JP5368321B2 - 固相ｐＨ検出を用いたｑＰＣＲ - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、ｐＨ感受性イオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いて増幅の結果としてプライマー伸長法から生じるプロトン放出を検出することによる、核酸増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応または転写媒介増幅、の定量的リアルタイムモニタリングに関する。本発明は、この目的のためのｐＨ感受性ＩＳＦＥＴを含む検出機器を提供するものでもある。

発明の背景
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ）はＤＮＡまたはＲＮＡの少量の複製、例えば遺伝子配列のクローニング、疾患に関連付けられた変異のための法医学的検査および遺伝学的検査、のための業界標準になっている。ｑＰＣＲのほとんどの形態は標識されたプローブ（例えば、蛍光染料）を単位複製配列を検出するために必要とする。ここで開示されたｑＰＣＲは、標識プローブの必要性を避けている。それは、代わりにＰＣＲサイクルの結果によって生じるプロトン放出のｐＨ感受性ＩＳＦＥＴ検出によるものであり、チップ上で行なうことができる。

発行された国際特許出願ＷＯ０３／０７３０８８で報告されているように、発明者らは既に、ＩＳＦＥＴがオリゴヌクレオチド鎖における個々の核酸挿入に関連したプロトン放出を測定するために用い得ることを見出していた。ｐＨ感受性ＩＳＦＥＴによる個々の核酸挿入の測定は、従来のサンガー法ＤＮＡシークエンシングに基づいたＤＮＡシークエンシング、および、標的特異的核酸部位に対してデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を検出することにより対立遺伝子多型、例えば一塩基多型（ＳＮＰｓ）、の同定に要されることができる。プロトンがＰＣＲ産物でもあること、および、したがってｑＰＣＲが好ましくは低反応容量の容器におけるプロトン放出のＩＳＦＥＴ測定によっても達成されることを発明者らがさらに理解したことによって生じるものである。

すなわち、本発明の一態様において、サンプル中にある場合の標的配列の増幅のための緩衝化された核酸増幅混合物を含むサンプルにおける、核酸増幅の測定方法であって、
前記測定は、超えられるべきサンプルの緩衝能に対する閾値サイクル数より多い増幅の結果としての、標的配列の存在下におけるプロトン放出から生じるｐＨ変化を検出することによって行なわれ、
前記検出は検出機器を採用し、
前記検出機器は、前記検出サンプルに晒された検出表面を有し、かつ前記トランジスタ表面におけるｐＨ変化に応じた電気的出力信号を発生するように配置されたＩＳＦＥＴ、および、該ＩＳＦＥＴからの電気的出力信号を検出するための手段を含む
ことを特徴とする測定方法が提供される。

検出において求められる感度を達成するために、増幅は、好ましくは、小さな（好ましくはナノ）容量、および、放出されたプロトンの数が迅速なｐＨ変化をもたらし、サンプルの緩衝能が打ち負かされるような低緩衝能において実行される。したがって、かかる方法は、有利にはマイクロ流体デバイスまたはチップに備え付けられた統合されたｐＨ感受性ＩＳＦＥＴを備えたナノリアクタ中で行なわれてもよい。

本発明の実施形態は、添付の図面を参照して実施例のみによって記載されている。ここで：

図１は、緩衝化された反応媒体を用いたＤＮＡ鎖伸長の間に生じるｐＨ変化を示す。 図２は、上記のようにＤＮＡシークエンシングのために利用された電界効果トランジスタの回路図である。 図３は、上記のようにＤＮＡシークエンシングのために採用された電界効果トランジスタのペアの回路図である。 図４は、すべて必要とされるｄＮＴＰＳおよび１つのｄｄＮＴＰを反応混合物中に採用するＤＮＡ鋳型上のサンガー型のＤＮＡ塩基配列決定のための電界効果トランジスタのペアを用いて得られた結果の略図である。 図５は、標的核酸配列の増幅を生じるＰＣＲサイクルを模式的に示す。 図６は、ＤＮＡ配列決定のための本発明を適用して測定したＤＮＡ伸長を通してのプロトン放出を示す。 図７は、ＩＳＦＥＴｐＨ検出を用いた定量的リアルタイムＰＣＲのシミュレートの結果を示す。 図８は、ｑＰＣＲを実行するための低容量反応チャンバに組込まれたＩＳＦＥＴを含むマイクロ流体デバイスの回路図である。 図９は、カバー（２０）付きの反応チャンバ／ウェル（１９）における固定サンプルのＰＣＲ測定を行なうためのマイクロ流路デバイスのさらなる概略図である。 図１０は、本発明に係るＰＣＲ測定を行なうためのマイクロ流路デバイスの平面図および交差部分を示し、該サンプルはＤＮＡ変性、標的へのプライマーハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長それぞれのために異なる温度に維持されたシリコンチップ基体（２３）の領域を連続的に横断するマイクロ流体流路（２２）、例えば、アクリルまたはパースペックスの基体、を通して流れる。ＰＣＲのためのサンプルの温度サイクルの３つの温度領域が示される。 図１１は、必要な温度サイクルを達成するための異なる温度領域のチャンバにおいて後方または前方にサンプルが移動させられる本発明に係るＰＣＲ測定のための選択的マイクロ流体デバイス模式図である。

詳細な説明
ｐＨ感受性ＩＳＦＥＴ
上述のように、ＷＯ０３／０７３０８８は、成長中のＤＮＡ鎖へのヌクレオチド塩基の結合が水素イオンの放出を生じることに基づいて（図６参照）、サンガー型のＤＮＡシークエンシングのためにｐＨ感受性ＩＳＦＥＴを用いることを教示する。図１に示された結果は、ＤＮＡ伸長反応とそのｐＨにおける効果を実証する。ｐＨはガラス電極配置を用いて測定され、３０秒毎の絶対値が測定された。そのようなＤＮＡ伸長の間に成長するヌクレオチド鎖の末端における個々のヌクレオチド挿入を測定することのできるＩＳＦＥＴは、核酸増幅測定のために同様に提供される。上述のように、係るＩＳＦＥＴは、例えば、その最上部がポリメラーゼの層であるイオン感受性窒化シリコン層とともに備え付けられる。該ＩＳＦＥＴは、迅速なｐＨ変化を検出でき、かつ、ｐＨ変化の１ｍｓ以内で測定された即時の応答速度を有している［Woias et al.,‘Modelling the short-time response
of ISFET sensors’, Sensors and Actuators B, 24-25(1995), 211-217］。ヌクレオチド挿入に続くフォローアップ反応はｐＨ依存性であり、したがって、水素イオンの正味の消費または生産は、反応が起こるところのｐＨに依存する。一般に、該反応は、６から８．５、例えば、７から７．５、のｐＨ範囲で行なわれる。この範囲では、水素イオンはヌクレオチド挿入の間全体的に遊離している。

ＤＮＡ伸長または核酸増幅を測定するために用い得るようなｐＨ感受性ＩＳＦＥＴが図２に示される。ＷＯ０３／０７３０８８に記載されるように、ＩＳＦＥＴは酸化シリコン誘電体層１、窒化シリコン物質感受性層２、および酵素／電解質界面３を含んでいる。該層１、２および界面３は電源４およびドレイン５の間に配置されている（従来のＦＥＴの構成）。該ＦＥＴはシリコンチップ上に備え付けられ、試薬混合物から保護するためにエポキシ樹脂中に封入される。該エポキシ樹脂はＦＥＴを水素および電荷移動から保護するのに役立つ［Matsuo and Esashi,‘Methods of ISFET fabrication’, Sensors and Actuators, 1(1981) 77-96］。ＦＥＴゲート自体は試薬混合物に浸されるようにエポキシ樹脂で被覆されていない。

図２に示される酵素／電解質界面３は窒化シリコン層２のイオン感受性がＤＮＡシークエンシングまたは核酸増幅の測定のためのプロトン検出に用いられるようにしている。物質感受性層２の表面および反応性媒体（例えば、酵素／電解質界面３）の間の荷電されたイオンの交換を発生することによりＦＥＴは機能する：
ＳｉＯＨ ←→ＳｉＯ^-＋Ｈ⁺
ＳｉＯＨ₂ ⁺ ←→ＳｉＯＨ＋Ｈ⁺
ＳｉＮＨ₃ ⁺ ←→ＳｉＮＨ₂＋Ｈ⁺
窒化シリコンを含むことは、窒化シリコンがない場合に得られるよりも、ｐＨ変化に対する増加されたより早い感受性を提供できるため有利である。また、窒化シリコンはＦＥＴを水素化および電荷移動から保護するのに役立つ。

非ネルンスト応答は、絶縁ゲート窒化シリコン表面における迅速なプロトン依存性の荷電イオンの結合および非結合によって引き起こされるＦＥＴの迅速な感受性を説明し、窒化シリコン層２全体における電圧降下の再生可能な変化をもたらす。窒化シリコン層２全体における電圧降下の変化は、ｐＨの変化に関連している。電圧降下は計装回路を用いて測定され、ここでは個々のヌクレオチド挿入の検出が可能である。測定された電圧はフラットバンド電圧として言及されている。

酵素／電解質界面３は、公知の酵素関連方法［Starodub et al.,‘Optimisation methods of enzyme intergration with transducers for analysis of irreversible inhibitors’, Sensors and Actuators B 58 (1999) 420-426］を用いて窒化シリコン層の上に堆積される。該方法は、アミノシラン溶液を用いて窒化シリコン層２にシラン前処理を行ない、それからグルタルアルデヒドを用いてその表面を活性化する工程を含んでいる。緩衝液／ポリメラーゼ酵素溶液の液滴は、窒化シリコン層２の上に堆積され、酵素層３を形成するために約半時間乾燥されることができる。

図２に示される実施形態は、ｐＨ変化の測定を提供するための参照電極６を使用している。参照電極は比較的大きく作製が難しい。代わりの実施形態は参照電極を使用していない、しかし、第１のＦＥＴと同じ構造を有する第２のＦＥＴを代わりに使用し、酵素層３の代わりに非酵素結合層付きで提供される。この配置は、ノイズに対するシグナル比を改善する異なった方法が提供されるため有利である。

さらに選択的な実施形態が図３に記載され、ＷＯ０３／０７３０８８にも既に記載されているがＤＮＡ伸長の測定の文脈においては単独では記載されていない。この実施形態の構成は公知の構造に基づいている［Wong and White,‘A self-Contained CMOS Integrated pH Sensor, Electron Devices meeting IEEE 1988］それは既にｐＨの緩やかな遅い動向を測定することを用いている。本実施形態は、第１のＦＥＴ１１の電源が接続された第１の演算増幅器１０（第１のＦＥＴは酵素結合層を有している）、および第２のＦＥＴ１３の電源が接続された第２の演算増幅器１２（第２のＦＥＴは酵素が結合されていない）
を含んでいる。第１および第２のＦＥＴのドレインは固定の電流源（示していない）に接続されている。第１および第２の演算増幅器からの出力は差動増幅器１４へ移動され、出力信号Ｖ_OUTを生じる出力の間の差を増幅する。差動増幅器１４からのネガティブフィードバックは試薬混合物中に位置する貴金属電極１５へ送られる。演算増幅器１４は、水素濃度の変化にもかかわらずＦＥＴ１１，１３へ同じ電圧を供給し続ける出力電圧を生じる。図３に示される実施形態は、ＦＥＴ１１，１３および演算増幅器１０，１２，１５の製作を合理化することができるため有利である。

ＦＥＴ１１，１３は、演算増幅器１０，１２の第１ステージから配置されていてもよい。これはそれぞれの演算増幅器のために演算増幅器の入力部に位置された長い末端ペアの従来のＦＥＴを、第１または第２のＦＥＴ１１，１３で置き換えることにより行なわれる。これは、第１および第２のＦＥＴが増幅回路の一部を形成することができるため有利である。

ＤＮＡシークエンシングのための図３に示す形態を用いて検出されたフラットバンド電圧の図例が図４に描かれている。フラットバンド電圧は、ヌクレオチド挿入に関連したｐＨ変化を示すパルスおよびｄｄＮＴＰ挿入および連鎖停止に関連した降下から構成される。より大きな降下の前の局所パルスの数は公知の塩基における停止前に存在する塩基の数を決定し、より大きい降下の大きさは試薬混合物中で用いられたｄｄＮＴＰ：ｄＮＴＰの比に依存し、その降下のための実際の長さの依存の理由から重要である。４つのｄｄＮＴＰＳの各々を別々に含む異なる反応チャンバにおいての４回の工程の繰返しを通して、完全な塩基配列が描かれる。

イオン感受性ＦＥＴを製作するために用いられる工程は以下のとおりである：
精製シリコン基板
ドーパントの添加：ｐ型基板の製造
表面酸化：ＳｉＯ₂層生成
電源／ドレイン定義および植込み
ＬＰＣＶＤ^*を用いた窒化シリコン堆積
接触形成
パッシベーション
＊ 低圧化学蒸着
ＦＥＴおよび特に図３に示されるもの、および増幅ステージは、ＰＭＯＳトランジスタに置き換えまたは結合されてもよい。

核酸増幅の測定
図２または３に示されるような検出デバイス形式におけるｐＨ感受性ＦＥＴは、本発明によって核酸増幅を測定することを好適に採用してもよい。ｐＨ感受性ＦＥＴのそのような使用は、ｑＰＣＲを行なうことに関連してさらに以下に記載される。しかしながら、ｐＨ感受性ＦＥＴは、転写介在増幅（ＴＭＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む核酸増幅のいずれかの形式を測定するのと同じ方法を採用することが好ましい。

ＰＣＲは、増幅プロセスのサイクル数を超えた増幅のために重要な各々のＤＮＡ鎖へのハイブリダイゼーションの特異的塩基配列へのターゲット化をプライマーが与える二重鎖ＤＮＡのフラグメントの増幅の工程である。それには図５に示されるようなＰＣＲサイクルに対する３つのステージがある。それは以下に示すような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー伸長のための必要な成分の存在下での温度サイクルを通して達成される：
・変性：二重鎖鋳型ＤＮＡは２つのＤＮＡ鎖を結合する水素結合を破壊することにより、例えば、９５℃において、２つの一本鎖に分離される；
・アニーリング：重要な塩基配列は、例えば５５℃で実行される鋳型ＤＮＡの一本鎖へ
のハイブリダイズをする２つのオリゴヌクレオチドプライマーによって決定される；
・伸長：ＤＮＡポリメラーゼはｄＮＴＰｓの存在下で各々のプライマーを伸長する、例えば７２℃において
サイクルの伸長ステージにおいて、プロトンは各々のプライマーへの塩基の添加の結果として放出される。それは、本発明に基づいたＰＣＲ産物のリアルタイム定量のための基礎として用いられるこのプロトン放出である。上述したように、ＩＳＦＥＴ検出表面は緩衝化された増幅混合物に晒され、好ましくは、低容量反応チャンバまたは流路、例えばマイクロ流体デバイスのチャンバまたは流路中に配される。このように、例えば、低容量反応チャンバまたはウェルは好適に採用されることができ、例えば容量が１ｐＬから約１０μＬのものである。これはＩＳＦＥＴの上に図８に示すように設けられてもよく、ここではＩＳＦＥＴ（１６）反応チャンバまたはウェル（１８）の基体（１７）に設けられ、マイクロ流路はサンプル輸送およびチャンバからの排出のために設けられる。チャンバは、ＰＣＲ温度サイクルのためのアニーリングおよび変性温度の間（例えば、５５および９５℃の間）において加熱および冷却されることができる。プライマーおよびｄＮＴＰｓなどの増幅のための試薬は，反応チャンバ内で乾燥されサンプルとともに導入されてもよい。標的塩基配列が存在する場合は、それからＰＣＲサイクルの進行のある閾値を超えたｐＨ降下により決定されることができる。標的塩基配列が存在しない場合は、プライマーは鋳型ＤＮＡにアニールせず、プロトン放出プライマー伸長は起こらないためｐＨの大きな変化が得られない。増幅混合物中のバッファの存在により、ＰＣＲサイクルによって生じるｐＨ変化はまず緩衝作用によって計測される。しかしながら、一度、緩衝能が打ち消されると、図７に示されるようにｐＨの迅速な変化が測定される。ｐＨ変化が一定の閾値を通過する前のサイクルの数は、ＤＮＡ鋳型の濃度に依存し、濃度が高いほどサイクルは少なくなり、公知の鋳型負荷に対する閾値に達するＰＣＲサイクルの数を算出することにより鋳型ＤＮＡの定量が可能とされている。

上述のようなＩＳＦＥＴが含む多数のチャンバは１つのマイクロ流体チップに備え付けられることができる。これは、例えばＤＮＡ指紋法用のショートタンデムリピート（ＳＴＲｓ）の増幅が望まれる場合、または、遺伝学的テストのために同じ由来または異なる由来の多種のＤＮＡサンプルを増幅すること、または１つのＤＮＡ鎖の異なるサイトを増幅することが望まれる場合に特に有益である。マイクロ流体チャンバ内に備えられたＩＳＦＥＴは、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび伸長のための温度を制御する抵抗性チップ状発熱体および温度センサを備えたシリコンチップなどのチップの完全な部分であってもよい。そのようなチップはさらに統合された参照電極および導電率センサを備えていてもよい。

ＰＣＲ測定のための統合されたアクチュエータ（ヒータ）を備えたシリコン内の１つまたは多数のナノリットル反応チャンバの製作は、Iordanovら‘Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication, IEEE (2004) 229-232に例えば記載されている。このように製作されたチャンバ（図９参照）は、各々が本発明に基づいた核酸増幅の測定のための統合されたＩＳＦＥＴとともに備え付けられてもよい。Iordanovらによって彼らの上記文献に記載されるように、未処理のシリコンおよび標準シリコン関連材料はＴａｑポリマーの阻害剤である。したがって、例えばシリコンゲルマニウムまたは歪みシリコン（このような材料のすべてを以後シリコン基材と呼ぶ）が核酸増幅のためのマイクロチップチャンバまたは流路の製作のために採用されるときは、ＳＵ８、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、パースペックス（登録商標）またはガラスなどのシリコンによるポリメラーゼ減退降下を避けるための材料で通常被覆される。

微小製作されたＰＣＲ用のシリコンガラスチップの表面パッシベーションは、ShoffnerらによってNucleic Acid Res. (1996) 24, 375-379にも記載されている。彼らの研究では、シリコンチップは標準的なフォトリソグラフィの手順を用いて製作され、１１５μｍの
深さにエッチングされた。パイレックス（登録商標）ガラスカバーが各々のシリコンチップの最上部上に配置され、該シリコンおよびガラスは陽極接合された。いくつかのタイプの表面パッシベーションは供給されたチャンバ内での温度サイクルによるＰＣＲ増幅降下の改善の観点で調査された。酸化されたシリコン表面（ＳｉＯ₂）は従来のＰＣＲチューブ内で行なわれる反応と比較して一貫した増幅が得られることがわかった。そのような表面は本発明に基づくＩＳＦＥＴｐＨ検出を備えた核酸増幅を実行するためのマイクロ流体デバイスの製作においても有利である。ＰＣＲマイクロ流体デバイスの製作における表面パッシベーションのさらなる議論のために参照文献としてZhangら‘PCR microfluidic devices for DNA amplification’in Biotechnology Advances (2006) 24, 243-が挙げられる。概観した論文に記載されるように、基材コーティングによる静的表面パッシベーションの代わりとして、サンプル中にパッシベーション剤を含むことができるようにしてもよい（直接的パッシベーション）。

固定サンプルにおけるＰＣＲ測定を実行するための上記のような低容量反応チャンバの代わりとして、ＰＣＲ測定のサンプルマイクロ流体デバイスの流路またはチャンバを通した流れを生じさせるようにしてもよく、その流れがＰＣＲのための温度サイクルが達成される異なる温度に連続的に晒されるようにしてもよい。このように、例えば，サンプルはＰＣＲステージの変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長に適した異なる温度領域を連続的に横断する流路またはチャンバ、例えばマイクロ流体デバイスの流路、例えばシリコンチップデバイス、を通して流れることとなるようにしてもよく、それらは変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のＰＣＲステージの流路に沿った連続的反復に適した基体において設けられる異なる温度領域を連続的に横断する。チップ上で連続的フロー核酸増幅を行なうためのそのようなマイクロ流体構造は、例えば、Aurouxらによって‘Minaturised nucleic acid analysis’Lab Chip (2004) 4, 534-546に記載されており、増幅のＩＳＦＥＴ測定と組み合わされてもよい。図１０および１１に示されたようなタイプのマイクロ流体構造は、例えば流体ネットワークを決定するためのフォトリソグラフィを用いた標準的な微小製作技術、およびその後の例えばＰＭＭＡ、アクリル、パースペックス（登録商標）またはガラス基材において必要な流路または複数流路を作り上げるためのエッチングまたは堆積工程の使用を通して製作されてもよい。流路の基体はヒータまたはヒートポンプ（ペルティエ）要素と同様に統合されたＩＳＦＥＴおよび温度センサとともにシリコンチップに基材が結合されることによって形成されてもよく、そのような反応混合物はそれらのセンサおよびアクチュエータに直接的に接触し、温度制御のための回路を含んでいてもいなくてもよい。代わりに、流路の基体は反応混合物に直接的に接触するようなＩＳＦＥＴに備えられたプリント回路ボード（ＰＣＢ）および温度センサによって形成されていてもよい。ＰＣＢの表面は、その上にマイクロ流体プラットフォームが設置される平面ベースを提供するように平らにされることが必要とされる。ＰＣＢはヒータまたはヒートポンプ要素、センサインターフェイスおよび温度コントロール回路をさらに収容していてもよい。マイクロ流体流路またはチャンバ内に存在する試薬は選択された塩基配列の増幅のために適したサイトにおいて標的にハイブリダイズする能力のために選択されたプライマー、増幅に必要な酵素および過剰の全部で４つのｄＮＴＰｓを含む緩衝化された増幅混合物のそれとなる。

このように、本発明に基づく温度サイクルを伴うＰＣＲの測定のための一実施形態において、核酸増幅のためのサンプルは、基材（２３）、例えばシリコンチップのシリコン基材、の上のマイクロ流体流路（２２）（例えばアクリル、ＰＭＭＡまたはパースペックスのプラットフォームに微小作製された）を通して流れるようになっており、変性、アニーリングおよび鎖伸長、変性のための９５℃、プライマーの標的へのハイブリダイゼーションのための５５℃およびプライマー伸長のための７２℃その後の反復を伴う（図１０参照の）ステージの流路の長さに沿って連続的反復のために適した基材または基体に設けられた温度領域を連続的に横断するように流れる。このように、連続的フロースルー増幅は達
成され基体に設けられた１つ以上のＩＳＦＥＴを用いて本発明に従って測定されてもよい。それはリアルタイムＰＣＲ分析が増幅手順として達成されるように連続的フローＰＣＲのための上記デバイスの流路に沿った多数の位置においてＩＳＦＥＴ検出器が設けられることが好ましい。

ポリシリコン抵抗などのオンチップ発熱体は、電流が流れたときの抵抗において浪費された電力のジュール加熱効果（Ｐ＝Ｉ²Ｒ）を用いて反応混合物を加熱するために用いられてもよい。冷却はシリコン基材およびマイクロ流体プラットフォームを通した加熱浪費を通して達成されることができ、少量の反応混合物がシリコンチップ基体の効果的温度浪費と同様に含んでいることからそれは可能である。代わりに、加熱および冷却の両方のためのオンチップペルティエヒートポンプ要素が公知の方法で補充されることができる。温度均一性は反応混合物のためおよびＩＳＦＥＴおよび他のオンチップ回路のための両方のために、チップ上の温度勾配を避けるために非常に重要である。これは発熱体の適切な配置によって達成することができる。

温度制御は比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラによって達成されることができ、最も一般的な閉回路フィードバック制御システムの１つである。測定温度と標的温度との間の誤差は要求される加熱レベルを計算するために使用される。この出力レベルの計算は直接的な電流誤差（比例の）、誤差の歴史（全体）、および予測されるその変化速度に基づいた将来的誤差（派生物）に基づいて行なわれる。同様に、ＰＩコントローラは、Iordanovら（2004）ibidに記載されるような誤差の現在および過去の値に基づいて温度を安定させる。代わりに，パルス幅変調または負荷サイクルなどの技術を実装されることができる。これらの技術において、ヒータ出力は大きさではなく一定に時間のパーセンテージとしてのヒータが「オン」である時間によって調整される。該「オン」時間測定温度と標的温度の間の誤差に反比例し、標的温度を近づけるために、発熱体の「オン」時間も減少される。

また、それは増幅混合物がマイクロチャンバ内で温度サイクルのための必要な温度領域の間で後方および前方に移動される往復システム（図１１参照）を有するように選択されてもよい。そのようなオンチップサンプルシャントＰＣＲ（Aurouxらの上記参照論文に記載される）から生じる核酸増幅はマイクロ流体チャンバの壁内にＩＳＦＥＴを備えることにより測定されることが好ましい。

ＰＣＲのためのマイクロ流体デバイスのさらなる詳細としては、本発明に従ってＩＳＦＥＴ検出のために改変されていてもよく、再び参考文献としてZhangら（2006）Biotech. Adv. 24, 243-284が挙げられる。その参照論文で議論されるように、そのようなデバイスは好ましくはシリコンチップの形態を取ることができる一方で、他のチップ基材の材料はガラス、さまざまなポリマーおよびセラミックスなどを採用してもよい．温度サイクルのための接触加熱の代わりとして、さまざまな非接触加熱方法を同じ参考論文でも議論されるように採用することができ、例えば熱風媒介加熱、ＩＲ光の利用、レーザ媒介加熱、誘導加熱およびマイクロ波照射を含んでいる。

上述のＰＣＲシステムが温度サイクルを達成するように設計されている一方で、種々の等温核酸増幅技術が知られており、例えば一重螺旋置換増幅（ＳＳＤＡ）がある。そして、そのような技術を用いたＤＮＡまたはＲＮＡ増幅は本発明に従ったＩＳＦＥＴ検出によって同様に測定されることができる。

装置
本発明のさらなる一態様において、本発明に従ったサンプルにおける核酸増幅の測定のための検出装置が提供され、上記装置は基体、例えばシリコン基材、の中または上にサン
プルを受入れるためのチャンバまたは流路を含んでおり、１つ以上のｐＨ感受性ＩＳＦＥＴが上記チャンバまたは流路内の核酸増幅の測定のために配置され、上記チャンバまたは流路内に存在する上記基体が増幅降下を改善するためのコーティングを有し、すなわち上記基体は上述のような表面パッシベーションを受ける。マイクロ流体デバイスは、上述のような如何なる形態も取り得る。基体の表面パッシベーションの必要性は、しかしながら、基体材料を選択することにより、または既に上述したような動的パッシベーションを採用する場合は避けることができる。

このように、本発明は、サンプル中の核酸増幅の測定のためのさらに一般的な検出装置を提供し、上記装置はマイクロ流体デバイスを含んでおり、サンプルを受入れるためのチャンバまたは流路が基体、例えばシリコン基材、の中または上に備えられ、１以上のｐＨ感受性ＩＳＦＥＴが上記チャンバまたは流路内の核酸増幅の測定のために配置される。上述のような低容量反応チャンバまたはウェルは固定サンプルまたは連続的フローＰＣＲ用のチャンバまたは流路におけるＰＣＲ測定のために備え付けられていてもよい。さらなるチャンバまたは流路が多数のサンプルの同時測定のために設けられていてもよい。上述のように、基体はサンプルの温度サイクルのための発熱体および温度センサを含んでいてもよい。

ビーズ上でのＤＮＡ伸長の測定
ｐＨ感受性ＩＳＦＥＴがＤＮＡシークエンシングのために使用されようと、ＩＳＦＥＴ表面に固定化されたＤＮＡ上のＤＮＡ伸長の代わりとして核酸増幅、例えばｑＰＣＲ、のために用いられようと、ＤＮＡ伸長はビーズ上で起こる。ビーズの使用は例えば図８に示されるように、反応チャンバまたは流路の底の水平面に配されたＩＳＦＥＴと好適に結び付けることができ、ビーズはＩＳＦＥＴ検出表面の付近に定着する。ビーズは重力的定着のみでビーズがＩＳＦＥＴ検出表面付近に運ばれるようなものが選択されることができる。また、磁石／金属のビーズが選択され、磁気的にＩＳＦＥＴ検出表面付近に引込まれてもよい。ビーズはＤＮＡの付着のためのどのような適切な材料、例えばシリカ、ポリスチレン、アガロースまたはデキストラン、から合成された球状粒子であってもよい。ビーズのサイズは重力沈降を助けるように、および、反応チャンバおよびポート入口および出口の妨害物を避けるための必要性と合致するように調整されていてもよい。ビーズは水または緩衝液を用いてセンサ表面から洗い流されることができる。ビーズへのＤＮＡの結合は従来の方法、例えばビーズ表面の機能化、を用いて達成してもよい。スペーサを採用してもよい。ビーズの被覆率はビーズに対するＤＮＡの比を調整することにより制御される。ｐＨ感受性ＩＳＦＥＴがＤＮＡシークエンシングまたは核酸増幅の測定に用いられ、より小さいサイズの制約がある場合、例えば、シリカビーズ（例えば直径約２００ｎｍ）、および、ビーズに直接的に固定化された、またはカルボキシル基を有する官能基を供給するための次のビーズの修飾体に固定化されたＤＮＡを好適に採用することができる。例えば、プラスチックビーズ（例えば約１μｍのプラスチックマイクロビーズ）を好適に採用することができる。ＩＳＦＥＴを核酸増幅の測定のために採用する場合、ビーズはサンプル中の標的ＤＮＡを捕捉するプローブＤＮＡを運ぶことができる。

ＩＳＦＥＴ上に固定されたＤＮＡプローブの使用
ビーズの使用の代わりとして、標的ＤＮＡの捕捉のためのＤＮＡプローブは直接的または間接的にＩＳＦＥＴに結合されていてもよい。そのようなＤＮＡプローブの固定化は固体表面へのＤＮＡプローブの固定化のための周知の方法、例えばＤＮＡマイクロアレイ技術において周知のそのような技術、を用いることにより達成されてもよい。このように、ＩＳＦＥＴ上のＤＮＡプローブ固定化はインサイチューオリゴヌクレオチド合成により（リソグラフィまたは他の方法により）達成されてもよい。

増幅のためのサンプルの準備
上述のような標的プローブの固定化はサンプルが標的核酸と標的以外の核酸の両者を含む場合に好ましい。プローブの固定化は標的以外の核酸または緩衝タンパク質からの標的の分離を可能とするためにそのようにされる。固定化プローブを用いて標的をＩＳＦＥＴ検出表面に近接させておくことにより、核酸増幅によって生じるｐＨ変化が一定範囲に抑えられ、ノイズに対する信号の比の増加という利益を達成してもよい。

増幅のためのＤＮＡは、口腔スワブ、血液サンプルまたは培養細胞などの種々の材料に由来するものであってもよい。本発明に従った核酸増幅の測定のためのサンプルの準備は、細胞、例えばクローンＤＮＡ配列、からの増幅のために必要とされる細胞の凝集および核酸の放出の工程の１つまたは両方を含んでいてもよい。これらの工程は、核酸増幅のためのデバイスと分離して、または、同じデバイス、例えば上述のＰＣＲチップ、の一部に統合されて実行されてもよい。増幅のための放出された核酸は、例えば、上述のようなマイクロ粒子（ビーズ）に結合することによりさらに生成されてもよい。このような生体サンプルからの標的ＤＮＡの流出および生成は、Leeら‘Microchip-based one step DNA extraction and real time PCR in one chamber for rapid pathogen identification’, Lab Chip (2006) 6, 886-895に記載されるようなレーザ照射磁気ビーズシステム（ＬＩＭＢＩＳ）などの適切なラブオンザチップ（ＬＯＣ）法を採用することにより、ＰＣＲと同じチップ上で達成することができる。

キット
本発明のさらなる態様において、サンプル中の標的核酸塩基配列を核酸増幅、例えばｑＰＣＲ、によって検出するためのキットが提供され、反応チャンバまたは流路を含む検出デバイスおよび上述のような上記反応チャンバまたは流路内の核酸増幅の測定のためのｐＨ感受性ＩＳＦＥＴ、例えばマイクロ流体チップの形成におけるそのような検出デバイス、を含んでおり、上記増幅のためのプライマーは反応チャンバまたは流路内またはキットとは別に備えられている。プライマーは、標的核酸用のビーズ固定化オリゴヌクレオチドプローブとともに備えられていてもよい。上述のように、検出デバイスの反応チャンバまたは流路はＤＮＡポリメラーゼを含む反応チャンバ内で乾燥された他の試薬およびプライマー伸長のための必要なｄＮＴＰｓを有していてもよい。

以下の参考文献は本発明に関する追加的な背景情報を提供する：
Shakhov and Nyren,‘A Sensitive and Rapid Method for Determination of Pyophosphate Activity’, Acta Chem. Scand. B 36 (1982) 689-694;
R. Buck,‘Electrochemistry of Ion-Selective Electrodes’, Sensors and Actuators (1981) 1, 197-260;
Victorova et al,‘New substrates of DNA polymerases’, FEBS Let. (1999) 453, 6-10;
Hanazato et al.,‘Integrated Multi-Biosensors Based on an Ion-sensitive Field-Effect Transistor Using Photolithographic Techniques’, IEEE Transactions on Electron Devices (1989) 36, 1303-1310.

以下の実施例では、ＤＮＡ増幅のＰＣＲサイクルに伴うｐＨ変化のさらに詳細なシミュレーションにおいて記載され、これがどのようにして標的増幅のＩＳＦＥＴ検出に用いられるかが記載される。

実施例
図７は、１０μＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０５ｗ／ｖ％ＢＳＡ、１Ｕ／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ、１μＭ ＰＣＲプライマーペア、および、準備されたＤＮＡ鋳型（１５０〜１５
０，０００コピー）の複製混合物を採用する典型的なＰＣＲ増幅のためのＰＣＲサイクルでのｐＨ変化を示す。仮定上の単位複製配列は２００塩基対であり、各々のｄＮＴＰの結合は１つのプロトンを放出する。初期ｐＨ値は７．５である。ＴｒｉｓおよびｄＮＴＰの濃度を考慮すると、各々のｐＨ値における緩衝能を決定することができる。理論的ｐＨ変化は反応から放出されたプロトンの数および反応が起こるｐＨにおける緩衝能によって決定することができる。

上述のように、ｐＨ変化が一定の閾値に達する前のサイクルの数は、ＤＮＡ鋳型の濃度に依存し、濃度が高いほどサイクル数は少なくなり、既知の鋳型の投入量に対する閾値に達するためのＰＣＲサイクル数を計算することにより鋳型ＤＮＡの定量が可能となる。

理論的ｐＨ変化の計算
簡易化されたバージョンの反応において、一重伸長反応は以下のように記載することができる：
（１） ＨＰ₃Ｏ₁₀ ^-3−ヌクレオシド＋ＤＮＡ−３’ＯＨ＝＞Ｈ₂Ｐ₂Ｏ₇ ^2-＋ＤＮＡ−Ｏ−ＰＯ（Ｏ^-）−Ｏ−ヌクレオシド
（２） Ｈ₂Ｐ₂Ｏ₇ ^2-＝＞ＨＰ₂Ｏ₇ ^3-＋Ｈ⁺
ヌクレオチド挿入反応の即時の成分均衡が（１）に示され、伸長されたＤＮＡ鎖および正味荷電−２のピロリン酸（ｐＫａ₁およびｐＫａ₂）が得られる。６から８．５のｐＨ範囲において、いくつかのピロリン酸は（２）に示されるように第３のプロトン（ｐＫａ₃）を解離させ、ｐＨの低下をもたらす。

ピロリン酸のｐＫａ
ｐＫａ₁〜０．８３
ｐＫａ₂〜１．９６
ｐＫａ₃〜６．６８
ｐＫａ₄〜９．３９
簡易化されたバージョンにおけるＰＣＲサイクルの機能としてのｐＨ変化の計算：

ここで、ｄｎは塩基の増加量であり、ｄｐＨはｐＨ値の変化量である。

ここで、［ＨＡ］₀はＴｒｉｓＨＣｌ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡなどの緩衝能のある物質のトータル濃度であり、Ｋａはそれらの物質のプロトンの解離定数であり、［Ｈ⁺］はプロトン濃度である。

反応の初期ｐＨが７．５と与えられると、１５０コピーのＤＮＡ、１０μＭ ＴｒｉｓＨＣｌおよび４００μＭ ｄＮＴＰの反応混合物の総緩衝能を算出することができ、
β＝β_Tris＋β_dNTP＝１．０８×１０^-4Ｍ（ＤＮＡ濃度は無視できる）
そして、

そして、新たな緩衝能は、新たな初期ｐＨ値および生産されたプロトン量で与えられる予想ｐＨ変化に基づいて計算することができる。

Claims (30)

1. サンプル中にある場合の標的配列の増幅のための緩衝化された核酸増幅混合物を含むサンプルにおける、核酸増幅の測定方法であって、
   前記測定は、超えられるべきサンプルの緩衝能に対する閾値サイクル数より多い増幅の結果としての、標的配列の存在下におけるプロトン放出から生じるｐＨ変化を検出することによって行なわれ、
   前記検出は検出機器を採用し、
   前記検出機器は、前記検出サンプルに晒された検出表面を有し、かつ前記トランジスタ表面におけるｐＨ変化に応じた電気的出力信号を発生するように配置されたＩＳＦＥＴ、および、該ＩＳＦＥＴからの電気的出力信号を検出するための手段を含む
   ことを特徴とする測定方法。
2. 前記核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩＳＦＥＴは、窒化シリコン層を備えている、請求項１または２に記載の方法。
4. ＤＮＡポリメラーゼ酵素固定層を前記窒化シリコン層の上に備えた、請求項３に記載の方法。
5. 参照電極が設けられた、請求項１から４のいずれかに記載の記載の方法。
6. 増幅のための標的核酸がビーズ上に捕捉され、前記ＩＳＦＥＴ検出表面の付近に運び込まれた該ビーズ上で核酸増幅が起こる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 増幅のための標的核酸が、前記ＩＳＦＥＴ上に固定されたプローブによって捕捉される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
8. 前記ＩＳＦＥＴ検出表面が、１ｐＬから１０μＬの低容量反応チャンバ内の前記サンプルに晒される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 前記反応チャンバは、１つ以上のサンプルにおいて核酸増幅が同時的に測定され得る前記ＩＳＦＥＴを含む、さらに１つ以上の別のチャンバを含むマイクロ流体デバイス内にある、請求項８に記載の方法。
10. 前記反応チャンバは、抵抗オンチップヒータ部および温度センサを含むチップ上にあり、前記チャンバはＰＣＲ温度サイクルのために加熱または冷却されることができる、請求項８に記載の方法。
11. 前記チップはさらにオンチップ温度制御回路を含む、請求項１０に記載の方法。
12. ＰＣＲ測定用の前記サンプルは、マイクロ流体デバイスの流路またはチャンバを通して流れるようにされており、ＰＣＲのための温度サイクルが達成されるように流れながら連続して異なる温度に晒される、請求項２に記載の方法。
13. 前記サンプルは、前記温度サイクルに適した異なる温度領域を連続的に横断するチャンバまたは流路を通して流れるようにされている、請求項１２に記載の方法。
14. 前記サンプルは、前記マイクロ流体デバイスの基体に備えられた異なる温度領域を連続的に横断するチャンネルを通して流れるようにされており、前記領域は、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のＰＣＲステージの流路に沿っての連続的反復に適したものである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記流路に沿った異なる位置においてサンプルのｐＨ変化を検出するために１以上のＩＳＦＥＴが備えられた、請求項１４に記載の方法。
16. 前記サンプルは、マイクロチャンバ内の温度サイクルのために必要とされる温度領域の間を後方および前方に移動し、前記ＩＳＦＥＴは前記チャンバの壁に備えられた、請求項１２または１３に記載の方法。
17. 前記核酸増幅は等温核酸増幅である、請求項１に記載の方法。
18. 標的核酸を核酸増幅のモニタリングによって検出する方法であり、前記緩衝能が超えられた時点での前記ｐＨ変化が前記標的核酸の検出に相関する、請求項１に記載の方法。
19. 前記閾値サイクル数に達するために用いられる増幅サイクル数が、前記サンプル中に存在する前記標的配列の量を定量するために用いられる、請求項１に記載の方法。
20. サンプルを加熱するために配置された１つ以上の発熱体と、サンプルのｐＨを測定するためのＩＳＦＥＴを各々有する２つ以上のＩＳＦＥＴ含有反応チャンバとが一体化されたシリコン基材を含む、
    サンプル中の核酸増幅測定用の検出装置。
21. 前記ＩＳＦＥＴの検出表面は窒化シリコン層で提供される、請求項２０に記載の検出装置。
22. さらに、１つ以上の温度センサーを含む、請求項２０または２１に記載の検出装置。
23. 前記温度センサーは、前記サンプルの温度を制御するために、前記１つ以上の発熱体を制御するように配置される、請求項２２に記載の検出装置。
24. 前記反応チャンバが、前記シリコン基材の中または上で前記サンプルを受け入れるか、または、
    前記検出装置が、前記シリコン基材の中または上で前記サンプルを受け入れるための流路を含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載の検出装置。
25. 前記サンプルを含む１ｐＬ〜１０μＬの低容量反応チャンバが、前記ＩＳＦＥＴ上に設けられた、請求項２０に記載の検出装置。
26. 前記サンプルは、マイクロ流体デバイスの流路または反応チャンバを通して流れるようにされており、ＰＣＲのための温度サイクルが達成されるように連続して異なる温度に晒される、請求項２０に記載の検出装置。
27. 前記サンプルは、前記温度サイクルに適した異なる温度領域を連続的に横断する反応チャンバまたは流路を通して流れるようにされている請求項２６に記載の装置。
28. 前記サンプルは前記マイクロ流体デバイスの基体に備えられた異なる温度領域を連続的に横断する流路を通して流れるようにされており、前記領域は変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のＰＣＲステージの流路に沿っての連続的反復に適したものである請求項２７に記載の装置。
29. 前記流路に沿った異なる位置においてサンプルのｐＨ変化を検出するために１以上のＩＳＦＥＴが備えられた請求項２８に記載の装置。
30. 前記サンプルは反応チャンバ内の温度サイクルのために必要とされる温度領域の間を後方および前方に移動し、前記ＩＳＦＥＴは前記反応チャンバの各々の壁に備えられた請求項２６または２７に記載の装置。

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