ｂ））、被検物質２に結合しなかった第２抗体（Ｆ）と、被検物質２に結合して形成される第１抗体−被検物質−第２抗体の複合体４（Ｂ）を分離した後、複合体４を検出又は定量する方法である。第２抗体に酵素等の標識を結合させることにより、複合体４の検出が容易かつ高感度で検出可能となる。   As a heterogeneous immunoassay, for example, an ELISA as shown in FIG. 9 is generally used. This is because the test substance 2 is captured by the first antibody 1 immobilized on the solid phase (FIG. 9 (a)), and then a second antibody 3 specific to the test substance 2 is further added, The antibody 3 is bound to the test substance 2 (FIG. 9B), the second antibody (F) not bound to the test substance 2 and the first antibody formed by binding to the test substance 2− This is a method for detecting or quantifying the complex 4 after separating the test substance-second antibody complex 4 (B). By binding a label such as an enzyme to the second antibody, the complex 4 can be easily detected with high sensitivity.

しかしながら、固相上に第２抗体３が非特異吸着することがあり（図９（ｃ））、この固相に非特異吸着した第２抗体３は、洗浄によるＢ／Ｆ分離では除去されずに残存していることが多い。このため、非特異吸着した第２抗体３がノイズとなるため、バックグラウンドが高くなり、微量な被検物質の検出、定量についての感度アップの改良が求められている。   However, the second antibody 3 may be non-specifically adsorbed on the solid phase (FIG. 9 (c)), and the second antibody 3 non-specifically adsorbed on the solid phase is not removed by B / F separation by washing. Often remain. For this reason, since the non-specifically adsorbed second antibody 3 becomes noise, the background becomes high, and an improvement in sensitivity for detection and quantification of a trace amount of a test substance is required.

非特異吸着によるノイズ低減、高感度なイムノアッセイとしては、特許文献１（特開２００３−１０７０８９号）で、被検物質と該被検物質と特異的に結合する物質との複合体を第１固相上に形成させた後、この複合体を溶出して第２の固相に移し替え、第２固相に結合した複合体を測定する方法を提案している。具体的には、図１０に示すように、第１の固相にジニトロフェニル抗体１１を固相化しておき、ジニトロフェニル基で標識した一次抗体１２と該一次抗体１２に結合する標的タンパク１３と該標的タンパク１３に結合する二次抗体（標識抗体）１４の複合体１５を形成させて固相に添加すると（図１０（ａ））、ジニトロフェニル基（ＤＮ）がジニトロフェニル抗体１１に結合するにしたがって、ジニトロフェニル基を介して、一次抗体−標的タンパク−二次抗体複合体が第１の固相に結合固定化される。洗浄後、第１固相上に過剰のＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン（ＮＤＬ）を添加し（図１０（ｂ））、これによりジニトロフェニル抗体に対して一次抗体とＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンとの競合反応が起り、一次抗体−標的タンパク−二次抗体の複合体１５が解離される（図１０（ｃ））。解離された複合体１５’を別の第２の固相上に移し替えて、第２の固相に結合固定化させた後、複合体を検出する。複合体を構成する抗体（例えば一次抗体１２）を、例えば、予めビオチンなどで標識しておき、第２の固相にストレプトアビジンを使用することで、一次抗体−標的タンパク−二次抗体複合体１５’を特異的に第２固相に結合固定化させることができる。このようにして、第２固相に結合した複合体を検出することで、二次抗体１４が標的分子以外に吸着するような、第１固相で生じる非特異的吸着の影響を減らすことができる。また第１固相から特異的に解離した一次抗体が第２固相に結合することから、第２固相では複合体が精製されて結合することになる。よって、第２固相上では二次抗体（標識抗体）１４の非特異的吸着の影響が減少され、結果としてノイズが低減される。   As a noise reduction and highly sensitive immunoassay by nonspecific adsorption, Patent Document 1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-107089) discloses a complex of a test substance and a substance that specifically binds to the test substance. After forming on the phase, a method is proposed in which the complex is eluted and transferred to the second solid phase, and the complex bound to the second solid phase is measured. Specifically, as shown in FIG. 10, a dinitrophenyl antibody 11 is immobilized on a first solid phase, a primary antibody 12 labeled with a dinitrophenyl group, and a target protein 13 that binds to the primary antibody 12 When a complex 15 of a secondary antibody (labeled antibody) 14 that binds to the target protein 13 is formed and added to the solid phase (FIG. 10 (a)), the dinitrophenyl group (DN) binds to the dinitrophenyl antibody 11. Accordingly, the primary antibody-target protein-secondary antibody complex is bound and immobilized to the first solid phase via the dinitrophenyl group. After washing, an excess of N-2,4-dinitrophenyl-L-lysine (NDL) is added onto the first solid phase (FIG. 10 (b)), whereby the primary antibody and N- A competitive reaction with 2,4-dinitrophenyl-L-lysine occurs, and the primary antibody-target protein-secondary antibody complex 15 is dissociated (FIG. 10C). The dissociated complex 15 ′ is transferred onto another second solid phase and bound and immobilized on the second solid phase, and then the complex is detected. The antibody constituting the complex (for example, the primary antibody 12) is labeled with, for example, biotin in advance, and streptavidin is used for the second solid phase, whereby the primary antibody-target protein-secondary antibody complex. 15 ′ can be specifically bound and immobilized on the second solid phase. In this way, by detecting the complex bound to the second solid phase, it is possible to reduce the influence of non-specific adsorption that occurs in the first solid phase such that the secondary antibody 14 is adsorbed to other than the target molecule. it can. Moreover, since the primary antibody specifically dissociated from the first solid phase binds to the second solid phase, the complex is purified and bound to the second solid phase. Therefore, the influence of non-specific adsorption of the secondary antibody (labeled antibody) 14 is reduced on the second solid phase, and as a result, noise is reduced.

しかし、このような免疫学的手法による検出、定量方法では、第１の固相から複合体を解離させる際の競合反応は平衡反応であることから、第１の固相に結合固定化された複合体の全てが競合反応の相手物質（上記例ではＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン）に置換されるということは少ないため、複合体の検出、分離される量は、第２固相に移し替える時点でのロスが少なくなく、試料中に含まれる標的物質の定量方法としては、精度的に満足できるものではなかった。従って、バックグラウンドが低く、精度の高い検出方法が望まれる。   However, in such a detection and quantification method using an immunological technique, since the competitive reaction when the complex is dissociated from the first solid phase is an equilibrium reaction, it is bound and immobilized on the first solid phase. Since it is rare that all of the complex is substituted with the partner substance of the competitive reaction (N-2,4-dinitrophenyl-L-lysine in the above example), the amount of complex detected and separated is the second The loss at the time of transfer to the solid phase is not small, and the method for quantifying the target substance contained in the sample is not satisfactory in terms of accuracy. Therefore, a detection method with low background and high accuracy is desired.

特開２００３−１０７０８９JP 2003-107089 A

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、バックグラウンドが低く、精度の高い被検物質の検出方法を提供することにある。   This invention is made | formed in view of the above situations, The objective is to provide the detection method of the test substance with a low background and high precision.

本発明の核酸プローブを用いる被検物質の検出方法は、試料中の被検物質を検出する方法であって、第１固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第１核酸プローブと、該第１核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドとがハイブリダイズした第１ハイブリッド；前記被検物質；及び該被検物質に結合可能な標識物質からなる標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させる工程；
前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体から、前記核酸リガンドと前記標識物質と前記被検物質とが結合した標識被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる工程；
解離された標識被検物質−核酸リガンド複合体を分離採取する工程；並びに
前記標識被検物質−核酸リガンド複合体中の標識物質に基づいて被検物質を検出する工程を含む。 A method for detecting a test substance using a nucleic acid probe of the present invention is a method for detecting a test substance in a sample, the first nucleic acid probe being fixed to a first solid phase and having a single-stranded portion, A first hybrid hybridized with a complementary base sequence part of a base sequence capable of hybridizing to the single-stranded part of the first nucleic acid probe and a nucleic acid ligand comprising a recognition binding part capable of specifically capturing a test substance; Forming a labeled test substance-first hybrid complex comprising a test substance; and a labeling substance that can bind to the test substance;
Dissociating the labeled analyte-nucleic acid ligand complex in which the nucleic acid ligand, the labeled substance, and the analyte are bound from the labeled analyte-first hybrid complex;
Separating and collecting the dissociated labeled test substance-nucleic acid ligand complex; and detecting the test substance based on the labeling substance in the labeled test substance-nucleic acid ligand complex.

前記分離採取した標識被検物質−核酸リガンド複合体と、第２固相に固定され且つ前記核酸リガンドの相補塩基配列部にハイブリダイズ可能な一本鎖を有する第２核酸プローブとからなる標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成し、前記被検物質の検出工程は、前記標識被検物質−第２ハイブリッド複合体中の標識物質に基づいて行なわれることが好ましい。   A labeled sample comprising the labeled analyte-nucleic acid ligand complex collected and collected, and a second nucleic acid probe having a single strand that is immobilized on a second solid phase and capable of hybridizing to a complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand. It is preferable that a test substance-second hybrid complex is formed, and the test substance detection step is performed based on the labeling substance in the labeled test substance-second hybrid complex.

前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体形成工程は、前記第１ハイブリッドに被検物質及び標識物質を結合させることにより行なってもよいし、前記第１核酸プローブに前記標識被検物質−核酸リガンド複合体を結合させることにより行なってもよい。   The labeled test substance-first hybrid complex forming step may be performed by binding a test substance and a labeling substance to the first hybrid, or the labeled test substance-nucleic acid is bound to the first nucleic acid probe. It may be performed by binding a ligand complex.

前記認識結合部は、被検物質と結合できるアプタマー、抗体、及び受容体からなる群より選ばれる１種であることが好ましい。   The recognition binding part is preferably one type selected from the group consisting of an aptamer, an antibody, and a receptor that can bind to a test substance.

また、前記相補塩基配列部はＤＮＡ又はＲＮＡで構成され、前記認識結合部は、前記相補塩基配列部の３’末端に結合していることが好ましい。   The complementary base sequence portion is preferably composed of DNA or RNA, and the recognition binding portion is preferably bound to the 3 'end of the complementary base sequence portion.

前記解離工程は、前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を含む系の温度を上げることにより行なってもよいし、あるいは、第１核酸プローブとハイブリダイズ可能であり且つ前記核酸リガンドよりも鎖長が長い一本鎖の長鎖核酸の存在下で、前記第１核酸プローブと前記核酸リガンドとのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）よりも高く且つ前記長鎖核酸と前記第１核酸プローブとのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）よりも低い温度にまで、前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を含む系の温度を上昇させることにより行なってもよい。あるいは、前記解離工程は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰからなる群より選択される少なくとも１種のデオキシヌクレオチドとの存在下で、前記第１核酸プローブを鋳型とする伸長反応により行なってもよい。   The dissociation step may be performed by raising the temperature of the system containing the labeled analyte-first hybrid complex, or may be capable of hybridizing with the first nucleic acid probe and chained more than the nucleic acid ligand. In the presence of a long long single-stranded nucleic acid, the melting temperature (Tm value) of the hybrid of the first nucleic acid probe and the nucleic acid ligand is higher than the long nucleic acid and the first nucleic acid probe. You may carry out by raising the temperature of the system containing the said labeled to-be-tested substance-1st hybrid complex to temperature lower than the melting temperature (Tm value) of a hybrid. Alternatively, the dissociation step is an extension using the first nucleic acid probe as a template in the presence of a strand displacement DNA polymerase and at least one deoxynucleotide selected from the group consisting of dATP, dGTP, dTTP and dCTP. You may carry out by reaction.

前記標識物質としては、前記被検物質に結合可能な第２認識結合部と、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群より選択される少なくとも１種とを有するもの；あるいは、前記被検物質に結合可能な第１物質と、前記第１物質に結合可能であり、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群より選択される少なくとも１種を有する第２物質とからなるものが好ましく用いられる。   The labeling substance has a second recognition binding part capable of binding to the test substance and at least one selected from the group consisting of a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance; or A first substance capable of binding to the test substance; and a second substance capable of binding to the first substance and having at least one selected from the group consisting of a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance. Those consisting of are preferably used.

本発明の被検物質の採取方法は、試料から被検物質を採取する方法であって、固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第１核酸プローブと、該第１核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドとがハイブリダイズした第１ハイブリッドと、前記被検物質とを結合させて被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させる工程；前記被検物質−第１ハイブリッド複合体から、被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる工程；及び解離された被検物質−核酸リガンド複合体を採取する工程を含む。   The method for collecting a test substance of the present invention is a method for collecting a test substance from a sample, the first nucleic acid probe being fixed to a solid phase and having a single-stranded portion, and the one of the first nucleic acid probes. A first hybrid in which a nucleic acid ligand containing a complementary base sequence part of a base sequence capable of hybridizing to a main chain part and a recognition binding part capable of specifically capturing a test substance is hybridized with the test substance. Forming a test substance-first hybrid complex; dissociating the test substance-nucleic acid ligand complex from the test substance-first hybrid complex; and dissociated test substance-nucleic acid ligand Collecting the complex.

本発明の被検物質検出用試薬キットは、試料中の被検物質を検出するために用いられる試薬キットであって、一本鎖部分を有する第１核酸プローブを固定化した第１固相；前記第１核酸プローブの一本鎖部分にハイブリダイズ可能な相補塩基配列部と、前記被検物質に結合可能な認識結合部とを有する核酸リガンド；前記核酸リガンドの認識結合部にハイブリダイズ可能な一本鎖部分を有する第２核酸プローブを固定化した第２固相；及び前記被検物質に結合可能な標識物質を含む。   The reagent kit for detecting a test substance of the present invention is a reagent kit used for detecting a test substance in a sample, and is a first solid phase on which a first nucleic acid probe having a single-stranded portion is immobilized; A nucleic acid ligand having a complementary base sequence portion capable of hybridizing to a single strand portion of the first nucleic acid probe and a recognition binding portion capable of binding to the test substance; capable of hybridizing to the recognition binding portion of the nucleic acid ligand A second solid phase on which a second nucleic acid probe having a single-stranded portion is immobilized; and a labeling substance that can bind to the test substance.

さらに、前記第１固相を洗浄するための洗浄液を含むことが好ましく、また鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰからなる群より選択される少なくとも１つのデオキシヌクレオチドとを含むことが好ましい。   Further, it preferably contains a washing solution for washing the first solid phase, and contains a strand displacement type DNA polymerase and at least one deoxynucleotide selected from the group consisting of dATP, dGTP, dTTP and dCTP. Is preferred.

尚、本明細書における「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）の他に、ＰＮＡ (Peptide Nucleic Acid)やＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、及びこれらの類縁体などの人工的に合成された核酸（以下、「人工核酸」という）も含む。また、本明細書における「塩基配列」とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列だけでなく、人工核酸の塩基配列をも含む。   In this specification, “nucleic acid” refers to artificial substances such as PNA (Peptide Nucleic Acid), BNA (Bridged Nucleic Acid), and analogs thereof, in addition to deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA). (Hereinafter referred to as “artificial nucleic acid”). In addition, the “base sequence” in the present specification includes not only DNA and RNA base sequences but also artificial nucleic acid base sequences.

本明細書における「検出」とは、被検物質の有無だけでなく、被検物質の定量をも含む概念である。   “Detection” in the present specification is a concept including not only the presence / absence of a test substance but also quantification of the test substance.

本発明の被検物質の検出方法は、被検物質を核酸リガンドに結合させ、この核酸リガンドを、核酸プローブを用いて捕捉し、さらに分離採取して第２の固相に移すことによって精製しているので、バックグラウンドノイズが少なく、高精度で微量の被検物質を検出することができる。   In the method for detecting a test substance of the present invention, a test substance is bound to a nucleic acid ligand, the nucleic acid ligand is captured using a nucleic acid probe, further separated and collected, and purified by transferring it to a second solid phase. Therefore, it is possible to detect a small amount of a test substance with high accuracy with little background noise.

また、本発明の被検物質の分離方法では、塩基の特異的反応を利用して、被検物質を核酸プローブに捕捉させ、洗浄後、解離させて採取しているので、高純度で微量の被検物質を得ることができる。   In the method for separating a test substance of the present invention, the test substance is captured by a nucleic acid probe using a base-specific reaction, washed, dissociated, and collected. A test substance can be obtained.

本発明の被検物質の検出方法は、第１固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第１核酸プローブと、該第１核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドとがハイブリダイズした第１ハイブリッド；前記被検物質；及び該被検物質に結合可能な標識物質からなる標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させる工程；
前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体から、前記核酸リガンドと前記標識物質と前記被検物質とが結合した標識被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる工程；
解離された標識被検物質−核酸リガンド複合体を分離採取する工程；並びに
前記標識被検物質−核酸リガンド複合体中の標識物質に基づいて被検物質を検出する工程を含む。 The method for detecting a test substance of the present invention comprises a first nucleic acid probe immobilized on a first solid phase and having a single-stranded portion, and a base sequence capable of hybridizing to the single-stranded portion of the first nucleic acid probe. A labeled hybrid comprising a first hybrid hybridized with a nucleic acid ligand comprising a complementary base sequence part and a recognition binding part capable of specifically capturing the test substance; the test substance; and a labeling substance capable of binding to the test substance Forming a test substance-first hybrid complex;
Dissociating the labeled analyte-nucleic acid ligand complex in which the nucleic acid ligand, the labeled substance, and the analyte are bound from the labeled analyte-first hybrid complex;
Separating and collecting the dissociated labeled test substance-nucleic acid ligand complex; and detecting the test substance based on the labeling substance in the labeled test substance-nucleic acid ligand complex.

本発明の方法が適用される被検物質としては、タンパク質、核酸、糖類、脂質、ホルモン、ハプテン、トキシン、ウィルス、微生物などが挙げられる。前記微生物とは、バクテリア、プロチスタ、クロミスタなど、肉眼で観察できないような微小生物をいう。また、これらの被検物質を含む試料としては、例えば、血液、唾液、尿、鼻汁、涙液、糞便、組織抽出液、培養液、河川水、廃液などが挙げられ、これらの試料を精製したものも含まれる。   Examples of test substances to which the method of the present invention is applied include proteins, nucleic acids, saccharides, lipids, hormones, haptens, toxins, viruses, microorganisms, and the like. The microorganisms refer to micro-organisms that cannot be observed with the naked eye, such as bacteria, prostistas, and chromistas. Samples containing these test substances include, for example, blood, saliva, urine, nasal discharge, tears, feces, tissue extract, culture fluid, river water, waste liquid, etc., and these samples were purified. Also included.

本発明で用いられる第１固相としては、第１核酸プローブを安定に固定することができるものであればよく、プレート、チューブなどの容器、メンブレン、粒子などを用いることができる。具体的には、ポリプロピレン、ポリスチレン等の合成樹脂製又はガラス製のマイクロプレート、ニトロセルロースメンブレン、ラテックス粒子、磁性粒子などが挙げられる。   The first solid phase used in the present invention is not particularly limited as long as it can stably fix the first nucleic acid probe, and a container such as a plate or a tube, a membrane, or a particle can be used. Specifically, synthetic resin such as polypropylene and polystyrene, or a glass microplate, a nitrocellulose membrane, latex particles, magnetic particles, and the like can be given.

本発明の方法で用いられる第１核酸プローブは、上記核酸リガンドの相補塩基配列部とハイブリダイズ可能な塩基配列を有するものであればよい。第１核酸プローブは、１本鎖であってもよいし、長さの異なる２本の塩基配列がハイブリダイズして二本鎖部分と一本鎖部分とを有し、この一本鎖部分が核酸リガンドの相補塩基配列部とハイブリダイズできる配列を有しているものであってもよい。また、一本鎖でステムループを形成し且つ核酸リガンドとハイブリダイズできる配列を有する一本鎖部分を有しているものであってもよい。これらのうち、ステムループ構造を有する第１核酸プローブが好ましい。プローブの二本鎖を形成しているステム部分は５〜１０ｍｅｒで、１本鎖部分が１５〜２０ｍｅｒであることが好ましい。   The first nucleic acid probe used in the method of the present invention may have any base sequence that can hybridize with the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand. The first nucleic acid probe may be single-stranded, or two base sequences having different lengths are hybridized to have a double-stranded part and a single-stranded part, and this single-stranded part is It may have a sequence capable of hybridizing with the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand. Moreover, it may have a single-stranded portion that has a sequence that forms a stem loop with a single strand and can hybridize with a nucleic acid ligand. Of these, the first nucleic acid probe having a stem-loop structure is preferred. The stem portion forming the double strand of the probe is preferably 5 to 10 mer, and the single strand portion is preferably 15 to 20 mer.

このような第１核酸プローブは、第１固相に固定されている。第１固相への固定は、第１核酸プローブが直接第１固相と結合を形成することにより固定されていてもよいし、間接的に固定されていてもよい。間接的固定方法としては、例えば、固相に特定の物質Ａを固定し、さらにこの物質に結合できる物質Ｂを第１核酸プローブに結合させ、物質Ａと物質Ｂとの結合を介して、第１核酸プローブを固相に固定化する方法；第１核酸プローブを構成する何れかの塩基にアミノ基を化合させ、このアミノ基を固相に固定化する方法；固相に特定の塩基配列Ｘを有する一本鎖の核酸を固定し、この一本鎖の核酸に、塩基配列Ｘに相補的な塩基配列Ｘｃと、核酸リガンドの相補塩基配列部にハイブリダイズ可能な塩基配列Ｙとを有する核酸プローブを結合させる方法などが挙げられる。上記物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、ストレプトアビジンとビオチンとの組み合わせなどが挙げられる。第１核酸プローブがステムループ構造である場合、ループ部分が固相に固定化されていることが好ましい。   Such a first nucleic acid probe is fixed to the first solid phase. The fixation to the first solid phase may be performed by the first nucleic acid probe directly forming a bond with the first solid phase, or may be indirectly fixed. As an indirect immobilization method, for example, a specific substance A is immobilized on a solid phase, a substance B that can be bound to this substance is bound to a first nucleic acid probe, and the binding between the substance A and the substance B is performed. A method of immobilizing one nucleic acid probe on a solid phase; a method of combining an amino group with any of the bases constituting the first nucleic acid probe, and immobilizing the amino group on the solid phase; a specific base sequence X on the solid phase A nucleic acid having a base sequence Xc complementary to the base sequence X and a base sequence Y capable of hybridizing to the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand Examples include a method of binding a probe. Examples of the combination of the substance A and the substance B include a combination of streptavidin and biotin. When the first nucleic acid probe has a stem loop structure, the loop portion is preferably immobilized on a solid phase.

本発明の方法で用いられる核酸リガンドは、第１核酸プローブの１本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部と、被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部とを含む。   The nucleic acid ligand used in the method of the present invention includes a complementary base sequence portion of a base sequence capable of hybridizing to the single strand portion of the first nucleic acid probe, and a recognition binding portion capable of specifically capturing a test substance.

認識結合部は、被検物質と特異的に結合できるものであればよく、被検物質の種類に応じて適宜選択される。認識結合部としては、抗体、レセプター、ペプチド、核酸リガンド（アプタマー）、ポリヌクレオチドなどを用いることができる。本明細書における抗体とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体だけでなく、また、抗体フラグメント、及びその誘導体をも含む。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。 The recognition binding part is not particularly limited as long as it can specifically bind to the test substance, and is appropriately selected according to the type of the test substance. As the recognition binding part, an antibody, receptor, peptide, nucleic acid ligand (aptamer), polynucleotide or the like can be used. The antibody in this specification includes not only a monoclonal antibody and a polyclonal antibody, but also an antibody fragment and a derivative thereof. Specifically, Fab, Fab ′, F (ab) 2 , and Fv fragments (Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science, 242: 423-426). The subclass of the antibody is not limited to IgG, and may be IgM.

相補塩基配列部は、天然に存在するＤＮＡやＲＮＡで構成される場合に限らず、人工核酸で構成されていてもよいが、好ましくはＤＮＡの塩基配列である。
相補塩基配列部の配列は、使用する第１核酸プローブの配列に応じて適宜決められる。具体的には、第１核酸プローブの一本鎖部分とハイブリッドを形成できる相補性を有するものであればよく、一本鎖部分と完全な相補性を有するものに限定されない。特に後の解離工程を引き起こすためには、完全一致の相補性でないことが好ましく、相補塩基配列部における第１核酸プローブの相補部分との相同性は約５０％以上であればよい。 The complementary base sequence portion is not limited to being composed of naturally occurring DNA or RNA, but may be composed of an artificial nucleic acid, but is preferably a DNA base sequence.
The sequence of the complementary base sequence portion is appropriately determined according to the sequence of the first nucleic acid probe to be used. Specifically, it is sufficient if it has complementarity capable of forming a hybrid with the single-stranded portion of the first nucleic acid probe, and is not limited to those having perfect complementarity with the single-stranded portion. In particular, in order to cause a subsequent dissociation step, it is preferable that the complementarity is not completely identical, and the homology with the complementary portion of the first nucleic acid probe in the complementary base sequence portion may be about 50% or more.

相補塩基配列部の長さとしては、第１核酸プローブと安定的に結合できる長さで、しかも採用する解離方法で容易に解離できる程度の長さの配列であることが好ましく、使用する解離方法に応じて配列、鎖長は適宜決定される。   The length of the complementary base sequence portion is preferably a length that can be stably bound to the first nucleic acid probe and that can be easily dissociated by the employed dissociation method. Depending on the sequence, the sequence and chain length are appropriately determined.

例えば、解離反応が温度上昇により行われる場合、配列は、結合が比較的緩やかなＡ−Ｔ塩基対の組合わせのみで構成されることが好ましい。また、相補塩基配列部が、Ａ−Ｔ塩基対のみで形成される場合には、相補ヌクレオチド配列部長１２〜１６ｍｅｒであることが好ましい。   For example, when the dissociation reaction is carried out by increasing the temperature, the sequence is preferably composed only of a combination of AT base pairs that are relatively loosely bound. Moreover, when a complementary base sequence part is formed only by AT base pair, it is preferable that it is 12-16 mer of complementary nucleotide sequence part length.

認識結合部がアプタマーの場合、このアプタマーに相補塩基配列部が結合してもよいし、アプタマーの一部が相補塩基配列部となっていてもよい。例えば、配列「５’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＴＣＡＣＡＡＡ ３’」（配列ＩＤ Ｎｏ．１）からなるアプタマーは、５’末端から２０塩基（ｄＴ２０部分）が相補塩基配列部で、残りの配列がトロンビンと特異的に結合する３次元構造を有する認識結合部である。   When the recognition binding portion is an aptamer, a complementary base sequence portion may be bound to this aptamer, or a part of the aptamer may be a complementary base sequence portion. For example, an aptamer consisting of the sequence “5 ′ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTACTACTGGTTGGGTGAGGTTGGGGTAGTCAAAA 3 ′” (sequence ID No. 1) is a complementary sequence sequence portion with 20 nucleotides from the 5 ′ end (dT20 portion) and a complementary sequence sequence. It is a recognition coupling part having a three-dimensional structure.

認識結合部は、相補塩基配列部の末端に接続されていることが好ましい。相補塩基配列部がＤＮＡ又はＲＮＡの場合、認識結合部は相補塩基配列部の３’末端に結合していることが好ましい。また、認識結合部がアプタマーで構成されているときは、相補塩基配列部が５’末端側に形成され、３’末端側にアプタマーを構成する配列が形成されていることが好ましい。認識結合部が抗体のときは、例えば、核酸リガンドのヌクレオチド３’端にチオール基を修飾し、マレイミド基を有するリンカー分子と結合させ、このマレイミド基の反対方向にグルタルアルデヒド基を修飾しておき、このアルデヒド基が抗体中に存在するアミノ基と共有結合することにより、抗体を結合させることができる。   The recognition binding part is preferably connected to the end of the complementary base sequence part. When the complementary base sequence portion is DNA or RNA, the recognition binding portion is preferably bound to the 3 'end of the complementary base sequence portion. Further, when the recognition binding portion is composed of an aptamer, it is preferable that the complementary base sequence portion is formed on the 5 'end side and the sequence constituting the aptamer is formed on the 3' end side. When the recognition binding portion is an antibody, for example, a thiol group is modified at the nucleotide 3 ′ end of the nucleic acid ligand, and a linker molecule having a maleimide group is bound, and a glutaraldehyde group is modified in the opposite direction of the maleimide group. The antibody can be bound by covalently bonding this aldehyde group to an amino group present in the antibody.

本発明における標識物質は、被検物質に結合可能であり、標識を有する物質である。具体的には、被検物質に結合可能な第２認識結合部と標識との組み合わせ；又は被検物質に結合可能な第１物質と、該第１物質に結合可能な標識を有する第２物質との組み合わせなどが挙げられる。   The labeling substance in the present invention is a substance that can bind to a test substance and has a label. Specifically, a combination of a second recognition binding portion capable of binding to the test substance and a label; or a second substance having a first substance capable of binding to the test substance and a label capable of binding to the first substance The combination with is mentioned.

第２認識結合部としては、塩基配列、抗体、レセプター、アプタマーなどを用いることができる。第２認識結合部が認識する被検物質の領域は、核酸リガンドの認識結合部が認識する領域とは異なることが好ましい。   A base sequence, an antibody, a receptor, an aptamer, or the like can be used as the second recognition binding portion. It is preferable that the region of the test substance recognized by the second recognition binding portion is different from the region recognized by the recognition binding portion of the nucleic acid ligand.

標識としては、検出可能なシグナルを発する物質や、検出可能なシグナルを発する生成物を生じる反応を触媒する物質などを用いることができる。例えば、３２Ｐ、１２５Ｉなどの放射性同位元素、フルオレセインなどの蛍光色素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素、量子ドット、ナノ粒子などの蛍光・発光物質、フェロセンなどの電気化学活性をもつ物質、ルテニウム、ユーロピウム錯体などの電気化学発光物質などが挙げられる。 As the label, a substance that emits a detectable signal, a substance that catalyzes a reaction that generates a product that emits a detectable signal, or the like can be used. For example, radioactive isotopes such as 32 P and 125 I, fluorescent dyes such as fluorescein, enzymes such as alkaline phosphatase (ALP) and horseradish peroxidase (HRP), fluorescent / luminescent substances such as quantum dots and nanoparticles, ferrocene, etc. Examples include electrochemically active substances, and electrochemiluminescent substances such as ruthenium and europium complexes.

標識物質が、被検物質に結合可能な第１物質と、該第１物質に結合可能な標識を有する第２物質との組み合わせで構成される場合、被検物質−第１ハイブリッド複合体に第１物質が結合し、さらにこの第１物質に第２物質が結合することにより、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を間接的に標識することができる。   When the labeling substance is composed of a combination of a first substance that can bind to the test substance and a second substance that has a label that can bind to the first substance, the test substance-first hybrid complex includes the first substance. By binding one substance and further binding the second substance to the first substance, the labeled analyte-first hybrid complex can be indirectly labeled.

以下、本発明の検出方法の各工程について説明する。
先ず、第一固相（反応容器など）において、被検物質と、第１核酸プローブと、核酸リガンドと、標識物質とを結合させ、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させる（標識被検物質−第１ハイブリッド複合体形成工程）。 Hereinafter, each step of the detection method of the present invention will be described.
First, in a first solid phase (such as a reaction vessel), a test substance, a first nucleic acid probe, a nucleic acid ligand, and a labeling substance are bound to form a labeled test substance-first hybrid complex (labeling). Test substance-first hybrid complex formation step).

被検物質、第１核酸プローブ、及び核酸リガンドの結合は、第一固相において第１核酸プローブと核酸リガンドとを先ず結合させて、第１ハイブリッドを形成し、次いで、被検物質を含む試料を添加して、第１ハイブリッド中の核酸リガンドに被検物質を結合させることによって行うことができる。また、予め核酸リガンドと被検物質とを結合させて形成された被検物質−核酸リガンド複合体を、第一固相に固定されている第１核酸プローブに結合させて、核酸リガンドと第１核酸プローブとがハイブリダイズした第１ハイブリッドを形成させることによっても行うことができる。
標識物質と被検物質との結合は、被検物質と第１ハイブリッドとの複合体を形成させる前に行ってもよいし、後に行ってもよい。 The binding of the test substance, the first nucleic acid probe, and the nucleic acid ligand is performed by first binding the first nucleic acid probe and the nucleic acid ligand in the first solid phase to form the first hybrid, and then the sample containing the test substance. Can be added to bind the test substance to the nucleic acid ligand in the first hybrid. In addition, a test substance-nucleic acid ligand complex formed by binding a nucleic acid ligand and a test substance in advance is bound to a first nucleic acid probe fixed to the first solid phase, so that the nucleic acid ligand and the first It can also be carried out by forming a first hybrid hybridized with a nucleic acid probe.
The binding between the labeling substance and the test substance may be performed before or after the complex of the test substance and the first hybrid is formed.

標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を第一固相上に形成した後、第一固相を洗浄することが好ましい。これにより、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成できなかった標識物質、核酸リガンド、被検物質などを第一固相上から除去することができる。洗浄には、洗浄液を用いることが好ましい。洗浄液としては、ＴＢＳやＰＢＳなどの緩衝液を用いることができる。   It is preferable to wash the first solid phase after the labeled analyte-first hybrid complex is formed on the first solid phase. Thereby, the labeling substance, the nucleic acid ligand, the test substance and the like that could not form the labeled test substance-first hybrid complex can be removed from the first solid phase. It is preferable to use a cleaning liquid for cleaning. As the cleaning solution, a buffer solution such as TBS or PBS can be used.

次に、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体から標識被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる（解離工程）。
解離方法としては、（１）温度上昇を利用する方法、（２）競合反応を利用する方法、（３）鎖置換反応を利用する方法などが挙げられ、使用した第１核酸プローブに応じて適宜選択される。 Next, the labeled analyte-nucleic acid ligand complex is dissociated from the labeled analyte-first hybrid complex (dissociation step).
Examples of the dissociation method include (1) a method using a temperature increase, (2) a method using a competitive reaction, (3) a method using a strand displacement reaction, and the like, depending on the first nucleic acid probe used. Selected.

（１）の方法は、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体が形成されている反応系（第１核酸プローブが固相に固定されている容器内）の温度を上昇させることにより、前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体中の第１核酸プローブと核酸リガンドの相補塩基配列部とを解離させる方法である。   In the method (1), the temperature of the reaction system in which the labeled analyte-first hybrid complex is formed (in the container in which the first nucleic acid probe is fixed to the solid phase) is increased to increase the temperature of the label. This is a method of dissociating the first nucleic acid probe and the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand in the test substance-first hybrid complex.

室温で本発明を実施する場合、第１核酸プローブと相補塩基配列部とのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）が室温以上である必要がある。さらに、このＴｍ値は、プローブや被検物質を変性させない程度の温度であることが好ましい。例えば、相補塩基配列部を構成する塩基がＡ又はＴである場合には、鎖長１２〜１６ｍｅｒであれば、Ｔｍ値は約２４〜３３℃であるから、約４０℃で解離させることができる。相補塩基配列部の塩基は、Ｃ及びＧが含まれず、Ａ及びＴから構成されていることが好ましい。   When the present invention is carried out at room temperature, the melting temperature (Tm value) of the hybrid of the first nucleic acid probe and the complementary base sequence portion needs to be room temperature or higher. Further, the Tm value is preferably a temperature that does not denature the probe and the test substance. For example, when the base constituting the complementary base sequence portion is A or T, the Tm value is about 24 to 33 ° C. when the chain length is 12 to 16 mer, and can be dissociated at about 40 ° C. . The base of the complementary base sequence part preferably does not contain C and G and is composed of A and T.

（２）の方法は、第１核酸プローブの一本鎖部分と相補的な配列を有し、且つ核酸リガンドの相補塩基配列部よりも長い鎖長を有する競合用の長鎖核酸を用いる。核酸リガンドと第１核酸プローブとのハイブリッド（第１ハイブリッド）が不安定な温度で、第１核酸プローブとより安定なハイブリッドを形成することができる競合用の長鎖核酸が共存する場合、核酸リガンドが解離して、競合用の長鎖核酸と第１核酸プローブとがハイブリッドを形成するようになる。   The method (2) uses a competitive long-chain nucleic acid having a sequence complementary to the single-stranded portion of the first nucleic acid probe and having a longer chain length than the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand. When a long-chain nucleic acid for competition capable of forming a more stable hybrid with the first nucleic acid probe coexists at a temperature at which the hybrid of the nucleic acid ligand and the first nucleic acid probe (first hybrid) is unstable, the nucleic acid ligand Dissociates and the long nucleic acid for competition and the first nucleic acid probe form a hybrid.

従って、競合反応は、核酸リガンドと第１核酸プローブとがハイブリダイズしてなる第１ハイブリッドが不安定な温度で、競合用長鎖核酸と第１核酸プローブとのハイブリッドが安定に存在出来る温度で行なうことが好ましい。つまり、競合反応温度Ｔｃは、第１ハイブリッドのＴｍ値（Ｔｍ１）よりも高く、第１核酸プローブと競合用の長鎖核酸とのハイブリッドのＴｍ値（Ｔｍ２）よりも低い温度に設定することが好ましい（Ｔｍ１＜Ｔｃ＜Ｔｍ２）。 Accordingly, the competitive reaction is performed at a temperature at which the first hybrid formed by hybridization of the nucleic acid ligand and the first nucleic acid probe is unstable, and at a temperature at which the hybrid of the long-chain nucleic acid for competition and the first nucleic acid probe can exist stably. It is preferable to do so. That is, the competitive reaction temperature Tc is set to a temperature higher than the Tm value (Tm 1 ) of the first hybrid and lower than the Tm value (Tm 2 ) of the hybrid of the first nucleic acid probe and the long nucleic acid for competition. It is preferable (Tm 1 <Tc <Tm 2 ).

（３）の方法は、鎖置換用ポリメラーゼとデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）との存在下で、第１核酸プローブを鋳型として、伸長反応をおこさせることにより、核酸リガンドを解離させる方法である。   The method (3) is a method in which a nucleic acid ligand is dissociated by causing an extension reaction using the first nucleic acid probe as a template in the presence of a strand displacement polymerase and deoxynucleotides (dNTPs).

尚、用いられるデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）は、核酸プローブの一本鎖部分の配列によって選択される。核酸プローブがアデニン、グアニン、チミン、及びシトシンの全てを有する場合にはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰの全てを用いる必要があるが、例えば、核酸プローブがアデニンを有するヌクレオチドのみからなる場合には、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰの全てを用いる必要はなく、ｄＡＴＰを用いるだけで足りる。   The deoxynucleotide (dNTP) used is selected according to the sequence of the single-stranded part of the nucleic acid probe. When the nucleic acid probe has all of adenine, guanine, thymine, and cytosine, it is necessary to use all of dATP, dGTP, dTTP, and dCTP. For example, when the nucleic acid probe consists only of nucleotides having adenine , DATP, dGTP, dTTP, and dCTP do not need to be used, only dATP is used.

また、第１核酸プローブとしては、ＤＮＡを用いることが好ましい。第１核酸プローブが一本鎖である場合は、ポリメラーゼの伸長反応の基点とするため、第１核酸プローブの、相補塩基配列部とハイブリダイズしない部分に結合することのできるプライマを用いることが好ましい。
また、第１核酸プローブがステムループ構造を有している場合は、第１核酸プローブの一本鎖部分が５’末端側であることが好ましい。この場合、第１核酸プローブの３’末端側は二本鎖となっており、これを伸長反応の基点とすることができるため、プライマを用いる必要がない。 Moreover, it is preferable to use DNA as the first nucleic acid probe. When the first nucleic acid probe is single-stranded, it is preferable to use a primer that can bind to a portion of the first nucleic acid probe that does not hybridize with a complementary base sequence portion in order to serve as a base point for a polymerase extension reaction. .
In addition, when the first nucleic acid probe has a stem-loop structure, it is preferable that the single-stranded portion of the first nucleic acid probe is on the 5 ′ end side. In this case, the 3 ′ end side of the first nucleic acid probe is double-stranded, and this can be used as a base point for the extension reaction, so that it is not necessary to use a primer.

伸長反応に於いては、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰの存在下で反応系を３７〜５０℃にすることにより、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは第１核酸プローブの３’末端を始点として、順次、ヌクレオチドを連結していく。つまり第１核酸プローブの一本鎖部分を鋳型として伸長反応が起るとともに、第１核酸プローブと核酸リガンドのハイブリダイゼーションが解かれて、核酸リガンドが解離する。   In the extension reaction, by setting the reaction system to 37 to 50 ° C. in the presence of the strand displacement DNA polymerase and dNTP, the strand displacement DNA polymerase sequentially starts from the 3 ′ end of the first nucleic acid probe. Nucleotides are linked. That is, an extension reaction occurs using the single-stranded portion of the first nucleic acid probe as a template, the hybridization between the first nucleic acid probe and the nucleic acid ligand is released, and the nucleic acid ligand is dissociated.

この方法を用いる場合は、核酸リガンドの相補塩基配列部の５’末端の１〜２塩基が第１核酸プローブと相補性を有しないことが好ましい。これにより、ポリメラーゼの伸長反応による鎖置換が起こりやすくなる。   When this method is used, it is preferable that 1 to 2 bases at the 5 'end of the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand do not have complementarity with the first nucleic acid probe. This facilitates strand displacement due to the polymerase extension reaction.

上記（１）〜（３）のいずれかの方法により、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体から、標識被検物質−核酸リガンド複合体が解離したら、標識被検物質−核酸リガンド複合体が反応系で遊離状態となっている溶液を回収する（標識被検物質−核酸リガンド複合体の分離採取工程）。   When the labeled test substance-nucleic acid ligand complex is dissociated from the labeled test substance-first hybrid complex by any one of the methods (1) to (3), the labeled test substance-nucleic acid ligand complex becomes A solution in a free state in the reaction system is collected (step of separating and collecting the labeled test substance-nucleic acid ligand complex).

採取した標識被検物質−核酸リガンド複合体を含む溶液を第１固相とは異なる容器に移し、この溶液に含まれる標識被検物質−核酸リガンド複合体中の標識物質に基づいて被検物質を検出する（検出工程）。   The solution containing the collected labeled analyte-nucleic acid ligand complex is transferred to a container different from the first solid phase, and the analyte is based on the labeled substance in the labeled analyte-nucleic acid ligand complex contained in this solution. Is detected (detection step).

採取した標識被検物質−核酸リガンド複合体を含む溶液を、第２核酸プローブが固定されている第２固相に移し、標識被検物質−核酸リガンド複合体を第２核酸プローブとハイブリダイズさせて、標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成させ（第２複合体形成工程）、標識被検物質−第２ハイブリッド複合体中の標識物質に基づいて、被検物質を検出してもよい。   The collected solution containing the labeled analyte-nucleic acid ligand complex is transferred to the second solid phase on which the second nucleic acid probe is immobilized, and the labeled analyte-nucleic acid ligand complex is hybridized with the second nucleic acid probe. Then, a labeled test substance-second hybrid complex is formed (second complex forming step), and the test substance is detected based on the labeled substance in the labeled test substance-second hybrid complex. Good.

第２核酸プローブの構成は、第１核酸プローブの構成と同様のものを用いることができる。すなわち、上記核酸リガンドの相補塩基配列部とハイブリダイズ可能な塩基配列を有するものであればよい。第２核酸プローブは、第１核酸プローブと同様に、１本鎖であってもよく、長さの異なる２本の塩基配列がハイブリダイズして二本鎖部分と一本鎖部分とを有し、この一本鎖部分が核酸リガンドの相補塩基配列部とハイブリダイズできる配列を有しているものであってもよい。また、一本鎖でステムループを形成し且つ核酸リガンドとハイブリダイズできる配列を有する一本鎖部分を有しているものであってもよい。   The configuration of the second nucleic acid probe can be the same as that of the first nucleic acid probe. In other words, any base sequence that can hybridize with the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand may be used. Similar to the first nucleic acid probe, the second nucleic acid probe may be single-stranded, and two base sequences having different lengths hybridize to have a double-stranded part and a single-stranded part. The single-stranded portion may have a sequence capable of hybridizing with the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand. Moreover, it may have a single-stranded portion that has a sequence that forms a stem loop with a single strand and can hybridize with a nucleic acid ligand.

第２核酸プローブの塩基配列は、第１核酸プローブの塩基配列と同じであってもよいし、異なる配列であってもよい。   The base sequence of the second nucleic acid probe may be the same as or different from the base sequence of the first nucleic acid probe.

本発明で用いられる第２固相は、第２核酸プローブを安定に固定することができるものであればよく、第１固相と同様に、プレート、チューブなどの容器、メンブレン、粒子などを用いることができる。   The second solid phase used in the present invention is not particularly limited as long as it can stably fix the second nucleic acid probe. Similarly to the first solid phase, a container such as a plate or a tube, a membrane, or a particle is used. be able to.

標識被検物質−核酸リガンド複合体又は標識被検物質−第２ハイブリッド複合体中の被検物質の検出方法は、標識物質の標識の種類に応じて、公知の方法から適宜選択される。例えば、標識として蛍光色素を用いた場合には、反応系に紫外線等を照射し、蛍光強度を測定することができる。また、標識としてラジオアイソトープを用いた場合には、シンチレーションカウンタなどを用いて放射能を測定すればよい。標識として酵素を用いた場合には、当該酵素の基質となる物質を加え、酵素反応によって生成した物質を定量すればよい。   The detection method of the test substance in the labeled test substance-nucleic acid ligand complex or the labeled test substance-second hybrid complex is appropriately selected from known methods according to the type of labeling of the labeling substance. For example, when a fluorescent dye is used as a label, the reaction system can be irradiated with ultraviolet rays and the fluorescence intensity can be measured. In addition, when a radioisotope is used as a label, the radioactivity may be measured using a scintillation counter or the like. When an enzyme is used as a label, a substance that is a substrate for the enzyme is added, and the substance produced by the enzyme reaction may be quantified.

第２核酸プローブがステムループ構造を有する場合、被検物質の検出の前に、ステム部分の末端と相補塩基配列部の末端とを連結してもよい。第２核酸プローブ及び相補塩基配列部がＤＮＡの場合は、ライゲースを用いることにより、末端を連結することができる。また、第２核酸プローブ及び相補塩基配列部が人工核酸の場合は、光結合などによって連結させることができる。光結合による人工核酸の連結法としては、例えば米国特許ＵＳ６５９３０８８Ｂ１号公報記載の方法を用いることができる。   When the second nucleic acid probe has a stem-loop structure, the end of the stem portion and the end of the complementary base sequence portion may be linked before detection of the test substance. When the second nucleic acid probe and the complementary base sequence portion are DNA, the ends can be connected by using ligase. Further, when the second nucleic acid probe and the complementary base sequence portion are artificial nucleic acids, they can be linked by photobonding or the like. For example, a method described in US Pat. No. 6,659,088B1 can be used as a method for linking artificial nucleic acids by photobinding.

本発明の被検物質検出用試薬キットは、第１固相から分離採取した標識被検物質−核酸リガンドを第２固相で標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成し、かかる標識被検物質−第２ハイブリッド複合体中の標識物質に基づいて被検物質を検出する検出方法に好適に用いられる試薬キットで、一本鎖部分を有する第１核酸プローブを固定化した第１固相；前記第１核酸プローブの一本鎖部分にハイブリダイズ可能な相補塩基配列部と前記被検物質に結合可能な認識結合部とを有する核酸リガンド；前記核酸リガンドの認識結合部にハイブリダイズ可能な一本鎖部分を有する第２核酸プローブを固定化した第２固相；及び前記被検物質に結合可能な標識物質を含む。   The reagent kit for detecting a test substance of the present invention comprises a labeled test substance-nucleic acid ligand separated and collected from a first solid phase to form a labeled test substance-second hybrid complex in the second solid phase, and the labeled test substance. First solid phase in which a first nucleic acid probe having a single-stranded portion is immobilized in a reagent kit suitably used for a detection method for detecting a test substance based on a labeling substance in a test substance-second hybrid complex A nucleic acid ligand having a complementary base sequence portion capable of hybridizing to a single strand portion of the first nucleic acid probe and a recognition binding portion capable of binding to the test substance; capable of hybridizing to the recognition binding portion of the nucleic acid ligand; A second solid phase on which a second nucleic acid probe having a single-stranded portion is immobilized; and a labeling substance that can bind to the test substance.

さらに、第１固相を洗浄するための洗浄液を含むことが好ましい。また、解離工程として、伸長反応を利用するキットについては、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを、更に含むことが好ましい。   Furthermore, it is preferable to include a cleaning liquid for cleaning the first solid phase. Moreover, about the kit using an extension reaction as a dissociation process, it is preferable to further contain strand displacement type DNA polymerase and dNTPs.

次に、本発明の被検物質の測定方法の一実施態様を、図１及び図２に基づいて説明する。
図１の実施態様で使用されている第１核酸プローブ２１は、１本鎖ヌクレオチドで、ステムループを形成している。２重らせんを形成していない第１核酸プローブの１本鎖部分２１ａは、ループの３’端から数塩基おいて、核酸リガンドの相補塩基配列部と相補的な配列を有している。ループを構成している塩基の一つは、ビオチンで修飾されている。このような第１核酸プローブとしては、例えば、「５’ＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＡ＊ＡＡＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＡＡ３’」（配列ＩＤ Ｎｏ．２）の配列を有するものが挙げられる。３４番目の「Ａ＊」はビオチン修飾アデニンを示している。このような配列のプローブは、例えば、タカラバイオ（株）に合成を依頼して得ることができる。 Next, one embodiment of the method for measuring a test substance of the present invention will be described based on FIG. 1 and FIG.
The first nucleic acid probe 21 used in the embodiment of FIG. 1 is a single-stranded nucleotide and forms a stem loop. The single-stranded portion 21a of the first nucleic acid probe that does not form a double helix has a sequence complementary to the complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand at several bases from the 3 ′ end of the loop. One of the bases constituting the loop is modified with biotin. Examples of such a first nucleic acid probe include those having the sequence of “5 ′ AGAACAGCGTATAATCATTAGCCCCGCCCGGCCAA * AAAGGCCGGGCGGGCTAA3 ′” (sequence ID No. 2). The 34th “A * ” indicates biotin-modified adenine. A probe having such a sequence can be obtained, for example, by requesting synthesis from Takara Bio Inc.

第１固相たるガラス容器の底面には、ストレプトアビジンが固定されている。このストレプトアビジンにビオチンが結合することにより、第１核酸プローブが第１固相に固定されている（図１（ａ））。   Streptavidin is fixed to the bottom surface of the glass container as the first solid phase. By binding biotin to this streptavidin, the first nucleic acid probe is immobilized on the first solid phase (FIG. 1 (a)).

図１に示す実施態様では、被検物質２２が蛋白質（抗原）で、認識結合部２４ａとして該抗原に特異的に結合できる抗体を使用した核酸リガンド２４を用いている。核酸リガンド２４は、第１核酸プローブ２１の１本鎖部分２１ａと相補性ある相補塩基配列部２４ｂ（「ＡＴＡＣＧＣＴＧＴＴＣＴ」など）の３’端にリンカーを介して認識結合部２４ａたる抗体が結合したものである。   In the embodiment shown in FIG. 1, the test substance 22 is a protein (antigen), and the nucleic acid ligand 24 using an antibody capable of specifically binding to the antigen is used as the recognition binding portion 24a. The nucleic acid ligand 24 is obtained by binding an antibody as a recognition binding portion 24a to the 3 ′ end of a complementary base sequence portion 24b (such as “ATACGCTGTTTCT”) complementary to the single-stranded portion 21a of the first nucleic acid probe 21 via a linker. It is.

被検物質２２は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識した二次抗体（第２認識結合物質）２３によりラベル化されている。つまり、標識物質として、被検物質に結合可能な第２認識結合部として二次抗体とＡＬＰとの組み合わせを用いている。このような標識物質が結合した被検物質が認識結合部２４ａと結合してなる標識被検物質−核酸リガンド複合体２５を、第１核酸プローブ２１が固定化された容器に添加すると、核酸リガンド２４の相補塩基配列部２４ｂと第１核酸プローブ２１の一本鎖部分２１ａとがハイブリダイズして、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体が形成される（図１（ｂ））。   The test substance 22 is labeled with a secondary antibody (second recognition binding substance) 23 labeled with alkaline phosphatase (ALP). That is, as a labeling substance, a combination of a secondary antibody and ALP is used as a second recognition binding part capable of binding to a test substance. When a labeled test substance-nucleic acid ligand complex 25 formed by binding a test substance to which such a labeled substance is bound to the recognition binding unit 24a is added to the container on which the first nucleic acid probe 21 is immobilized, a nucleic acid ligand is obtained. The 24 complementary base sequence portions 24b and the single-stranded portion 21a of the first nucleic acid probe 21 are hybridized to form a labeled analyte-first hybrid complex (FIG. 1 (b)).

鎖置換型ポリメラーゼ及び塩基を添加すると、鎖置換型ポリメラーゼ２６が第１核酸プローブ２１の３’端に結合し（図１（ｃ））、第１核酸プローブ２１の一本鎖部分２１ａであった配列を鋳型として、第１核酸プローブが３’端へ伸長していく（図１（ｄ））。
伸長反応が進行するにつれ、核酸リガンド２４の相補塩基配列部２４ｂが剥がされ、鎖置換反応が生じる。第１核酸プローブ２１の一本鎖だった部分２１ａが伸長反応により二本鎖となると、標識被検物質−核酸リガンド複合体２５が完全に解離する（図１（ｅ））。 When the strand displacement polymerase and the base were added, the strand displacement polymerase 26 was bound to the 3 ′ end of the first nucleic acid probe 21 (FIG. 1 (c)), and was a single strand portion 21a of the first nucleic acid probe 21. Using the sequence as a template, the first nucleic acid probe extends to the 3 ′ end (FIG. 1 (d)).
As the extension reaction proceeds, the complementary base sequence portion 24b of the nucleic acid ligand 24 is peeled off, causing a strand displacement reaction. When the portion 21a that is a single strand of the first nucleic acid probe 21 becomes a double strand by the extension reaction, the labeled analyte-nucleic acid ligand complex 25 is completely dissociated (FIG. 1 (e)).

解離により得られた標識被検物質−核酸リガンド複合体２５を別の容器（第２固相）に移し替える。第２固相には、第２核酸プローブ３１が固定されている（図２（ａ））。   The labeled test substance-nucleic acid ligand complex 25 obtained by the dissociation is transferred to another container (second solid phase). A second nucleic acid probe 31 is immobilized on the second solid phase (FIG. 2 (a)).

第２核酸プローブ３１は、固相に結合した二本鎖ＤＮＡの片方のストランドが長く、一本鎖部分３１ａを有する（図２（ａ））。第２核酸プローブの一本鎖部分は５’末端側に位置している。   The second nucleic acid probe 31 has a long single strand of double-stranded DNA bound to a solid phase and a single-stranded portion 31a (FIG. 2 (a)). The single-stranded portion of the second nucleic acid probe is located on the 5 'end side.

第２核酸プローブ３１が固定されている第二固相に、標識被検物質−核酸リガンド２５を添加すると、第２核酸プローブの一本鎖部分３１ａと核酸リガンド２４の相補塩基配列部２４ｂとがハイブリダイズして、標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成する（図２（ｂ））。標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成させた後、標識被検物質−第２ハイブリッド複合体の標識を測定することにより、被検物質２２を検出することができる。   When the labeled test substance-nucleic acid ligand 25 is added to the second solid phase on which the second nucleic acid probe 31 is fixed, the single-stranded portion 31a of the second nucleic acid probe and the complementary base sequence portion 24b of the nucleic acid ligand 24 are obtained. Hybridizes to form a labeled test substance-second hybrid complex (FIG. 2 (b)). After the labeled test substance-second hybrid complex is formed, the test substance 22 can be detected by measuring the label of the labeled test substance-second hybrid complex.

本実施態様では、標識としてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を使用している。例えば、パラメトキシフェニルリン酸（ｐＭＰＰ）のようなＡＬＰの基質と、標識被検物質−第２ハイブリッド複合体のＡＬＰとを所定時間反応させると（図２（ｃ））、ｐＭＰＰがｐ−メトキシフェノール（ｐＭＰ）に変化する。ＥＤＴＡを添加することによりＡＬＰの反応を停止させた（図２（ｄ））後、反応生成物であるｐＭＰの発色を測定することにより、被検物質を検出できる。   In this embodiment, alkaline phosphatase (ALP) is used as a label. For example, when an ALP substrate such as paramethoxyphenyl phosphate (pMPP) and ALP of the labeled test substance-second hybrid complex are reacted for a predetermined time (FIG. 2 (c)), pMPP is converted to p-methoxy. Changes to phenol (pMP). After stopping the ALP reaction by adding EDTA (FIG. 2 (d)), the test substance can be detected by measuring the color development of the reaction product pMP.

上述の方法を用いると、標識物質が被検物質と結合せずに固相に吸着することによって生じるバックグラウンドノイズを減らすことができ、正確に被検物質の検出を行うことができる。また、核酸リガンドを介して行なわれる核酸プローブとの解離、捕捉は、塩基の相補性に基づくもので、抗原−抗体反応よりも再現性、効率がよいので、高精度、高感度の検出、測定が可能となる。また、核酸反応を利用することは、塩基配列を随意に決定することにより核酸リガンドと核酸プローブとからなるハイブリッドのＴｍ値を設定することが可能となるので、検出方法での温度管理が簡便になる。   When the above-described method is used, the background noise caused by the labeling substance adsorbing to the solid phase without binding to the test substance can be reduced, and the test substance can be detected accurately. In addition, dissociation and capture with a nucleic acid probe performed via a nucleic acid ligand is based on base complementarity, and is more reproducible and efficient than antigen-antibody reaction. Therefore, highly accurate and sensitive detection and measurement Is possible. In addition, the use of a nucleic acid reaction makes it possible to set the Tm value of a hybrid composed of a nucleic acid ligand and a nucleic acid probe by arbitrarily determining the base sequence. Become.

尚、本発明の核酸リガンドは、上記本発明の検出方法の利用だけに限定されない。例えば、上記測定方法で被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させ、被検物質−第１ハイブリッド複合体から被検物質−核酸リガンド複合体を解離する工程、及び解離した被検物質−核酸リガンド複合体を採取する工程までを行うことで、混合物の測定試料から、目的の被検物質の分離採取することができる。すなわち高純度及び高濃度の測定試料を得ることが可能となる。従って、電気泳動や質量分析、ＬＣ、分子間相互作用測定装置（ＳＰＲ−ＲＯＭ）などに供する高純度の測定試料を得るための前処理として、被検物質−第１ハイブリッド複合体形成工程から分離採取工程までを利用することも可能である。   The nucleic acid ligand of the present invention is not limited to the use of the detection method of the present invention. For example, a step of forming a test substance-first hybrid complex by the measurement method and dissociating the test substance-nucleic acid ligand complex from the test substance-first hybrid complex, and the dissociated test substance-nucleic acid By performing the steps up to collecting the ligand complex, the target test substance can be separated and collected from the measurement sample of the mixture. That is, it is possible to obtain a measurement sample with high purity and high concentration. Therefore, as a pretreatment for obtaining a high-purity measurement sample to be used for electrophoresis, mass spectrometry, LC, intermolecular interaction measurement device (SPR-ROM), etc., it is separated from the test substance-first hybrid complex formation step. It is also possible to use up to the sampling process.

〔実施例１〕
（１）第１核酸プローブの固相化
９６穴プレートＡ（ＩＷＡＫＩ製のＥＬＩＳＡプレート）の各ウェルに、０．２ｐｍｏｌ／μｌのストレプトアビジン（ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＳＡ１０１ Ｌｏｔ，２１０８０９２９）を５０μｌ添加し、３７℃で１．７時間保存して、ストレプトアビジンを結合させた（図３（ａ））。 [Example 1]
(1) Immobilization of the first nucleic acid probe 50 μl of 0.2 pmol / μl of streptavidin (chemicon SA101 Lot, 21080929) was added to each well of 96-well plate A (IWAKI ELISA plate) at 37 ° C. After storing for 1.7 hours, streptavidin was bound (FIG. 3 (a)).

プレートＡの各ウェルを、０．１％ＢＳＡ（シグマ製）を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、各ウェルに、ＴＢＳ−ＴでＢＳＡ３％Ｓａｌｍｏｎ−ＤＮＡ（サケ***ＤＮＡ）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した溶液３００μｌを添加し、３７℃で３時間静置して、非特異吸着をブロックした。   Each well of plate A was washed with TBS (TBS-T) containing 0.1% BSA (manufactured by Sigma), and then each well was filled with BSA 3% Salmon-DNA (salmon sperm DNA) with TBS-T. 300 μl of a solution diluted to a concentration of 1 mg / ml was added and left at 37 ° C. for 3 hours to block nonspecific adsorption.

第１核酸プローブとして、ｂｉｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ用ＤＮＡ（ステムループを形成したＤＮＡでステム部分の１塩基にあたる３４番目のＡがビオチンで修飾されている：配列「５’ＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＡ＊ＡＡＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＡＡ ３’」（配列ＩＤ Ｎｏ．２））を用いた。このｂｉｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ用ＤＮＡ１ｐｍｏｌ／μｌの５０μｌをストレプトアビジンが固定された各ウェルに添加し、３７℃で５時間静置した。第１核酸プローブ中のビオチンがストレプトアビジンと結合することにより、第１核酸プローブが各ウェルの固相に固定された（図３（ｂ））。 As a first nucleic acid probe, bio-Transfer DNA (Stem loop-formed DNA in which the 34th A corresponding to one base of the stem portion is modified with biotin: sequence “5′AGAACAGCGTATAATCATTAGCCCCGCCCGGCCAA * AAAGGCCGGGCGGGCTAA 3 ′” (sequence ID No. 2)) was used. 50 μl of 1 pmol / μl of this DNA for bio-Transfer was added to each well on which streptavidin was fixed, and allowed to stand at 37 ° C. for 5 hours. The biotin in the first nucleic acid probe was bound to streptavidin, whereby the first nucleic acid probe was immobilized on the solid phase of each well (FIG. 3 (b)).

（２）標識被検物質−第１ハイブリッド複合体の形成
核酸リガンドとして、第１核酸プローブの１本鎖にハイブリダイズ可能な配列を有し、３'端に認識結合部としてビオチンが結合したもの（「５’ＡＴＡＧＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＡＡＴＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴＡ−ｂｉｏｔｉｎ ３’」（配列ＩＤ Ｎｏ．３））を用いた。第１核酸プローブ（配列ＩＤ Ｎｏ．２）の１〜９番目までの塩基と、この核酸リガンド（配列ＩＤ Ｎｏ．３）の７〜１５番目の塩基が相補的関係にある。 (2) Formation of labeled analyte-first hybrid complex A nucleic acid ligand having a sequence capable of hybridizing to the first strand of the first nucleic acid probe, and biotin bound to the 3 'end as a recognition binding moiety ("5'ATAGCGCGCTGTTCTTACTCAGGGCACTGCAATTGTGGTCCACATGGGCTGAGTTA-biotin 3 '" (sequence ID No. 3)) was used. The 1st to 9th bases of the first nucleic acid probe (sequence ID No. 2) and the 7th to 15th bases of this nucleic acid ligand (sequence ID No. 3) are in a complementary relationship.

各ウェルに、上記核酸リガンドを添加し、室温で１．７時間静置することにより、核酸リガンドと第１核酸プローブとをハイブリダイズさせた（図３（ｃ））。核酸リガンドの添加量は、ウェル５０μｌあたり、０．１×１０−１４ｍｏｌ、１×１０−１３ｍｏｌ、１×１０−１２ｍｏｌ、１×１０−１１ｍｏｌ、又は３．３×１０−１０ｍｏｌとした。 The nucleic acid ligand was added to each well and left at room temperature for 1.7 hours to hybridize the nucleic acid ligand and the first nucleic acid probe (FIG. 3 (c)). The addition amount of the nucleic acid ligand is 0.1 × 10 −14 mol, 1 × 10 −13 mol, 1 × 10 −12 mol, 1 × 10 −11 mol, or 3.3 × 10 −10 mol per 50 μl of the well. It was.

（３）被検物質の捕捉
次いで、被検物質（アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したストレプトアビジン）を添加し、核酸リガンドのビオチンでこれらを捕捉した（図３（ｄ））。尚、被検物質の捕捉は、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＮＯＲＤＩＣ社製、ＳＡｖ−ＡＰ）の２０００倍希釈液と核酸リガンドを、１時間反応させることにより行なった。これにより、核酸リガンドのビオチンと被検物質たるストレプトアビジンが結合し、その結果、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体が形成された。 (3) Capture of test substance Next, a test substance (streptavidin labeled with alkaline phosphatase (ALP)) was added, and these were captured with biotin as a nucleic acid ligand (FIG. 3 (d)). The test substance was captured by reacting a 2000-fold diluted alkaline phosphatase-labeled streptavidin (manufactured by NORDIC, SAv-AP) with a nucleic acid ligand for 1 hour. As a result, biotin as a nucleic acid ligand and streptavidin as a test substance were bound to each other, and as a result, a labeled test substance-first hybrid complex was formed.

尚、被検物質の添加量は、各ウェルにおける核酸リガンドの濃度にかかわらず、核酸リガンドのすべてに被検物質が結合する量とした。   The addition amount of the test substance was an amount that allows the test substance to bind to all of the nucleic acid ligands regardless of the concentration of the nucleic acid ligand in each well.

（４）解離工程
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔａｋａｒａ製のＲｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｏｔａｑｓｅＸＬ（ＡＭＶ）を用いた。
下記組成を含む反応液５０μｌを、各ウェルに１μｌ添加し、３７℃で１５時間反応させた。 (4) Dissociation Step As a strand displacement type DNA polymerase, Reverse Transcriqaq XL (AMV) manufactured by Takara was used.
1 μl of a reaction solution containing the following composition was added to each well and reacted at 37 ° C. for 15 hours.

Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸、４０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．２）
塩化マグネシウム ６ｍＭ
ｄＮＴＰｓ ２５０μｌ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬ（５Ｕ／μｌ） Tris buffer (50 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, pH 8.2)
Magnesium chloride 6 mM
dNTPs 250 μl
DTT 2 mM
AMV RTaseXL (5U / μl)

鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼＡＭＶは、第１ハイブリッドの核酸プローブの３’端に結合し、第１核酸プローブを鋳型として伸長させた。このようにして鎖置換型反応が起り、標識被検物質−核酸リガンド複合体が解離した（図３（ｄ））。   The strand displacement type DNA polymerase AMV was bound to the 3 'end of the first hybrid nucleic acid probe, and extended using the first nucleic acid probe as a template. In this way, a strand displacement reaction occurred, and the labeled test substance-nucleic acid ligand complex dissociated (FIG. 3 (d)).

（５）第２核酸プローブの第２固相への固定
第２固相として、オリゴｄＴ２０が固定化されたプレートＢ（ベリタス製のＧＥＮＥ ＰＬＡＴＥ２１ＧＰ０２−３ＲＮＡｔｕｒｅ）を用いた（図３（ｇ））。 (5) Immobilization of the second nucleic acid probe on the second solid phase As the second solid phase, plate B (GENE PLATE21GP02-3RNAture manufactured by Veritas) on which oligo dT20 was immobilized was used (FIG. 3 (g)).

プレートＢに、ｄＡ２０を有し且つ核酸リガンドとハイブリダイズ可能な塩基配列とを有する１本鎖の核酸を、１時間、室温で静置することによりハイブリダイズさせ、第２核酸プローブを固定化した（図３（ｅ））。   A single-stranded nucleic acid having dA20 and a base sequence capable of hybridizing with a nucleic acid ligand was allowed to hybridize by allowing it to stand at room temperature for 1 hour to immobilize the second nucleic acid probe. (FIG. 3 (e)).

プレートＢを洗浄した後、ＢＳＡを３％含むＳａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｕｍａ ＤＮＡ（サケ***ＤＮＡ）をＴＢＳ−Ｔで０．０１％に希釈した溶液を添加し、室温で１．５時間以上静置し、ブロッキングを行った。   After washing plate B, add a solution prepared by diluting Salmon Speruma DNA (salmon sperm DNA) containing 3% BSA to 0.01% with TBS-T and let stand at room temperature for 1.5 hours or longer to block. went.

（６）分離採取、移送工程
（４）で得られた標識被検物質−核酸リガンド複合体を含むプレートＡの各ウェルに収容された溶液を、マイクロピペットを用いて採取し、第２核酸プローブを固定化したプレートＢに移した（図３（ｅ））。上澄み液中には、（４）の解離反応で得られた被検物質−核酸リガンド複合体が含有されている。室温で１時間静置することにより、第２核酸プローブの一本鎖と複合体中の相補塩基配列部をハイブリダイズさせて、被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成させた（図３（ｆ））。 (6) Separation and collection, transfer step The solution contained in each well of the plate A containing the labeled analyte-nucleic acid ligand complex obtained in (4) is collected using a micropipette, and the second nucleic acid probe Was transferred to the immobilized plate B (FIG. 3E). In the supernatant, the test substance-nucleic acid ligand complex obtained by the dissociation reaction of (4) is contained. By allowing to stand at room temperature for 1 hour, the single strand of the second nucleic acid probe and the complementary base sequence portion in the complex were hybridized to form a test substance-second hybrid complex (FIG. 3 ( f)).

（７）検出測定工程
被検物質−第２ハイブリッド複合体が形成されている容器に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の基質であるｐ−メトキシフェニルフォスフェイト（ｐ−ＭＰＰ）１０ｍＭ（希釈液：０．５Ｍ、炭酸緩衝液）を１０μｌずつ添加して、ＡＬＰ反応を３７℃で３０分間行った。ＡＬＰ反応後、停止液（ＥＤＴＡ溶液：ｐＨ９）を１０μｌずつ添加した。 (7) Detection measurement step In a container in which the test substance-second hybrid complex is formed, 10 mM of p-methoxyphenyl phosphate (p-MPP) which is a substrate of alkaline phosphatase (ALP) (diluent: 0. 0). 5 M, carbonate buffer solution) was added in an amount of 10 μl, and the ALP reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes. After the ALP reaction, 10 μl of a stop solution (EDTA solution: pH 9) was added.

ＡＬＰ反応によりｐ−ＭＰＰがｐ−メトキシフェノール（ｐ−ＭＰ）に分解される。
ｐ−ＭＰ量はＡＬＰの分子数に応じて変化する。従って、ｐ−ＭＰ量を測定することによって、核酸リガンド−ストレプトアビジン−ＡＬＰ複合体の量を測定することができる。 P-MPP is decomposed into p-methoxyphenol (p-MP) by the ALP reaction.
The amount of p-MP varies depending on the number of molecules of ALP. Therefore, the amount of the nucleic acid ligand-streptavidin-ALP complex can be measured by measuring the amount of p-MP.

ｐ−ＭＰ量は、図４に示すフロー式電気化学測定系を用いて測定した。結果を図５に示す。   The amount of p-MP was measured using a flow electrochemical measurement system shown in FIG. The results are shown in FIG.

〔アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識の電気化学的手法での検出系〕
インジェクターに測定試料液（実施例１ではＡＬＰ反応を終了させた溶液）を入れる。試料液は、インジェクトバルブ（Ｒｅｏｄｉｎｅ製７７２５１）を開いて、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−ＡＭ、ＡＭ３Ｃ７ＡＭ１２Ｓ０５−Ｌ５０２ＷＴ Ｎｏ．０２７０４５８（Ｗ））、ショートカラム（ＹＭＣセミミクロガードカートリッジカラム２×１０、ＡＭ１２Ｓ０５−０１０２ＣＣ）を通って、電気化学検出部へ送液される。このときの溶出液としては、４５ｖ／ｖ％又５０ｖ／ｖ％メタノールを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液を用いた。ショートカラムは、インジェクトバルブと電極検出部の間に配置されて、測定試料に混入するタンパク成分が電極検出部に到達することで電極表面の汚れを防止する。また、ショートカラムにより緩衝液由来のノイズ電流と検出成分の電流を検出器に到達する時間で分離する。 [Detection system of alkaline phosphatase (ALP) labeling by electrochemical method]
A measurement sample solution (a solution in which the ALP reaction is completed in Example 1) is put into an injector. The sample solution was opened by opening an injection valve (Reodine 77251), ODS column (YMC-Pack-ODS-AM, AM3C7AM12S05-L502WT No. 0270458 (W)), short column (YMC semi-micro guard cartridge column 2 × 10, AM12S05-0102CC) and sent to the electrochemical detector. As an eluate at this time, a 0.1 M phosphate buffer containing 45 v / v% or 50 v / v% methanol was used. The short column is disposed between the injection valve and the electrode detection unit, and prevents protein components mixed in the measurement sample from reaching the electrode detection unit, thereby preventing contamination of the electrode surface. Moreover, the noise current derived from the buffer solution and the current of the detection component are separated by the short column by the time to reach the detector.

溶出液を収納したデガッサ（Ｖａｃｃｕｍ Ｄｅｇａｓｓｅｒ ＬＣ−２７Ａ）は溶出液の気泡を除去し、ポンプ（ＭＩＣＲＯ ＬＣポンプＬＣ−１００）により、２５０μｌ／ｍｉｎで溶出液を電気化学検出部に送ることにより、インジェターに収容した試料液が電気化学検出部に送られる。   The degasser (Vaccum Degasser LC-27A) containing the eluate removes bubbles from the eluate, and the pump (MICRO LC pump LC-100) sends the eluate to the electrochemical detector at 250 μl / min. The sample solution accommodated in is sent to the electrochemical detection unit.

ＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴ（Ｆｌｏｗ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｙｓ−Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）流路への測定試料のサンプル量は２０μｌとなるように設定した。   The sample amount of the measurement sample to the FIA-EC-DT (Flow Injection Analysis-Electrochemical-Detection) flow path was set to 20 μl.

ＦＩＡ−ＥＣ−ＤＴの電極検出部には３電極系を使用し、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ（ＢＡＳ ＲＥ３Ｖ）、カウンター電極には流路一体型電極、作用電極にはグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ００３４５６）を使用した。電気化学測定器には、ＢＡＳ社のＡＬＳ８３２ａを使用した。   The electrode detection part of FIA-EC-DT uses a three-electrode system, the reference electrode is Ag / AgCl (BAS RE3V), the counter electrode is a flow channel integrated electrode, the working electrode is a glassy carbon electrode (BAS003456) It was used. As the electrochemical measuring instrument, ALS832a manufactured by BAS was used.

各サンプルをフロー式電気化学測定系にインジェクトし、酸化電流値のピークを求めて、電気化学検出した。検出条件は、作用電極電位（酸化電位）が０．５５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、インジェクターから電極検出部までの出現時間は９０秒である。   Each sample was injected into a flow type electrochemical measurement system, and the peak of the oxidation current value was obtained and electrochemical detection was performed. The detection condition is that the working electrode potential (oxidation potential) is 0.55 V vs Ag / AgCl, and the appearance time from the injector to the electrode detector is 90 seconds.

〔比較例１〕
実施例１の操作（１）〜（３）を同様に行ない、９６穴プレートに標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させた。この状態で、ＡＬＰ反応を利用して、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体の量を測定した。 [Comparative Example 1]
The operations (1) to (3) of Example 1 were similarly performed to form a labeled test substance-first hybrid complex in the 96-well plate. In this state, the amount of the labeled test substance-first hybrid complex was measured using the ALP reaction.

アルカリフォスファターゼの測定は、図４に示すフロー式電気化学的検出系を用いて測定した。結果を図５に示す。   The alkaline phosphatase was measured using a flow electrochemical detection system shown in FIG. The results are shown in FIG.

図５の結果からバックグラウンドノイズを差し引いたシグナル値との関係を図６に示す。   FIG. 6 shows the relationship with the signal value obtained by subtracting the background noise from the result of FIG.

図５，６中、「■」は実施例、「□」は比較例を示している。横軸は、使用した核酸リガンド（核酸リガンド−ストレプトアビジン複合体）量（ｍｏｌ）を示し、縦軸は、検出系で測定された電流値（Ａ）を示している。   5 and 6, “■” indicates an example, and “□” indicates a comparative example. The horizontal axis represents the amount (mol) of nucleic acid ligand (nucleic acid ligand-streptavidin complex) used, and the vertical axis represents the current value (A) measured by the detection system.

〔評価結果〕
図５からわかるように、解離反応を行わなかったアッセイ系（比較例１）では、試料濃度が１０−１２ｍｏｌまでは、試料濃度と測定値がほぼ相関関係を有するが、それ未満では、ほぼ測定値は変化しなかった。このことは、バックグラウンドノイズが大きいために、１０−１２ｍｏｌ未満の微量試料を区別して測定できないことを意味する。 〔Evaluation results〕
As can be seen from FIG. 5, in the assay system in which the dissociation reaction was not performed (Comparative Example 1), the sample concentration and the measured value were substantially correlated until the sample concentration was 10 −12 mol. The measured value did not change. This means that the background noise is large, so that it is impossible to distinguish and measure a trace amount sample of less than 10 −12 mol.

一方、解離反応を行ったアッセイ系（実施例１）では、試料濃度と測定値がほぼ相関関係にあった。従って、解離反応を行なうアッセイ系では、１０ー１４ｍｏｌ、少なくとも１０ー１３ｍｏｌまで測定することはできる。このことは、従来のアッセイ系より検出レベルが１桁以上向上したことを意味する。 On the other hand, in the assay system (Example 1) in which the dissociation reaction was performed, the sample concentration and the measured value were substantially correlated. Thus, in the assay system to perform the dissociation reaction, 10 over 14 mol, it can be measured to at least 10 over 13 mol. This means that the detection level has improved by an order of magnitude or more over conventional assay systems.

〔実施例２〕
（１）第１核酸プローブの固相化
第１固相となる９６穴プレートＣ（CORNING社、DNA-BIND plate）の各ウェルに、５０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｐｍｏｌ アミノ化オリゴＤＮＡ（第１核酸プローブ：５’ＡＧＡＡＣＡＧＣＧＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＡ（ＮＨ２−Ａ）ＡＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＡＡ ３’（配列ＩＤ Ｎｏ．４、株式会社ベックス）を含む溶液（ｐＨ８．５）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間静置して、第１核酸プローブ４１の３５番目のアデニンに付加したアミノ基がプレートＣに結合し、第１核酸プローブ４１が固定された（図７（ａ））。 [Example 2]
(1) Immobilization of the first nucleic acid probe In each well of a 96-well plate C (CORNING, DNA-BIND plate) serving as the first solid phase, 50 mM Na 2 PO 4 , 1 mM EDTA, 100 pmol aminated oligo DNA ( First nucleic acid probe: 5 ′ AGAACAGCGTATAATCATTAGCCCCGCCCGCGCAA (NH 2 -A) AAGGCCGGGCGGGCTAA 3 ′ (sequence ID No. 4, Vex Inc.) 100 μl of a solution (pH 8.5) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. The amino group added to the 35th adenine of the first nucleic acid probe 41 was bound to the plate C, and the first nucleic acid probe 41 was fixed (FIG. 7 (a)).

プレートＣの各ウェルを、２００μｌのＰＢＳで三回洗浄した後、各ウェルに５０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＢＳＡを含むブロッキング用溶液を２００μｌ添加し、３７℃で３０分間静置して、非特異吸着をブロックした。 After washing each well of plate C three times with 200 μl of PBS, 200 μl of blocking solution containing 50 mM Na 2 PO 4 , 1 mM EDTA, 3% BSA was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. Non-specific adsorption was blocked.

（２）標識被検物質−第１ハイブリッド複合体の形成
標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成する際のハイブリダイゼーション用バッファーとして、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ（ニッポンジーン社）を希釈して調製）、０．０５％ ＳＤＳ（１０％ＳＤＳ（ニッポンジーン社）を希釈して調製）及び０．００５％ ＢＳＡを超純水に溶解した溶液を用いた。 (2) Formation of labeled test substance-first hybrid complex 5 × SSC (20 × SSC (Nippon Gene) was diluted as a hybridization buffer for forming the labeled test substance-first hybrid complex. Prepared), 0.05% SDS (prepared by diluting 10% SDS (Nippon Gene)) and 0.005% BSA dissolved in ultrapure water were used.

被検物質として、M１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（タカラバイオ社：以下、「Ｍ１３ＤＮＡ」という）を用いた。これを、サケ***ＤＮＡ（ナカライテクス社）を１０μｇ／ｍｌの濃度で含むＴＥバッファ（ニッポンジーン社）に添加し、調製した溶液を測定用試料とした。   As the test substance, M13mp18 single-stranded DNA (Takara Bio Inc .: hereinafter referred to as “M13DNA”) was used. This was added to TE buffer (Nippon Gene) containing salmon sperm DNA (Nacalai Tex) at a concentration of 10 μg / ml, and the prepared solution was used as a measurement sample.

核酸リガンド４４として、第１核酸プローブ４１及びＭ１３ＤＮＡの両者にハイブリダイズ可能な配列を持ち、３’末端をリン酸化したＤＮＡ（５’ＴＧＡＣＣＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’：配列ＩＤ Ｎｏ．５、シグマジェノシス社）を用いた。   As the nucleic acid ligand 44, a DNA having a sequence capable of hybridizing to both the first nucleic acid probe 41 and M13 DNA and phosphorylated at the 3 ′ end (5′TGACCATACGCGTCCTTTTTGTTAAAACGACGGCCAGT3 ′: sequence ID No. 5, Sigma Genosys) is used. It was.

標識物質としては、ビオチン化ＤＮＡ（第１物質４３ａ）とＨＲＰ標識ストレプトアビジン（第２物質４３ｂ）との組み合わせを用いた。第１物質４３ａであるビオチン化ＤＮＡは、核酸リガンド４４とハイブリダイズ可能で且つ被検物質であるＭ１３ＤＮＡともハイブリダイズ可能で、５’末端をビオチン化し、３’末端をリン酸化したＤＮＡ（５’ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣ３’：配列ＩＤ Ｎｏ．６、シグマジェノシス社）である。   As a labeling substance, a combination of biotinylated DNA (first substance 43a) and HRP-labeled streptavidin (second substance 43b) was used. The biotinylated DNA that is the first substance 43a can hybridize with the nucleic acid ligand 44 and also with the M13 DNA that is the test substance, and the DNA (5 ') is biotinylated at the 5' end and phosphorylated at the 3 'end. TTTTTGTCGAACTCTAGAGGATC3 ′: Sequence ID No. 6, Sigma Genosys).

第１核酸プローブ４１を固定化したプレートＣの各ウェルに、先ず上述のハイブリダイゼーション用バッファーを１００μｌずつ添加した。次にプレートＣの各ウェルに、測定用試料、核酸リガンド１０ｐｍｏｌ及び第１物質１０ｐｍｏｌを添加し、３７℃で１時間静置して、第１核酸プローブ４１と、核酸リガンド４４と、Ｍ１３ＤＮＡと、第１物質４３ａとを結合させた（図７（ｂ））。次に、プレートＣの各ウェルを洗浄バッファー（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む）２００μｌを用いて３回洗浄した。   First, 100 μl of the above-described hybridization buffer was added to each well of the plate C on which the first nucleic acid probe 41 was immobilized. Next, a sample for measurement, 10 pmol of the nucleic acid ligand and 10 pmol of the first substance are added to each well of the plate C, left at 37 ° C. for 1 hour, and the first nucleic acid probe 41, the nucleic acid ligand 44, M13 DNA, The first substance 43a was bound (FIG. 7 (b)). Next, each well of plate C was washed 3 times with 200 μl of wash buffer (containing 2 × SSC, 0.1% SDS).

プレートＣの各ウェルにブロッキング溶液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ニッポンジーン社））を２００μｌ添加して、３７℃３０分間静置してプレートのブロッキングを行った。ブロッキング溶液をウェルから除去した後、このブロッキング溶液で１０００倍希釈した標識用第２物質としてのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（1000Ｕ／ｍｌ、ロシュ社）溶液を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間静置し、第１物質４３ａと第２物質４３ｂとの間で、ビオチンとストレプトアビジンを結合させた。これにより、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体が形成された（図７（ｃ））。   200 μl of blocking solution (PBS containing 3% BSA (Nippon Gene)) was added to each well of plate C, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to block the plate. After removing the blocking solution from the well, 100 μl of HRP-labeled streptavidin (1000 U / ml, Roche) solution as a second substance for labeling diluted 1000-fold with this blocking solution was added to each well at 37 ° C. The mixture was allowed to stand for a period of time, and biotin and streptavidin were bound between the first substance 43a and the second substance 43b. Thereby, a labeled test substance-first hybrid complex was formed (FIG. 7C).

（３）解離工程
以下の組成を含む反応液１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃１時間反応させた。
１×Thermopol バッファ（New England Labs社）
１ｍＭ ｄＡＴＰｓ（インビトロジェン社）
１ｍＭ ｄＧＴＰｓ（インビトロジェン社）
１ｍＭ ｄＴＴＰｓ（インビトロジェン社）
１ｍＭ ｄＣＴＰｓ（インビトロジェン社）
２．４Ｕ／ｍｌ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（New England Labs社）
なお、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。
この反応によって、標識被検物質−第１ハイブリッド複合体からＨＲＰで標識された被検物質−核酸リガンド複合体を解離させ、反応液中に遊離させた。 (3) Dissociation Step 100 μl of a reaction solution containing the following composition was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
1 x Thermopol buffer (New England Labs)
1 mM dATPs (Invitrogen)
1 mM dGTPs (Invitrogen)
1 mM dTTPs (Invitrogen)
1 mM dCTPs (Invitrogen)
2.4 U / ml Bst DNA polymerase (New England Labs)
Bst DNA polymerase is a strand displacement type DNA polymerase.
By this reaction, the test substance-nucleic acid ligand complex labeled with HRP was dissociated from the labeled test substance-first hybrid complex and released into the reaction solution.

（４）第２核酸プローブの固定化
第２固相となる９６穴プレートＤ（CORNING社、DNA-BIND plate）の各ウェルに５０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｐｍｏｌ ３’末端アミノ化オリゴＤＮＡ（第２核酸プローブ：５’ ＡＧＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴ３’：配列ＩＤ Ｎｏ．７、シグマジェノシス社）を含む溶液（ｐＨ８．５）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間静置して、第２核酸プローブ５１を結合させた。その後、プレートＤに固定化されなかった第２核酸プローブを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄することにより除去した。 (4) Immobilization of the second nucleic acid probe 50 mM Na 2 PO 4 , 1 mM EDTA, 100 pmol 3 ′ terminal aminated oligo DNA in each well of a 96-well plate D (CORNING, DNA-BIND plate) serving as the second solid phase 100 μl of a solution (pH 8.5) containing (second nucleic acid probe: 5 ′ AGAGCAGCGTATGGTCATTTTTTT3 ′: sequence ID No. 7, Sigma Genosys) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Were combined. Thereafter, the second nucleic acid probe not immobilized on the plate D was removed by washing with 200 μl of PBS three times.

（５）移送工程
（３）で得られたプレートＣの反応液の全量をプレートＤの各ウェルに移動した。移動後、３７℃で１時間静置することにより、反応液中のＨＲＰで標識した被検物質−核酸リガンド複合体を第２核酸プローブ５１とハイブリダイズさせ、標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成させた（図１０）。標識被検物質−第２ハイブリッド複合体の形成後、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。 (5) Transfer step The entire amount of the reaction solution of plate C obtained in (3) was moved to each well of plate D. After moving, the test substance-nucleic acid ligand complex labeled with HRP in the reaction solution is allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to hybridize with the second nucleic acid probe 51, and the labeled test substance-second hybrid complex A body was formed (FIG. 10). After formation of the labeled test substance-second hybrid complex, each well was washed 3 times with 200 μl of PBS.

（６）検出工程
（５）の工程を終了した後、各ウェルの洗浄用のＰＢＳを除去した。次に、各ウェルにＨＲＰの基質であるＴＭＢ（3,3',5,5'Tetramethylbensidine ）を含む基質溶液１００μｌを添加し、３７℃で反応させ、ＨＲＰの作用で基質であるＴＭＢを分解し、発色させた。１時間後、各ウェルに１００μｌの１Ｎ ＨＣｌ（和光純薬社）を加えて反応を停止させた。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダ（TECAN社、Safire2）を用いて測定した。 (6) Detection Step After completing the step (5), PBS for washing each well was removed. Next, 100 μl of a substrate solution containing TMB (3,3 ′, 5,5′tetramethylbensidine), which is an HRP substrate, is added to each well and reacted at 37 ° C. to decompose TMB as a substrate by the action of HRP. Color was developed. After 1 hour, 100 μl of 1N HCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well to stop the reaction. The absorbance at 450 nm of each well was measured using a plate reader (TECAN, Safire 2).

また、測定の際のバックグラウンド値を測定するため、被検物質を含まない試料（0 fmol）を用いて実施例２の（１）〜（６）を実施し、吸光度測定を行った。測定結果を表１に示す。   Moreover, in order to measure the background value at the time of measurement, (1)-(6) of Example 2 was implemented using the sample (0 fmol) which does not contain a test substance, and the light absorbency measurement was performed. The measurement results are shown in Table 1.

〔比較例２〕
実施例２と同様にして（１）〜（２）の工程を実施した。その後、（３）〜（５）の工程を行わず、（６）と同様にしてＨＲＰによる発色反応を行い、吸光度を測定した。また、測定の際のバックグラウンド値を測定するため、被検物質を含まない試料（0 fmol）を用いて実施例２の（１）〜（２）を実施し、さらに（６）と同様にしてＨＲＰによる発色反応を行い、吸光度測定を行った。測定結果を表１に示す。 [Comparative Example 2]
The steps (1) to (2) were carried out in the same manner as in Example 2. Thereafter, the steps (3) to (5) were not performed, and a color development reaction with HRP was performed in the same manner as in (6), and the absorbance was measured. In addition, in order to measure the background value at the time of measurement, (1) to (2) of Example 2 was carried out using a sample (0 fmol) that did not contain the test substance, and in the same manner as (6). Then, a color reaction with HRP was performed, and the absorbance was measured. The measurement results are shown in Table 1.

Figure 2006129866
Figure 2006129866

実施例２のバックグラウンド値（被検物質量が０ｆｍｏｌの場合の吸光度）は、比較例２のバックグラウンド値に比べ、約１０分の１の値を示した。また、実施例２のシグナル値（被検物質量が１０ｆｍｏｌの場合の吸光度）は、比較例２のシグナル値に比べ、約２分の１の値を示した。シグナル値とバックグラウンド値（ノイズ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、比較例２の２．４７に比べて実施例２は１２．４となり、約５倍の値を示した。   The background value of Example 2 (absorbance when the amount of the test substance was 0 fmol) was about 1/10 of the background value of Comparative Example 2. Further, the signal value of Example 2 (absorbance when the amount of the test substance was 10 fmol) was about half that of the signal value of Comparative Example 2. The ratio between the signal value and the background value (noise) (S / N ratio) was 12.4 in Example 2 compared to 2.47 in Comparative Example 2, indicating a value about 5 times as large.

実施例２及び比較例２より、第一固相から標識被検物質−核酸リガンド複合体を分離採取し、これを第二固相へ移送することによって被検物質の検出の際のバックグラウンド値が大幅に低下することが確認された。また、Ｓ／Ｎ比も大きく向上し、高精度で被検物質を検出することができた。従って、本発明の検出方法によると、バックグラウンドが少なく、試料に含まれる微量の被検物質を高精度で検出することができることがわかる。   From Example 2 and Comparative Example 2, the labeled test substance-nucleic acid ligand complex is separated and collected from the first solid phase, and this is transferred to the second solid phase to detect the background value when detecting the test substance. Was confirmed to decrease significantly. In addition, the S / N ratio was greatly improved, and the test substance could be detected with high accuracy. Therefore, according to the detection method of the present invention, it can be seen that a small amount of a test substance contained in a sample can be detected with high accuracy with little background.

本発明の測定方法は、微量の被検物質、特に試料中に目的物質が微量に含まれている場合の、目的物質の検出、定量に利用できる。
また、試料に含まれる特定物質について、質量分析、電気泳動、分子間相補作用測定を行なうに際して、高純度の測定試料を得るための前処理として利用できる。 The measurement method of the present invention can be used for detection and quantification of a target substance when the target substance is contained in a trace amount, particularly in a sample.
In addition, when a specific substance contained in a sample is subjected to mass spectrometry, electrophoresis, or intermolecular complementary action measurement, it can be used as a pretreatment for obtaining a high-purity measurement sample.

本発明の測定方法の一実施態様を説明するための図である。It is a figure for demonstrating one embodiment of the measuring method of this invention. 本発明の測定方法の一実施態様を説明するための図である。It is a figure for demonstrating one embodiment of the measuring method of this invention. 実施例１の操作を説明するための図である。FIG. 6 is a diagram for explaining an operation of the first embodiment. アルカリホスファターゼの反応の測定に用いたシステムの構成を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the structure of the system used for the measurement of the reaction of alkaline phosphatase. 供した試料濃度と測定電流値との関係の測定結果を示すグラフである。It is a graph which shows the measurement result of the relationship between the provided sample density | concentration and measured current value. 図５の結果からバックグラウンドノイズを差し引いたグラフである。6 is a graph obtained by subtracting background noise from the results of FIG. 実施例２の操作を説明するための図である。FIG. 10 is a diagram for explaining an operation of the second embodiment. 実施例２の操作を説明するための図である。FIG. 10 is a diagram for explaining an operation of the second embodiment. 従来の測定方法を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the conventional measuring method. 従来の測定方法を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the conventional measuring method.

符号の説明Explanation of symbols

２１ 第１核酸プローブ
２２ 被検物質
２３ 二次抗体（第２認識結合物質）
２４ 核酸リガンド
２４ａ 認識結合部
２４ｂ 相補塩基配列部
２５ 標識被検物質−核酸リガンド複合体
２６ 鎖置換型ポリメラーゼ
３１ 第２核酸プローブ
４１ 第１核酸プローブ
４３ａ 第１物質
４３ｂ 第２物質
４４ 核酸リガンド
５１ 第２核酸プローブ 21 First nucleic acid probe 22 Test substance 23 Secondary antibody (second recognition binding substance)
24 Nucleic acid ligand 24a Recognition binding part 24b Complementary base sequence part 25 Labeled analyte-nucleic acid ligand complex 26 Strand displacement polymerase 31 Second nucleic acid probe 41 First nucleic acid probe 43a First substance 43b Second substance 44 Nucleic acid ligand 51 First Two nucleic acid probes

Claims (15)

試料中の被検物質を検出する方法であって、
第１固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第１核酸プローブと、該第１核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドとがハイブリダイズした第１ハイブリッド；前記被検物質；及び該被検物質に結合可能な標識物質からなる標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させる工程；
前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体から、前記核酸リガンドと前記標識物質と前記被検物質とが結合した標識被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる工程；
解離された標識被検物質−核酸リガンド複合体を分離採取する工程；並びに
前記標識被検物質−核酸リガンド複合体中の標識物質に基づいて被検物質を検出する工程
を含む核酸プローブを用いる被検物質の検出方法。 A method for detecting a test substance in a sample,
A first nucleic acid probe immobilized on a first solid phase and having a single-stranded portion, a complementary base sequence portion of a base sequence capable of hybridizing to the single-stranded portion of the first nucleic acid probe, and a test substance A first hybrid hybridized with a nucleic acid ligand containing a recognition-binding moiety that can be captured on; a test substance; and a labeled test substance-first hybrid complex comprising the test substance; and a labeling substance that can bind to the test substance Process;
Dissociating the labeled analyte-nucleic acid ligand complex in which the nucleic acid ligand, the labeled substance, and the analyte are bound from the labeled analyte-first hybrid complex;
Separating and collecting the dissociated labeled analyte-nucleic acid ligand complex; and detecting the analyte based on the labeled substance in the labeled analyte-nucleic acid ligand complex Method for detecting a test substance. 前記分離採取した標識被検物質−核酸リガンド複合体と、第２固相に固定され且つ前記核酸リガンドの相補塩基配列部にハイブリダイズ可能な一本鎖を有する第２核酸プローブとからなる標識被検物質−第２ハイブリッド複合体を形成し、
前記被検物質の検出工程は、前記標識被検物質−第２ハイブリッド複合体中の標識物質に基づいて行なわれる請求項１に記載の検出方法。 A labeled sample comprising the labeled analyte-nucleic acid ligand complex collected and collected, and a second nucleic acid probe having a single strand that is immobilized on a second solid phase and capable of hybridizing to a complementary base sequence portion of the nucleic acid ligand. Forming a test substance-second hybrid complex,
The detection method according to claim 1, wherein the detection step of the test substance is performed based on the labeling substance in the labeled test substance-second hybrid complex. 前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体形成工程は、
前記第１ハイブリッドに、被検物質及び標識物質を結合させることにより行なわれる請求項１又は２に記載の検出方法。 The labeled analyte-first hybrid complex formation step includes:
The detection method according to claim 1, wherein the detection method is performed by binding a test substance and a labeling substance to the first hybrid. 前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体形成工程は、
前記第１核酸プローブに、前記標識被検物質−核酸リガンド複合体を結合させることにより行なわれる請求項１又は２に記載の検出方法。 The labeled analyte-first hybrid complex formation step includes:
The detection method according to claim 1, wherein the detection method is performed by binding the labeled analyte-nucleic acid ligand complex to the first nucleic acid probe. 前記認識結合部は、被検物質と結合できるアプタマー、抗体、及び受容体からなる群より選ばれる１種である請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。 The measurement method according to any one of claims 1 to 4, wherein the recognition binding part is one selected from the group consisting of an aptamer, an antibody, and a receptor that can bind to a test substance. 前記相補塩基配列部はＤＮＡ又はＲＮＡで構成され、
前記認識結合部は、前記相補塩基配列部の３’末端に結合している請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 The complementary base sequence part is composed of DNA or RNA,
The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the recognition binding portion is bound to the 3 ′ end of the complementary base sequence portion. 前記解離工程は、前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を含む系の温度を上げることにより行われる請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。 The measurement method according to claim 1, wherein the dissociation step is performed by raising a temperature of a system including the labeled analyte-first hybrid complex. 前記解離工程は、
第１核酸プローブとハイブリダイズ可能であり且つ前記核酸リガンドよりも鎖長が長い一本鎖の長鎖核酸の存在下で、
前記第１核酸プローブと前記核酸リガンドとのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）よりも高く且つ前記長鎖核酸と前記第１核酸プローブとのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）よりも低い温度にまで、
前記標識被検物質−第１ハイブリッド複合体を含む系の温度を上昇させることにより行なわれる請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。 The dissociation step includes
In the presence of a single-stranded long-chain nucleic acid that can hybridize with the first nucleic acid probe and has a longer chain length than the nucleic acid ligand,
To a temperature higher than the melting temperature (Tm value) of the hybrid of the first nucleic acid probe and the nucleic acid ligand and lower than the melting temperature (Tm value) of the hybrid of the long nucleic acid and the first nucleic acid probe,
The detection method according to any one of claims 1 to 6, which is carried out by increasing the temperature of a system containing the labeled analyte-first hybrid complex. 前記解離工程は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰからなる群より選択される少なくとも１種のデオキシヌクレオチドとの存在下で、前記第１核酸プローブを鋳型とする伸長反応により行われる請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。 The dissociation step is performed by an extension reaction using the first nucleic acid probe as a template in the presence of a strand displacement DNA polymerase and at least one deoxynucleotide selected from the group consisting of dATP, dGTP, dTTP, and dCTP. The detection method according to claim 1, wherein the detection method is performed. 前記標識物質は、
前記被検物質に結合可能な第２認識結合部と、
放射性同位元素、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群より選択される少なくとも１種とを有する請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法。 The labeling substance is
A second recognizing and binding part capable of binding to the test substance;
The detection method according to claim 1, comprising at least one selected from the group consisting of a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance. 前記標識物質は、
前記被検物質に結合可能な第１物質と、
前記第１物質に結合可能であり、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群より選択される少なくとも１種を有する第２物質とからなる請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法。 The labeling substance is
A first substance capable of binding to the test substance;
The second substance that can bind to the first substance and has at least one selected from the group consisting of a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance. Detection method. 試料から被検物質を採取する方法であって、
固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第１核酸プローブと、該第１核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドとがハイブリダイズした第１ハイブリッドと、
前記被検物質とを結合させて被検物質−第１ハイブリッド複合体を形成させる工程；
前記被検物質−第１ハイブリッド複合体から、被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる工程；及び
解離された被検物質−核酸リガンド複合体を採取する工程；
を含む被検物質の採取方法。 A method for collecting a test substance from a sample,
Specific capture of a first nucleic acid probe immobilized on a solid phase and having a single-stranded portion, a complementary base sequence portion of a base sequence capable of hybridizing to the single-stranded portion of the first nucleic acid probe, and a test substance A first hybrid hybridized with a nucleic acid ligand comprising a recognizable binding moiety,
Binding the test substance to form a test substance-first hybrid complex;
Dissociating the test substance-nucleic acid ligand complex from the test substance-first hybrid complex; and collecting the dissociated test substance-nucleic acid ligand complex;
For collecting test substances containing 試料中の被検物質を検出するために用いられる試薬キットであって、
一本鎖部分を有する第１核酸プローブを固定化した第１固相；
前記第１核酸プローブの一本鎖部分にハイブリダイズ可能な相補塩基配列部と、前記被検物質に結合可能な認識結合部とを有する核酸リガンド；
前記核酸リガンドの認識結合部にハイブリダイズ可能な一本鎖部分を有する第２核酸プローブを固定化した第２固相；及び
前記被検物質に結合可能な標識物質；
を含む被検物質検出用試薬キット。 A reagent kit used to detect a test substance in a sample,
A first solid phase on which a first nucleic acid probe having a single-stranded portion is immobilized;
A nucleic acid ligand having a complementary base sequence portion capable of hybridizing to a single-stranded portion of the first nucleic acid probe and a recognition binding portion capable of binding to the test substance;
A second solid phase on which a second nucleic acid probe having a single-stranded portion capable of hybridizing to a recognition binding portion of the nucleic acid ligand is immobilized; and a labeling substance capable of binding to the test substance;
A reagent kit for detecting a test substance, comprising: さらに、前記第１固相を洗浄するための洗浄液を含む請求項１３に記載の試薬キット。 The reagent kit according to claim 13, further comprising a cleaning solution for cleaning the first solid phase. 鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰからなる群より選択される少なくとも１種のデオキシヌクレオチドとを、さらに含む請求項１３又は１４に記載の試薬キット。
The reagent kit according to claim 13 or 14, further comprising: a strand displacement type DNA polymerase; and at least one deoxynucleotide selected from the group consisting of dATP, dGTP, dTTP, and dCTP.
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