JP5465194B2 - 改良されたプローモーターおよびそれを用いたl−リシンの生産方法 - Google Patents
改良されたプローモーターおよびそれを用いたl−リシンの生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5465194B2 JP5465194B2 JP2011014476A JP2011014476A JP5465194B2 JP 5465194 B2 JP5465194 B2 JP 5465194B2 JP 2011014476 A JP2011014476 A JP 2011014476A JP 2011014476 A JP2011014476 A JP 2011014476A JP 5465194 B2 JP5465194 B2 JP 5465194B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- transformant
- lysine
- gene
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims description 63
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 title claims description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 25
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 title claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 57
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 32
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 24
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 23
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 23
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 23
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 33
- 101150070145 aspB gene Proteins 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 4
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100337176 Escherichia coli (strain K12) gltB gene Proteins 0.000 description 2
- 101100505027 Escherichia coli (strain K12) gltD gene Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000500375 Microbacterium sp. Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100057034 Talaromyces wortmannii astB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- -1 nitrogen-containing organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- RLFYROFKMULBFJ-REOHCLBHSA-N (2s)-2-hydrazinylbutanedioic acid Chemical compound NN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O RLFYROFKMULBFJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000186312 Brevibacterium sp. Species 0.000 description 1
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101150062405 ICDH gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101150019587 PDH gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
ところが、現在まで、リシン生合成経路のうち、リシンの前駆体であるアスパラギン酸塩を供給する重要な役割を担当すると思われるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase;EC;2.6.1.1;aspB)遺伝子のプロモーターを改良して、発現率を高めたコリネ型細菌については開示されたことがない。
すなわち、本発明の目的は、改良されたプロモーターの活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム由来の核酸分子を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記プロモーターの活性を有する核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養する段階を含む、リシンの生産方法を提供することにある。
本発明者らは、具体的な一実施例において、aspB遺伝子の転写開始点同定のために5’−RACE(Rapid Amplification of 5’cDNA Ends)技法(Sambrook,J.,Russell,D.W.Molecular Cloning:a laboratory manual 3rd ed.8.54)を行った。5’−RACEは、mRNAの一部が既知の場合に、それを用いて5’上流の未知領域をクローニングするための方法であり、Takara社の5’−Full Race core set(Cat.No.6122)を用いて実験を行った。実験の結果、aspB遺伝子の転写開始点は、ATG開始コドンの上流72bpに位置するGであると同定された。
前記で同定された転写開始点を+1位置にして、改良のためのプロモーターコンセンサス配列部位を選定した。
本発明の用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的の遺伝子を発現させることができるように適切な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するDNA構築物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することが可能なプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。
本発明の用語「形質転換」は、DNAを宿主に導入し、該DNAが染色体外因子として、または染色体に組み込まれることによって複製可能になることを意味する。好ましい一実施態様として、ベクターで宿主細胞を形質転換した後、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列は、宿主細胞ゲノム上の内在性(endogeneous)aspB遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こして染色体内に挿入されてもよいし、プラスミド形態で保持されてもよい。
本発明において、形質転換体の培養は公知の方法によって行われ得る。培養温度、培養時間および培地のpHなどの条件は適切に調節できる。これらの公知の培養方法は、文献[Chmiel;Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fisher Verlag,Stuttgart,1991)、およびStorhas;Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag、Braunschweig / Wiesbaden、1994)]に詳細に記述されている。また、培養方法には回分式培養(batch culture)、連続式培養(continuous culture)、および流加式培養(fed−batch culture)が含まれる。好ましくはバッチ工程、または注入バッチまたは反復注入バッチ工程で連続的に培養することができるが、これらに限定されない。
以下、下記実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を例示的に実施するためのもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
本実施例では、現在まで、知られていなかったaspB遺伝子の転写開始点(transcriptional start site)を同定した。
aspB遺伝子の転写開始点の同定のために、5’−RACE(Rapid Amplification of 5’cDNA Ends)技法(Sambrook, J., Russell, D.W. Molecular Cloning:a laboratory manual 3rd ed. 8.54)を用いた。
5’−RACEは、mRNAの一部が既知の場合に、それを用いて5’上流の未知領域をクローニングするための方法であり、本実施例ではTakara社の5’−Full Race core set(Cat.No.6122)を用いて実験を行った。
5’−RACE実験のために、米国国立衛生研究所のジーンバンク(NIH GenBank)に登録されたaspB遺伝子(コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032のゲノム(NCBI登録番号:NC_003450.3)上の遺伝子座タグ(locas tag)NCg10237)の塩基配列に基づいて5つのプライマー(表1、配列番号5〜9)を合成した。
前記において、ライゲーション反応が終わった試料を鋳型とし、配列番号6と7をプライマーとして用いてPCR増幅をし、1次PCR産物を得た。前記で得られた1次PCR産物を鋳型とし、配列番号8と9をプライマーとして用いてPCRを再び行い、2次PCR産物を得た。PCRは、変性95℃、30秒、アニーリング55℃、30秒、および重合反応72℃、1分の条件を30サイクル繰り返し行った。最終的に得られたPCR産物は、遺伝子精製を行った後、シークエンシングによる塩基配列の分析を行った。
塩基配列の分析の結果、aspB遺伝子の転写開始点は、ATG開始コドンの上流72bpに位置するGであると同定された。前記において、同定された転写開始点を+1位置にし、改良のためのプロモーターコンセンサス配列部位を選定した。
(1)染色体挿入用ベクター(pDZ)の製作
本実施例では、大腸菌クローニング用ベクターpACYC177(New England Biolab、GenBank accetion #X06402)を基本ベクターとして用いて、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZを製作した。
pACYC177ベクターをAcuIおよびBanI制限酵素で処理した後、クレノウ酵素処理によって平滑末端化した。選択マーカーとして使用される大腸菌由来のlacZ遺伝子は、大腸菌K12 W3110のゲノムDNAからPCRによって自体のプロモーターを含むように増幅した後、T4 DNAポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼ処理によって5’−末端リン酸化および平滑化することにより準備した。このように準備した2種のDNA断片を接合し、接合された環状DNA分子の制限酵素BamHI部位に、人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZを完成した。図1はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターpDZを示す図である。
本実施例では、リシンを生産する菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクム由来のaspB遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクターを製作した。
まず、米国国立衛生研究所のジーンバンク(NIH GenBank)から、aspB遺伝子(コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032のゲノム(NCBI登録番号:NC_003450.3)上の遺伝子座タグ(locas tag)NCg10237)のプロモーター部位を含む塩基配列(配列番号1)を収得し、改変されたプロモーター配列を含むDNAの断片(配列番号2、3、および4)を収得した。改変プロモーター配列は一般に微生物において知られているプロモーターコンセンサス配列に基づいて考案した。
また、前記変形されたプロモーター配列を製造するためのプライマーとしては、前記塩基配列に基づいて8つのプライマー(表2、配列番号10〜17)を合成した。
pDZ−aspBP2およびpDZ−aspBP3の場合にも、pDZ−aspBP1の場合と同様の方法によって製作した。但し、挿入断片のPCR増幅の際に、pDZ−aspBP2の場合には、配列番号10と14をプライマーとして用いて得られたaspBP2−1断片、および配列番号11と15を用いて得られたaspBP2−2断片とを用いて製作し、pDZ−aspBP3の場合には、配列番号10と16をプライマーとして用いて得られたaspBP3−1断片と、配列番号11と17を用いて得られたaspBP3−2断片とを用いて製作した。
図2、3、および4は、それぞれ配列番号2、3、および4に該当するaspBP1、aspBP2、aspBP3を含んでいるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターpDZ−aspBP1、pDZ−aspBP2およびpDZ−aspBP3を示す図である。
本実施例では、コリネバクテリウムの染色体上のaspB遺伝子のプロモーターを改良するために、前記で製作した組換えベクターでリシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881を形質転換させて、菌株染色体のプロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列とを相同組換えによって置換させることにより、染色体内に前記改良プロモーター配列を挿入した。
前記実施例2において製造した改良プロモーター配列を有するDNA断片を含む前記の組換えベクターであるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターpDZ−aspBP1、pDZ−aspBP2およびpDZ−aspBP3を、それぞれコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881に電気パルス法により導入し、形質転換した後(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541−545による形質転換法を用いる)、カナマイシン25mg/Lを含有する選択培地で、染色体上の同遺伝子との相同性により挿入された菌株を選択した。
ベクターが首尾よく染色体に挿入されたことは、X−gal(5−プロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)を含む固体培地で青色を示すか否かを確認することにより、検出可能であった。1次染色体挿入された菌株を栄養培地で振とう培養(30℃、8時間)した後、それぞれ10−4から10−10まで希釈し、X−galを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を示すが、これに反して低い比率で現れる白色のコロニーを選択することにより、二重交差(Double−crossover)によってaspB遺伝子のプロモーター内で塩基配列が置換された菌株を選択した。このように選択された菌株は、PCRを用いた塩基置換の有無の確認および当該領域における塩基配列確認過程を経て最終選定した。
プロモーターの塩基置換の有無は、aspBP1の場合、配列番号11と19、aspBP2の場合、配列番号11と18、aspBP3の場合、配列番号11と18をプライマーとして用いてPCRを行うことにより分析し、目的の部位に対する塩基配列分析によって最終確認した。
最終的に、二重の交差過程を経て、染色体上のaspB遺伝子のプロモーターに塩基置換を含む、リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881−aspBP1、KFCC10881−aspBP2およびKFCC10881−aspBP3をそれぞれ得て、これらをそれぞれCA01−773、CA01−774およびCA01−775と命名し、2010年2月5日付で韓国微生物保存センターに受託番号KCCM11061P、KCCM11062PおよびKCCM11063Pで寄託した。
母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881菌株および実施例3で最終的に製作されたL−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881−aspBP1、KFCC10881−aspBP2およびKFCC10881−aspBP3菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定するために、下記のような方法で培養し、培養液からタンパク質を分離して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を測定した。
対数期まで培養した培養液をOD600値が0.3となるように25mLの下記種培地に接種した後、OD600値が約15に達するまで培養した。
*種培地(pH7.0)
原糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4 ・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸溜水1L基準)
培養液から遠心分離(5,000rpm、10分)によって菌体を回収し、0.1% Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄した後、同緩衝溶液で600nmの濁度が160程度となるように懸濁した。懸濁液1.5mL当り1.25gのガラスビーズ(glass bead)を添加した後、ビーズビーター(bead beater)を用いて6分間菌体を破砕した。遠心分離(13,000rpm、30分)によって上澄み液を回収し、ブラッドフォード法(Bradford、M.M 1976.Anal.Biochem.72:248−254)によりタンパク質の濃度を定量した後、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として使用した。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定するために、0.24M アスパラギン酸塩、0.09M Tris(pH7.8)、0.64mM NADH、0.11mM ピリドキサルリン酸塩(pyridoxal phosphate)、0.93kU/l MDH、0.42kU/l LDHを含む反応液に0.1mLの粗タンパク質溶液を混合し、30℃で10分間定置した後、12mMの2−オキソグルタル酸塩(oxoglutarate)を添加することにより反応を開始した。340nm波長で5分間吸光度の減少を測定してアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を計算した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性単位(U)は、1分間に1mgのタンパク質によって減少したNADHのnmoleとして定義した。
コリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881−aspBP1、KFCC10881−aspBP2、およびKFCC10881−aspBP3の各菌株が示すアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、母菌株KFCC10881と比較してみた結果、KFCC10881−aspBP1菌株の場合、2.1倍、KFCC10881−aspBP2菌株の場合、2.6倍、そしてKFCC10881−aspBP3菌株の場合、1.8倍高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を示すことが確認された(表3)。
母菌株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881菌株、および実施例3で最終的に製作されたL−リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881−aspBP1、KFCC10881−aspBP2、およびKFCC10881−aspBP3菌株を、L−リシン生産のために下記の方法で培養した。
下記の種培地25mLを含有する250mLのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミクム母菌株KFCC10881と、KFCC10881−aspBP1、KFCC10881−aspBP2、およびKFCC10881−aspBP3とを接種し、30℃で20時間200rpmで振とう培養した。下記の生産培地24mLを含有する250mLのコーナーバッフルフラスコに1mLの種培養液を接種し、30℃で120時間200rpmで振とう培養した。
*種培地(pH7.0)
原糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸溜水1L基準)
*生産培地(pH7.0)
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(蒸溜水1L基準)
培養終了の後、HPLCを用いた方法によってL−リシンの生産量を測定した。 コリネバクテリウム・グルタミクムKFCC10881と、KFCC10881−aspBP1、KFCC10881−aspBP2、およびKFCC10881−aspBP3とにおける培養液中のL−リシン濃度は、下記表4のとおりである。
Claims (12)
- 配列番号2の1〜386番目のヌクレオチドの配列、配列番号3の1〜386番目のヌクレオチドの配列、および配列番号4の1〜386番目のヌクレオチドの配列からなる群より選ばれるいずれか一つの塩基配列を含む、プロモーター活性を有する核酸分子。
- 前記塩基配列は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結されている、請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸分子。
- 請求項1または2に記載のプロモーター活性を有する核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項3のベクターで形質転換された、形質転換体。
- 前記形質転換体が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物である、請求項4に記載の形質転換体。
- 前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムCA01−773(受託番号KCCM11061P)である、請求項4に記載の形質転換体。
- 前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムCA01−774(受託番号KCCM11062P)である、請求項4に記載の形質転換体。
- 前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムCA01−775(受託番号KCCM11063P)である、請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項1または2に記載のプロモーター活性を有する核酸分子が、染色体内に相同組換えで挿入されることを特徴とする、請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項1または2に記載のプロモーター活性を有する核酸分子が、プラスミド形態で保持されていることを特徴とする、請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項3のベクターで形質転換したL−リシン生産能を有する原核生物の形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法。
- 前記培養する工程で生成されるリシンを回収する工程をさらに含む、請求項11に記載のリシンの生産方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2010-0020140 | 2010-03-05 | ||
KR1020100020140A KR101226384B1 (ko) | 2010-03-05 | 2010-03-05 | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011182779A JP2011182779A (ja) | 2011-09-22 |
JP5465194B2 true JP5465194B2 (ja) | 2014-04-09 |
Family
ID=44303344
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011014476A Active JP5465194B2 (ja) | 2010-03-05 | 2011-01-26 | 改良されたプローモーターおよびそれを用いたl−リシンの生産方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8329434B2 (ja) |
EP (1) | EP2371947B1 (ja) |
JP (1) | JP5465194B2 (ja) |
KR (1) | KR101226384B1 (ja) |
CN (1) | CN102191247B (ja) |
BR (1) | BRPI1103675A2 (ja) |
WO (1) | WO2011108808A2 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101335853B1 (ko) | 2011-12-01 | 2013-12-02 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 |
KR101500073B1 (ko) * | 2013-04-23 | 2015-03-06 | 씨제이제일제당 (주) | L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법 |
KR101632642B1 (ko) * | 2015-01-29 | 2016-06-22 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 프로모터 및 그의 용도 |
CN108559747B (zh) * | 2016-08-31 | 2021-08-31 | Cj第一制糖株式会社 | 新型启动子及其应用 |
CN106318964B (zh) * | 2016-09-01 | 2017-07-18 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造 |
EP3533875B1 (en) | 2016-09-01 | 2023-02-15 | Ningxia Eppen Biotech Co. Ltd | Corynebacterium for producing l-lysine by fermentation |
CN108866028B (zh) * | 2017-05-09 | 2020-04-10 | 中国科学院微生物研究所 | 一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用 |
WO2020051420A1 (en) * | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Archer Daniels Midland Company | Engineered strains of corynebacteria |
CN110951662B (zh) * | 2019-12-26 | 2024-03-12 | 新疆梅花氨基酸有限责任公司 | 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用 |
CN112980867B (zh) * | 2021-03-09 | 2023-04-11 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种改造谷氨酸棒杆菌启动子的重组菌株及其构建方法与产l-氨基酸的应用 |
CA3217149A1 (en) * | 2021-04-29 | 2022-11-03 | Young Ju Lee | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine using same |
CN115449519B (zh) * | 2021-06-08 | 2023-04-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 基于dapB基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020086370A1 (en) * | 1995-06-07 | 2002-07-04 | Seiko Otsuna | Method of producing l-lysine |
KR0159812B1 (ko) | 1995-12-20 | 1998-11-16 | 손경식 | 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법 |
JP4075087B2 (ja) | 1996-12-05 | 2008-04-16 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
HU225541B1 (en) | 1998-09-25 | 2007-03-28 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-amino acids by fermentation and amino acid-producing bacterium strains |
US20020086371A1 (en) | 1999-07-07 | 2002-07-04 | Degussa-Huls Aktiengesellschaft | L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine |
KR100397322B1 (ko) | 2000-12-30 | 2003-09-06 | 씨제이 주식회사 | 엘-라이신의 제조방법 |
KR100653742B1 (ko) * | 2004-12-30 | 2006-12-05 | 씨제이 주식회사 | 신규한 l-라이신-유도성 프로모터 |
CN101573438B (zh) * | 2006-09-15 | 2013-01-02 | Cj第一制糖株式会社 | 具有增加的l-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产l-赖氨酸的方法 |
KR100789274B1 (ko) * | 2007-01-15 | 2008-01-02 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래한 신규한 프로모터핵산 분자, 그 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 그재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 그 숙주 세포를이용하여 유전자를 발현하는 방법 |
US20090215133A1 (en) | 2007-02-02 | 2009-08-27 | Evonik Degussa Gmbh | Production of l-lysine and l-lysine-containing feed additives |
KR100930203B1 (ko) * | 2008-01-28 | 2009-12-07 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
KR100987281B1 (ko) * | 2008-01-31 | 2010-10-12 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
-
2010
- 2010-03-05 KR KR1020100020140A patent/KR101226384B1/ko active IP Right Grant
-
2011
- 2011-01-03 WO PCT/KR2011/000012 patent/WO2011108808A2/en active Application Filing
- 2011-01-26 JP JP2011014476A patent/JP5465194B2/ja active Active
- 2011-02-15 CN CN2011100392076A patent/CN102191247B/zh active Active
- 2011-02-16 EP EP11001256.4A patent/EP2371947B1/en active Active
- 2011-03-01 US US13/037,790 patent/US8329434B2/en active Active
- 2011-03-09 BR BRPI1103675-3A patent/BRPI1103675A2/pt active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2371947B1 (en) | 2014-07-16 |
US20110217741A1 (en) | 2011-09-08 |
US8329434B2 (en) | 2012-12-11 |
WO2011108808A2 (en) | 2011-09-09 |
CN102191247A (zh) | 2011-09-21 |
CN102191247B (zh) | 2013-04-24 |
WO2011108808A3 (en) | 2011-11-24 |
KR20110101010A (ko) | 2011-09-15 |
KR101226384B1 (ko) | 2013-01-25 |
BRPI1103675A2 (pt) | 2012-07-31 |
JP2011182779A (ja) | 2011-09-22 |
EP2371947A1 (en) | 2011-10-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5396403B2 (ja) | 改良されたプロモーターおよびこれを用いたl−リシンの生産方法 | |
JP5465194B2 (ja) | 改良されたプローモーターおよびそれを用いたl−リシンの生産方法 | |
JP5400065B2 (ja) | 改良されたプロモーターおよびこれを用いたl−リシンの生産方法 | |
CA2860252C (en) | Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine | |
JP5756259B2 (ja) | L−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたl−リジン生産方法 | |
CN112695036B (zh) | 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用 | |
JP5618164B2 (ja) | 外来種由来のグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を獲得したコリネバクテリウム属のl−リシン生産方法 | |
JP6625133B2 (ja) | ピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体、それを含む微生物及びそれを用いるl−アミノ酸生産方法 | |
KR20090018531A (ko) | 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 | |
EP3498853A1 (en) | Method for the fermentative production of l-lysine | |
US20240218405A1 (en) | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine using same | |
AU2021432764A1 (en) | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine by using same | |
BRPI1103675B1 (pt) | Molécula de ácido nucléico contendo atividade promotora, vetor, transformante e método para produzir lisina que compreende cultivo do transformante |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130507 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130807 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130807 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140107 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140121 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5465194 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |