JP2017209049A - 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)生体分子を含む試料を、前記複数の標的生体分子の1つと結合し得るリガンドが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b)前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
(d)前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、
(e)前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f)前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、を含み、
前記複数のビーズは、各々電気特性の異なる材料を含み、
個々のビーズの少なくとも1種の電気特性を測定することにより、ビーズに固定化されたリガンドの種類を反応槽毎に特定する、標的生体分子の特定方法である。
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー(以下「標的核酸用プライマー」という)である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。
工程(a1)は、核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の1つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
また、ビーズ種類の特定を、ビーズ1のインピーダンスで行う場合には、ビーズ種類毎に異なるインピーダンスを有するビーズが必要となる。そのようなビーズを作製するには、上述の強誘電体材料と、金、銀などの導電性粒子が、それぞれ異なる含有率で配合される。このことにより、ビーズの誘電率および導電率を独立したパラメータとして設定することが可能となり、識別可能なビーズ種類が増えることに寄与する。ビーズ1の基材としては、ポリスチレン、ラテックス等の樹脂系材料を挙げることができる。本実施形態においては上述のように、ビーズ1毎に材料や材料配合を変化させることにより、ビーズ1毎に固有の電気特性を有するように調製される。
工程(b1)は、核酸を含む試料と接触させたビーズ体100を、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程である。本実施形態の工程(b1)を、図3を参照して、説明する。図3中、20はビーズ配置用基板であり、21は反応槽である。この一例においては、ビーズ配置用基板20は、m×n個(m、nはいずれも自然数。)の反応槽21を備える。この反応槽21をウエルWともいう。
反応槽21のうち、例えば、ウエルW11には、ビーズ体100−11が配置される。ウエルWmnには、ビーズ体100−mnが配置される。
なお、反応槽21にビーズ体100を配置する工程において、図4に示すように誘電泳動によるソーティングを行ってもよい。この変形例では、ビーズ体100は、標的核酸用プライマー2の配列の種類ごとに異なる誘電率を有している。例えば、ビーズ体100Aの誘電率は、誘電率εA、ビーズ体100Bの誘電率は、誘電率εB、ビーズ体100Cの誘電率は、誘電率εC、ビーズ体100Dの誘電率は、誘電率εDである。
互いに異なる誘電率を持つビーズを作製する方法としては、例えば、ビーズ材料に占める強誘電体の含有率が異なるビーズを作製することで実現可能である。
つまり、この変形例によれば、ビーズ体100に固定されている標的核酸用プライマー2の配列の種類を、誘電率によって選別することができる。
工程(c1)は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
本実施形態においては、核酸伸長反応に必要な試薬として、DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等を挙げることができる。一例として、DNAポリメラーゼは、Taqポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼ、鎖置換型DNAポリメラーゼである。核酸伸長反応に必要な試薬は、後述の工程(d1)で行う核酸伸長反応の方法に応じて、適宜選択することができる。なお、一例として、DNAポリメラーゼなどの一部の試薬は、本工程で添加せず、あらかじめ反応槽21の内壁に結合させておいてもよい。
工程(d1)は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。
核酸伸長反応は、DNAポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸伸長反応の条件は、用いる方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、反応槽21内の温度を55〜70℃程度に維持して、核酸伸長反応を行ってもよい。
工程(e1)は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。核酸伸長反応によって核酸が1塩基伸長すると、1分子のプロトンが発生する。反応槽21内のプロトン発生量は、センサ30によって検出される。一例として、センサ30は、ISFETである。本実施形態に使用可能なISFETとしては、例えば、国際公開公報WO2008/107014号に記載のもの等を挙げることができる。
工程(f1)は、測定された前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽における核酸伸長の有無を判定する工程である。センサ30による反応槽21内のプロトン発生量の測定値が上昇したか否かに基づいて、反応槽21内での核酸伸長の有無を判定する。反応槽21内のプロトン発生量が上昇した場合には、核酸伸長が生じたと判定され、反応槽21内のプロトン発生量の上昇が検出されない場合には、核酸伸長が生じていないと判定される。
なお、センサ30は、電流検出器CDによって検出されるドレイン電流の大きさに応じて、反応槽21内に存在する核酸伸長が生じたビーズ体100の数を検出する構成であってもよい。
なお、ビーズ体100は、標的核酸用プライマー2の配列の種類ごとに異なるインピーダンスを有していてもよい。この場合には、ビーズ体100のインピーダンスを測定することにより、ビーズ体100に固定化された標的核酸用プライマー2の配列の種類を特定することができる。図6に示すように、各反応槽21には、インピーダンス測定用の端子EZA及び端子EZBが備えられる。インピーダンス測定部40は、端子EZAと、端子EZBとの間のインピーダンス、すなわち反応槽21内のインピーダンスを測定する。各反応槽21に1つのビーズ体100が配置される場合、反応槽21内のインピーダンスを測定すれば、反応槽21に配置されたビーズ体100のインピーダンスを測定することができる。
また、反応槽21毎に、センサ30とインピーダンス測定部40とが形成されていれば、ビーズ体100の種類と、そのビーズ体100における核酸伸長の有無とを同時に判定することができる。
<第2実施形態>
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該タンパク質に結合し得る抗体(以下「標的抗原検出用抗体」という)である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。
工程(a2)は、タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の1つと結合し得る標的抗原検出用抗体が固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
本実施形態の工程(b2)は、第1実施形態の工程(b1)と同様に行うことができる。
工程(c2)は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
工程(d2)は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。
本工程は、第1実施形態の工程(d1)と同様に行うことができる。なお、本工程では、図10に示すように、シグナル生成用配列312を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第1実施形態と同様に、標的抗原検出用抗体5に標的タンパク質400が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。
工程(e2)は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量の測定をする工程である。本工程は、第1実施形態の工程(e1)と同様に行うことができる。
工程(f2)は、工程(e2)で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。本工程は、第1実施形態の工程(f1)と同様に行うことができる。
ビーズ種類の判定は、第1実施形態における標的核酸用プライマー2に替えて、標的抗原検出用抗体5を用いる以外は、第1実施形態と同様に行うことができる。すなわち、第1実施形態と同様に、各反応槽におけるビーズ1の電気特性を特定し、該ビーズ1の電気特性に基づいて、各反応槽における標的抗原検出用抗体5の種類を特定することができる。
本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を効率よく検出することができる。
[標的核酸配列特定装置の構成例]
上述した第1実施形態の方法を実現する標的核酸配列特定装置200の構成の一例について、図8及び図9を参照して説明する。
図8は、本実施形態における標的核酸配列特定装置200の構成の一例を示す図である。標的核酸配列特定装置200は、ビーズ配置用基板20と、演算装置210とを備える。
ビーズ配置用基板20は、反応槽21と、センサ30とをそれぞれ複数備える。このセンサ30とは、検出部の一例である。1つの反応槽21には、1つのビーズ1が配置される。このビーズ1には、上述した標的核酸用プライマー2が固定化されている。このビーズ1は、ビーズ1に固定化されている標的核酸用プライマー2の核酸の配列に応じた電気特性を有する。つまり、反応槽21には、標的核酸用プライマー2が固定化され、当該標的核酸用プライマー2の核酸の配列に応じた電気特性を有するビーズ1が配置される。標的核酸用プライマー2の核酸の配列と、ビーズ1の電気特性との対応関係は、演算装置210が備える核酸配列記憶部214に記憶されている。この核酸配列記憶部214の構成の具体例について、図9を参照して説明する。
核酸伸長判定部211は、センサ30が検出する反応槽21毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽21内における核酸伸長の有無を反応槽21毎に判定する。具体的には、核酸伸長判定部211は、センサ30の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸伸長判定部211は、センサ30の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸伸長判定部211は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸伸長の有無を判定する。ここで、センサ30は反応槽21毎に備えられている。核酸伸長判定部211は、反応槽21毎にセンサ30の出力電流値を取得することにより、核酸伸長の有無を反応槽21毎に判定する。
上述した第2実施形態の方法を実現する標的タンパク質特定装置200−2の構成は、上述の標的核酸配列特定装置200において、核酸配列記憶部214に替えて抗原記憶部214−2、標的核酸配列特定部212に替えて標的タンパク質特定部212−2、伸長核酸種類特定部213に替えて結合タンパク質種類特定部213−2を備えたものとすることができる。この標的タンパク質特定部212−2とは、標的リガンド特定部の一例である。
図11は、本実施形態における標的タンパク質特定装置200−2の構成の一例を示す図である。また、図12は、抗原記憶部214−2の構成の一例を示す図である。抗原記憶部214−2には、ビーズIDと、ビーズ1の電気特定を示す情報と、標的抗原検出用抗体5の抗原を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。
Claims (13)
- 標的生体分子の特定方法であって、
(a)生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の1つと結合し得るリガンドが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b)前記試料と接触させたビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、
(d)前記ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程と、
(e)前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f)前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、を含み、
前記複数のビーズは、各々電気特性の異なる材料を含み、
個々のビーズの少なくとも1種の電気特性を測定することにより、ビーズに固定化されたリガンドの種類を反応槽毎に特定する、
標的生体分子の特定方法。 - 前記標的生体分子が核酸であり、前記リガンドが前記標的生体分子である核酸とアニーリングし得るプライマーである、請求項1に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記標的生体分子がタンパク質であり、前記リガンドが前記標的生体分子であるタンパク質と結合し得る抗体である、請求項1に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記電気特性が、インピーダンスである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記電気特性が、誘電率である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記電気特性が、導電率である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 工程(b)における反応槽へのビーズの配置と、ビーズの電気特性の測定が、誘電泳動によって行われる、請求項4に記載の標的生体分子の特定方法。
- 工程(d)の核酸伸長反応が、PCR法又は等温増幅法により行われる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 工程(d)の核酸伸長反応が、デジタルPCR法又はデジタル等温増幅法により行われる、請求項5記載の標的生体分子の特定方法。
- 工程(e)のプロトン発生量の測定が、ISFETにより行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子特定用ビーズ。
- 所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子特定用ビーズを複数含む、標的生体分子を特定するためのビーズのセット。
- 複数の生体分子の1つと結合し得るリガンドが固定化されたビーズであって、固定化された前記リガンドの種類に対応する種類の電気特性をそれぞれ有する複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、
前記ビーズが配置された前記反応槽内での核酸伸長反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、
前記ビーズの電気特性を前記反応槽毎に測定する電気特性測定部と、
前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、
前記電気特性測定部が測定する前記ビーズの電気特性に基づいて、前記標的リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的リガンド特定部と、
を備える標的生体分子特定装置。
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