JP5396403B2 - 改良されたプロモーターおよびこれを用いたl−リシンの生産方法 - Google Patents
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Description
ところが、現在まで、リシン生合成経路のうち最も核心的な役割を担当するものと思われる遺伝子としてのlysC−asdオペロンのプロモーターを改良して発現率を高めたコリネ型細菌については開示されたことがない。
本発明の他の目的は、前記プロモータ活性を有する核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養する段階を含む、リシンの生産方法を提供することにある。
他の様態として、本発明は、前記改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターに関する。
具体的に、本発明のベクターは、宿主細胞内に導入させ、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列が宿主細胞ゲノム上の内在性lysC−asdオペロン遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こし、染色体内に挿入できる。したがって、本発明のベクターとしては、宿主染色体への挿入有無を確認するための選択マーカーをさらに含みうる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択する、すなわち目的遺伝子の挿入有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーが使用できる。選択剤で処理された環境では、選択マーカーを発現する細胞のみが生存し、あるいは他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。ベクターとして好ましくは、lacZ遺伝子が挙げられる。
本発明のベクターで形質転換された形質転換体では、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミカムのlysC−asdオペロン遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異されたプロモーター配列で代替することにより、lysC−asdオペロン遺伝子は改良されたプロモーターを有する。これにより形質転換体は、アスパラギン酸キナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が天然型より増加する特徴を持つ。
(1)染色体挿入用ベクター(pDZ)の製作
本実施例では、大腸菌クローニング用ベクターpACYC177(New England Biolab、GenBank accetion #X06402)を基本ベクターとして用いて、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZを製作した。
pACYC177ベクターをAcuIおよびBanI制限酵素で処理した後、クレノウ酵素処理によって平滑末端化した。選択マーカーとして使用される大腸菌由来のlacZ遺伝子は、大腸菌K12 W3110のゲノムDNAからPCRによって自体プロモーターを含むように増幅した後、T4 DNAポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼ処理によって5’−末端リン酸化および平滑化することにより準備した。このように準備した2種のDNA断片を接合し、接合された環状DNA分子の制限酵素BamHI部位に、人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZを完成した。図1はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZを示す図である。
本実施例では、リシンを生産する菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカム由来のlysC−asdオペロン遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクターを製作した。
まず、米国国立衛生研究所のジーンバンク(NIH GenBank)から、lysC−asd遺伝子(NCBI登録番号NCg10247)のプロモーター部位を含む塩基配列(配列番号1)を確保し、主要部位に変形された配列を有するプロモーターを含むDNA断片(配列番号2)を確保した。変形プロモーター配列は一般に微生物において知られているプロモーターコンセンサス配列に基づいて考案した。
また、前記変形されたプロモーター配列を製造するためのプライマーは、前記塩基配列に基づいて4つのプライマー(表1、配列番号3〜6)を合成した。
本実施例では、コリネバクテリウムの染色体上のlysC−asdオペロンプロモーターを改良するために、前記で製作した組換えベクターをリシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10881に形質転換させて、菌株染色体のプロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列を相同組換えによって置換させることにより、染色体内に前記改良プロモーター配列を挿入させた。
最終的に、二重交差工程を経て、染色体上でlysC−asd遺伝子のプロモーターの主要部位に置換された塩基を含んでいる、リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10881−lysCP1を得た。
母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10881菌株および実施例2で最終的に製作されたL−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10881−lysCP1菌株を培養し、培養液からタンパク質を分離してアスパラギン酸キナーゼ酵素活性を測定した。
原糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸留水1L基準)
母菌株として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10881菌株、および実施例2で最終的に製作されたL−リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10881−lysCP1菌株を、L−リシン生産のために下記の方法で培養した。
原糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO47H2O0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸留水1L基準)
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(蒸留水1L基準)
表3に示すように、アスパラギン酸キナーゼ活性が5倍以上強化されたKFCC10881−lysCP1菌株は、母菌株KFCC10881に比べてリシン生産効率が5%以上増加したことを確認することができた。
Claims (9)
- 配列番号2の1〜353番目のヌクレオチド配列を持つ、改良されたプロモーター活性を有する核酸分子。
- 請求項1の改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項1の核酸分子、ならびに該核酸分子に作動可能に連結されたアスパラギン酸キナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された、形質転換体。
- 前記形質転換体が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属である、請求項3に記載の形質転換体。
- 受託番号KCCM10919Pであって、CA01−0135と命名された、請求項3に記載の形質転換体。
- 請求項1の核酸分子が、染色体内に相同組換えで挿入されることを特徴とする、請求項3に記載の形質転換体。
- 請求項1の核酸分子を、プラスミド形態で保有していることを特徴とする、請求項3に記載の形質転換体。
- 請求項1の核酸分子、ならびに該核酸分子に作動可能に連結されたアスパラギン酸キナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された、リシン生産能を有する原核生物の形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法。
- 発酵培養の間に生成されるリシンを回収する工程をさらに含む、請求項8に記載のリシンの生産方法。
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