KR102011394B1 - 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 - Google Patents

퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 (genus Corynebacterium) 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 생산방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 {Microorganism producing putrescine and method of producing putrescine using the microorganism}
본 발명은 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 당해 미생물을 이용한 퓨트레신의 생산방법에 관한 것이다.
코리네형 미생물은 L- 아미노산 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 다양한 용도를 갖는 물질을 산업적으로 생산하는데에 자주 이용되는 그람양성 미생물이다. 근래에는 디아민(diamine), 케토산(keto-acid) 등을 코리네형 미생물로부터 생산하기도 한다.
미생물 발효를 통하여 유용 산물을 생산하기 위하여, 미생물내 목적산물의 생합성 경로 강화와 함께 에너지원 또는 환원력에 대한 요구가 증가한다. 이 중, 환원력을 공급하는데 있어 NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)는 필수요소이다. 산화형인 NADP+와 환원형인 NADPH는 서로 생체내 전자 전달 물질로, 여러 합성과정에 관여한다. 중앙대사 경로중 NADPH를 생산하는 경로에는 1) 산화적 오탄당 인산경로(oxidative pentose phosphate pathway)와 2) TCA경로의 NADP 의존성 이소시트르산 탈수소효소(NADP-dependent isocitrate dehydrogenase; Icd 유전자)에 의해 주로 생산되는 것으로 알려져 있다. 이외 여러 미생물에서 NADPH를 공급하기 위한 다양한 대안경로로써 말레익 효소 (malate enzyme), 글루코즈 디하이드로게나제 (glucose dehydrogenase). 비인산화 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (nonphosphorylation glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 가지고 있다.
또한 중앙대사경로와 무관하게 NADPH를 생산하는 효소로는 트렌스수소화효소 (transhydrogenase), 페레독신 NADP+ 산화환원효소 (Ferredoxin:NADP+ oxidoredutase) 등이 있다.
한편, 퓨트레신은 폴리아미드의 원료 물질 중 하나로 알려져 있다. 퓨트레신은 주로 석유화합물을 원료물질로 하는 화학적 방법으로 생산되며, 근래 들어 미생물의 유전자 조작 기술 및 발효 기술을 이용한 퓨트레신 발효 생산 기술이 연구되고 있다. 예를 들어, 대장균과 코리테박테리움속 미생물을 형질전환하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 공개되어 있다(Morris et al., J Biol. Chem. 241: 13, 3129-3135, 1996, 국제특허공개 WO06/005603; 국제특허공개 WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 17-30, 2011).
그러나, 환원력과 퓨트레신 생산능과의 관계에 대하여는 아직까지 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 퓨트레신 생산 미생물에서 퓨트레신의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 고농도 퓨트레신 생산을 위한 NADPH 강화하는 다방면의 연구를 통하여 코리네박테리움 속 미생물에서 퓨트레신 생산이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 생산능이 비변형 미생물에 비해 증가된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 생산능이 비변형 미생물에 비해 증가된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)"는 니코틴 아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 구조를 공유하는 NADH와 함께 많은 산화환원효소(oxidoreductase와 dehydrogenase)의 반응에 전자 공여체로 참여해 환원력을 제공하는 조효소의 일종이다. 이들 조효소의 산화물(NAD+와 NADP+)은 생체 이화반응에서 생성되는 에너지를 전자와 프로톤 형태로 수용하는 중요한 기능을 담당하며, 산화환원효소 반응에 전자 수용체로 참여하는 것으로 알려져 있다.
구체적으로 상기 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 NADPH 생산능을 증가시키기 위해서 (1) NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 트랜스케톨라제(Transketolase), 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 (Glucose-6- phosphate 1- dehydrogenase), 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase), NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase), 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (nicotinate phosphoribosyltransferase), 및 NAD+ 키나제 (NAD+ kinase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성이 강화되거나, (2) 글루코네이트 키나제 (Gluconate kinase) 및 NAD+ 디포스포파타아제 (NAD+ diphosphophatase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성이 불활성화되거나, (3) (1) 및 (2)의 조합으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (1) NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 트랜스케톨라제(Transketolase), 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 (Glucose-6- phosphate dehydrogenase), 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase), NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase), 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (nicotinate phosphoribosyltransferase), 및 NAD+ 키나제 (NAD+ kinase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성의 강화는 1이상, 2이상, 3이상, 4이상, 5이상 또는 모든 효소의 활성이 증가되는 것일 수 있다.
또한, 상기 (2) 글루코네이트 키나제 (Gluconate kinase) 및 NAD+ 디포스포파타아제 (NAD+ diphosphophatase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 또는 2 모두의 활성이 불활성화되는 것일 수 있다.
또한, 상기 (3)에서, (1) 및 (2)의 조합은 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 트랜스케톨라제(Transketolase), 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 (Glucose-6- phosphate dehydrogenase), 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase), NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase), 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (nicotinate phosphoribosyltransferase), 및 NAD+ 키나제 (NAD+ kinase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성의 강화는 1이상, 2이상, 3이상, 4이상, 5이상 또는 모든 효소의 활성이 증가되고 글루코네이트 키나제 (Gluconate kinase) 및 NAD+ 디포스포파타아제 (NAD+ diphosphophatase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 또는 2 모두의 활성이 불활성화되는 조합일 수 있다.
본 출원에서 용어, "NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)"는 D- 글리세르알데드-3-포스페이트 (D-glyceraldehyde-3-phosphate)로부터 3-포스포-D-글리세레이트 (3-phospho-D-glycerate)로 전환하면서 NADPH 1분자를 합성하는 효소를 통칭한다.
구체적으로 상기 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제는 서열번호 1 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 1 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 혹은 서열번호 1 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "트랜스케톨라제(Transketolase)"는 오탄당 인산 경로에 영향을 미치는 효소로서 D-크실룰로오스-5-인산과 D-리보오스-5-인산으로부터 D-세도헵툴로오스-7-인산과 D-글리세르알데히드-3-인산을 생성한다.
구체적으로 상기 트랜스케톨라제는 서열번호 10 또는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 10 또는 서열번호 16로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 10 또는 서열번호 16로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 (Glucose-6- phosphate dehydrogenase)"는 β-D-글루코스 6-포스페이트로부터 6-포스포 D-글루코노-1,5-락톤으로 전환하면서 NADPH 1분자를 합성하는 효소를 통칭한다. 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제는 다른 이름으로 G6PD, G6PDH 등으로 불리워지고 있다. 또한, 본 출원에서는 상기 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제는 G6PD 또는 G6PDH와 혼용될 수 있다.
구체적으로 상기 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제는 서열번호 20 또는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 20 또는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 20 또는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase)"는 D-글루코네이트 6-포스페이트로부터 D-리불로스 5-포스페이트로 전환하면서 NADPH 1분자를 합성하는 효소를 통칭한다. 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제는 다른 이름으로 6PGD 등으로 불리워지고 있다. 또한, 본 출원에서는 상기 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제는 6PGD와 혼용될 수 있다.
구체적으로 상기 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제는 서열번호 32 또는 서열번호 36로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 32 또는 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 32 또는 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase)"는 NADH의 수소를 NADP+로 전달하면서 NADPH 1분자를 합성할 수 있는 효소를 통칭한다.
구체적으로 상기 NAD(P) 트랜스하이드로게나제는 서열번호 39 또는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 39 또는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 39 또는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "글루코네이트 키나제 (Gluconate kinase)"는 오탄당 인산화 경로의 중간체인 6-포스포-D-글루코네이트 (6-phospho-D-gluconate)로부터 글루코네이트로 전환할 수 있는 효소를 통칭한다.
구체적으로 상기 글루코네이트 키나제는 서열번호 45 서열번호 53, 서열번호 51 또는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 51 또는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 51 또는 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (nicotinate phosphoribosyltransferase)"는 니코티네이트로부터 β-니코티네이트 D-리보뉴클레오티드((β-nicotinate D-ribonucleotide)를 합성하는 효소를 통칭한다. 상기 β-니코티네이트 D-리보뉴클레오티드는 Deamino-NAD+를 거쳐 NAD+로 전환되고, 또한 NAD+는 NADP+로 전환될수 있으므로, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제강화는 NADPH의 전구체들의 양을 증가시킬 수 있다.
구체적으로 상기 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제는 서열번호 61, 서열번호 65 또는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 65 또는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 65 또는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "NAD+ 디포스포파타제 (NAD+ diphosphatase)"는 NAD+로부터 β-니코틴아마이드 D-리보뉴클레오티드 (β-nicotinamide D-ribonucleotide)로 분해하는 효소로써, NAD+ 디포스파타제 약화는 NADPH의 전구체인 NAD 양을 증가시킬 수 있다.
구체적으로 상기 NAD+ 디포스포파타제는 서열번호 73 또는 서열번호 79 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 73 또는 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 73 또는 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "NAD+ 키나제 (NAD kinase)"는 NAD+로부터 NADP+를 합성하는 효소로써, NADP+는 NADPH의 전구체이다.
구체적으로 상기 NAD+ 키나제는 서열번호 81 또는 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열번호 81 또는 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 혹은 서열번호 81 또는 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, NAD(P) 트랜스하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, NAD+ 키나제, 글루코네이트 키나제 또는 NAD+ 디포스파타제의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, NAD(P) 트랜스하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, NAD+ 키나제, 글루코네이트 키나제 또는 NAD+ 디포스파타제는 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지 않는다.
또한, 본 출원에서 상기 효소들은 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 포함할 수 있다.
또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 효소 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, NAD(P) 트랜스하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, NAD+ 키나제, 글루코네이트 키나제 또는 NAD+ 디포스파타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, NAD(P) 트랜스하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, NAD+ 키나제, 글루코네이트 키나제 또는 NAD+ 디포스파타제 효소 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 더욱 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제는 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드서열로 암호화 될 수 있으며 , 트랜스케톨라제는 서열번호 11 또는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제는 서열번호 21 또는 서열번호 28의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제는 서열번호 33 또는 서열번호 37의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, NAD(P) 트랜스하이드로게나제는 서열번호 40 또는 서열번호 42의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제는 서열번호 62, 서열번호66 또는 서열번호 70의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, NAD+ 키나제는 서열번호 82 또는 서열번호 86의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, 글루코네이트 키나제는 서열번호 46, 서열번호 52, 서열번호 54 또는 서열번호 60의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으며, NAD+ 디포스파타제는 서열번호 74 또는 서열번호 80의 폴리뉴클레오티드 서열로 암호화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, NAD(P) 트랜스하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, NAD+ 키나제, 글루코네이트 키나제 또는 NAD+ 디포스파타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열이면 제한없이 포함될 수 있다.
또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 상기 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, NAD(P) 트랜스하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, NAD+ 키나제, 글루코네이트 키나제 또는 NAD+ 디포스파타제 효소 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 출원에서 용어, "활성의 강화"는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 자연적 혹은 인위적으로 나타나게 되는 것을 의미한다. "비변형 미생물"은, 비교 대상 미생물의 특정 단백질이 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 갖고 있는 미생물을 말한다. "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다. 본 출원에서 비변형은 유전적 변이가 일어나지 않은 내재적 활성을 갖는 형태와 혼용되어 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 활성 강화는 외래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 및/또는 NAD(P) 트랜스하이드로게나제를 도입하거나 도입하여 강화하는 것, 또는 내재적 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 및/또는 NAD+ 키나제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 활성 증가의 방법으로는,
1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있다. 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 속 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터 (WO2009/096689) 혹은 CJ7 프로모터(WO2006/065095)와 작동 가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "불활성화"는 본래 미생물이 가진 효소 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여, 그 활성이 약화되는 경우, 전혀 발현이 되지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 약화하거나 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 미생물에 비하여 낮거나 제거된 경우, 상기 유전자가 일부 또는 전체 결실된 경우, 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다.
이러한 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 약화되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 2) 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열을 변형하는 방법; 3) 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 4) 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 5) 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 6) 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 또는 7) 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본 출원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 용어 "퓨트레신을 생산하는 미생물", "퓨트레신 생산능을 가지는 미생물"이란, 자연적으로 퓨트레신 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 퓨트레신 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 천연형 또는 변이를 통하여 퓨트레신 생산능을 가지고 있는 미생물을 의미한다.
구체적으로, 본 출원에서 퓨트레신을 생산하는 미생물은 천연형 미생물 자체 또는 외부 퓨트레신 생산 기작과 관련된 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 퓨트레신 생산능을 가지게 된 미생물을 의미할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 출원에서 퓨트레신을 생산하는 미생물은 "코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 추가적으로 오르니틴 디카복실라제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 도입된 것일 수 있다. 상기 오르니틴 디카복실라제는 오르니틴의 디카복실화(decarboxylation)를 매개하여 퓨트레신을 생산하는 효소를 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물에는 퓨트레신 생합성 경로가 없지만 외부로부터 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)를 도입하면 퓨트레신이 합성될 수 있다.
또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 추가적으로 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)이 불활성화된 것일 수 있다.
또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 글루타메이트에서 오르니틴까지의 생합성 경로를 강화하기 위해 글루타메이트를 아세틸글루타메이트 (N-acetylglutamate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제 (ArgJ), 아세틸글루타메이트를 아세틸글루타밀 포스페이트 (N-acetylglutamyl phosphate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 키나제 (ArgB), 아세틸글루타밀 포스페이트를 아세틸글루타메이트 세미알데히드 (N-acetylglutamate semialdehyde)로 전환하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제 (ArgC), 아세틸글루타메이트 세미알데히드를 아세틸오르니틴 (N-acetylornithine)으로 전환하는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제 (ArgD)의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어 퓨트레신의 생합성 원료로서 사용되는 오르니틴의 생산성이 향상된 것일 수 있다.
또한, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 추가적으로 퓨트레신 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 약화된, 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
아울러, 상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 퓨트레신 배출단백질의 활성이 강화된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 퓨트레신 배출단백질의 활성 강화는 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 87의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 퓨트레신 배출단백질의 활성 강화는 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 88의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화된것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 하나의 양태로서 본 출원은, (1) NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 트랜스케톨라제(Transketolase), 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 (Glucose-6- phosphate dehydrogenase), 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase), NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase), 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (nicotinate phosphoribosyltransferase), 및 NAD+ 키나제 (NAD+ kinase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성이 강화되거나, (2) 글루코네이트 키나제 (Gluconate kinase) 및 NAD+ 디포스포파타제 (NAD+ diphosphophatase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성이 불활성화되거나, (3) (1) 및 (2)의 조합으로 구성되어, NADPH생산능이 증가된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법을 제공한다.
"NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제", "트랜스케톨라제", "글루코스-6-포스포 1-디하이드로게나제", "6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제", "NAD(P) 트랜스하이드로게나제", "니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제", "NAD 키나제 (NAD kinase)", "활성의 강화", "글루코네이트 키나제" "NAD+ 디포스포파타제", "활성의 불활성화" 및 "퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움속 미생물"에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃ , 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 퓨트레신을 회수 할 수 있다. 상기 퓨트레신을 회수하는 방법은, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 당해 미생물을 이용한 퓨트레신의 생산방법에 관한 것으로, 코리네박테리움 속 미생물에서 퓨트레신 생산이 증가되는 우수한 효과를 갖는다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입을 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
1-1: 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 코리네형 미생물 염색체 내 트랜스포존 내 도입을 위한 벡터의 제작
코리네박테리움에 친화력이 높은 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제로 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 선정하였다. 이후 상기 활성을 향상시키기 위해 다음의 실험을 진행하였다.
락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 gapN을 암호화 하는 Ldb1179 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 1)과 염기서열 (서열번호 2)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
또한, 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 Ldb1179 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 pDZTn(WO2009/125992)를 사용하였으며, 프로모터는 cj7 (WO 2006/65095)를 이용하였다. Ldb1179 유전자는 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 3 및 4 프라이머를 이용하여 개시코돈 TTG를 ATG로 변경한 형태로 약 1.43 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 1). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 약 1.4 kb 밴드를 용리하여 정제하였다. 또한, CJ7 프로모터 부위는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 PCR산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. pDZTn 벡터는 XhoI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-(L)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
3 gapN(L)-F aaggaaacactgatatc aTGACAGAACACTATTTAAACTATGTCAATG
4 gapN(L)-R gccaaaacagcctcgagTTAGTCTTCGATGTTGAAGACAACG
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
1-2: 스트렙토코커스 변이주 (Streptococcus mutans) ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 코리네형 미생물 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 도입을 위한 벡터의 제작
락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 gapN의 대조군으로써, 스트렙토코커스 변이주(Streptococcus mutans) ATCC 25175내 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성을 가진 SMUFR_0590 (대한민국 등록특허 제1182033호)을 도입하기 위해 다음의 실험을 진행하였다.
스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN을 암호화하는 SMUFR_0590 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 7) 염기서열 (서열번호 8)과 은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였고, 트랜스포존 유전자 내 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 SMUFR_0590을 도입하기 위한 벡터를 제작하였다
실시예 1-1에서와 마찬가지로 형질전환용 벡터 pDZTn를 사용하였으며, 프로모터는 cj7를 이용하였다. 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175유래의 SMUFR_0590 유전자는 pECCG117-Pcj7-gapN1 (대한민국 등록특허 제 1182033호)을 주형으로 서열번호 5 및 9 프라이머를 이용하여 약 1.7 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 2). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. pDZTn 벡터는 XhoI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-gapN(S)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
9 gapN(S)-R gccaaaacagcctcgagTTATTTGATATCAAATACGACGGATTTA
1-3. 퓨트레신을 생산하는 코리네형 균주에 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입을 통한 퓨트레신 발효
<1-3-1> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입
실시예 1-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-gapN(L)와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-gapN(S)를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11240P (대한민국 공개특허 제2013-0003648), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), KCCM11520P (대한민국 공개특허 제2014-0049766)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신(25 μg/㎖)과 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌린-β-D-갈락토시드)이 함유된 BHIS 평판배지(Braine heart infusion 37 g/l, 소르비톨 91 g/l, 한천 2%)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 푸른색의 콜로니를 선택함으로써 상기 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-gapN(L) 또는 pDZTn:P(CJ7)-gapN(S)가 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 CM 배지(글루코스 10 g/l, 폴리펩톤 10 g/l, 효모 추출물 5 g/l, 비프 추출물 5 g/l, 염화나트륨(NaCl) 2.5 g/l, 우레아 2 g/l, pH 6.8)에 접종하여 30℃에서 8시간 동안 진탕 배양하고, 각각 10-4부터 10-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택하여, gapN(L) 또는 gapN(S)을 암호화하는 유전자인 Ldb1179와 SMUFR_0590이 도입된 퓨트레신 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다. 이로부터 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(S)로 명명하였다.
<1-3-2> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b (대한민국 공개특허 제2013-0003648), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), DAB12-b ΔNCgl2523 (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 앞에서 제작한 pDZTn:P(CJ7)-gapN(L)과 pDZTn:P(CJ7)-gapN(S)를 실시예 <1-3-1>과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이로부터 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(S)라 명명하였다.
<1-3-3> NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 도입시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-3-1> 및 <1-3-2>에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 6종의 대조군(KCCM11240P, KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, KCCM11520P, DAB12-b, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b ΔNCgl2523)과 12종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b △NCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b △NCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(S))를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이로부터 배양된 각 균주를 25 ml의 생산 배지에 한 백금이 정도로 접종한 후 이를 30℃에서 200 rpm으로 50시간 후 샘플하고, 최종 98시간에 샘플링하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다.
<CM 평판 배지(pH 6.8)>
포도당 1%, 폴리펩톤 1%, 효모 추출물 0.5%, 비프 추출물 0.5%, 염화나트륨(NaCl) 0.25%, 우레아 0.2%, 50% 수산화나트륨(NaOH) 100 μl, 한천(agar) 2%, pH 6.8, (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 8%, 대두단백질 0.25%, 옥수수고형 0.50%, 황산암모늄((NH4)2SO4) 4%, 인산칼륨(KH2PO4) 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 (MgSO4·7H2O) 0.05%, 우레아 0.15%, 바이오틴 100 μg, 티아민 염산염 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, 탄산칼슘 (CaCO3) 5% (증류수 1리터 기준).
50시간에 샘플링한 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P 5.8 6.96
KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L) 6.4 7.68
KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S) 6.3 7.56
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L) 10.6 12.72
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 9.8 11.76
KCCM11520P 7.0 8.40
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L) 9.8 11.76
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 9.2 11.04
DAB12-b 6.5 7.80
DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(L) 7.0 8.40
DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(S) 6.9 8.28
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.36
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L) 11.5 13.80
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 10.7 12.84
DAB12-b ΔNCgl2523 7.5 9.00
DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(L) 10.6 12.72
DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 10.1 12.12
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 L. delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC 11842 유래의 gapN(L) 유전자 또는 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN(S) 유전자가 도입된 12종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 증가되었다. 이로부터 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 통한 NADPH 공급시 퓨트레신 생산성이 증가됨을 확인하였다.
또한, 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN(S)이 도입된 6종 변이주 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 대비 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN(L)이 도입된 6종 변이주 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(L) 균주의 퓨트레신 생산성이 더 높음을 확인하였다.
또한 98시간에 샘플링한 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
　 균주명 퓨트레신(g/L) 생산성(g/L/min)
KCCM11240P 12.3 7.52
KCCM11240P Tn:P(cj7)-gapN(L) 12.5 7.65
KCCM11240P Tn:P(cj7)-gapN(S) 12.3 7.52
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 15.5 9.48
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(L) 16.5 10.01
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) 16.0 9.79
KCCM11520P 14.5 8.87
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(L) 15.3 9.36
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) 15.0 9.18
DAB12-b 13.1 8.02
DAB12-b Tn:P(cj7)-gapN(L) 13.4 8.20
DAB12-b Tn:P(cj7)-gapN(S) 13.3 8.14
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 15.9 9.73
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(L) 16.7 10.22
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) 16.4 10.04
DAB12-b ΔNCgl2523 15.0 9.18
DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(cj7)-gapN(L) 15.7 9.61
DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(cj7)-gapN(S) 15.5 9.49
마찬가지로 표 4에서 KCCM11240P 또는 DAB12-b 기반에서 gapN을 강화한 4종의 변이균주 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b Tn:P(CJ7)-gapN(S)은 대조군 대비 동등이상 수준의 퓨트레신 생산량을 나타내었고, 퓨트레신 배출능이 강화된 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, KCCM11520P, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b ΔNCgl2523 기반에서 gapN을 강화한 8종의 변이균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(L), DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gapN(S)의 퓨트레신 생산성이 더욱 증가함을 확인할 수 있다.
이로써 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자를 강화하였을 때, 생산성과 생산량이 모두 증가함을 확인하였으며, 퓨트레신 배출능이 함께 강화시 증가폭이 더욱 커짐을 확인하였다.
1-4: 퓨트레신 균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성 비교
Ldb1179 유전자 또는 SMUFR_0590 유전자가 도입된 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L), KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S) 균주로부터 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN(L)과 스트렙토코커스 변이주 유래의 gapN(S)의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성을 비교하였다. 대조군으로 gapN 유전자가 없는 KCCM11240P 균주를 사용하였다. 각 균주를 1 mM 아르기닌 함유 복합 평판 배지에서 하루 정도 배양한 후, 1 mM 아르기닌 함유 종배지에 초기 OD600=0.2로 맞추어 배양한 후, OD600=10에서 세포를 회수하였다.
<종배지>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 10 g, 요소 5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7 H2O 0.5 g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍ (공정수 1 리터 기준)
공지된 방법 (A. Soukri et al., Protein Expression and Purification; 25; (2002) 519-529)을 이용하여 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성을 측정하고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
균주명 gapN activity (%)
KCCM 11240P 0
KCCM 11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L) 154
KCCM 11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S) 100
상기 표 5에 나타난 바와 같이 스트렙토코커스 변이주 유래의 gapN(S)이 도입된 KCCM 11240P Tn:P(CJ7)-gapN(S)의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성을 100으로 보았을 때, L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN(L)이 도입된 KCCM 11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L) 균주의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성은 1.5배 이상 더 높음을 확인하였다. 이로써 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 높을수록, 공급된 NADPH가 많을수록 퓨트레신 생산성 및 생산량이 증가함을 확인하였다.
실시예 2: 트랜스케톨라제 강화를 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 트랜스케톨라제 활성 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
2-1: 트랜스케톨라제 강화를 위한 개시코돈 치환
<2-1-1> 트랜스케톨라제의 개시코돈 TTG를 ATG로 치환하기 위한 벡터의 제작
트랜스케톨라제의 활성을 강화하기 위해, 이를 코딩하는 유전자의 개시코돈 TTG를 ATG로 바꾸기 위한 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 트랜스케톨라제를 암호화하는 NCgl1512 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 10)과 염기서열 (서열번호 11)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 12 및 13 프라이머와 서열번호 14 및 15 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 6). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-1'tkt(ATG)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
12 NCgl1512_5F CCGGGGATCCTCTAGAGTAGACGCTTGATTGGCGGAC
13 NCgl1512_5R TCCTTCCTGGGTTAAACCGGG
14 NCgl1512_ATG_3F gtttaacccaggaaggaaTGACCACCTTGACGCTGTCAC
15 NCgl1512_3R GCAGGTCGACTCTAGAGTCGAATAGGCCACGCTCAC
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 트랜스케톨라제를 암호화하는 NCgl1512와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 16)과 염기서열 (서열번호 17)을 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 동일한 프라이머를 사용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하여 상기 방법과 같이 벡터를 제작하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-2'tkt(ATG)라 명명하였다.
<2-1-2> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 트랜스케톨라제의 개시코돈 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), KCCM11520P (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 2-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-1'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1512의 개시코돈이 ATG로 치환된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 tkt(ATG), KCCM11520P tkt(ATG)라 명명하였다.
<2-1-3> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 트랜스케톨라제의 개시코돈 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), DAB12-b ΔNCgl2523 (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 2-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-2'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1512의 개시코돈이 ATG로 치환된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 tkt(ATG), DAB12-b ΔNCgl2523 tkt(ATG)라 명명하였다.
<2-1-4> 트랜스케톨라제의 개시코돈 치환된 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 트랜스케톨라제를 암호화하는 유전자 tkt의 발현이 증가할 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1-2 및 2-1-3에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 tkt(ATG) 8.3 9.96
KCCM11520P 7.0 8.40
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 tkt(ATG) 7.9 9.48
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.36
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 tkt(ATG) 8.9 10.68
DAB12-b ΔNCgl2523 7.5 9.00
DAB12-b ΔNCgl2523 tkt(ATG) 8.5 10.2
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환된 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 증가되었다.
2-2: 트랜스케톨라제 강화 및 오탄당 인산 경로를 강화하기 위한 프로모터 치환
<2-2-1> 트랜스케톨라제의 프로모터를 치환한 벡터의 제작
트랜스케톨라제 활성을 가진 NCgl1512의 활성을 강화하기 위해 염색체 내 NCgl1512 유전자의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터를 도입하기 위한 벡터를 제작하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 12 및 13 프라이머와 서열번호 19 및 15 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 8). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 18 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-1'tkt(ATG)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
12 NCgl1512_5F CCGGGGATCCTCTAGAGTAGACGCTTGATTGGCGGAC
13 NCgl1512_5R TCCTTCCTGGGTTAAACCGGG
18 NCgl1512-PC7-F gtttaacccaggaaggaGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 PC7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
19 NCgl1512-PC7-ATG-F aaggaaacactgatatcaTGACCACCTTGACGCTGTCAC
15 NCgl1512_3R GCAGGTCGACTCTAGAGTCGAATAGGCCACGCTCAC
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 동일한 프라이머를 사용하여 유전자 단편 3개를 증폭하여고 상기 방법과 같이 벡터를 제작하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-2'tkt(ATG)라 명명하였다.
<2-2-2> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트랜스케톨라제의 프로모터 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), KCCM11520P (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 2-2-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-1'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1512의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-tkt(ATG), KCCM11520P P(CJ7)-tkt(ATG)라 명명하였다.
<2-2-3> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트랜스케톨라제의 프로모터 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), DAB12-b ΔNCgl2523 (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 2-2-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-2'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1512 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-tkt(ATG), DAB12-b ΔNCgl2523 P(CJ7)-tkt(ATG)라 명명하였다.
<2-2-4> 트랜스케톨라제의 프로모터를 강화한 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 트랜스케톨라제의 프로모터를 치환했을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-2-2 및 2-2-3에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-tkt(ATG) 12.4 14.94
KCCM11520P 7.0 8.4
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-tkt(ATG) 11.8 14.22
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.36
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-tkt(ATG) 13.4 16.08
DAB12-b ΔNCgl2523 7.5 9.00
DAB12-b ΔNCgl2523 P(CJ7)-tkt(ATG) 12.5 15.06
표 9에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 tkt의 프로모터를 CJ7 프로모터로 치환된 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 대폭 증가되었다.
실시예 3: G6PD 강화를 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 활성 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
3-1: G6PD 강화를 위한 프로모터 치환
<3-1-1> G6PD의 프로모터를 치환하기 위한 벡터의 제작
G6PD의 활성을 강화하기 위해 염색체 내 이를 코딩하는 유전자의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터를 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 G6PD를 암호화 하는 NCgl1514 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 20)과 염기서열 (서열번호 21)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 22 및 23 프라이머와 서열번호 25 및 26 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 10). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 24 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-1'zwf라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
22 NCgl1514-5F CCGGGGATCCTCTAGACTGAAGGTGCCAACACTCAGC
23 NCgl1514-5R GATGGTAGTGTCACGATCCTTTC
24 PC7-F(1514) gatcgtgacactaccatcGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 PC7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
25 NCgl1514-3F(C7-GTG) aaggaaacactgatatcGTGAGCACAAACACGACCCCC
26 NCgl1514-3R GCAGGTCGACTCTAGACGGTGGATTCAGCCATGCC
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 G6PD를 암호화하는 NCgl1514와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 27)과 염기서열 (서열번호 28)을 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 22 및 29 프라이머와 서열번호 25 및 26 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 11). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호 30 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-2'zwf라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
22 NCgl1514-5F CCGGGGATCCTCTAGACTGAAGGTGCCAACACTCAGC
29 2'NCgl1514-5R GATGGTAGCGTCACGATCCTTTC
30 2'PC7-F(1514) gatcgtgacgctaccatcGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 PC7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
25 NCgl1514-3F(C7-GTG) aaggaaacactgatatcGTGAGCACAAACACGACCCCC
26 NCgl1514-3R GCAGGTCGACTCTAGACGGTGGATTCAGCCATGCC
<3-1-2> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 G6PD 의 프로모터 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), KCCM11520P (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 3-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-1'zwf를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1514의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf, KCCM11520P P(CJ7)-zwf 명명하였다.
<3-1-3> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 G6PD 의 프로모터 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), DAB12-b ΔNCgl2523 (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 3-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-2'zwf를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1512 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf, DAB12-b ΔNCgl2523 P(CJ7)-zwf라 명명하였다.
<3-1-4> G6PD 의 프로모터를 강화한 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 G6PD 의 프로모터를 치환했을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-1-2 및 3-1-3에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/h)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf 7.9 9.48
KCCM11520P 7.0 8.40
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf 7.5 9.00
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.36
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf 8.5 10.20
DAB12-b ΔNCgl2523 7.5 9.00
DAB12-b ΔNCgl2523 P(CJ7)-zwf 8.0 9.60
상기 표 12에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 G6PD 의 프로모터를 CJ7 프로모터로 치환된 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 증가되었다.
3-2: G6PD 강화를 위한 프로모터및 개시코돈 동시 치환
<3-2-1> G6PD의 프로모터 및 개시코돈이 동시에 치환된 벡터의 제작
G6PD의 활성을 강화하기 위해 염색체 내 이를 코딩하는 유전자의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터를 도입과 동시에 개시코돈 GTG를 ATG로 치환하기 위한 벡터를 제작하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 22 및 23 프라이머와 서열번호 31 및 26 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 13). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 24 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-1'zwf(ATG)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
22 NCgl1514-5F CCGGGGATCCTCTAGACTGAAGGTGCCAACACTCAGC
23 NCgl1514-5R GATGGTAGTGTCACGATCCTTTC
24 PC7-F(1514) gatcgtgacactaccatcGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 PC7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
31 NCgl1514-3F(C7-ATG) aaggaaacactgatatcATGAGCACAAACACGACCCCC
26 NCgl1514-3R GCAGGTCGACTCTAGACGGTGGATTCAGCCATGCC
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 22 및 프라이머 29와 서열번호 31 및 26 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 14). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 30 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-P(CJ7)-2'zwf(ATG)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
22 NCgl1514-5F CCGGGGATCCTCTAGACTGAAGGTGCCAACACTCAGC
29 2'NCgl1514-5R GATGGTAGCGTCACGATCCTTTC
30 2'PC7-F(1514) gatcgtgacgctaccatcGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 PC7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
31 NCgl1514-3F(C7-ATG) aaggaaacactgatatcATGAGCACAAACACGACCCCC
26 NCgl1514-3R GCAGGTCGACTCTAGACGGTGGATTCAGCCATGCC
<3-2-2> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 G6PD 의 프로모터 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), KCCM11520P (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 3-2-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-1'zwf(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl15124의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입되고 개시코돈이 ATG로 치환된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf(ATG), KCCM11520P P(CJ7)-zwf(ATG)라 명명하였다.
<3-2-3> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 G6PD 의 프로모터 치환
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), DAB12-b ΔNCgl2523 (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 3-2-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-2'zwf(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1512 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf(ATG), DAB12-b ΔNCgl2523 P(CJ7)-zwf(ATG)라 명명하였다.
<3-2-4> G6PD의 프로모터를 강화하고 개시코돈을 ATG 로 치환한 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 G6PD 의 프로모터를 CJ7 프로모터로를 치환하고 개시코돈을 ATG로 치환했을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-2-2 및 3-2-3에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf(ATG) 7.9 9.48
KCCM11520P 7.0 8.40
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf(ATG) 7.6 9.12
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.36
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-zwf(ATG) 8.6 10.32
DAB12-b ΔNCgl2523 7.5 9.00
DAB12-b ΔNCgl2523 P(CJ7)-zwf(ATG) 8.1 9.72
상기 표 15에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 zwf의 프로모터를 CJ7 프로모터로 치환하고 개시코돈을 ATG로 치환한 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 증가되었다.
실시예 4: 6PGD 강화를 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 6PGD(6-phosphogluconate dehydrogenase) 활성 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
4- 1: 6PGD를 코리네형 미생물 염색체 내 트렌스포존 유전자내 도입을 위한 벡터의 제작
6PGD 활성을 가진 NCgl1396의 활성을 강화하기 위해 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 NCgl1396을 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 6PGD활성이 있는 Gnd을 암호화 하는 하는 NCgl1396 의 아미노산 서열 (서열번호 32)과 염기서열 (서열번호 33)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 pDZTn를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 34 및 35 프라이머를 이용하여 약 1.45 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 16). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-1'gnd라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
34 NCgl1396-F aaggaaacactgatatcATGACTAATGGAGATAATCTCGCAC
35 1'NCgl1396-R gccaaaacagcctcgagTTAAGCTTCAACCTCGGAGCG
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 Gnd를 암호화하는 NCgl1396와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 36)염기서열과 (서열번호 37)을 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 34 및 38 프라이머를 이용하여 약 1.45 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 17). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-2'gnd라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
34 NCgl1396-F aaggaaacactgatatcATGTCTGGAGGATTAGTTACAGC
38 2'NCgl1396-R gccaaaacagcctcgagTTAAGCTTCCACCTCGGAGC
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
4-2: ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 6PGD 도입
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), KCCM11520P (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 4-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-1'gnd를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 트렌스포존 내 Gnd을 암호화하는 유전자인 NCgl1396이 도입되었음을 확인하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd, KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gnd 명명하였다.
4-3: ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 6PGD 도입
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호), DAB12-b ΔNCgl2523 (대한민국 공개특허 제2014-0049766)를 대상으로 실시예 4-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-1'gnd를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 트렌스포존 내 Gnd을 암호화하는 유전자인 NCgl1396이 도입되었음을 확인하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd, DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gnd 라 명명하였다.
4- 4: 6PGD를 강화한 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 6PGD를 암호화하는 NCgl1396을 염색체 내 트렌스포존 내 도입하였을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-2 및 4-3에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 4종의 대조군(KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, KCCM11520P, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b ΔNCgl2523)과 4종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd, KCCM11520P Tn:P(CJ7)-gnd, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd, DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gnd 를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이로부터 배양된 각 균주를 25 ml의 생산 배지에 한 백금이 정도로 접종한 후 이를 30℃에서 200 rpm으로 98시간 동안 진탕 배양하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다.
<CM 평판 배지(pH 6.8)>
포도당 1%, 폴리펩톤 1%, 효모 추출물 0.5%, 비프 추출물 0.5%, 염화나트륨(NaCl) 0.25%, 우레아 0.2%, 50% 수산화나트륨(NaOH) 100 μl, 한천(agar) 2%, pH 6.8, (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 8%, 대두단백질 0.25%, 옥수수고형 0.50%, 황산암모늄((NH4)2SO4) 4%, 인산칼륨(KH2PO4) 0.1%, 황산마그네슘 7 수화물 (MgSO4·7H2O) 0.05%, 우레아 0.15%, 바이오틴 100 μg, 티아민 염산염 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, 탄산칼슘 (CaCO3) 5% (증류수 1리터 기준).
98시간 배양한 최종산물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/L/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 15.5 9.48
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd 15.9 9.73
KCCM11520P 14.5 8.87
KCCM11520P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd 15.2 9.30
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 15.9 9.73
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gnd 16.2 9.91
DAB12-b ΔNCgl2523 15.0 9.18
DAB12-b ΔNCgl2523 Tn:P(CJ7)-gnd 15.5 9.49
상기 표 18에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 gnd의 발현양을 증가시킨 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산량이 소폭 증가되었다.
실시예 5 : NAD (P) 트랜스하이드로게나제 도입을 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase)활성 강화시 NADPH 공급에 따른 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
5-1: 대장균( E. coli ) W3110 유래의 NAD (P) 트랜스하이드로게나제를 코리네형 미생물 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 도입을 위한 벡터의 제작
대장균 W3110 유래의 NAD(P) 트랜스하이드로게나제활성을 가진 PntAB를 암호화하는 Y75_p1579와 Y75_p1578의 발현을 강화하기 위해 염색체 내 트랜스포존 유전자 내 트랜스포존 유전자 내 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 Y75_p1579와 Y75_p1578 유전자를 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 대장균 W3110 유래의 NAD(P) 트랜스하이드로게나제는 PntA와 PntB가 complex를 이룬다. PntA를 암호화 하는 Y75_p1579 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 39)과 염기서열 (서열번호 40) 및 PntB를 암호화하는 Y75_p1578 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 41)과 염기서열 (서열번호 42)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 pDZTn를 사용하였다. 대장균 W3110 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 43 및 44 프라이머를 이용하여 약 2.92 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 19). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 3분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZTn 벡터는 XhoI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-pntAB라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
43 Y75_p1579-F aaggaaacactgatatcATGCGAATTGGCATACCAAGAGAAC
44 Y75_p1578-R gccaaaacagcctcgagTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCC
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
5-2: ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 NAD(P) 트랜스하이드로게나제 도입
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P (대한민국 공개특허 제2013-0003648호), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호)를 대상으로 실시예 5-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-pntAB를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 트렌스포존 내 PntAB을 암호화하는 유전자인 Y75_p1579과 Y75_p1578이 도입되었음을 확인하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-pntAB, KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-pntAB 명명하였다.
5-3: ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 NAD(P) 트랜스하이드로게나제도입
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-b (대한민국 공개특허 10-2013-0003648), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 (대한민국 공개특허 제2014-0115244호)를 대상으로 실시예 5-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-pntAB를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 트렌스포존 내 PntAB을 암호화하는 유전자인 암호화하는 유전자인 Y75_p1579과 Y75_p1578이 도입되었음을 확인하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b Tn:P(CJ7)-pntAB, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-pntAB라 명명하였다.
5-4: NAD (P) 트랜스하이드로게나제를 도입한 코리네 퓨트레신 생산균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 NAD(P) 트랜스하이드로게나제 유전자 도입시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-2 및 5-3에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P 5.8 6.96
KCCM11240P Tn:P(CJ7)-pntAB 6.1 7.32
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-pntAB 7.5 9.00
DAB12-b 6.5 7.80
DAB12-b Tn:P(CJ7)-pntAB 6.7 8.04
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.36
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-pntAB 8.1 9.72
상기 표 20에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 대장균 유래의 NADP 트랜스하이드로게나제 pntAB를 도입한 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 소폭 증가되었다.
실시예 6: 글루코네이트 키나제의 불활성화를 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 글루코네이트 키나제(Gluconate kinase) 활성 약화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
실시예 6-1: 글루코네이트 키나제 유전자 NCgl2399 , NCgl2905 결손벡터 제작
<6-1-1> NCgl2399 결손을 위한 벡터의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 염색체 내에는 글루코네이트 키나제 활성을 가지는 유전자 NCgl2399와 NCgl2905가 있다. 글루코네이트 키나제 활성을 가진 두개의 유전자 중, NCgl2399 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 NCgl2399 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 45)과 염기서열 (서열번호 46)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 47 및 48 프라이머와 서열번호 49 및 50 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 21). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-1'NCgl2399(K/O)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
47 NCgl2399-del-5F CCGGGGATCCTCTAGAgcccacgctttgtatcaatgg
48 NCgl2399-del-5R GAAGTTCGTCGCCGTCTTTG
49 NCgl2399-del-3F GACGGCGACGAACTTCGGCCGCCCAATCTGCAG
50 NCgl2399-del-3R GCAGGTCGACTCTAGAGGGTGGGGTCTGCTTTGG
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 NCgl2399와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 51)과 염기서열 (서열번호 52)를 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 동일한 프라이머를 사용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하여 상기 방법과 같이 벡터를 제작하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-2'NCgl2399(K/O)라 명명하였다.
<6-1-2> NCgl2905 결손을 위한 벡터의 제작
글루코네이트 키나제 활성을 가진 또다른 유전자 NCgl2905 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 NCgl2905 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 53)과 염기서열 (서열번호 54)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 55 및 56 프라이머와 서열번호 57 및 58 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 22). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-1'NCgl2905(K/O)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
55 NCgl2905-del-5F CCGGGGATCCTCTAGActgggtcgtggcataagaa
56 NCgl2905-del-5R GTGCCTTTGATTGGGCAGC
57 NCgl2905-del-3F GCCCAATCAAAGGCACGAATTCCTCGCGATGCTTTCC
58 NCgl2905-del-3R GCAGGTCGACTCTAGACTAGACCAACTTGAGGTAGAGG
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 NCgl2905와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 59)과 염기서열 (서열번호 60)을 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 동일한 프라이머를 사용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하여 상기 방법과 같이 벡터를 제작하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-2'NCgl2905(K/O)라 명명하였다.
6-2: 글루코네이트 키나제 유전자 NCgl2399 , NCgl2905 결손균주 제작 및 평가
<6-2-1> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 NCgl2399 결손균주 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11240P(대한민국 공개 특허 제2013-0003648호) 를 대상으로 실시예 6-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-1'NCgl2399(K/O)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl2399 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P ΔNCgl2399 라 명명하였다.
<6-2-2> ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주의 NCgl2399 , NCgl2905 동시 결손균주 제작
실시예 6-2-1에서 제작한 KCCM11240P ΔNCgl2399를 대상으로 실시예 6-1-2에서 제작한 플라스미드 pDZ-1'NCgl2905(K/O)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl2399 유전자와 NCgl2905가 모두 결손된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P ΔNCgl2399 ΔNCgl2905라 명명하였다.
<6-2-3> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 NCgl2399 결손균주 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 기반의 퓨트레신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-b (대한민국 공개특허 제2013-0003648호) 를 대상으로 실시예 6-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-2'NCgl2399(K/O)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl2399 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b ΔNCgl2399라 명명하였다.
<6-2-4> ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주의 NCgl2399 , NCgl2905 동시 결손균주 제작
실시예 7-2-3에서 제작한 KCCM11240P ΔNCgl2399를 대상으로 실시예 6-1-2에서 제작한 플라스미드 pDZ-2'NCgl2905(K/O)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl2399 유전자와 NCgl2905가 모두 결손된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-b ΔNCgl2399 ΔNCgl2905라 명명하였다.
<6-2-5> 글루코네이트 키나제의 활성이 불활성화된 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 글루코네이트 키나제 유전자 NCgl2399와 NCgl2905가 결손되었을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6-2-1, 6-2-2, 6-2-3 및 6-2-4에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P 5.8 6.96
KCCM11240P ΔNCgl2399 5.9 7.08
KCCM11240P ΔNCgl2399 ΔNCgl2905 6.4 7.68
DAB12-b 6.5 7.80
DAB12-b ΔNCgl2399 6.5 7.80
DAB12-b ΔNCgl2399 ΔNCgl2905 7.1 8.52
상기 표 23에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 글루코네이트 키나제 유전자 NCgl2399와 NCgl2905가 결손된 변이주 모두 대조군 대비 퓨트레신 생산성이 증가되었다. 그리고 NCgl2399 단독 결손된 균주대비 NCgl2399와 NCgl2905 모두 결손된 균주의 퓨트레신 생산성이 더 높음을 확인하였다.
실시예 7: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입 및 트랜스케톨라제 강화를 통한 퓨르레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성과 트랜스케톨라제 활성이 모두 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
7-1: 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 퓨트레신 생산균주에서 트랜스케톨라제 강화를 위한 개시코돈 치환 통합균주 제작
실시예 1-4-1에서 제작한 ATCC 13032기반 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 2-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-1'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이로부터 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) tkt(ATG)라 명명하였다.
마찬가지로 실시예 1-4-2에서 제작한 ATCC 13869기반 퓨트레신 생산균주 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 2-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-2'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이로부터 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) tkt(ATG)라 명명하였다.
7-2: 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 퓨트레신 생산균주에서 트랜스케톨라제 강화를 위한 프로모터 치환 통합균주 제작
실시예 1-4-1에서 제작한 ATCC 13032기반 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 2-2-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-1'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이로부터 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) P(CJ7)-tkt(ATG)라 명명하였다.
마찬가지로 실시예 1-4-2에서 제작한 ATCC 13869기반 퓨트레신 생산균주 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 2-2-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-2'tkt(ATG)를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 이로부터 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) P(CJ7)-tkt(ATG)라 명명하였다.
7-3: 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 도입되고, 트랜스케톨라제의 활성이 강화된 통합균주의 퓨트레신 생산능 평가
NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성을 지닌 gapN 유전자가 강화되고 동시에 트랜스케톨라제인 NCgl1512의 개시코돈이 TTG에서 ATG로 치환되었을 때, 또는 NCgl1512의 프로모터가 CJ7으로 치환되었을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 7-1과 7-2에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 2개의 대조군(KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입된 2개의 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S))과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입되고 tkt의 개시코돈이 TTG에서 ATG로 치환된 2종의 변이주의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) tkt(ATG), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) tkt(ATG)와 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입되고 tkt의 프로모터가 CJ7으로 치환된 2종의 변이주의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) P(CJ7)-tkt(ATG), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) P(CJ7)-tkt(ATG) 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) 9.9 11.88
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) tkt(ATG) 10.5 12.60
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) P(CJ7)-tkt(ATG) 12.7 15.24
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.9 9.48
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) 10.7 12.84
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) tkt(ATG) 11.3 13.56
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(cj7)-gapN(S) P(CJ7)-tkt(ATG) 13.6 16.32
상기 표 24에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 gapN이 도입되고 tkt의 개시코돈을 ATG로 치환하거나 gapN이 도입되고 tkt 프로모터를 치환하여 발현양을 증가시킨 경우, gapN 단독 강화균주보다 퓨트레신 생산성이 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 8: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입 및 G6PD 강화를 통한 퓨르레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성과 G6PD 활성이 모두 강화되는 경우, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
8-1: 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 퓨트레신 생산균주에서 G6PD 강화를 위한 CJ7 프로모터 도입 통합균주 제작
실시예 1-4-1에서 제작한 ATCC 13032기반 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 3-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-1'zwf를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1514의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) P(CJ7)-zwf라 명명하였다.
마찬가지로 실시예 1-4-2에서 제작한 ATCC 13869기반 퓨트레신 생산균주 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 3-1-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-P(CJ7)-2'zwf를 실시예 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1514의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) P(CJ7)-zwf라 명명하였다.
8-2: 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 도입되고, G6PD의 활성이 강화된 통합균주의 퓨트레신 생산능 평가
NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성을 지닌 gapN 유전자가 강화되고 동시에 G6PD 인 NCgl1514의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입었을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 8-1에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 2개의 대조군(KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입된 2개의 변이주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)와 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입되고 NCgl1514의 앞에 CJ7 프로모터가 도입된 2종의 변이주의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) P(CJ7)-zwf, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) P(CJ7)-zwf를 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신(g/L) 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 9.9 11.88
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) P(CJ7)-zwf 10.0 12.00
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.48
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 10.7 12.84
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) P(CJ7)-zwf 10.9 13.08
상기 표 25에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 gapN이 도입되고 zwf의 개시코돈 앞에 CJ7 프로모터가 도입하였을 때, gapN 단독 강화균주보다 퓨트레신 생산성이 소폭 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 9: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입 및 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 강화를 통한 퓨트레신 생산
본 실시예에서는 NADP로부터 NADPH를 합성하는 반응을 활성화시킴과 동시에 NAD, NADP의 전구체인 β-니코티네이트 D-리보뉴클레오티드도 함께 강화하기 위하여 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성과 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성이 모두 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다. 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제는 대장균 유래의 유전자와 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 유전자를 각각 적용해보았다.
9-1: 대장균 W3110 유래의 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (EC.2.4.2.11) 를 코리네형 미생물 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 도입을 위한 벡터의 제작.
대장균 W3110 유래의 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제활성을 지닌 pncB를 암호화하는 Y75_p0903을 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 대장균 W3110 유래의 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 활성을 지닌 PncB을 암호화 하는 Y75_p0903 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 61)과 염기서열 (서열번호 62)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 pDZTn를 사용하였다. Y75_p0903 유전자는 대장균 W3110 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 63 및 64 프라이머를 이용하여 약 1.2 kb의 유전자 단편을 증폭하였다(표 26). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. 또한, CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 PCR산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. pDZTn 벡터는 XhoI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-pncB(Eco)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
63 pncB(Eco)-F aaggaaacactgatatcATGACACAATTCGCTTCTCCTG
64 pncB(Eco)-R gccaaaacagcctcgagTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGGAAG
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
9-2: 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 를 코리네형 미생물 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 도입을 위한 벡터의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제활성을 지닌 PncB를 암호화하는 NCgl2431을 염색체 내 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 NCgl2431 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 65)과 염기서열 (서열번호 66)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다. 이때 NCgl2431의 개시코돈 GTG가 아닌 ATG 형태로 도입하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 pDZTn를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 67 및 68 프라이머를 이용하여 약 1.3 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 27). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-1'pncB라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
67 1'NCgl2431-F aaggaaacactgatatcATGAATACCAATCCGTCTGAATTCTCC
68 1'NCgl2431-R gccaaaacagcctcgag CTAAGCGGCCGGCGGGAA
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 NCgl2431와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 69)과 염기서열 (서열번호 70)을 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 71 및 72 프라이머를 이용하여 약 1.45 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 28). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-2'pncB라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
71 2'NCgl2431-F aaggaaacactgatatcATGAATACCAATCCTTCTGAATTCTCC
72 2'NCgl2431-R gccaaaacagcctcgagCTAAGCGACCGGCGGGAATC
5 CJ7-F ggcccactagtctcgagGCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
9-3: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 코리네기반 퓨트레신 생산균주에서 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 강화를 통한 퓨트레신 발효
<9-3-1> 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 코리네기반 퓨트레신 생산균주에서 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 강화 균주 제작
실시예 1-4-1에서 제작한 ATCC 13032기반 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 9-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-pncB(Eco)와 실시예 9-2에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-1'pncB를 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 대장균 W3110 유래의 pncB를 암호화하는 Y75_p0903 유전자 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 pncB를 암호화는 NCgl2431 유전자가 트렌스포존 내 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-pncB(Eco), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-1'NCgl2431라 명명하였다.
마찬가지로 실시예 1-4-2에서 제작한 ATCC 13869기반 퓨트레신 생산균주 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 9-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-pncB(Eco)와 실시예 9-2에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-2'pncB를 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 대장균 W3110 유래의 pncB를 암호화하는 Y75_p0903 유전자 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래의 pncB를 암호화는 NCgl2431 유전자가 트렌스포존 내 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-pncB(Eco), DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-2'NCgl2431라 명명하였다.
<9-3-2> 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 도입되고, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제의 활성이 강화된 통합균주의 퓨트레신 생산능 평가
대장균 W3110 유래의 PncB를 암호화하는 Y75_p0903 유전자 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 PncB를 암호화는 NCgl2431 유전자가 강화되었을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 9-1에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 2개의 대조군(KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도임된 2개의 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S))과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입되고 대장균 W3110 유래의 pncB를 암호화하는 Y75_p0903 유전자 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 pncB를 암호화는 NCgl2431 유전자가 도입된 4종의 변이주의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-pncB(Eco), KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-1'NCgl2431, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-pncB(Eco), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-2'NCgl2431를 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 9.9 11.88
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-pncB(Eco) 10.0 12.00
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-1'NCgl2431 10.2 12.24
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.48
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 10.7 12.84
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-pncB(Eco) 10.9 13.08
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-2'NCgl2431 11.1 13.32
상기 표 29에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 gapN이 도입되고 대장균 W3110 유래의 pncB를 암호화하는 Y75_p0903 유전자 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 pncB를 암호화는 NCgl2431이 강화되었을 때 퓨트레신 생산성이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 대장균 유래의 pncB 도입보다 코리네 유래의 pncB를 강화했을 때 보다 퓨트레신 생산성이 더 증가됨을 확인하였다.
실시예 10: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입 및 NAD+ 디포스파타제 결손을 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성 강화와 NAD+ 디포스파타제 활성 약화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
10-1: NAD + 디포스파타제 유전자 NCgl0744 결손벡터 제작
NAD+ 디포스파타제 활성을 지닌 NCgl0744 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 73)과 염기서열 (서열번호 74)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다. NAD+ 디포스파타제 활성을 약화하기 위해 NCgl0744 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하였다..
본 출원의 구체적인 실시예에서는 형질전환용 벡터 pDZ를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 75 및 76 프라이머와 서열번호 77 및 78 프라이머를 이용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하였다(표 30). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-1'NCgl0744(K/O)라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
75 0744-del-5F CCGGGGATCCTCTAGAGCAGATGTGTTGCGTCTAGC
76 0744-del-5R TTGTCATTTACCTCCTCGCTAAATAC
77 0744-del-3F cgaggaggtaaatgacaaGGAAGATGAGTTGCCTCAAGG
78 0744-del-3R GCAGGTCGACTCTAGACAGATTACCCGCCACCTGAG
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 NCgl0744와 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열(서열번호 79)과 염기서열 (서열번호 80)을 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 동일한 프라이머를 사용하여 약 0.5 kb 의 유전자 단편 2개를 증폭하여 상기 방법과 같이 벡터를 제작하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZ-2'NCgl0744(K/O)라 명명하였다.
10-2: NAD + 디포스파타제 유전자 NCgl0744 결손균주 제작 및 평가
<10-2-1> 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 코리네기반 퓨트레신 생산균주에서 NAD+ 디포스파타제 결손 균주 제작
실시예 1-4-1에서 제작한 ATCC 13032기반 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 10-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-1'NCgl0744(K/O)를 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl0744 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) ΔNCgl0744, KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) ΔNCgl0744라 명명하였다.
마찬가지로 실시예 1-4-2에서 제작한 ATCC 13869기반 퓨트레신 생산균주 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 10-1에서 제작한 플라스미드 pDZ-2'NCgl0744(K/O)를 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl0744 유전자가 결손된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) ΔNCgl0744, DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) ΔNCgl0744라 명명하였다.
<10-2-2> 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 도입되고, NAD+ 디포스파타제 의 활성이 불활성화된 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 NAD+ 디포스파타제 유전자 NCgl0744 가 결손되었을 때 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 10-2-1에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
　 균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/l/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7.3 8.76
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 9.9 11.88
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) ΔNCgl0744 10.1 12.12
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 7.8 9.48
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 10.7 12.84
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) ΔNCgl0744 11.0 13.20
상기 표 31에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 gapN이 도입되고 NAD+ 디포스파타제 를 암호화하는 NCgl0744가 결손되었을 때 퓨트레신 생산성이 소폭 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 11: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입 및 NAD+ 키나제 강화를 통한 퓨트레신 생산
퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 활성과 NAD+ 키나제 활성이 모두 강화시 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인해보았다.
11-1: NAD + 키나제 를 코리네형 미생물 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 도입을 위한 벡터의 제작
NAD+ 키나제 활성을 가진 NCgl1358의 활성을 강화하기 위해 염색체 내 트랜스포존 유전자 내 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 NCgl1358을 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 NCgl1358 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 81)과 염기서열 (서열번호 82)은 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 확보하였다.
본 출원의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 트렌스포존 유전자 내 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 pDZTn를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 83 및 84 프라이머를 이용하여 약 0.96 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 32). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. CJ7 프로모터 부위는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초 과정을 30회 반복하여 수득하였다. pDZ 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-1'ppnk라 명명하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
83 NCgl1358-F aaggaaacactgatatc_atgactgcacccacgaacgc
84 NCgl1358-R gccaaaacagcctcgag TTACCCCGCTGACCTGGG
5 CJ7-F ggcccactagtctcgag GCCGGCATAGCCTACCGAT
6 CJ7-R GATATCAGTGTTTCCTTTCGTTGG
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염기서열을 기반으로 PCR 반응 및 시퀀싱을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 ppnK 암호화하는 NCgl1358과 상동성을 가지는 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 85)과 염기서열 (서열번호 86)과 을 확보하였다.
마찬가지로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주의 염색체를 주형으로 동일한 프라이머를 이용하여 약 0.96 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다. 이때, PCR 반응과 클로닝 방법은 상기와 동일하며 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZTn:P(CJ7)-2'ppnk라 명명하였다.
11-2: NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 코리네기반 퓨트레신 생산균주에서 NAD + 키나제 강화를 통한 퓨트레신 발효
<11-2-1> 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 도입된 코리네기반 퓨트레신 생산균주에서 NAD 키나제 강화 균주 제작
실시예 1-4-1에서 제작한 ATCC 13032기반 퓨트레신 생산균주 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 11-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-1'ppnk 를 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1358 유전자가 트렌스포존 내 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-1'ppnk라 명명하였다.
마찬가지로 실시예 1-4-2에서 제작한 ATCC 13869기반 퓨트레신 생산균주 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 P(CJ7)-gapN(S)를 대상으로 실시예 11-1에서 제작한 플라스미드 pDZTn:P(CJ7)-2'ppnk 를 <1-4-1>과 동일한 방법으로 형질전환하여 NCgl1358 유전자가 트렌스포존 내 도입된 균주를 제작하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-2'ppnK라 명명하였다.
<11-2-2> 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 도입되고, NAD + 키나제의 활성이 강화된 통합균주의 퓨트레신 생산능 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 NADPH의 전구체인 NADP 공급을 원활히 하기 위해 NAD+ 키나제 활성을 가진 NCgl1358을 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 형태로 염색체 내 트랜스포존 유전자 내 도입했을 때, 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 11-2-1에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 2개의 대조군(KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도임된 2개의 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S), DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S))과 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN이 도입되고 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 ppnK 가 도입된 4종의 변이주의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-1'ppnK, DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-2'ppnK 를 실시예 1-4-3과 동일한 방법으로 98시간 배양한 최종산물로부터 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
균주명 퓨트레신
(g/L)		 생산성
(g/L/min)
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 15.5 9.48
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 16.1 9.85
KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-1'ppnK 16.7 10.22
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 15.9 9.73
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) 16.5 10.01
DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522 Tn:P(CJ7)-gapN(S) Tn:P(CJ7)-2'ppnK 16.9 10.34
상기 표 33에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 13869 유래의 퓨트레신 생산균주에서 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 gapN이 도입되고 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 NAD+ 키나제인 ppnK를 암호화는 NCgl1358 강화하였을 때 퓨트레신 생산성이 소폭 증가함을 확인할 수 있었다.
본 출원에서 아세틸퓨트레신 합성경로가 결손된 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물에서 트랜스포존 내 Ldb1179를 도입하여 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 활성을 강화시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 고수율 및 고생산성으로 퓨트레신을 생산할 수 있음을 확인하고, 상기균주를 KCCM11240P Tn:P(CJ7)-gapN(L), CC01-0811로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2017년 6월 29일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12052P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12052P
수탁일자 : 20170629
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism producing putrescine and method of producing putrescine using the microorganism <130> KPA161439-KR <160> 88 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 476 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus <400> 1 Leu Thr Glu His Tyr Leu Asn Tyr Val Asn Gly Glu Trp Arg Asp Ser 1 5 10 15 Ala Asp Ala Ile Glu Ile Phe Glu Pro Ala Thr Gly Lys Ser Leu Gly 20 25 30 Thr Val Pro Ala Met Ser His Glu Asp Val Asp Tyr Val Met Asn Ser 35 40 45 Ala Lys Lys Ala Leu Pro Ala Trp Arg Ala Leu Ser Tyr Val Glu Arg 50 55 60 Ala Ala Tyr Leu Gln Lys Ala Ala Asp Ile Leu Tyr Arg Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ile Gly Ser Thr Leu Ser Lys Glu Ile Ala Lys Gly Leu Lys Ser 85 90 95 Ser Ile Gly Glu Val Thr Arg Thr Ala Glu Ile Val Glu Tyr Thr Ala 100 105 110 Lys Val Gly Val Thr Leu Asp Gly Glu Val Met Glu Gly Gly Asn Phe 115 120 125 Glu Ala Ala Ser Lys Asn Lys Leu Ala Val Val Arg Arg Glu Pro Val 130 135 140 Gly Leu Val Leu Ala Ile Ser Pro Phe Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ala 145 150 155 160 Gly Ser Lys Ile Ala Pro Ala Leu Met Gly Gly Asn Val Val Ala Phe 165 170 175 Lys Pro Pro Thr Gln Gly Ser Ile Ser Gly Leu Leu Leu Ala Lys Ala 180 185 190 Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr Ile Thr Gly 195 200 205 Arg Gly Arg Val Ile Gly Asp Tyr Ile Val Glu His Pro Ala Val Asn 210 215 220 Phe Ile Asn Phe Thr Gly Ser Ser Ala Val Gly Lys Asn Ile Gly Lys 225 230 235 240 Leu Ala Gly Met Arg Pro Ile Met Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asp Ala 245 250 255 Ala Ile Val Leu Glu Asp Ala Asp Leu Asp Leu Thr Ala Lys Asn Ile 260 265 270 Val Ala Gly Ala Phe Gly Tyr Ser Gly Gln Arg Cys Thr Ala Val Lys 275 280 285 Arg Val Leu Val Met Asp Ser Val Ala Asp Glu Leu Val Glu Lys Val 290 295 300 Thr Ala Leu Ala Lys Asp Leu Thr Val Gly Ile Pro Glu Glu Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ile Thr Pro Leu Ile Asp Thr Lys Ser Ala Asp Tyr Val Gln Gly 325 330 335 Leu Ile Glu Glu Ala Ala Glu Lys Gly Ala Lys Pro Leu Phe Asp Phe 340 345 350 Lys Arg Glu Gly Asn Leu Ile Tyr Pro Met Val Met Asp Gln Val Thr 355 360 365 Thr Asp Met Arg Leu Ala Trp Glu Glu Pro Phe Gly Pro Val Leu Pro 370 375 380 Phe Ile Arg Val Lys Ser Ala Asp Glu Ala Val Met Ile Ala Asn Glu 385 390 395 400 Ser Glu Tyr Gly Leu Gln Ser Ser Val Phe Ser Arg Asn Phe Glu Lys 405 410 415 Ala Phe Ala Ile Ala Gly Lys Leu Glu Val Gly Thr Val His Ile Asn 420 425 430 Asn Lys Thr Gln Arg Gly Pro Asp Asn Phe Pro Phe Leu Gly Val Lys 435 440 445 Ser Ser Gly Ala Gly Val Gln Gly Val Lys Tyr Ser Ile Gln Ala Met 450 455 460 Thr Arg Val Lys Ser Val Val Phe Asn Ile Glu Asp 465 470 475 <210> 2 <211> 1371 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC 11842 <400> 2 ttgacagaac actatttaaa ctatgtcaat ggcgaatggc gggactccgc tgacgcgatt 60 gaaattttcg aaccagcaac tggcaagtcc ctgggtactg tacctgccat gtcccacgaa 120 gacgtggact acgtaatgaa cagcgccaaa aaggcccttc cagcctggcg ggccctctca 180 tacgttgaac gggccgcata cttgcaaaag gcagcggaca tcctttaccg agatgctgaa 240 aagatcggtt ctaccttgtc caaggaaatc gccaagggcc tcaagtcctc tatcggcgaa 300 gtaacccgga cggcggaaat cgttgaatac acggccaagg tcggcgtaac tttggacggg 360 gaagtcatgg agggcggcaa ctttgaagcg gcaagcaaga acaagttggc tgttgtccgc 420 cgggaaccag tcggcctggt tttggcaatt tcacccttca actacccggt taacctggcc 480 ggctcaaaga tcgcgcctgc tttgatgggc gggaacgtgg tggccttcaa gccgccgaca 540 caagggtcaa tctccggtct gcttttggcc aaggccttcg ccgaagctgg cctgccagcc 600 ggcgtcttca acaccattac cggccggggt cgggttatcg gcgactacat cgttgaacac 660 ccggcagtca acttcatcaa cttcaccggt tccagtgctg tcggcaagaa catcggcaaa 720 ctggccggga tgcggccgat tatgctggaa cttggcggca aggacgcggc catcgtcttg 780 gaagacgctg acttggacct gacggccaag aacatcgttg ccggcgcctt tggctactcc 840 ggccagcgtt gtaccgccgt taagcgggtt ctggtcatgg acagcgtggc tgacgaattg 900 gttgaaaagg tgactgcttt ggccaaggat ttgacggtcg ggataccaga agaggatgcc 960 gacatcactc ctttgatcga cactaagtct gccgactacg tacaaggctt aattgaagaa 1020 gccgcagaaa agggcgctaa gcctttgttt gacttcaagc gcgaaggcaa cctgatctac 1080 ccaatggtca tggaccaagt gacgactgac atgcgcctgg cctgggaaga accatttggg 1140 ccagtattgc cattcatccg cgtcaagtca gctgacgaag ctgtcatgat tgccaatgaa 1200 tcagaatacg gccttcaaag ctccgtcttc tcacggaact ttgaaaaagc ctttgccatt 1260 gcaggaaaat tggaagtggg cacggtccac atcaacaaca agacccaaag aggtccggac 1320 aacttcccat tcctgggcgt aaagagctca ggggcaggcg tacagggggt c 1371 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapN(L)-F <400> 3 aaggaaacac tgatatcatg acagaacact atttaaacta tgtcaatg 48 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapN(L)-R <400> 4 gccaaaacag cctcgagtta gtcttcgatg ttgaagacaa cg 42 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7-F <400> 5 ggcccactag tctcgaggcc ggcatagcct accgat 36 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7-R <400> 6 gatatcagtg tttcctttcg ttgg 24 <210> 7 <211> 475 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Streptococcus mutans ATCC 25175 <400> 7 Leu Thr Lys Gln Tyr Lys Asn Tyr Val Asn Gly Glu Trp Lys Leu Ser 1 5 10 15 Glu Asn Glu Ile Lys Ile Tyr Glu Pro Ala Ser Gly Ala Glu Leu Gly 20 25 30 Ser Val Pro Ala Met Ser Thr Glu Glu Val Asp Tyr Val Tyr Ala Ser 35 40 45 Ala Lys Lys Ala Gln Pro Ala Trp Arg Ser Leu Ser Tyr Ile Glu Arg 50 55 60 Ala Ala Tyr Leu His Lys Val Ala Asp Ile Leu Met Arg Asp Lys Glu 65 70 75 80 Lys Ile Gly Ala Val Leu Ser Lys Glu Val Ala Lys Gly Tyr Lys Ser 85 90 95 Ala Val Ser Glu Val Val Arg Thr Ala Glu Ile Ile Asn Tyr Ala Ala 100 105 110 Glu Glu Gly Leu Arg Met Glu Gly Glu Val Leu Glu Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Glu Ala Ala Ser Lys Lys Lys Ile Ala Val Val Arg Arg Glu Pro Val 130 135 140 Gly Leu Val Leu Ala Ile Ser Pro Phe Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ala 145 150 155 160 Gly Ser Lys Ile Ala Pro Ala Leu Ile Ala Gly Asn Val Ile Ala Phe 165 170 175 Lys Pro Pro Thr Gln Gly Ser Ile Ser Gly Leu Leu Leu Ala Glu Ala 180 185 190 Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr Ile Thr Gly 195 200 205 Arg Gly Ser Glu Ile Gly Asp Tyr Ile Val Glu His Gln Ala Val Asn 210 215 220 Phe Ile Asn Phe Thr Gly Ser Thr Gly Ile Gly Glu Arg Ile Gly Lys 225 230 235 240 Met Ala Gly Met Arg Pro Ile Met Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asp Ser 245 250 255 Ala Ile Val Leu Glu Asp Ala Asp Leu Glu Leu Thr Ala Lys Asn Ile 260 265 270 Ile Ala Gly Ala Phe Gly Tyr Ser Gly Gln Arg Cys Thr Ala Val Lys 275 280 285 Arg Val Leu Val Met Glu Ser Val Ala Asp Glu Leu Val Glu Lys Ile 290 295 300 Arg Glu Lys Val Leu Ala Leu Thr Ile Gly Asn Pro Glu Asp Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ile Thr Pro Leu Ile Asp Thr Lys Ser Ala Asp Tyr Val Glu Gly 325 330 335 Leu Ile Asn Asp Ala Asn Asp Lys Gly Ala Ala Ala Leu Thr Glu Ile 340 345 350 Lys Arg Glu Gly Asn Leu Ile Cys Pro Ile Leu Phe Asp Lys Val Thr 355 360 365 Thr Asp Met Arg Leu Ala Trp Glu Glu Pro Phe Gly Pro Val Leu Pro 370 375 380 Ile Ile Arg Val Thr Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Ile Ser Asn Lys 385 390 395 400 Ser Glu Tyr Gly Leu Gln Ala Ser Ile Phe Thr Asn Asp Phe Pro Arg 405 410 415 Ala Phe Gly Ile Ala Glu Gln Leu Glu Val Gly Thr Val His Ile Asn 420 425 430 Asn Lys Thr Gln Arg Gly Thr Asp Asn Phe Pro Phe Leu Gly Ala Lys 435 440 445 Lys Ser Gly Ala Gly Ile Gln Gly Val Lys Tyr Ser Ile Glu Ala Met 450 455 460 Thr Thr Val Lys Ser Val Val Phe Asp Ile Lys 465 470 475 <210> 8 <211> 1428 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Streptococcus mutans ATCC 25175 <400> 8 ttgacaaaac aatataaaaa ttatgtcaat ggcgagtgga agctttcaga aaatgaaatt 60 aaaatctacg aaccggccag tggagctgaa ttgggttcag ttccagcaat gagtactgaa 120 gaagtagatt atgtttatgc ttcagccaag aaagctcaac cagcttggcg atcactttca 180 tacatagaac gtgctgccta ccttcataag gtagcagata ttttgatgcg tgataaagaa 240 aaaataggtg ctgttctttc caaagaggtt gctaaaggtt ataaatcagc agtcagcgaa 300 gttgttcgta ctgcagaaat cattaattat gcagctgaag aaggccttcg tatggaaggt 360 gaagtccttg aaggcggcag ttttgaagca gccagcaaga aaaaaattgc cgttgttcgt 420 cgtgaaccag taggtcttgt attagctatt tcaccattta actaccctgt taacttggca 480 ggttcgaaaa ttgcaccggc tcttattgcg ggaaatgtta ttgcttttaa accaccgacg 540 caaggatcaa tctcagggct cttacttgct gaagcatttg ctgaagctgg acttcctgca 600 ggtgtcttta ataccattac aggtcgtggt tctgaaattg gagactatat tgtagaacat 660 caagccgtta actttatcaa tttcactggt tcaacaggaa ttggggaacg tattggcaaa 720 atggctggta tgcgtccgat tatgcttgaa ctcggtggaa aagattcagc catcgttctt 780 gaagatgcag accttgaatt gactgctaaa aatattattg caggtgcttt tggttattca 840 ggtcaacgct gtacagcagt taaacgtgtt cttgtgatgg aaagtgttgc tgatgaactg 900 gtcgaaaaaa tccgtgaaaa agttcttgca ttaacaattg gtaatccaga agacgatgca 960 gatattacac cgttgattga tacaaaatca gctgattatg tagaaggtct tattaatgat 1020 gccaatgata aaggagccgc tgcccttact gaaatcaaac gtgaaggtaa tcttatctgt 1080 ccaatcctct ttgataaggt aacgacagat atgcgtcttg cttgggaaga accatttggt 1140 cctgttcttc cgatcattcg tgtgacatct gtagaagaag ccattgaaat ttctaacaaa 1200 tcggaatatg gacttcaggc ttctatcttt acaaatgatt tcccacgcgc ttttggtatt 1260 gctgagcagc ttgaagttgg tacagttcat atcaataata agacacagcg cggtacggac 1320 aacttcccat tcttaggggc taaaaaatca ggtgcaggta ttcaaggggt aaaatattct 1380 attgaagcta tgacaactgt taaatccgtc gtatttgata tcaaataa 1428 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapN(S)-R <400> 9 gccaaaacag cctcgagtta tttgatatca aatacgacgg attta 45 <210> 10 <211> 80 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 10 Leu Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg 1 5 10 15 Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr 20 25 30 Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His 35 40 45 Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln 50 55 60 Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp 65 70 75 80 <210> 11 <211> 2103 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 11 ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca ctgtacgcaa ttacccctct 60 gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc gtgtcctcgc tgcagacgct 120 gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga gcctggctcc ccttgcatac 180 accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca ccaactgggc aggccgtgac 240 cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt acatccagct ttacttgggt 300 ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca cctgggattc cttgacccca 360 ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca ccactggccc tcttggccag 420 ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc gtgagcgtgg cctattcgac 480 ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca tctacgtcat tgcttctgat 540 ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca tcgctggcac ccagcagctg 600 ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca tcgaagacaa cactgagatc 660 gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg gctggcagac cattgaggtt 720 gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg ctgaggctaa gaaggacacc 780 aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct tcccagctcc aactatgatg 840 aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg aggttgcagc aaccaagact 900 gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg atgaggttat cgctcacacc 960 cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat ggcaggtcaa gttcgatgag 1020 tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc gcctgaactc ccgtgagctt 1080 ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag atgagaaggg cgtcgcaact 1140 cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga cccttcctga gctgtggggc 1200 ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca agggctcccc ttccttcggc 1260 cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt acggccgtaa cctgcacttc 1320 ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca tttccctcca cggtggcacc 1380 cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca tgcgtcctgc agttcgtctt 1440 gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc acgactccat cggtctgggc 1500 gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg cactgcgcgc catcccaggt 1560 ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc aggcttgggc tgcagcactt 1620 gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc agaacgttcc tgttctggaa 1680 ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg gctacgtcct ggttgagggt 1740 tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct ccgaggttca gcttgcagtt 1800 aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc gcgttgtttc cgttccttgc 1860 atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt ccgttctgcc tgcagctgtg 1920 accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt ggtaccgctt cttgggcacc 1980 cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg cggattacca gaccctgttt 2040 gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg ccaaggactc cattaacggt 2100 taa 2103 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1512_5F <400> 12 ccggggatcc tctagagtag acgcttgatt ggcggac 37 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1512_5R <400> 13 tccttcctgg gttaaaccgg g 21 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1512_ATG_3F <400> 14 gtttaaccca ggaaggaatg accaccttga cgctgtcac 39 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1512_3R <400> 15 gcaggtcgac tctagagtcg aataggccac gctcac 36 <210> 16 <211> 700 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum 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cgccatcttg gcagccaagc tgctcgacga tgctggaatc 120 gatgtgaggg tgctgatcaa tgatgcagat gatccaattg cagagcaccc cgttttaggc 180 cgtttcaccc atgtcaggca cgctgccgac gctgctgacg gcgcagaact agttctggtg 240 ctgggtggag atggcacctt cctccgcgca gcagatatgg cccacgctgt tgatttgcct 300 gttctgggca tcaacctagg ccatgtggga ttcttggctg aatgggagtc tgactcactt 360 gaagaggcac tcaaacgtgt gatcgaccgc gattaccgta ttgaagatcg catgacctta 420 actgtcgttg tcctagacgg cggtggagaa gaaatcggcc gaggctgggc tctcaatgag 480 gtcagtattg aaaacttaaa ccgcagggga gtgctcgatg caaccctcga ggtagatgca 540 cgaccagttg cttcctttgg ttgcgatggc gtgctgattt ccaccccaac cggctccacc 600 gcttatgcat tttccgccgg tggtcctgta ctgtggccag aactcgatgc catcttggtg 660 gttcctaata acgcccacgc gctgtttacc aaaccgctgg ttgtgagccc aaaatccacc 720 gtagctgtgg aatccaattc agatacttca gcagcgatgg ccgtcatgga tggtttccgt 780 cccattccta tgcctccagg atcccgtgtt gaggtcacca ggggtgagcg tcccgtgcgt 840 tgggtgaggc ttgattcttc accgtttacc gaccgacttg tgagcaaatt aaggctcccc 900 gttaccggtt ggcggggtcc gcaaaaacag gcggaaaata aagatcccag gtcagcgggg 960 taa 963 <210> 87 <211> 494 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 87 Met Thr Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg 1 5 10 15 Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val 20 25 30 Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu 35 40 45 Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu 50 55 60 Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile 65 70 75 80 Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala 85 90 95 Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala 100 105 110 Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu 115 120 125 Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro 145 150 155 160 Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe 165 170 175 Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe 180 185 190 Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu 195 200 205 Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Ile Thr Ile 210 215 220 Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Met Pro Leu Leu Leu Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys 245 250 255 Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu 260 265 270 Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser 275 280 285 Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe 290 295 300 Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser 305 310 315 320 Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe 325 330 335 Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ala Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala 340 345 350 Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile 355 360 365 Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val 370 375 380 Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met 385 390 395 400 Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser 405 410 415 Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala 420 425 430 Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile 435 440 445 Asp Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val 450 455 460 Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser 465 470 475 480 Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His 485 490 <210> 88 <211> 177 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 88 Met Arg Thr Ser Lys Lys Glu Met Ile Leu Arg Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Glu Tyr Ser Leu Glu Thr Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Ala Glu 20 25 30 Ala Thr Gly Leu Ser Lys Ser Gly Leu Ile Tyr His Phe Pro Ser Arg 35 40 45 His Ala Leu Leu Leu Gly Met His Glu Leu Leu Ala Asp Asp Trp Asp 50 55 60 Lys Glu Leu Arg Asp Ile Thr Arg Asp Pro Glu Asp Pro Leu Glu Arg 65 70 75 80 Leu Arg Ala Val Val Val Thr Leu Ala Glu Asn Val Ser Arg Pro Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Leu Ile Asp Ala Pro Ser His Pro Asp Phe Leu Asn Ala 100 105 110 Trp Arg Thr Val Asn His Gln Trp Ile Pro Asp Thr Asp Asp Leu Glu 115 120 125 Asn Asp Ala His Lys Arg Ala Val Tyr Leu Val Gln Leu Ala Ala Asp 130 135 140 Gly Leu Phe Val His Asp Tyr Ile His Asp Asp Val Leu Ser Lys Ser 145 150 155 160 Lys Arg Gln Ala Met Leu Glu Thr Ile Leu Glu Leu Ile Pro Ser Gln 165 170 175 Thr

Claims (7)

  1. NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 활성을 강화시켜, NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 생산능이 비변형 미생물에 비해 증가된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은
    (1) 트랜스케톨라제(Transketolase), 글루코스-6-포스포 디하이드로게나제 (Glucose-6- phosphate dehydrogenase), 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase), NAD(P) 트랜스하이드로게나제 (NAD(P) transhydrogenase), 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제 (nicotinate phosphoribosyltransferase), 및 NAD+ 키나제 (NAD+ kinase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성이 추가로 강화되거나,
    (2) 글루코네이트 키나제 (Gluconate kinase) 및 NAD+ 디포스파타제 (NAD+ diphosphophatase)로 구성되는 그룹 중에서 하나 이상의 활성이 추가로 불활성화되거나,
    (3) (1) 및 (2)의 조합이 추가로 구성되어,
    NADPH 생산능이 비변형 미생물에 비해 증가된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 오르니틴 디카복실라제의 활성이 도입된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 퓨트레신 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 약화된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 퓨트레신 배출단백질의 활성이 강화된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  7. (ⅰ) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 퓨트레신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는, 퓨트레신의 생산방법.

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