JP5803563B2 - イソブタノールの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)イソブタノール生合成経路を有し、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化した組換え酵母を培養し、培養物からイソブタノールを取得することを特徴とするイソブタノールの製造方法。
(2)上記組換え酵母は、上記イソブタノール生合成経路において、補酵素としてNADPHを利用して2-アセト乳酸を2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸とする反応を触媒するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼが機能する細胞内組織において、上記NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化したものであることを特徴とする(1)記載のイソブタノールの製造方法。
(3)上記細胞内組織はミトコンドリアであることを特徴とする(2)記載のイソブタノールの製造方法。
(4)上記NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルをコードする領域を有する遺伝子又は当該領域を付加した融合遺伝子であることを特徴とする(3)記載のイソブタノールの製造方法。
(5)上記組換え酵母は、上記イソブタノール生合成経路において、ピルビン酸から2-ケトイソ吉草酸までの経路に関与する酵素をコードする遺伝子群を細胞質内で発現させたものであることを特徴とする(2)記載のイソブタノールの製造方法。
(6)上記組換え酵母は、上記細胞内組織にて機能するNAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させたものであることを特徴とする(2)記載のイソブタノールの製造方法。
(7)イソブタノール生合成経路を有し、補酵素としてNADPHを利用して2-アセト乳酸を2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸とする反応を触媒するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼが機能する細胞内組織においてNADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化した組換え酵母。
(8)上記細胞内組織はミトコンドリアであることを特徴とする(7)記載の組換え酵母。
(9)上記NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルをコードする領域を有する遺伝子又は当該領域を付加した融合遺伝子であることを特徴とする(8)記載の組換え酵母。
(10)上記イソブタノール生合成経路において、ピルビン酸から2-ケトイソ吉草酸までの経路に関与する酵素をコードする遺伝子群を細胞質内で発現させたものであることを特徴とする(7)記載の組換え酵母。
(11)上記細胞内組織にて機能するNAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させたことを特徴とする(7)記載の組換え酵母。
本発明に係るイソブタノールの製造方法は、イソブタノール生産能を有する酵母に対して、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化した組換え微生物を培養し、培養物からイソブタノールを得るものである。
以下、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼについて詳述する。NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼとは、イソクエン酸を基質とし、2-オキソグルタル酸を生成する反応を触媒し、補酵素としてNADPを必要とする酵素であってクエン酸回路(図2参照)を構成する酵素である。なお、NADを補酵素として必要とするNAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼも知られている。特に、サッカロマイセス・セレビジエでは、図2に示すように、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としてIPD1遺伝子及びIPD2遺伝子が知られている。IPD1遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルを有するNADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードしている。また、IPD2遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルを有しないNADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードしている。なお、サッカロマイセス・セレビジエにおいてNAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、図2に示すように、ミトコンドリア内にて機能するIDH1遺伝子及びIDH2遺伝子が知られている。
本発明において、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化する対象となる酵母は、イソブタノール生合成経路を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属酵母、Candida属酵母、Torulopsis属酵母、Zygosaccharomyces属酵母、Schizosaccharomyces属酵母、Pichia属酵母、Yarrowia属酵母、Hansenula属酵母、Kluyveromyces属酵母、Debaryomyces属酵母、Geotrichum属酵母、Wickerhamia属酵母及びFellomyces属酵母を挙げることができる。なお、酵母は、上述した酵母の野生株でも良いが、各種の変異が導入された変異株でも良い。例えば、遺伝子組換えや変異導入により外来遺伝子の発現量が向上するといった特徴を有する酵母変異株を宿主として使用することができる。
上述したNADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化する対象となる酵母を、グルコース等の炭素源を含む培地で培養することによって、イソブタノールの生合成が進行する。このとき、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、2-アセト乳酸から2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸への反応に使用されるNADPHを供給することができる。これにより、イソブタノール生合成経路におけるNADPHの枯渇或いは減少に起因するイソブタノール生産性の低下が防止され、イソブタノールの生産性を高く維持することができる。
下記の参考例に作製方法を記載したpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6を鋳型として、HIS3遺伝子のターミネーター領域とTDH3遺伝子のプロモーター領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。このPCRにはプライマーとして、TB3345(5'-TGCGGCCGGCCGCAGCTTTGCAGAG-3':配列番号3)とTB1928(5'-TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC-3':配列番号4)を使用した。
上記で得られたpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1partを鋳型として、PrimeSTAR MAX DNA Polymerase(タカラバイオ社製)用いて、IDP2遺伝子に融合されているCOX4遺伝子のミトコンドリア移行シグナルを欠失したプラスミドを構築した。このプラスミドをpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2-T_IDP2-PDC1partと命名した。このときプライマーはTB2091(5’-AACAAACAAAACAAAATGACAAAGATTAAGGTAGCTAACCC-3’:配列番号15)とTB2595を使用した。
先ず、下記の参考例に作製方法を記載したpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB0948とTB0735を使用した(プライマーの配列は参考例を参照)。Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット(ZYMO RESEARCH)を用いて、サッカロマイセス・セレビジエOC2-T株(J. Ferment. Bioeng. 81:98-103)に、キット添付のプロトコールに従い、増幅したDNA断片を形質転換した。形質転換後、ゼオシン(300μg/ml)を含むYPDとしたプレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得、Uz180株と命名した。
上記で得られたpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1partを鋳型として、TDH3遺伝子のプロモーター領域、HIS3遺伝子のターミネーター領域、pCR-Blunt II TOPOのベクター配列、PDC1遺伝子の一部を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCRにはプライマーとしてTB1928とTB1147(5’-CCAGCTAACTTGGTCGACTTG-3’:配列番号16)を使用した。
上記で得られたpCR-5U_IDH1-P_TDH3-IDP2m-T_IDP2-ERO1_T-HOR7_P-AUR1-3U_IDH3を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCRにはプライマーとしてTB2789とTB2791を使用した。OC2-T株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、増幅したDNA断片で形質転換した。形質転換後、オーレオバシジン(1.5μg/ml)を含むYPDとしたプレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得、Uz487株と命名した。なお、OC2-T株は2倍体のため、Uz487株はヘテロにIDH1遺伝子が破壊されている。
先ず、酵母OC2株のゲノムDNAを鋳型として、PDC5遺伝子とその5'上流・3'下流非翻訳領域とを含むDNA断片と、プラスミドpUC19を鋳型として、pUC19のマルチクローニングサイトで切断され、pUC19全長を含むDNA断片とをPCRで増幅した。なお、PCRに使用するプライマーは増幅した断片が約15bp重複するように設計した。
次に、pUC19-5U_PDC5-PDC5-3U_PDC5を鋳型として、PDC5遺伝子の5'上流・3'下流非翻訳領域とpUC19を含む領域のDNA断片と、酵母OC2株のゲノムDNAを鋳型として、TDH3ターミネーター領域を含むDNA断片、細胞質局在型のILV5遺伝子及びターミネーター領域を含むDNA断片、細胞質局在型のILV2遺伝子及びターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。ここで、細胞質局在型のILV5遺伝子とは、5'末端よりミトコンドリア移行シグナルと推定される34アミノ酸をコードする領域に代えてメチオニンをコードするコドンに置換した塩基配列からなる遺伝子である。細胞質局在型のILV2遺伝子とは、5'末端よりミトコンドリア移行シグナルと推定される54アミノ酸をコードする領域に代えてメチオニンをコードするコドンに置換した塩基配列からなる遺伝子である。ミトコンドリア移行シグナルは、予測プログラム「TargetP」を用いて推測した。なお、PCRに使用するプライマーは増幅した断片が約15bp重複するように設計した。
上記で得られたpUC19-5U_PDC5-T_CYC1-P_TEF1-ADH2-T_HIS3-P_CYC1-G418-T_URA3-P_TDH2-ILV3c-T_ILV3- ILV6_T-ILV6c-PDC1_P-3U_PDC5を鋳型として、CYC1ターミネーター領域からPDC5遺伝子の3’下流非翻訳領域までのDNA断片と、pUC19-5U_PDC5- P_TDH3-ILV5c-T_ILV5-ILV2_T-ILV2c-P_FBA1-P_ADH1-ARO10-T_CYC1-P_TEF1-3U_PDC5を鋳型として、PDC5遺伝子の5’上流非翻訳領域からTEF1プロモーター領域までのDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2236とTB1566、TB1511とTB2269を使用した。増幅した断片は、CYC1ターミネーター領域とTEF1プロモーター領域がそれぞれ配列が重複しているため、本断片を同時に形質転換した場合、PDC5遺伝子座5’上流非翻訳領域、CYC1ターミネーター領域かTEF1プロモーター領域、PDC5遺伝子座3’下流非翻訳領域の3か所で相同組換えが起こり、ゲノムに全ての遺伝子が導入される。OC2-T株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、増幅したDNA断片を形質転換した。形質転換後、G418(200μg/ml)を含むYPDとしたプレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得、Uz258株と命名した。
上記で得られたpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB0948とTB0735を使用した。上記で得られたUz258株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、増幅したDNA断片を形質転換した。形質転換後、ゼオシン(300μg/ml)を含むYPDとしたプレートにまいて、30℃で5日間培養し、形質転換体を得、Uz430株と命名した。
先ず、得られた形質転換体をYPD培地(イーストエキストラクト 10g/L、ペプトン 20g/Lグルコース20g/L)に植菌し、30℃で24時間震盪培養を行った。培養終了後、遠心分離(2000g、3分)により菌体を回収した。
カラム:J&W 社製キャピラリーカラムDB-1(30m×内径0.32mm,膜厚1μm)
ガスクロマトグラフパラメータは以下の通りとした。カラム温度:40℃、平衡時間:2分、気化室温度:250℃、検出器温度:300℃、サンプリング時間:1分、スプリット:スプリットレス、キャリア圧力:58.9kPa、カラム流量:1.79ml/分、線速度:30cm/sec、全流量:4.8ml/分、オーブン温度:40℃(2分)→(5℃/分)→70℃→(50℃/分)→250℃(1分)
発酵試験の結果を図3及び4に示した。
図3に示すように、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするIDP2遺伝子をミトコンドリアで過剰発現させたUz251-17株は、イソブタノールの収率が向上した。一方、IDP2遺伝子をミトコンドリアで過剰発現させるとともにミトコンドリアに局在するNAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼIDHの1つのサブユニットをコードするIDH1遺伝子をヘテロに破壊したUz487株は、Uz251-17株と比較してイソブタノールの収率が更に向上していた。これは、ミトコンドリア内において、NAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を下げ、相対的にNADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を向上させることで、NADPHの供給量を増加させることができたことによると考えられる。
本参考例では、実施例で使用したpCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6の作製手順について説明する。このプラスミドは、上述した実施例において、IPD2遺伝子を過剰発現させるDNA断片を導入する土台となるプラスミドである。すなわち、実施例で作製したpCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1partを鋳型とし、プライマーTB1932及びTB0115用いて増幅したDNA断片をOC2株のゲノムに導入するためには、相同組換え領域であるDNA断片の5'及び3'両末端の配列がそれぞれの染色体上の近傍な位置にある必要がある。そこで、HIS3遺伝子のターミネーター領域及びTDH3遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片と、PDC1遺伝子の一部を含むDNA断片とをPDC6遺伝子上流に導入するためのDNA断片を作製した。
Claims (6)
- イソブタノール生合成経路を有し、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするNADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を過剰発現可能に導入した組換え酵母を培養し、
(a) 配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b) 配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
培養物からイソブタノールを取得することを特徴とするイソブタノールの製造方法。 - 上記組換え酵母は、上記イソブタノール生合成経路において、補酵素としてNADPHを利用して2-アセト乳酸を2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸とする反応を触媒するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼが機能する細胞内組織において、上記NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を強化したものであることを特徴とする請求項1記載のイソブタノールの製造方法。
- 上記細胞内組織はミトコンドリアであることを特徴とする請求項2記載のイソブタノールの製造方法。
- 上記NADP依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルをコードする領域を有する遺伝子又は当該領域を付加した融合遺伝子であることを特徴とする請求項3記載のイソブタノールの製造方法。
- 上記組換え酵母は、上記イソブタノール生合成経路において、ピルビン酸から2-ケトイソ吉草酸までの経路に関与する酵素をコードする遺伝子群を細胞質内で発現させたものであることを特徴とする請求項2記載のイソブタノールの製造方法。
- 上記組換え酵母は、上記細胞内組織にて機能するNAD依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させたものであることを特徴とする請求項2記載のイソブタノールの製造方法。
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