JP5387756B2 - 組換え酵母及びこれを用いた物質生産方法 - Google Patents

組換え酵母及びこれを用いた物質生産方法 Download PDF

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Description

本発明は、所定の遺伝子の発現を抑制及び/又は強化するよう改変し、また所定の遺伝子を導入した組換え酵母及び当該組換え酵母を使用した物質生産方法に関する。
酵母を用いた物質生産に関連する技術としては、主として、アセチルCoAを中間体とする物質生産経路を設計する方法が挙げられる。例えば、代表的な脂肪酸であるオレイン酸は９分子のアセチルCoAが原料として必要であり、代表的なジテルペンであるカロチンは１２分子のアセチルCoAが原料として必要である。このように、酵母内に蓄積されたアセチルCoAを利用して医薬品やファインケミカルとして有用な脂肪酸を合成する技術（特許文献１）、テルペノイドを合成する技術（特許文献２）、ポリケタイドを合成する技術（特許文献３）が知られている。また、アセチルCoAを中間体として合成される物質としては、バイオ燃料として注目されているブタノール（特許文献４）、イソプロパノール（特許文献５）及びファルネサン（特許文献５）を挙げることができる。
ところで、酵母においてアセチルCoAは、菌体外に生産されたエタノールが体内に取り込まれ、取り込まれたエタノールから合成される。酵母が生産したエタノールが高濃度になると酵母自身の生育が阻害される。したがって、酵母のエタノール生産能を高める、或いは酵母のエタノール取り込み量を高めるといった手段による、菌体内におけるアセチルCoA量を向上させることは困難であった。
より具体的に、特許文献２には、アセチルCoAからファルネサンを合成する技術が開示されているが、その収率は理論収率の２５％程度である。また、特許文献６には、アセチルCoAから６−メチルサリチル酸を合成する技術が開示されているが、その収率は理論収率の２０％程度である。このように、アセチルCoAからの物質生産においては、生産性が著しく低いといった問題があった。
 先行特許文献
特開昭６３−２８７４９１号公報 ＷＯ２００８／０４５５５５ 特開２００８−２２８６５ ＷＯ２００８／１３７４０６ ＵＳ２００８／０２９３１２５ ＵＳ２００６／０１４８０５２
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、酵母おいてグルコース６リン酸からアセチルCoA又は酢酸を合成する代謝経路を導入することで、物質生産性に優れた組換え酵母及び当該酵母を用いた物質生産方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、酵母に対して解糖系に関与する遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入することで、酢酸、アセチルCoA及びアセチルCoA由来物質の生産性が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。なお、ホスホケトラーゼとは、キシルロース5-リン酸をアセチルリン酸とグリセルアルデヒド3-リン酸に変換する反応を触媒する酵素である。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入されてなる組換え酵母。
（２）グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び/又はD-リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ遺伝子の発現量を強化したことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（３）ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を導入した及び/又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子の発現量を強化したことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（４）アセチルCoAを基質として酢酸エチルを合成する反応に関与するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を強化したことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（５）アセチルCoAを基質としてイソプロパノールを合成する反応に関与するアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、酪酸-アセト酢酸 CoAトランスフェラーゼのサブユニットA遺伝子、酪酸-アセト酢酸 CoAトランスフェラーゼのサブユニットB遺伝子、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（６）上記（１）乃至（５）いずれかに記載の組換え酵母を培地にて培養する工程を含む物質の製造方法。
（７）上記物質は、酢酸、アセチルCoA、アセチルCoAに由来する酢酸エチル及びアセチルCoAに由来するイソプロパノールからなる群から選ばれる１種であることを特徴とする（６）記載の物資の製造方法。
本発明に係る組換え酵母は、フルクトース-6-リン酸をフルクトース-1,6-ビスリン酸に変換する活性が減弱化され、且つ、キシルロース5-リン酸をアセチルリン酸へと変換する活性を付与されている。これにより、本発明に係る組換え酵母を利用することにより、酢酸やアセチルCoA由来物質の生産性を向上させることができる。
本発明に係る酵母において減弱化するホスホフルクトキナーゼ遺伝子の関与する代謝経路を含む解糖系の一部を示す特性図である。 本発明に係る酵母において導入するホスホケトラーゼ遺伝子の関与する代謝経路を含むペントースリン酸系の一部を示す特性図である。 各種生物由来のホスホケトラーゼ遺伝子について分子系統樹解析の結果を示す特性図である。 アセチルリン酸及び酢酸からアセチルCoAを合成する経路及びアセチルCoAから他の物質を合成する経路を示す特性図である。 各種生物由来のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子について分子系統樹解析の結果を示す特性図である。 pESC-HIS-ZWF1-RPE1ベクターを作製するためのフロー図である。 pESC-Leu-PKTベクター及びpESC-Leu-PKT-PTAベクターを作製するためのフロー図である。 pESC-Trp-ATF1ベクターを作製するためのフロー図である。 PFK1遺伝子破壊用ベクターを作製するためのフロー図である。 PFK2遺伝子破壊用ベクターを作製するためのフロー図である。 酢酸生産試験の結果を示す特性図である。 酢酸エチル生産試験の結果を示す特性図である。 イソプロパノール生産試験の結果を示す特性図である。 CE-TOFMSによる酵母のメタボローム解析の結果を示す特性図である。
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係る組換え酵母は、解糖系に関与する酵素をコードする遺伝子を減弱化し、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入されることでキシルロース5-リン酸をアセチルリン酸へと変換する活性を有している。宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae等のCandida属酵母、Pichia stipitis等のPichia属酵母、Pachysolen tannophilus等のPachysolen属酵母、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属酵母及びSchizosaccharomyces pombe等のSchizosaccharomyces属酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
ここで、解糖系に関与する酵素をコードする遺伝子であって減弱化する対象の遺伝子としては、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を挙げることができる。
なお、解糖系に関与する酵素としては、ホスホフルクトキナーゼ以外にもヘキソキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、エノラーゼ及びピルビン酸キナーゼが知られている。これらホスホフルクトキナーゼ以外の酵素をコードする遺伝子を減弱化しても良い。
ホスホフルクトキナーゼ遺伝子は、図１に示すように解糖系において、フルクトース-6-リン酸をフルクトース-1,6-ビスリン酸に変換する酵素をコードしている。ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとは、ホスホフルクトキナーゼ活性を有意に低下させること、換言すれば、解糖系におけるフルクトース-1,6-ビスリン酸の合成量を有意に低下させることを意味する。ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化する手段としては、特に限定されないが、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を破壊する又は欠失させる、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子の発現制御領域を破壊する又は欠失させる、ホスホフルクトキナーゼの阻害物質（例えばクエン酸）を添加する、若しくは、siRNA等のRNA干渉を利用する方法やアンチセンス法によりホスホフルクトキナーゼ遺伝子の発現を抑制するといった手法を挙げることができる。
なお、Saccharomyces cerevisiaeに内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子としては、PFK1遺伝子及びPFK2遺伝子が知られている（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 275, No. 52, Issue of December 29, pp. 40952-40960, 2000）。本発明に係る組換え酵母の宿主としてSaccharomyces cerevisiaeを利用する場合、これらPFK1遺伝子及びPFK2遺伝子のいずれか一方を減弱化しても良いし、両方を減弱化しても良い。なお、Saccharomyces cerevisiae以外の酵母についても、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子は公知であり、既存のGenbank、DDBJ、EMBL等のデータベースを参照して特定することができる。このように、各種の酵母に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を特定することで、上述した手法及び/又は手段により特定したホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化することができる。
また、本発明に係る組換え酵母は、ホスホケトラーゼ遺伝子（PKT遺伝子）が外来的に導入されることで、キシルロース5-リン酸をアセチルリン酸へと変換する能力を獲得している。なお、キシルロース5-リン酸は、酵母が本来的に有しているペントースリン酸系における代謝物質としてリブロース-5-リン酸から合成される（図２）。ホスホケトラーゼにより合成されたアセチルリン酸は、酵母が本来的に有している酢酸キナーゼにより酢酸に変換される。したがって、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母においては、培地への酢酸の分泌生産性が大幅に向上する。
ホスホケトラーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ヘテロ乳酸発酵の代謝経路を有する乳酸菌やビフィズス菌由来のホスホケトラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。ここでヘテロ乳酸発酵とは、グルコースから解糖系を経て生成したピルビン酸が乳酸のみならず、エタノールや酢酸と二酸化炭素に代謝される発酵を意味する。ヘテロ乳酸発酵においては、ホスホケトラーゼにより生成したアセチルリン酸からエタノールや酢酸が合成されることとなる。
より具体的に、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、図３に示すように、各種微生物由来のホスホケトラーゼ遺伝子を使用することができる。なお、図３に示す分子系統樹に割り振った番号と微生物との対応関係を下記表１に示した。
Figure 0005387756
また、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、図３に示す分子系統樹において破線枠内に分類されるホスホケトラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。この一群に分類されるホスホケトラーゼ遺伝子は、主として、ヘテロ乳酸発酵の代謝経路を有する乳酸菌やビフィズス菌に由来する。すなわち、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、図３に示す分子系統樹において破線枠内に分類されるように、ビフィズス菌であるBifidobacterium属微生物、乳酸菌であるLactobacillus属微生物やLeuconostoc属微生物由来の遺伝子を使用することが好ましい。更に詳細に、図３に示す分子系統樹において破線枠内に分類されるホスホケトラーゼ遺伝子としては、配列番号１〜１９のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含むホスホケトラーゼをコードする遺伝子を使用することができる。配列番号１のアミノ酸配列は、Bifidobacterium animalis由来のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号２〜１９に示すアミノ酸配列は、それぞれ順にBifidobacterium longum、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium pullorum、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus casei、Bacillus coagulans、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc mesenteroides、Streptococcus gordonii、Clostridium acetobutylicum、Clostridium butyricum及びMycoplasma agalactiae由来のホスホケトラーゼ遺伝子がコードアミノ酸配列である。
すなわち、本発明においては、配列番号１〜１９のいずれかに記載されたアミノ酸配列をコードするホスホケトラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。なかでも、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、Bifidobacterium animalis（配列番号１）、Bifidobacterium longum（配列番号２）、Bifidobacterium adolescentis（配列番号３）及びBifidobacterium pullorum（配列番号４）を使用することが最も好ましい。
なお、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、配列番号１〜１９のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば２〜１００個、好ましくは２〜８０個、より好ましくは２〜５５個、更に好ましくは２〜１５個のアミノ酸を意味する。
また、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、配列番号１〜１９のいずれかのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなり、ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、配列類似性とは、BLAST、PSI-BLAST、HMMERといった配列類似性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で使用して２つのアミノ酸配列間の類似性を示す値として算出される値を意味する。
ここで、ホスホケトラーゼ活性とは、キシルロース-5-リン酸をアセチルリン酸に変換する活性である。よって、所定のタンパク質がホスホケトラーゼ活性を有するか否かは、キシルロース-5-リン酸を基質として含有する反応液を利用してアセチルリン酸の合成量により判定することができる（例えば、JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Vol. 183, No. 9, May 2001, p. 29292936）。
ところで、本発明に係る組換え酵母は、図２に示したペントースリン酸系に関与する酵素遺伝子の発現を強化することで、導入したホスホケトラーゼ遺伝子によるアセチルリン酸の合成量を向上させることができ、その結果、酢酸の合成量を向上させることができる。図２に示したペントースリン酸系において発現を強化する対象の遺伝子としては、特に限定されないが、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びリブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ遺伝子を挙げることができる。なお、これら遺伝子のうち一方の遺伝子の発現を強化しても良いし、両方の遺伝子の発現を強化しても良い。
なお、Saccharomyces cerevisiaeに内在するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、ZWF1遺伝子として知られている。また、Saccharomyces cerevisiaeに内在するリブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ遺伝子としては、RPE1遺伝子として知られている。Saccharomyces cerevisiae以外の酵母についても、内在するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子やリブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ遺伝子は公知であり、既存のGenbank、DDBJ、EMBL等のデータベースを参照して特定することができる。
ここで、遺伝子の発現を強化するとは、対象となる遺伝子がコードする酵素の活性が有意に向上することを意味し、当該遺伝子の発現量を有意に向上させることを含む意味である。遺伝子の発現を強化する手法としては、当該遺伝子の発現量を有意に向上させる手法を挙げることができる。特定の遺伝子の発現量を向上する手法としては、特に限定されないが、染色体に内在する遺伝子の発現制御領域を改変する手法、活性の高いプロモーターの下流に当該遺伝子を配置したベクターを導入する手法を挙げることができる。
一方、本発明に係る組換え酵母は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子の減弱化及びホスホケトラーゼ遺伝子の導入に加えて、図４に示すように、更にホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（PTA遺伝子）を導入するか、更にアセチルCoAシンテターゼ遺伝子（ACS遺伝子）を強化することで、アセチルCoAの合成量を向上させることができる。
ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子は、本来酵母が有していない遺伝子であり、外来遺伝子として導入される。ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、各種細菌においてPTA遺伝子と呼称されるものを広く適用することができる。
より具体的に、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、図５に示すように、各種微生物由来のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を使用することができる。なお、図５に示す分子系統樹に割り振った番号と微生物との対応関係を下記表２に示した。
Figure 0005387756
図５及び表２に示した、Bacillus subtilis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示し、Bacillus amyloliquefaciens由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示し、Bacillus licheniformis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示し、Geobacillus thermodenitrificans由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に示し、Listeria innocua由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示し、Staphylococcus aureus由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２５に示し、Lactococcus lactis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２６に示し、Carnobacterium sp.由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７に示し、Mycobacterium vanbaalenii由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に示し、Clostridium perfringens由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２９に示し、Enterococcus faecalis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３０に示し、Leuconostoc mesenteroides由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３１に示し、Clostridium acetobutylicum由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３２に示し、Bifidobacterium animalis_lactis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３３に示し、Corynebacterium glutamicum由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３４に示し、Escherichia coli K-12由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３５に示し、Escherichia coli 53638由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３６に示し、Vibrio vulnificus由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３７に示し、Haemophilus somnus由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３８に示し、Yersinia pestis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３９に示し、Shigella sonnei由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４０に示す。
なお、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、配列番号２０〜４０のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば２〜３５個、好ましくは２〜２５個、より好ましくは２〜１５個、更に好ましくは２〜１０個のアミノ酸を意味する。
また、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、配列番号２０〜４０のいずれかのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなり、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、配列類似性とは、BLAST、PSI-BLAST、HMMERといった配列類似性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で使用して２つのアミノ酸配列間の類似性を示す値として算出される値を意味する。
ここで、ホスホトランスアセチラーゼ活性とは、アセチルリン酸にCoAを転移する活性である。よって、所定のタンパク質がホスホトランスアセチラーゼ活性を有するか否かは、アセチルリン酸及びCoAを含有する反応液を利用してアセチルCoAの合成量により判定することができる。
また、図４に示したアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は、酵母が本来有している遺伝子である。よってアセチルCoAシンテターゼ遺伝子を強化するには、染色体に内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する手法、活性の高いプロモーターの下流に当該遺伝子を配置したベクターを導入する手法を適用することができる。なお、Saccharomyces cerevisiaeに内在するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子としては、ACS1遺伝子及びACS2遺伝子が知られている。Saccharomyces cerevisiae以外の酵母についても、内在するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は公知であり、既存のGenbank、DDBJ、EMBL等のデータベースを参照して特定することができる。
以上のように、本発明に係る組換え酵母は、アセチルリン酸の合成量すなわち酢酸の合成量が顕著に向上しているか（図２）、アセチルCoAの合成量が顕著に向上している（図４）。このため、本発明に係る組換え酵母は、酢酸又はアセチルCoAを生産対象とする場合に使用できる。あるいは、本発明に係る組換え微生物は、アセチルCoAを基質として他の物質（図４中、アセチルCoA由来の物質と表記）を製造できるように更なる改変を行うための宿主として使用することができる。
具体的には、アセチルCoA由来の物質としては、特に限定されないが、ブタノール、アルカン、プロパノール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アセトン、アセト酢酸、酢酸エチル、ポリケチド、アミノ酸及びテルペノイドを合成することができる。これらを生産対象の物質としたとき、本発明に係る組換え酵母を利用することによって生産対象の物質の生産性を大幅に向上できる。
イソプロパノールを生産対象物質とする場合、例えば、APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2007, p. 7814-7818, Vol. 73, No. 24を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入すべき遺伝子を特定することができる。また、ポリケタイドを生産対象物質とする場合、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 505-509, January 1998を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入すべき遺伝子を特定することができる。さらに、脂肪酸を生産対象物質とする場合、例えば、Eur. J. Biochem. 112, p. 431-442 (1980)又はMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Sept. 2004, p. 501-517を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入するか、強化すべき遺伝子（例えば、FAS遺伝子）を特定することができる。さらにまた、アルカンを生産対象物質とする場合、脂肪酸からアルデヒドの合成、更にアルデヒドからアルカンの合成に関与する遺伝子について例えば、Science vol329 30 july p559-562を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入すべき遺伝子を特定することができる。
また、酵母に内在するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ATF1遺伝子）の発現を更に強化することで、アセチルCoAからの酢酸エチルの合成量を向上できる。すなわち、酢酸エチルを生産対象物質とする場合、内在するATF1遺伝子の発現を強化することが好ましい。
また、上述したように、所定の遺伝子の発現を強化する際には、転写活性の高い適当なプロモーターを使用する。このようなプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。その他にも、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどを使用することで、下流の遺伝子を強発現させることができる。
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
以上で説明した組換え酵母を使用して物質を製造する際には、適当な炭素源を含有する培地にて培養を行う。より具体的には、定法に従い前培養した組換え酵母を培地にて培養し、目的物質を生産させる。例えば、目的物質として、ブタノール、アルカン、プロパノール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アセトン、アセト酢酸、酢酸エステル、ポリケチド、アミノ酸及びテルペノイドを製造する際、これら目的物質は培地中に合成される、遠心分離等の手段によって培地から菌体を分離した後の上清画分から物質を単離できる。上清画分から物質を単離するには、例えば、上清画分に酢酸エチル及びメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌する。水層と溶媒層とに分離し、溶媒層から物質を抽出することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
本実施例では、野生型の酵母及びイソプロパノール生産酵母において、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母、及び更に他の遺伝子を導入又は強化した組換え酵母を作製し、酢酸、酢酸エチル及びイソプロパノールの生産性について検討した。
〔材料と方法〕
宿主
ECOS Competent E. coli JM109 (ニッポンジーン社製)、野生型酵母としてS.cerevisiae YPH499（stratagene社製）及びイソプロパノール生産酵母として後述の参考例に開示した＃15-10株を使用した。
プラスミド
＜pESCpgkgap-HISの作製＞
以下の条件でPCRを行った。
（プライマー）
EcoRI-Pgap-F：5'-CACGGAATTCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAA-3'（配列番号４１）
BamHI-Pgap-R：5'-CTCTGGATCCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3'（配列番号４２）
（PCR条件）
鋳型：pDI626プラスミド1ng（特開２００５−５２０４６号公報参照）
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1xPfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10nmol dNTP及び1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
上記の条件でPCRを行った後、反応液に含まれるPCR産物をQIAGEN社製のMinElute PCR purification kitを用いて精製した。その後、PCR産物を制限酵素Bam HIとEcoR Iで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、686bpの断片を切り出してQIAGEN社製MiniElute Gel extraction kitを用いて精製した。また、制限酵素Bam HIとEcoR Iで消化したpESC-HISベクターにライゲーションした。こうして得られたプラスミドをpESCgap-HISと命名した。
次に以下の条件でPCRを行った。
（プライマー）
MunI-Ppgk1-F：5'-TAGGCAATTGCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG-3'（配列番号４３）
EcoRI-Ppgk1-R：5'-ATAAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG-3'（配列番号４４）
（PCR条件）
鋳型：pDI626PGKプラスミド1ng
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10nmol dNTP及び1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
上記の条件でPCRを行った後、反応液に含まれるPCR産物をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製した。その後、PCR産物を制限酵素Mun IとEcoR Iで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、718bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。また、制限酵素EcoR Iで消化し、BAP処理したpESCgap-HISベクターにライゲーションした。こうして得られたプラスミドをpESCpgkgap-HISと命名した。
＜pESCpgkgap-LEUの作製＞
上記pESCpgkgap-HISを制限酵素Bam HIとNot Iで消化後、1427bpの断片を切り出し、同様に制限酵素Bam HIとNot Iで消化したpESC-LEUベクター(Stratagene社製)にライゲーションした。
＜pESCpgkgap-TRPの作製＞
上記pESCpgkgap-HISを制限酵素Bam HIとNot Iで消化後、1427bpの断片を切り出し、同様に制限酵素Bam HIとNot Iで消化したpESC-TRPベクター(Stratagene社製)にライゲーションした。
＜pESCpgkgap-URAの作製＞
上記pESCpgkgap-HISを制限酵素Bam HIとNot Iで消化後、1427bpの断片を切り出し、同様に制限酵素Bam HIとNot Iで消化したpESC-URAベクター(Stratagene社製)にライゲーションした。
＜その他ベクターの作製＞
ZWF1遺伝子及びRPE1遺伝子の発現を強化するためのpESC-HIS-ZWF1-RPE1ベクター；PKT遺伝子を導入するためのpESC-Leu-PKTベクター；PKT遺伝子及びPTA遺伝子を導入するためのpESC-Leu-PKT-PTAベクター；ATF1遺伝子の発現を強化するためのpESC-Trp-ATF1ベクター；及びPFK1遺伝子並びにPFK2遺伝子破壊用ベクターを作製する際には、以下の組成及び条件にてPCRを行った。なお、DNAポリメラーゼは、KOD-Plus-Ver.2（TOYOBO社製）を使用した。
Figure 0005387756
Figure 0005387756
pESC-HIS-ZWF1-RPE1ベクターを作製するフローを図６に示した。pESC-Leu-PKTベクター及びpESC-Leu-PKT-PTAベクターを作製するフローを図７に示した。pESC-Trp-ATF1ベクターを作製するフローを図８に示した。PFK1遺伝子破壊用ベクターを作製するフローを図９に示した。PFK2遺伝子破壊用ベクターを作製するフローを図１０に示した。図６〜１０に示したベクター作製フローにおいて、使用したプライマーを表５に纏めた。
Figure 0005387756
なお、PCR産物の精製は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を使用した。また、図６〜１０に示したベクター作製フローにおいて、PCR産物のTOPOクローニングは、Zero Blunt TOPO PCR cloning kit（invitrogen社製）を使用した。また、pAUR135はタカラバイオ(株)より購入した。図６〜１０に示したベクター作製フローにおいて、アガロースゲルからのDNA断片の切り出しは、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を使用した。図６〜１０に示したベクター作製フローにおいて、ベクターとDNA断片の連結は、Ligation-convenience Kit（ニッポンジーン社製）によるライゲーション反応、又はIn-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit（クロンテック社製）によるインフュージョン反応で行った。
また、図７に示したベクター作製フローにおいて、pBSK-PKT及びpBSK-PTAと表記したベクターは、5種類のPKT遺伝子と、3種類のPTA遺伝子を合成してpBluescript IISK(+)のSma Iサイトに挿入して作製したものである。なお、これら5種類のPKT遺伝子と3種類のPTA遺伝子は全てSaccharomyces cerevisiae 用コドンに最適化した。
5種類のPKT遺伝子とは、Bifidobacterium animalis subsp.lactis由来のphosphoketolase遺伝子（配列番号６３及び６４）、Aspergillus oryzae RIB40由来phosphoketolase I遺伝子（配列番号６５及び６６）、Aspergillus oryzae RIB40由来phosphoketolase II遺伝子（配列番号６７及び６８）、Nostoc punctiforme ATCC 29133由来phosphoketolase遺伝子（配列番号６９及び７０）、Marinobacter aquaeolei ATCC 700491由来phosphoketolase遺伝子（配列番号７１及び７２）である。また、3種類のPTA遺伝子とは、Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168由来phosphate acetyltransferase遺伝子（配列番号７３及び７４）、Bifidobacterium animalis subsp.lactis AD011由来phosphate acetyltransferase遺伝子（配列番号７５及び７６）及びEscherichia coli K-12 MG1655由来phosphate acetyltransferase遺伝子（配列番号７７及び７８）である。
形質転換
大腸菌の形質転換は、ECOS Competent E. coli JM109 (ニッポンジーン社製)付属のプロトコルに沿って行った。酵母の形質転換は、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（ザイモリサーチ社製）付属のプロトコルに沿って行った。PFK1遺伝子並びにPFK2遺伝子破壊用ベクターを用いた酵母の遺伝子破壊は、pAUR135DNA（タカラバイオ社製）添付のプロトコルに沿って行った。
酢酸生産試験
形質転換体の培養は、SD-His，Leu寒天培地でアクティブコロニーを作り、15ml容量試験管に入った2mlのSD-His，Leu培地に植菌して30℃で一晩培養（オリエンタル技研工業製IFM型，130rpm）した前培養液を、500ml容量三角フラスコに入った100mlのSD-His，Leu培地に1％容量接種し培養した。培養液は遠心（6000×g、15min、室温）し、その上清1mlをガラス製バイアルビンにいれ、これを分析用サンプルとした。
酢酸エチル生産試験
形質転換体の培養は、SD-His，Leu，Trp寒天培地でアクティブコロニーを作り、15ml容量試験管に入った2mlのSD-His，Leu，Trp培地に植菌して30℃で一晩培養（130rpm）した前培養液を、500ml容量三角フラスコに入った100mlのSD-His，Leu，Trp培地に1％容量接種し培養した。培養液は遠心（6000×g、15min、室温）し、その上清1mlをガラス製バイアルビンにいれ、これを分析用サンプルとした。
イソプロパノール生産試験
形質転換体の培養は、SD-His，Leu，Ura，Trp寒天培地でアクティブコロニーを作り、15ml容量試験管に入った2mlのSD-His，Leu，Ura，Trp培地に植菌して30℃で一晩培養（130rpm）した前培養液を、500ml容量三角フラスコに入った50mlのSD-His，Leu，Ura，Trp培地に1％容量接種し培養した。培養液は遠心（6000×g、15min、室温）し、その上清1mlをガラス製バイアルビンにいれ、これを分析用サンプルとした。
GC分析条件
標品は、酢酸（ナカライテスク社製）、酢酸エチル（ナカライテスク社製）、イソプロパノール（ナカライテスク社製）を使用した。分析機器、分析条件は酢酸生産試験、酢酸エチル生産試験及びイソプロパノール生産試験の全てについて以下の条件とした。
Figure 0005387756
CE-TOFMSによる酵母のメタボローム解析
＜前処理＞
SD−His，Leu，Ura，Trp培地で菌体の培養を行い（30℃）、試料量が15 ODunitになるようにサンプリングした。これをフィルトレーションにより速やかに吸引ろ過した。次にMilli-Q水10mL×2回を吸引ろ過し、洗浄した。フィルター上に集菌された酵母菌体は内部標準物質5μMを含んだメタノール2mLに浸した後に、1.6mLを遠沈管に移した。ここに1600μLのクロロホルム及び640μLのMilli-Q水を加え撹拌し、遠心分離（2,300×g、4℃、5分）を行った。遠心分離後、水相を限外ろ過チューブ（MILLIPORE社製、ウルトラフリーMC UFC3 LCC 遠心式フィルターユニット 5KDa）に250μL×6本移し取った。これを遠心（9,100×g、4℃、120分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50μLのMilli-Q水に溶解して測定に供した。
＜測定＞
本試験では陰イオン性代謝物質（アニオンモード）の測定を以下に示す条件(参考文献1)〜3)参照)で行った。
装置：
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies社）
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件：
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1021)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1022)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
＜参考文献、資料＞
1) T. Soga, D. N. Heiger: Amino acid analysis by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal.Chem. 72: 1236-1241, 2000.
2) T. Soga, Y. Ueno, H. Naraoka, Y. Ohashi, M. Tomita et al.: Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal.Chem. 74: 2233-2239, 2002.
3) T. Soga, Y. Ohashi, Y. Ueno, H. Naraoka, M. Tomita et al.: Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2: 488-494, 2003.
4) http://vanted.ipk-gatersleben.de/
〔結果〕
酢酸生産試験
酢酸生産試験に供した酵母を表７に纏め、試験結果を図１１に示した。
Figure 0005387756
表中、PKT(1)とはBifidobacterium animalis subsp.lactis由来のphosphoketolase遺伝子であり、PKT(2)とはAspergillus oryzae RIB40由来phosphoketolase I遺伝子であり、PKT(3)とはAspergillus oryzae RIB40由来phosphoketolase II遺伝子であり、PKT(4)とはNostoc punctiforme ATCC 29133由来phosphoketolase遺伝子であり、PKT(5)とはMarinobacter aquaeolei ATCC 700491由来phosphoketolase遺伝子である。
図１１に示した結果より、宿主となる酵母に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入することによって、解糖系ではなくペントースリン酸系（図２）への流束を高めることができ、酢酸を高生産できることが明らかとなった。また、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、ビフィズス菌由来の遺伝子、特にBifidobacterium animalis由来の遺伝子が酢酸の生産性の点で優れることが明らかとなった。この結果からホスホケトラーゼ遺伝子としては、図３に示した系統樹において破線枠内にあるホスホケトラーゼ遺伝子が酢酸生産性の点でより好ましいことが明らかとなった。
さらに、図１１に示した結果より、解糖系への流束を弱めるため、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化する場合、PFK1遺伝子及びPFK2遺伝子の両方を破壊することが好ましいことが明らかとなった。さらにまた、ペントースリン酸系（図２）に関与する酵素遺伝子を強化することで、ペントースリン酸系（図２）への流束をより高めることができ、酢酸をより高生産できることが明らかとなった。
酢酸エチル生産試験
酢酸エチル生産試験に供した酵母を表８に纏め、試験結果を図１２に示した。
Figure 0005387756
表中、PTA(1)とはBacillus subtilis subsp. subtilis str.168由来phosphate acetyltransferase遺伝子であり、PTA(2)とはBifidobacterium animalis subsp.lactis AD011由来phosphate acetyltransferase遺伝子であり、PTA(3)とはEscherichia coli K-12 MG1655由来phosphate acetyltransferase遺伝子である。なお、本試験において、PKT遺伝子は、Bifidobacterium animalis subsp.lactis由来のphosphoketolase遺伝子を使用した。
図１２に示すように、野生株（YPH499株）にATF1遺伝子を導入したコントロール株においても、野生株と比較すると酢酸エチルの生産性が向上している。しかし、宿主となる酵母に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（PTA遺伝子）を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子（ACS遺伝子）を強化することで、コントロールと比較して酢酸エチルの生産性が更に向上していることが判る。この結果及び図４に示した代謝概略マップから、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（PTA遺伝子）を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子（ACS遺伝子）を強化することでアセチルCoAの合成量が顕著に向上していることが示された。そして、合成されたアセチルCoAは、ATF1酵素により酢酸エチルとして菌体外に高蓄積されることが示された。
特に、導入するホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、Bacillus subtilis由来の遺伝子がアセチルCoA生産性の観点から好ましいことが判った。また、強化するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は、ACS1遺伝子及びACS2遺伝子のうちACS1遺伝子のほうが好ましいことが明らかとなった。
さらに、図１２に示した結果より、解糖系への流束を弱めるため、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化する場合、PFK1遺伝子及びPFK2遺伝子の両方を破壊することが好ましいことが明らかとなった。さらにまた、ペントースリン酸系（図２）に関与する酵素遺伝子を強化することで、ペントースリン酸系（図２）への流束をより高めることができ、酢酸エチルをより高生産できることが明らかとなった。
イソプロパノール生産試験
イソプロパノール生産試験に供した酵母を表９に纏め、試験結果を図１３に示した。
Figure 0005387756
表中、PTA(1)〜(3)は表８と同じ遺伝子を示している。
図１３に示すように、野生株（YPH499株）にctfA遺伝子、ctfB遺伝子、adc遺伝子及びipdh遺伝子を導入することで、酵母にイソプロパノール生産能を付与できることが判る。そして、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（PTA遺伝子）を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子（ACS遺伝子）を強化することで、コントロールと比較してイソプロパノールの生産性が顕著に向上していることが判る。
この結果及び図４に示した代謝概略マップから、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（PTA遺伝子）を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子（ACS遺伝子）を強化することでアセチルCoAの合成量が顕著に向上していることが示された。そして、合成されたアセチルCoAは、ctfA、ctfB、adc及びipdhによりイソプロパノールとして菌体外に高蓄積されることが示された。
特に、導入するホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、Bacillus subtilis由来の遺伝子がアセチルCoA生産性の観点から好ましいことが判った。また、強化するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は、ACS1遺伝子及びACS2遺伝子のうちACS1遺伝子のほうが好ましいことが明らかとなった。
CE-TOFMSによる酵母のメタボローム解析
野生型（YPH499株）、YPH499株に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにペントースリン酸系（図２）に関与する酵素遺伝子を強化した株（YPH499ΔPFKα/ZWF-RPEと表記）及びYPH499株に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにペントースリン酸系（図２）に関与する酵素遺伝子を強化し、ホスホケトラーゼ遺伝子及びホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入した株（YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE, PKT-PTAと表記）について、メタボローム解析した結果を図１４に示す。
図１４中、YPH499株（野生株）に関するアセチルCoA量は、エタノールを介するアセチルCoA合成経路とミトコンドリア内におけるアセチルCoA合成経路の合算値である。なお、酵母におけるアセチルCoA合成経路は、これらエタノールを介するアセチルCoA合成経路とミトコンドリア内におけるアセチルCoA合成経路の２つが存在する。
一方、YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株では、エタノールを介するアセチルCoA合成経路が機能しなくなる。これは、ZWFでNADPが消費されてしまい、その結果、アルデヒドから酢酸への反応を触媒するALD2が機能しなくなるためである（酢酸生産試験（図１１）のコントロール株における酢酸生産性を参照）。従って、YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株におけるアセチルCoA合成量の値は、ミトコンドリア内におけるアセチルCoA合成経路で生成されたアセチルCoA量に対応している。なお、ミトコンドリア内で合成されたアセチルCoAは、ミトコンドリア内で消費されるため、酢酸エチルやイソプロパノール等の物質の原料として使用することができない。よって、酵母細胞のサイトゾルにおいてアセチルCoAの合成量を高めなければ、合成されたアセチルCoAを用いた物質の合成量を向上させることはできない。
そして、YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE, PKT-PTA株は、YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株にPKT遺伝子及びPTA遺伝子を導入することで新規なアセチルCoA合成経路（図２及び４参照）を構築した変異株である。したがって、YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE, PKT-PTA株におけるアセチルCoA合成量から、YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株におけるアセチルCoA合成量を差し引くことで、上述した新規なアセチルCoA合成経路によるアセチルCoAの合成量を評価することができる。詳細には、図１４に示した結果から62-14=48pmolに相当するアセチルCoAが、新たなアセチルCoA合成経路により合成できたと結論付けられた。
〔参考例〕
本参考例では、上述の実施例で使用したイソプロパノール生産酵母（＃15-10）の作製について説明する。
イソプロパノール合成遺伝子の取得
以下の４つの遺伝子をクロストリジウムClostridium acetobutylicum ATCC824株のゲノムよりpT7Blueベクターにクローニングした。
adc （Acetoacetate decarboxylase）
ctfA （Butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit A）
ctfB（ Butyrate-acetoacetate CoA-transferase subunit B）
thiA （Acetyl-CoA acetyltransferase）
pT7Blue-ADCの作製
以下の条件でPCRを行った。
プライマー
adc-F：5'-ATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAG-3'（配列番号７９）
adc-R：5'-TTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGCTC-3'（配列番号８０）
反応条件
鋳型：0.4μgのクロストリジウムのゲノムDNA
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
増幅した735bpの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いてpT7Blueベクターにブラントエンドクローニングした。クローニングした配列をシークエンスしClostridium acetobutylicum ATCC824株のadc 配列（CA-P0165）であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-ADCと命名した。
pT7Blue-CTFAの作製
以下の条件でPCRを行った。
プライマー
ctfA-F：5'-ATGAACTCTAAAATAATTAGATTTGAAAATTTAAGG-3'（配列番号８１）
ctfA-R：5'-TTATGCAGGCTCCTTTACTATATAATTTA-3'（配列番号８２）
反応条件
鋳型：0.4μgのクロストリジウムのゲノムDNA
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
増幅した657bpの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いて同様にクローニングした。クローニングした配列をシークエンスしClostridium acetobutylicum ATCC824株のctfA 配列（CA-P0163）であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-CTFAと命名した。
pT7Blue-CTFBの作製
以下の条件でPCRを行った。
プライマー
ctfB-F：5'-ATGATTAATGATAAAAACCTAGCGAAAG-3'（配列番号８３）
ctfB-R：5'-CTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTC-3'（配列番号８４）
反応条件
鋳型：0.4μgのクロストリジウムのゲノムDNA
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 2分)×30サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
増幅した666bpの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いてクローニングした。クローニングした配列をシークエンスし、Clostridium acetobutylicum ATCC824株のctfB配列（CA-P0164）であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-CTFBと命名した。
pDI626PGKproの作製
以下の条件でPCRを行った。
プライマー
SacI-Ppgk1 FW：5'-TAGGGAGCTCCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG-3'（配列番号８５）
SacII-Ppgk1 RV：5'-ATAACCGCGGTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG-3'（配列番号８６）
反応条件
鋳型：0.4μgの酵母YPH499のゲノムDNA
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素SacIとSacIIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、712bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。同様に制限酵素SacIとSacIIで消化したpDI626GAP（(APP. Env. Micro., 2009, 5536)）ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKproと命名した。
pDI626PGKの作製
以下の条件でPCRを行った。
プライマー
SalI-Tpgk1 FW：5'-TTAAGTCGACATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATC-3'（配列番号８７）
KpnI-Tpgk1 RV2：5'-TTAAGGTACCGCTTCAAGCTTACACAACAC-3'（配列番号８８）
反応条件
鋳型：0.4μgの酵母YPH499のゲノムDNA
プライマー：50 pmol primer DNA,
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 5分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分)×25サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素SalIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、330bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。制限酵素SalIとKpnIで消化したpDI626PGKproベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKと命名した。
pDI626PGK-Tの作製
pDI626PGKを制限酵素SbfIで消化し、反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製した。その後、TaKaRaBIO社製Blunting kitを用いて末端を平滑化し、さらに制限酵素KpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、3650bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。これをライゲーションするためのベクターとした。次にpRS524GAP(APP. Env. Micro., 2009, 5536)を制限酵素PmaCIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、765bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製しインサートとした。これらのライゲーションを行ない、得られた配列のつなぎ目をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGK-Tと命名した。
pCR2.1-iPDHの作製
GenBank（http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html）に登録されているClostridium beijerinckii NRRL B593由来のadh： NADP-dependent alcohol dehydrogenase遺伝子配列を元にSaccharomyces cerevisiae のコドンに最適化したDNA配列を合成した（Operon社）。vector部分はpCR2.1（Invitrogen社製）である。なお、合成したDNA配列を配列番号８９に示し、合成したDNA配列に含まれるコーディング領域によりコードされるアミノ酸配列を配列番号９０に示した。このプラスミドをpCR2.1-iPDHと命名した。
pDI626PGK-T-iPDHの作製
pCR2.1-iPDHを制限酵素SacIIとSalIで消化し、1080bpの断片を切り出して、同様に制限酵素SacIIとSalIで消化したpDI626PGK-Tベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGK-T-iPDHと命名した。
pENT-ADCの作製
pDI626-ADCを鋳型にして、以下のプライマーでPCRを行った。
プライマー
08-189-adc-attB1-Fw：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAGTTCGAGTTTATCATTATC-3'（配列番号９１）
08-189-adc-attB4-Rv：5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3'（配列番号９２）
得られた1809bpのPCR産物をgateway BP反応によりドナーベクターpDONR221 P1-P4に導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENT-ADCと命名した。
pENT-CTFAの作製
pDI626PGK-CTFAを鋳型にして、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
08-189-ctfA-attB4r-Fw：5'-GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGGCTTCAAGCTTACACAACACGG-3'（配列番号９３）
08-189-ctfA-attB3r-Rv：5'-GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG-3'（配列番号９４）
得られた1823bpのPCR産物をgateway BP反応によりドナーベクターpDONR221 P4r-P3rに導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENT-CTFAと命名した。
pDI626-CTFBの作製
pT7Blue-CTFBを制限酵素BamHIとSalIで消化し、771bpの断片を切り出して、同様に制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626-CTFB(+A)と命名した。
プライマー中の変異個所を修正するために以下のプライマーを用いて以下の条件でPCRを行った。
BamHI-ctfB-F：5'-TAGTGGATCCGATGATTAATGATAAAAACC-3'（配列番号９５）
pDI626MCS-seqF：5'-CCTAGACTTCAGGTTGTCTAAC-3'（配列番号９６）
反応条件
鋳型：1 ngのpDI626-CTFB(+A)
プライマー：50 pmol primer DNA
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene社製)を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分)×20サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素BamHIとSalIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、702bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製した。制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、変異個所が修正されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626-CTFBと命名した。
pENT-CTFBの作製
pDI626-CTFBを鋳型にして、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
08-189-ctfB-attB3-Fw：5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3'（配列番号９７）
08-189-ctfB-attB2-Rv：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAGTTCGAGTTTATCATTATC-3'（配列番号９８）
得られた1737bpのPCR産物をgateway BP反応によりドナーベクターpDONR221 P3-P2に導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENT-CTFBと命名した。
pDEST626(2008)の作製
以下の条件でPCRを行った。
プライマー
SacI-convA-F：5'-TAGGGAGCTCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTG-3'（配列番号９９）
KpnI-convA-R：5'-TTAAGGTACCATCACCACTTTGTACAAGAAAGC-3'（配列番号１００）
反応条件
鋳型：0.5 ngのRfA（Invitrogen社製；Gateway Vector Conversion SystemのReading Frame Cassette A）
プライマー：50 pmol primer DNA
反応液：1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene社製)、10 nmol dNTP、1μl Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)を含む50μl溶液
反応：95℃ 2分-(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分30秒)×20サイクル-72℃ 3分-4℃ストック
反応液をQIAGEN社製MinElute PCR purification kitを用いて精製後、制限酵素SacIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、1717bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinElute Gel extraction kitを用いて精製後、制限酵素SacIとKpnIで消化したpDI626GAPベクター(APP. Env. Micro., 2009, 5536)にライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した
pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBの作製
得られた3つのエントリークローン（pENT-ADC、pENT-CTFA、pENT-CTFB）をGateway LR反応により発現ベクターpDEST626(2008)に組み込んだ。得られたクローンについて、PCRでインサートサイズの確認を行ない、正しく組換えが行なわれたことを確認した。シークエンスを行ない、配列にエラーの無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBと命名した。
#3-17株の作製
発現ベクターpEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFBを制限酵素AatII、BssHII、で切断、線状化し、エタノール沈殿後0.1×TE Bufferに溶解、Frozen EZ yeast transformation kit （Zymoresearch社製）を用いてSaccharomyces cerevisiae YPH499（Stratagene社製）を形質転換した。得られたクローンをコロニーPCRし、25クローンでadc、ctfA、ctfB遺伝子が導入されていることを確認した。もっともアセトン生産量が多い株を＃3-17と命名した。
＃15-10株の作製
アセトンからイソプロパノールへの変換が期待される合成遺伝子であるipdh遺伝子の発現ベクターpDI626PGK-T-iPDHを制限酵素AatII及びBssHIIで切断、線状化し、エタノール沈殿後0.1×TE Buffer に溶解、Frozen EZ yeast transformation kit (Zymoresearch社製) を用いてアセトン生産酵母＃3-17を形質転換した。得られた14クローンをコロニーPCRし、13クローンでipdh遺伝子が導入されていることを確認した。最もイソプロパノール生産量が多かった株を＃15-10と命名した。

Claims (7)

  1. ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入された組換え酵母であって、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び/又はD-リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ遺伝子の発現を強化したことを特徴とする組換え酵母。
  2. ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入された組換え酵母であって、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を導入した及び/又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子の発現を強化したことを特徴とする組換え酵母。
  3. ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入された組換え酵母であって、アセチルCoAを基質として酢酸エチルを合成する反応に関与するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を強化したことを特徴とする組換え酵母。
  4. ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入された組換え酵母であって、アセチルCoAを基質としてイソプロパノールを合成する反応に関与するアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、酪酸-アセト酢酸 CoAトランスフェラーゼのサブユニットA遺伝子、酪酸-アセト酢酸 CoAトランスフェラーゼのサブユニットB遺伝子、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする組換え酵母。
  5. 請求項１乃至４いずれか一項記載の組換え酵母を培地にて培養する工程を含む物質の製造方法。
  6. 上記物質は、酢酸、アセチルCoA及びアセチルCoAに由来する物質からなる群から選ばれる１種であることを特徴とする請求項５記載の物質の製造方法。
  7. 上記アセチルCoAに由来する物質は、酢酸エチル又はイソプロパノールであることを特徴とする請求項６記載の物質の製造方法。
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