JP5346957B2

JP5346957B2 - 不特定疾患の汎用マーカーとしてのｙｋｌ−４０

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Publication number: JP5346957B2
Application number: JP2010543375A
Authority: JP
Inventors: ヨハンセン，ジュリア; ボージェセン，スティグ; グローンノルデスガード，ボージェ; ジョルゲンニールセン，ハンス; ジャーレクリステンセン，イブ
Original assignee: Rigshospitalet; Herlev Hospital Region Hovedstaden
Current assignee: Rigshospitalet; Herlev Hospital Region Hovedstaden
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2029-01-22
Also published as: US8697384B2; CN101971027A; WO2009092381A1; NZ586909A; IL207112A; KR20100127210A; CA2740028A1; JP2011510307A; AU2009207922A1; AU2009207922B2; IL207112A0; US20110045518A1; EP2245459A1

Description

本発明は、被験者における不特定疾患又は障害の存在を診断する方法であって、参照レベルを超えるYKL-40の測定レベルが不特定疾患又は障害の存在を示す方法に関する。被験者は、様々な疾患又は障害に罹患していてもよい。また、本発明は、被験者における不特定疾患又は障害の重症度を分類するための方法であって、1つ以上の参照レベルを超える又は1つ以上の参照レベル未満のYKL-40の測定レベルが前記の不特定疾患又は障害の重症度を示す方法に関する。また、本発明は、本発明の方法に使用され得るキット及び器具であって、試料中のYKL-40のレベルを測定するための手段と、測定されたYKL-40のレベルを少なくとも1つのYKL-40参照レベルと比較するための手段と、を含むキット及び器具に関する。

病気、疾患又は1以上の症状を治療する場合には、根底にある疾患又は障害を診断することが必要である。多くの症状は、身体的及び精神的疾患を含む複数の疾患によって生じ得る。従って、疾患の診断は後に続く治療のために最も重要である。治療の結果は疾患の進行及び診断前の経過時間に依存することが多く、早期の治療介入が非常に重要であり得る。しかしながら、患者が医学的支援を求めるためには、少なくとも何らかの症状が存在することが必要である。様々な癌や生活習慣病(アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患、糖尿病、高血圧症、肝線維症、慢性閉塞性肺疾患等)のように、疾患は患者が自覚することなく進展する場合が非常に多い。

疾患によっては、ライフスタイルの改善等の予防手段を速やかに取り入れればより効果的に治癒又は回避すらすることができる。従って、人間ドック(health screenings)に入ることがますます一般的になっている。人間ドックでは、出発点としての症状がない場合が非常に多い。症状が既に存在しているか、人間ドックに関連した診断であるかにかかわらず、患者についての診断を確立するためには、医師は解明のための出発点を必要とする。

「赤血球沈降速度」(「沈降速度」ともいう)は、炎症の存在を示すものとして広く使用されてきた。沈降速度は、赤血球が1時間に沈降する率である。炎症過程が存在している場合には、血液中の高濃度のフィブリノゲンによって赤血球は付着し合う。沈降速度は、あらゆる炎症原因や炎症中心(focus)によって上昇する。基礎沈降速度は女性においてわずかに高く、年齢と共に上昇する傾向がある。しかしながら、無症状の人における沈降速度の有用性は、その感受性及び特異性の低さによって制限される。それでも、沈降速度は、疾患の疑いがいくらかある場合における、一種の病気指標として使用されている。

Bunn, et al., U.S. Pat. No. 5,213,961

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現在、バイオマーカーであるC反応性タンパク質(CRP)が炎症の初期スクリーニングにおいて沈降速度にほぼ取って代わって使用されるようになった。CRPは急性又は慢性炎症又は感染症の指標であり、炎症の存在と強度を反映し、医学における有用な検査対象である。ただし、C反応性タンパク質濃度の上昇は、何か一つの病気を表す診断徴候ではない。血清CRPレベルの陽性反応を引き起こし得る病気としては、例えば、関節リウマチ、狼蒼、リウマチ熱、癌、心臓疾患、心臓血管疾患、炎症性腸疾患、及び細菌又はウイルス感染症が挙げられる。しかしながら、これらの疾患に罹患した全ての患者が高い血清CRPレベルを有する訳ではないため、これらの患者には血清CRPレベルを病気指標として使用することができない。

本明細書に記述される本発明は、以下の実施態様を含む。
[実施態様1]
被験者における不特定の疾患又は障害の存在を診断するための方法であって、
v)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
vi)前記YKL-40の測定レベルをYKL-40参照レベルと比較すること、
を含み、ここで、前記参照レベルを超える前記試料中のYKL-40レベルは不特定の疾患又は障害の存在を示す、方法。
[実施態様2]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体から得た試料中のYKL-40レベルを測定することによって得られた平均のレベルである、実施態様1に記載の方法。
[実施態様3]
前記YKL-40参照レベルが、年齢調整された平均のレベルである、実施態様2に記載の方法。
[実施態様4]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの70パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様5]
前記年齢調整カットオフ値が、ln(血漿YKL-40)=3.1+0.02×年齢(歳)として定義される70パーセンタイル値である、実施態様4に記載の方法。
[実施態様6]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの75パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様7]
前記年齢調整カットオフ値が、ln(血漿YKL-40)=3.2+0.02×年齢(歳)として定義される75パーセンタイル値である、実施態様6に記載の方法。
[実施態様8]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの85パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様9]
前記年齢調整カットオフ値が、ln(血漿YKL-40)=3.4+0.02×年齢(歳)として定義される85パーセンタイル値である、実施態様8に記載の方法。
[実施態様10]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの90パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様11]
前記年齢調整カットオフ値が、ln(血漿YKL-40)=3.5+0.02×年齢(歳)として定義される90パーセンタイル値である、実施態様10に記載の方法。
[実施態様12]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの95パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様13]
前記年齢調整カットオフ値が、ln(血漿YKL-40)=3.6+0.02×年齢(歳)として定義される95パーセンタイル値である、実施態様12に記載の方法。
[実施態様14]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの97.5パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様15]
前記年齢調整カットオフ値が、ln(血漿YKL-40)=3.9+0.02×年齢(歳)として定義される97.5パーセンタイル値である、実施態様14に記載の方法。
[実施態様16]
前記YKL-40参照レベルが、実施態様4〜15のいずれか2項以上に記載のYKL-40年齢依存カットオフ値の組である、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
[実施態様17]
前記YKL-40年齢依存カットオフ値の組が以下の表によって定義される、実施態様16に記載の方法。

[実施態様18]
前記YKL-40参照レベルが、健康な個体の年齢分布亜集団から得た試料におけるYKL-40レベルを測定することによって得られたYKL-40年齢依存参照レベルの組である、実施態様1に記載の方法。
[実施態様19]
前記YKL-40年齢依存参照レベルの組が以下の表によって定義される、実施態様18に記載の方法。

[実施態様20]
被験者における不特定の疾患又は障害の存在を診断するための方法であって、
iii)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
iv)前記YKL-40の測定レベルを、同一の被験者について過去に測定したYKL-40レベルであるYKL-40参照レベルと比較すること、
を含み、ここで、前記YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルは不特定の疾患又は障害の存在を示す、実施態様1に記載の方法。
[実施態様21]
前記YKL-40参照レベルを年齢調整した、実施態様20に記載の方法。
[実施態様22]
前記参照レベルを、女性の場合には1歳当たり0.5μg/Lを加えることによって年齢調整し、男性の場合には1歳当たり0.8μg/Lを加えることによって年齢調整した、実施態様20又は21に記載の方法。
[実施態様23]
前記試料中の前記YKL-40レベルが約109%以上上昇した場合に、前記試料中の前記YKL-40レベルは前記参照レベルよりも有意に高く、不特定の疾患又は障害の存在を示すとみなされる、実施態様20〜22のいずれかに記載の方法。
[実施態様24]
前記YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍、より好ましくは少なくとも1.25倍、例えば1.30倍又は1.40倍、さらに好ましくは少なくとも1.50倍、例えば1.60倍又は1.70倍又は1.75倍、さらに好ましくは少なくとも1.75倍、例えば1.80倍又は1.90倍又は2倍、最も好ましくは少なくとも2倍、例えば2.10倍又は2.20倍又は2.25倍又は2.50倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルが不特定の疾患又は障害の存在を示す、実施態様20〜22のいずれかに記載の方法。
[実施態様25]
被験者における不特定の疾患又は障害の重症度を分類するための方法であって、
vii)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
viii)前記YKL-40の測定レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較すること、
を含み、前記不特定の疾患又は障害の重症度を前記比較から推定する方法。
[実施態様26]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルを、健康な個体から得た試料中のYKL-40レベルを測定することによって得る、実施態様25に記載の方法。
[実施態様27]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルが、1つ以上の年齢調整参照レベルである、実施態様25又は26に記載の方法。
[実施態様28]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルが、健康な個体の年齢分布亜集団から得た試料におけるYKL-40レベルを測定することによって得られたYKL-40年齢依存参照レベルの組である、実施態様25〜27のいずれかに記載の方法。
[実施態様29]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つが、健康な個体のYKL-40レベルの75パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様25〜28のいずれかに記載の方法。
[実施態様30]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つが、健康な個体のYKL-40レベルの85パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様25〜29のいずれかに記載の方法。
[実施態様31]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つが、健康な個体のYKL-40レベルの90パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様25〜30のいずれかに記載の方法。
[実施態様32]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つが、健康な個体のYKL-40レベルの95パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様25〜31のいずれかに記載の方法。
[実施態様33]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つが、健康な個体のYKL-40レベルの97.5パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である、実施態様25〜32のいずれかに記載の方法。
[実施態様34]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルが、同一の被験者について過去に測定した1つ以上のYKL-40レベルである、実施態様25に記載の方法。
[実施態様35]
前記1つ以上のYKL-40参照レベルが、女性の場合には1歳当たり0.5μg/Lを加えることによって年齢調整し、男性の場合には1歳当たり0.8μg/Lを加えることによって年齢調整した血漿YKL-40レベルである、実施態様34に記載の方法。
[実施態様36]
前記YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍、より好ましくは少なくとも1.25倍、例えば1.30倍又は1.40倍、さらに好ましくは少なくとも1.50倍、例えば1.60倍又は1.70倍又は1.75倍、さらに好ましくは少なくとも1.75倍、例えば1.80倍又は1.90倍又は2倍、最も好ましくは少なくとも2倍、例えば2.10倍又は2.20倍又は2.25倍又は2.50倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す、実施態様34又は35のいずれかに記載の方法。
[実施態様37]
前記YKL-40参照レベルの少なくとも0.90倍、より好ましくは少なくとも0.80倍、例えば0.70倍、さらに好ましくは少なくとも0.60倍、さらに好ましくは少なくとも0.50倍、最も好ましくは少なくとも0.48倍、例えば0.45倍又は0.43倍又は0.40倍又は0.38倍に低下した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す、実施態様34〜36のいずれかに記載の方法。
[実施態様38]
前記YKL-40参照レベルに対して109%上昇した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す、実施態様34〜37のいずれかに記載の方法。
[実施態様39]
前記YKL-40参照レベルに対して52%低下した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す、実施態様34〜38のいずれかに記載の方法。
[実施態様40]
前記参照レベルの1つ以上よりも高い、前記試料中のYKL-40測定レベルが、前記不特定の疾患又は障害の分類を提供する、実施態様25〜39のいずれかに記載の方法。
[実施態様41]
前記試料中におけるYKL-40測定レベルを、前記1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することによって前記不特定の疾患又は障害が分類され、ここで、前記YKL-40測定レベルが高い程、前記不特定の疾患又は障害の重症度が高いと分類される、実施態様25〜40のいずれかに記載の方法。
[実施態様42]
前記不特定の疾患又は障害が、C反応性タンパク質レベルの上昇をもたらさない1以上の疾患若しくは障害又は疾患群若しくは障害群である、実施態様1〜41のいずれかに記載の方法。
[実施態様43]
前記YKL-40レベルをイムノアッセイを使用して測定する、実施態様1〜42のいずれかに記載の方法。
[実施態様44]
前記イムノアッセイが競合的イムノアッセイである、実施態様1〜43のいずれかに記載の方法。
[実施態様45]
前記イムノアッセイが、放射性同位体、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、コロイド状金属からなる群から選択される検出可能な標識を使用してYKL-40を測定する、実施態様1〜44のいずれかに記載の方法。
[実施態様46]
前記イムノアッセイが、モノクローナル抗体を使用してYKL-40を測定する、実施態様1〜45のいずれかに記載の方法。
[実施態様47]
前記イムノアッセイが、ポリクローナル抗体を使用してYKL-40を測定する、実施態様1〜45のいずれかに記載の方法。
[実施態様48]
前記YKL-40レベルをPCRアッセイによって測定する、実施態様1〜42のいずれかに記載の方法。
[実施態様49]
前記YKL-40レベルを測定するのと同一の試料において、1つ以上の追加のバイオマーカーのレベルを測定する、実施態様1〜48のいずれかに記載の方法。
[実施態様50]
前記1つ以上の追加のバイオマーカーが、C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択される、実施態様1〜49のいずれかに記載の方法。
[実施態様51]
前記1つ以上の追加のバイオマーカーが、C反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質及びホモシステインからなる群から選択される、実施態様1〜50のいずれかに記載の方法。
[実施態様52]
前記YKL-40レベルを、ディップスティックを使用して測定する、実施態様1〜51のいずれかに記載の方法。
[実施態様53]
前記生体試料が、血液、血清又は血漿である、実施態様1〜52のいずれかに記載の方法。
[実施態様54]
前記生体試料が、血清又は血漿である、実施態様1〜53のいずれかに記載の方法。
[実施態様55]
前記被験者が、哺乳動物、好ましくはヒトである、実施態様1〜54のいずれかに記載の方法。
[実施態様56]
不特定の疾患又は障害の存在のバイオマーカーとしてのYKL-40の使用。
[実施態様57]
不特定の疾患又は障害の存在のバイオマーカーとしてのYKL-40の使用。
[実施態様58]
不特定の疾患又は障害の重症度を分類するためのバイオマーカーとしてのYKL-40の使用。
[実施態様59]
不特定の疾患又は障害の存在を診断するための器具であって、試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、前記YKL-40測定レベルを少なくとも1つのYKL-40参照レベルと比較するための手段と、を含む器具。
[実施態様60]
当該器具がディップスティックである、実施態様59に記載の器具。
[実施態様61]
カットオフ値を示す単一の参照レベルを含む、実施態様59又は60に記載の器具。
[実施態様62]
前記YKL-40測定レベルを年齢調整YKL-40参照レベルの組と比較するための手段を含む、実施態様59又は60に記載の器具。
[実施態様63]
前記YKL-40測定レベルを、以下の表に定義する年齢依存カットオフ値の組と比較するための手段を含む、実施態様59又は60に記載の器具。

[実施態様64]
i)試料中のYKL-40のレベルを測定するための手段と、
ii)前記YKL-40の測定レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較するための手段と、
iii)必要に応じて、前記試料を提供した被験者の年齢に応じて前記YKL-40参照レベルを年齢調整するやり方に関する説明書と、
を含むキット。
[実施態様65]
C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択される追加のバイオマーカーをアッセイするための手段をさらに含む、実施態様64に記載のキット。
[実施態様66]
実施態様59〜63のいずれかに記載の少なくとも1つの器具を含む、実施態様64又は65に記載のキット。
本明細書に記述される本発明は、被験者における不特定疾患又は障害の存在を診断するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
ii)前記YKL-40のレベルをYKL-40参照レベルと比較することを含み、
前記参照レベルを超える前記試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す方法に関する。好ましくは、前記YKL-40参照レベルは、健康な個体から得た試料中のYKL-40レベルを測定することによって得られた平均のレベルである。あるいは、前記YKL-40参照レベルは、同一の被験者の過去に測定したYKL-40レベルであり、前記過去に測定したYKL-40レベルの1.10倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す。

また、本発明は、被験者における不特定疾患又は障害の重症度を分類するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40レベルを測定し、
ii)前記YKL-40レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することを含み、
前記不特定疾患又は障害の重症度を前記比較から推定(deduced)する方法に関する。好ましくは、前記1つ以上のYKL-40参照レベルは、健康な個体から得た試料中のYKL-40レベルを測定することによって得ることができる。あるいは、前記YKL-40参照レベルは、同一の被験者の過去に測定したYKL-40レベルであってもよい。

また、本明細書に記述される本発明は、不特定疾患又は障害の存在を診断するための器具(device:機器、装置、器具、用具)であって、試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、前記測定されたYKL-40レベルを少なくとも1つのYKL-40参照レベルと比較するための手段と、を含む。本発明の好適な実施形態では、当該器具はカットオフ値を示す単一の参照レベルを含む。

また、本明細書に記述される本発明は、キット(kit of parts)であって、i)試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、ii)前記測定されたYKL-40レベルを少なくとも1つのYKL-40参照レベルと比較するための手段と、iii)必要に応じて、前記試料を提供した被験者の年齢に応じて前記YKL-40参照レベルを年齢調整するやり方に関する説明書と、を含むキットに関する。

2116人の健康な女性及び1494人の健康な男性における年齢及び性別に応じた血漿YKL-40濃度を示す。参加者は、1991〜1994年の血液採取時に既知の疾患に罹患しておらず、16年間の追跡期間にわたって健康を維持した(すなわち、死亡したり、癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、肺炎を発病したりしなかった)。これらの健康な参加者の血漿YKL-40濃度の中央値は42μg/Lだった(2.5%〜97.5%パーセンタイル値範囲:14〜168μg/L:90%パーセンタイル値 92μg/L:95%パーセンタイル値 124μg/L)。男性及び女性において血漿YKL-40レベルは年齢と共に上昇した(傾向検定 p<0.0001)。血漿YKL-40濃度と年齢とのスピアマンρ相関係数は0.41だった(p<0.0001)。男性及び女性において血漿YKL-40の差はなかった(Mann-Whitney U:p=0.27)。第1回目のYKL-40濃度測定を1991〜1994年の検査時に採取した血液によって行い、第2回目のYKL-40測定を2001〜2003年の検査時に採取した血液によって行った929人の健康な参加者(女性:463人、男性:466人)の群における血漿YKL-40濃度を示す。平均上昇率は、女性の場合には0.5μg/L/歳(四分位範囲:-0.6〜2.1μg/L/歳)であり、男性の場合には0.8μg/L/歳(四分位範囲:-0.3〜2.9μg/L/歳)だった。これは、健康を維持している被験者では血漿YKL-40が非常に安定していることを示し、回帰希釈率は0.8042と算出された。男女の間には統計的な差はなかった。 2116人の健康な女性及び1494人の健康な男性において血漿YKL-40濃度を測定した。参加者は、1991〜1994年の血液採取時に既知の疾患に罹患しておらず、16年間の追跡期間にわたって健康を維持した(すなわち、死亡したり、癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、肺炎を発病したりしなかった)。図3Aは、これらの健康な参加者の年齢ごとの50%パーセンタイル血漿YKL-40濃度(丸印)、70%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.1+0.02×年齢(歳)として定義)、75%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.2+0.02×年齢(歳))、90%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.5+0.02×年齢(歳))、及び95%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.6+0.02×年齢(歳))を示す。女性と男性の数値を組み合わせた。図3Aに対応し、血漿YKL-40濃度の85パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.4+0.02×年齢(歳)として定義)及び97.5パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.9+0.02×年齢(歳))をさらに含む。血漿YKL-40濃度に応じた一般集団の寿命及び生存率を示す(5つの性別及び10年年齢層パーセンタイル値区分(0〜33%パーセンタイル、34〜66%、67〜90%、91〜95%、96〜100%)に分類)。左側切断(Left-truncated)年齢及び追跡時間をそれぞれ時間軸とした。追跡は血液採取時に開始し、死亡時又は2007年7月のいずれか早い方に終了した。女性と男性の数値を組み合わせた。比較として、同一の集団における喫煙状況の影響を示す。血漿YKL-40濃度パーセンタイル値区分、喫煙状況、性別及び年齢に応じた絶対10年死亡率を示す。Copenhagen City Heart Studyの1991〜1994年の検査に参加した8899人の参加者を16年間にわたって追跡した。P値はログランク傾向検定のためのものである。血漿YKL-40濃度パーセンタイル値区分0〜33%、34〜66%、67〜90%、91〜95%、96〜100%を、50歳未満、50〜70歳、70歳超の年齢グループの各々について左から右に向かって示す。 16人の健康被験者の血清YKL-40濃度の一日の変動 38人の健康被験者の血清YKL-40濃度の3週間の変動それぞれ3週間に渡る4つのラウンドにおける、23人の血清YKL-40レベルの中央値(各バーは各被験者の1ラウンドの中央値を示す)。 30人の健康な女性の、4週間に渡って得られた血清YKL-40レベル、及び、その内21人の女性について、3年後に再び得られた血清YKL-40レベル。 A-B 上から見たディップスティックの実施形態を示す。

本願発明者らは、予期せぬことに、YKL-40のレベルが、不特定の疾患又は障害の存在を示す汎用バイオマーカーとして使用することができることを見出した。従って、本発明の方法により、不特定疾患又は障害の存在を診断するためにYKL-40レベルを使用することができる。

本発明に関する説明を簡略化するために、用語の定義を以下に記載する。従って、以下の定義は本発明を限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付請求の範囲及び明細書全体によって定義される。

本願明細書において使用する「不特定(の)疾患又は障害」、「不特定疾患」又は「不特定障害」という用語は、特定の疾患又は障害としてまだ明確に診断されていない1以上の疾患又は障害等の、あらゆる疾患又は障害を意味する。不特定疾患又は障害に罹患した被験者は、健康ではない(すなわち何らかの疾患又は障害に罹患している)ことによって一般集団と区別することができる。従って、不特定疾患又は障害の存在の診断は、被験者にどの特定の疾患又は障害が存在するかに関する情報を提供するものではない。

本願明細書において使用する「汎用バイオマーカー(general biomarker)」という用語は、被験者が健康ではなく、被験者において疾患又は障害が存在することを示すバイオマーカーを意味する。汎用バイオマーカーは、被験者に存在する特定の疾患又は障害に関する情報又は診断を提供するものではないが、初期スクリーニングにおいて使用される。しかしながら、当該汎用バイオマーカーが不在である(例えば、検出可能レベル未満又は所定のカットオフ値未満のレベルである)ことは、被験者に疾患又は障害が存在しない証拠と解釈されるものではない。汎用バイオマーカーは、特定の疾患を診断するための出発点として、疾患又は障害の存在の最初の兆候として使用することができる。

炎症に関して広く使用されている汎用バイオマーカーの例として、血清C反応性タンパク質(CRP)が挙げられる。CRPは初期スクリーニングに関連して使用される場合が多く、例えば、心臓病、心臓血管疾患、細菌感染、ウイルス感染等のリスクを大まかに示すものとして使用されている。しかしながら、疾患又は障害に罹患した患者でも血清CRPレベルの増加を示さない場合があり、これらの疾患に罹患した全ての患者における病気指標(sickness index)としてCRPレベルを使用することはできない。

CRPが広く使用され、周知になる前には、赤血球沈降速度(しばしば「沈降速度」とも呼ばれる)が炎症の非特異的尺度(病気指標)として初期スクリーニングに使用されていた。

本発明の方法は、YKL-40レベルという形の新たな汎用バイオマーカーを提供し、不特定疾患若しくは障害の存在を診断する方法又はそのような不特定疾患若しくは障害の重症度を分類する方法を提供するものである。また、不特定疾患又は障害が存在しているか否かを判定するだけではなく、病状、すなわち、不特定疾患又は障害の重症度を判定するためにもYKL-40を使用することができることが判明した。すなわち、YKL-40レベルは病気指標として有用であることが判明した。従って、被験者の疾患又は障害が、重症度のより高い状態に向かって進展するかあるいはより低い状態に向かって進展するかを分類するために、YKL-40を使用することができる。本願発明者らは、YKL-40が血清CRPよりも広範に適用することができる汎用バイオマーカーであることを見出した。

従って、本発明の第1の態様は、被験者における不特定疾患又は障害の存在を診断するための方法であって、
iii)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
iv)前記YKL-40のレベルをYKL-40の参照レベルと比較することを含み、
前記参照レベルを超える前記試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す方法に関する。

本発明の方法は、例えば1種以上の疾患又は障害等のあらゆる疾患又は障害の存在の診断に適切である。前記疾患又は障害は、例えばYKL-40レベルが増加するあらゆる疾患又は障害であり得る。

個体における血清中又は血漿中YKL-40レベルは長時間にわたって安定しており、日中及び週毎の変化を示さないことが判明した。また、YKL-40レベルは、少なくとも20分間の運動にも影響されないことも判明した。従って、本発明の方法においては、個体における血清又は血漿YKL-40レベルの1回の測定値を使用することができる。好ましくは、試料は、例えば、前日にアルコールを大量に摂取しておらず、細菌感染等の明白な症状を有していない被験者から得ることができる。必要に応じて、後日(例えば2週間後)に2回目又はそれ以降の試料を得て、最初に測定したYKL-40レベルの結果を確認することができる。

ここで、血漿又は血清中のYKL-40レベルの増加は、複数かつ多様な種類の疾患及び障害を反映し得ること、及び、そのようなYKL-40レベルの増加は健康な被験者においては通常は見られないこと、が強調される。従って、YKLレベルを本発明に係る病気指標として使用することができる。

本発明の第2の態様は、不特定疾患又は障害の存在のバイオマーカーとしてのYKL-40の使用に関する。本発明の第2の態様の詳細については、上述した本発明の方法の説明から明らかになるだろう。従って、本発明の方法と関連して記載するあらゆる特徴は、必要な変更を加えた上で不特定疾患又は障害の存在のバイオマーカーとしてのYKL-40の使用にも当てはまる。

また、本発明は、被験者におけるYKL-40レベルの上昇(例えば血漿又は血清YKL-40レベルの上昇)を判断するための方法であって、
v)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
vi)前記YKL-40レベルをYKL-40の参照レベルと比較することを含み、
前記参照レベルを超える前記試料中のYKL-40レベルは前記被験者におけるYKL-40レベルの上昇を示す方法に関する。参照レベルは、本願明細書(特に「参照レベル」と題する節)に記載する任意の参照レベルであってもよい。この方法は、好ましくは、被験者における、本願明細書に記載するいずれかの疾患又は障害等の、不特定疾患又は障害の存在を診断するために使用される。

本発明の第3の態様は、被験者における不特定疾患又は障害の存在を診断するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40レベルを測定し、
ii)前記YKL-40レベルを、前記被験者において過去に測定したYKL-40レベルであるYKL-40参照レベルと比較することを含み、
前記YKL-40参照レベルの1.10倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す方法に関する。本発明の第3の態様のさらなる詳細については、本発明の第1の態様の説明から明らかになるだろう。従って、本発明の第1の態様と関連して記載するあらゆる特徴は、特記しない限りにおいて、必要な変更を加えた上で本発明の第3の態様にも当てはまる。

本発明の第4の態様は、被験者における不特定疾患又は障害の重症度を分類するための方法であって、
iii)前記被験者から得た試料中のYKL-40レベルを測定し、
iv)前記YKL-40レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することを含み、
前記不特定疾患又は障害の重症度を前記比較から推定する方法に関する。好ましくは、前記1つ以上のYKL-40参照レベルは、健康な個体から得た試料中のYKL-40レベルを測定することによって得ることができる。あるいは、前記YKL-40参照レベルは、過去に測定した同一の被験者のYKL-40レベルであってもよい。そのような参照レベルについては、本願明細書(特に「参照レベル」と題する節)に詳細に記載する。

本願発明者らは、予期せぬことに、本発明の第4の態様において、1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することにより、不特定疾患又は障害の重症度を分類するためのバイオマーカーとしてYKL-40レベルを使用することができることを見出した。また、本願発明者らは、疾患又は障害の進展(すなわち、疾患又は障害が重症度のより高い状態に向かって進展するかあるいは低い状態に向かって進展するか)を追跡し、時間の経過に従って疾患又は障害の重症度を反復的及び/又は連続的に分類するためのマーカーとしてYKL-40レベルを使用することができることを見出した。これは、被験者のYKL-40測定値を、同一の被験者の過去の測定値である1つ以上の参照レベルと比較する場合に特に有益かつ適切である。従って、本発明の方法により、被験者における不特定疾患又は障害の重症度を分類するだけではなく、疾患又は障害の重症度を分類及び追跡するためにYKL-40レベルを使用することができる。

同じ疾患に罹患している患者でも、疾患の重症度(疾患がどれくらい深刻であるかの程度)において著しい差を見せる場合がある。本願明細書において使用する「重症段階」、「重症度」、「重症度が低い」、「重症度が高い」という用語は、例えば、回復の予後、生存の予後、疾患進行の予後、又は、事前に定義された、疾患の異なる段階に応じた重症度の目盛(graduation)を意味する。そのような段階は、様々な症状、及び/又は従来から測定可能であったバイオマーカーのレベル、身体機能等に基づくものであることができる。1人の被験者における疾患の進展に注目する場合には、より重症度の高い段階は疾患の悪化を意味し、以前よりも重症度の低い段階は、例えば十分な治療計画遂行による疾患の改善を意味する。

本発明の第4の態様のさらなる詳細については、本発明の第1又は第3の態様の説明から明らかになるだろう。従って、本発明の第1又は第3の態様と関連して記載するあらゆる特徴は、特記しない限りにおいて、必要な変更を加えた上で本発明の第4の態様にも当てはまる。

本発明の第5の態様は、疾患又は障害の重症度を分類するためのバイオマーカーとしてのYKL-40の使用に関する。本発明の第5の態様の詳細については、上述した本発明の方法の説明から明らかになるだろう。従って、本発明の方法と関連して記載するあらゆる特徴は、必要な変更を加えた上で、疾患又は障害の重症度を分類するためのバイオマーカーとしてのYKL-40の使用にも当てはまる。

本発明の方法は、CRPによっても見出され得る疾患の存在又は重症度を見出すために使用することができるが、CRPレベルの変化を示さない疾患を見出すためにも使用することができる。従って、本発明の一実施形態では、不特定疾患又は障害は、C反応性タンパク質レベルの上昇をもたらさない1以上の疾患若しくは障害又は疾患群若しくは障害群である。

また、本発明の方法は、個別化医療(personalized medicine)における付随の診断検査(companion diagnostic test)と関連させた診断手段として使用することもできる。これは例えば、YKL-40リガンド又は疾患若しくは障害を治療するために使用されるその他の種類の活性化合物に関係したものであり得る。

本願明細書において使用する「改善」という用語は、病状に関連して、寛解又は治癒を含む、病状の重症度又は進行の軽減、あるいは付随する痛みの軽減等の、重症度の知覚上の軽減を意味する。

本願明細書において使用する「抗体」という用語は、YKL-40タンパク質のエピトープ決定部位に結合することができる免疫グロブリン分子、並びにFab及びF(ab')₂等の免疫グロブリン分子の活性部分又はフラグメントを意味する。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリン分子又は免疫学的活性を保持する免疫グロブリン分子のフラグメントである。本願明細書において使用する「抗原」という用語は、YKL-40分子の免疫原性完全長分子又はフラグメントを意味する。

本願明細書において使用する「生体試料」という用語は、被験者又は個体から得られた試料を意味する。

本願明細書において使用する「バイオマーカー」という用語は、病態又は生理状態等、特定の生物学的性質の分子指標を意味する。

本願明細書において使用する「疾患」及び/又は「障害」という用語は、被験者又は個体における病気、傷害又は障害を意味する。障害は、先天的な病気又は傷害である場合が多い。

本願明細書において使用する「被験者」及び/又は「個体」という用語は、種(好ましくは哺乳動物種)の一員を意味する。本願明細書において使用する「哺乳動物」という用語は、ヒト及びヒト以外の哺乳動物を含む。本願明細書において使用する「患者」という用語は、疾患又は障害に罹患したあらゆる個体を意味する。

本願明細書において使用する「hnRNA」という用語は、ヘテロ核RNAを意味する。本願明細書において使用する「mAb」という用語は、モノクローナル抗体を意味する。本願明細書において使用する「mRNA」という用語は、伝令RNAを意味する。本願明細書において使用する「RNA」という用語は、自然界に由来する、あるいは自然界から単離された、又は合成されたあらゆる種類のRNAを意味する。本願明細書においてYKL-40に関して使用する「実質的に純粋」という用語は、自然界ではYKL-40に付随し得る他の分子を実質的に含まない、実質的に無傷の分子を意味する。

YKL-40

YKL-40は、そのN末端にある3つのアミノ酸であるチロシン(Y)、リジン(K)及びロイシン(L)、並びに分子量が約40kDaであることに基づいて命名された(Johansen et al.、1992)。ヒトYKL-40の完全なアミノ酸配列(配列番号2)及びコード配列(配列番号1)は、ジェンバンク(GenBank)に寄託番号M80927として登録されている。ヒトYKL-40は383個のアミノ酸からなる単鎖ポリペプチドを含み、系統学的に高度に保存されたヘパリン及びキチン結合性血漿糖タンパク質である。ヒトYKL-40と他の数種の哺乳動物のホモログとの配列同一性は、ブタ(配列同一性:84%)、ウシ(配列同一性:83%)、ヤギ(配列同一性:83%)、ヒツジ(配列同一性:83%)、モルモット及びラット(配列同一性:80%)、マウス(配列同一性:73%)である。YKL-40は「哺乳動物キチナーゼ様タンパク質」の一員だが、キチナーゼ活性は有していない。正常なヒト単球ではインビトロにおいてYKL-40は発現しないが、マクロファージの分化後期では活性化単球及び好中球によって、また、血管平滑筋細胞、癌細胞及び関節炎軟骨細胞によってYKL-40の発現が強く誘導される。インビボでは、YKL-40 mRNA及びタンパク質は、動脈硬化性プラーク、巨細胞動脈炎に罹患した個体の関節炎性血管、炎症を起こした滑膜、類肉腫病変等の、炎症に罹った組織中のマクロファージ亜集団、及び腫瘍周囲マクロファージによって発現される。

YKL-40の誘導及びその正確な機能を決定する分子過程は未知である。YKL-40は分泌タンパク質であり、YKL-40の作用部位は細胞外である可能性が最も高いことを示唆している。しかしながら、YKL-40に特異的な細胞表面又は可溶性受容体はこれまで同定されていない。YKL-40は線維芽細胞及び軟骨細胞の成長因子であり、IGF-1と相乗効果的に作用し、TNF及びIL-6によって調節され、NF-kappaBの持続的活性化を必要とする(Recklies et al.,2002,Ling et al.,2004,Recklies et al.,2005)。線維芽細胞のYKL-40処置はAKTのリン酸化によるTNF及びIL-1に対する炎症反応を抑制し、ASK1媒介性シグナリング経路を減衰させる。これにより、メタロプロテイナーゼ及びIL-8の発現のレベルが減少する。(Recklies et al.,2002,Ling et al.,2004,Recklies et al.,2005)。また、YKL-40はI型、II型及びIII型コラーゲンに結合し、I型コラーゲン原線維の形成速度を調節する(Bigg et al., 2006)。これらの観察結果は、YKL-40は炎症性環境において保護的な役割を果たし、細胞外マトリックスの劣化を制限し、組織リモデリングを制御することを示唆している。また、YKL-40は内皮細胞の化学誘因剤として作用し、内皮細胞の移動を促し、血管平滑筋細胞の移動及び付着を促進する(Millis et al.,1986,Nishikawa et al.,2003;Shackelton et al.,1995)。これは、YKL-40が血管新生において何らかの役割を果たすことを示唆している。また、YKL-40は線維芽細胞の成長因子であり、組織リモデリング時に細胞外マトリックスを保存する抗異化効果を有する(De Ceunicnck et al.,2001,Recklies et al.,2002,Ling et al.,2004,Recklies et al.,2005)。さらに、動脈硬化性プラークにおけるマクロファージ(特に病巣に深く侵入したマクロファージ)はYKL-40 mRNAを発現し、YKL-40の発現はアテローム性動脈硬化症の初期病変におけるマクロファージで最大となる(Boot et al.,1999)。また、YKL-40の血漿中又は血清中濃度はいくつかの炎症性疾患において増加するため、YKL-40は急性期タンパク質とみなすことができる。

YKL-40の生物学的作用を媒介する細胞受容体は知られていないが、細胞質シグナル伝達経路が活性化されることから、YKL-40が細胞膜上でシグナル伝達成分と相互作用することが示唆される。

本発明の一つの目的は、YKL-40遺伝子のあらゆる転写産物を検出することにある。従って、YKL-40遺伝子の転写産物は、hnRNA、mRNA、完全長タンパク質、断片化タンパク質又はYKL-40タンパク質のペプチドであることができる。1以上のタンパク質、RNA転写物、フラグメント及び/又はペプチドを同時に検出することができると理解される。また、本発明の一態様は、利用可能なあらゆる手段、例えば、YKL-40タンパク質、フラグメント又はペプチドの抗体検出等のイムノアッセイ、及びRT-PCRによるRNA検出等のPCRアッセイによって転写産物を検出する。

YKL-40の検出

本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、YKL-40の機能性誘導体、YKL-40ペプチド及びそれらをコードするヌクレオチドを含む。「機能性誘導体」とは、分子の「フラグメント」、「バリアント」、「類似体」又は「化学的誘導体」を意味する。本発明のDNA塩基配列等の分子の「フラグメント」は、分子のあらゆるヌクレオチド・サブセットを含む。そのような分子の「バリアント」とは、分子全体又はフラグメントと実質的に類似した自然発生分子を意味する。分子の「類似体」とは、分子全体又はフラグメントと実質的に類似した非天然分子を意味する。

分子が他の分子と「実質的に類似している」とは、それらの分子のアミノ酸配列が実質的に同じであることを意味する。実質的に類似したアミノ酸分子は、類似した生物学的活性を有する。従って、2つの分子が類似した活性を有していれば、一方の分子が他方の分子に見られないアミノ酸残基をさらに含んでいるか、又はアミノ酸残基の配列が同一ではない場合でも、それらは本願明細書において使用するバリアントであるとみなされる。

また、分子が通常はその分子の一部ではない化学部位(chemical moieties)を含む場合、その分子は通常の分子の「化学的誘導体」であるという。そのような部位は、分子の溶解性、吸収率、生物学的半減期等を向上させ得る。あるいは、そのような部位は分子の毒性を減少させるか、分子の望ましくない副作用等を解消又は減衰させることができる。そのような作用を媒介することができる部位は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980に開示されている。

YKL-40一次アミノ酸配列が僅かに改変すると、ここに記載されたYKL-40ペプチドと実質的に類似した活性を有するタンパク質及びぺプチドが得られる場合がある。そのような改変は、意図的(部位特異的突然変異誘発等)又は自然発生的であることができる。YKL-40の生物学的活性が維持されている限り、それらの改変によって生成されるあらゆるペプチドは本願明細書に含まれるものとする。また、1以上のアミノ酸の欠失により、生物学的活性を大きく変化させることなく分子の構造を改変させることができる。これにより、より広い有用性を有するより小さな活性分子を得ることができる。例えば、酵素が所望の触媒活性又は抗原活性を発揮するためには必要ではないアミノ又はカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。

以下に説明する本発明のイムノアッセイ及び治療方法では、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる。いくつかの抗YKL-40抗体が市販されており、本明細書に記載する方法又は公知の方法によって抗YKL-40抗体を得ることもできる。ポリクローナル抗体は、実質的に純粋なYKL-40又は抗原性YKL-40ペプチドを、ヒト以外の適当な哺乳動物の皮下又は筋肉内に複数回注射することによって得ることができる。YKL-40ペプチドの抗原性は、当該ペプチドで免疫された動物の抗体反応の大きさを決定する従来の方法によって決定することができる。通常、抗YKL-40抗体を得るために使用されるYKL-40ぺプチドは、YKL-40に対して比較的高い親和性を有する抗体を高タイターで生成させるものとする。本発明の一実施形態では、ディップスティックを使用してYKL-40レベルを測定する。

必要に応じて、免疫用ペプチドは、周知の技術を使用して担体タンパク質に結合させることができる。化学的にペプチドを結合させる通常使用される担体としては、スカシガイヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風トキソイドが挙げられる。そして、担体に結合させたペプチドを使用して動物(例えば、マウス又はウサギ)を免疫する。YKL-40は哺乳動物種間で保存されていることがあり得るため、YKL-40タンパク質の免疫原性を高める担体タンパク質を使用することが好ましい。

そして、当該哺乳動物から採取した血液試料から抗体を得る。ポリクローナル抗体を得るために使用される技術は公知である(例えば、Methods of Enzymology,Production of Antisera With Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections,Langone, et al.eds.(Acad.Press,1981)を参照)。動物によって産生されたポリクローナル抗体は、例えば、抗体産生に使用したペプチドが結合したマトリックスに結合させ溶出させることによって、さらに精製することができる。当業者には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の精製及び/又は濃縮のための、免疫学分野において一般的な様々な技術が知られている(例えば、Coligan, et al.,Unit 9,Current Protocols in Immunology,Wiley Interscience,1991を参照)。

しかしながら、製造するYKL-40抗体はモノクローナル抗体(「mAb」)であることが好ましい。モノクローナル抗体を製造する場合、マウス又はラットを免疫することが好ましい。本発明において使用する「抗体」という用語は、エピトープ決定部位に結合することができる無傷の分子又はそのフラグメント(Fab及びF(ab')₂等)を含む。また、「本発明のmAb」とは、YKL-40に対して特異性を有するモノクローナル抗体を意味する。

mAbsを分泌するハイブリドーマの製造に使用される方法は周知である(Kohler and Milstein,1975)。簡単に説明すると、Kohler and Milsteinに記載されているように、黒色腫、奇形癌、子宮頸癌、神経膠腫又は肺癌に罹患した5人の癌患者の局所流入領域リンパ節からリンパ球を分離し(試料は外科標本から得る)、細胞をプールし、SHFP-1と融合させた。癌細胞株に結合する抗体を生成するハイブリドーマをスクリーニングした。

mAbのYKL-40特異性は、対象となるmAbの素反応パターンを決定する、比較的ルーチンで使用されているスクリーニング技術(酵素免疫測定法(ELISA)等)を使用して確認することができる。また、本発明のmAbが、上述したように分離されたYKL-40に結合することを、試験対象のmAbが妨げるか否かを決定することにより、過度の実験を行うことなく、試験対象のmAbが本発明のmAbと同じ特異性を有するか否かを判断することができ、本発明のmAbの結合の減少によって試験対象のmAbが本発明のmAbと競合することが示される場合には、これらのモノクローナル抗体は同一又は密接に関連するエピトープに結合する可能性が高い。あるmAbが本発明のmAbと同じ特異性を有するか否かは、通常は試験対象のmAbが反応する抗原を、本発明のmAbと共に事前にインキュベートし、試験対象のmAbの当該抗原への結合が阻害されるか否かを決定することによって判断することもできる。試験対象のmAbが阻害される場合には、試験対象のmAbは本発明のmAbと同一又は密接に関連するエピトープ特異性を、ほぼ確実に有する。

イムノアッセイ法

使用するイムノアッセイは、疾患に罹患した個体におけるYKL-40レベルを、健康な個体における正常なYKL-40レベル及び/又は当該個体において測定されたバックグラウンドレベルから区別することができるように、定量的でなければならない。従って、(直接又は間接)検出可能な標識を使用した、固相上の競合的及びサンドイッチアッセイが好ましい。標識は、抗体のYKL-40抗原への結合を示す検出可能なシグナルをもたらす。抗体又は抗原は、検出可能なシグナルをもたらすように、放射性同位体、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、金コロイド等の公知の標識によって標識することができる。公知のアッセイ法のうち、放射標識イムノアッセイ(RIA)又は酵素結合イムノアッセイ(ELISA)が、感度が優れているために最も好ましい。従って、放射性同位体が好ましい標識である。

本発明の方法の一実施形態では、イムノアッセイを使用してYKL-40のレベルを測定する。本実施形態の一例では、イムノアッセイは競合的イムノアッセイである。

本発明の一実施形態では、イムノアッセイでモノクローナル抗体を使用してYKL-40を測定する。本発明の別の実施形態では、イムノアッセイでポリクローナル抗体を使用してYKL-40を測定する。

本発明の方法においてイムノアッセイを利用する場合には、放射性同位体、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、コロイド状金属からなる群から選択される検出可能な標識を使用してYKL-40を測定することができる。

抗体に直接的に結合させるか、YKL-40抗原に間接的に結合させることができる金属イオンは周知であり、例えば、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、²⁰¹Tlが挙げられる。抗原結合特異性を損なうことなく容易に結合させることができるため、¹²⁵Iが好ましい(ナトリウム塩、Amersham(英国))。¹²⁵IによるYKL-40の標識は、Salacinski, et al.(1981)に記載された方法に従って行うことができる。¹²⁵I標識を行うために使用するヨードゲン(1,3,4,6-テトラクロロ-3α,6α-ジフェニルグリコールウリル)は、Pierce and Warriner(英国チェスター)から市販されている。

本発明の好適な実施形態では、血漿YKL-40のレベルは、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートウェル、ビオチン化Fabモノクローナル捕捉抗体、アルカリホスファターゼで標識されたポリクローナル検出抗体を使用して、2部位サンドイッチ型酵素免疫測定法(ELISA)(例えば、Quidel,米国カリフォルニア州)(Harvey et al.1998)によって、二重に(in duplicate)測定することができる。Quidelを使用する場合には、ELISAの回収率は102%であり、検出限界は10μg/Lだった。感度は、ゼロ結合値の標準偏差の2倍に相当する検出可能質量と定義される。通常、標準曲線は20〜300μg/Lの範囲で直線的となる。アッセイ内変動係数は、5%(40μg/L)、4%(104μg/L)、4%(155μg/L)だった。アッセイ間変動係数は<6%だった。

本発明の別の実施形態では放射標識イムノアッセイを使用し、標準試料又は試料を実質的に等容量のYKL-40抗血清及びYKL-40トレーサーとインキュベートする。通常、標準試料及び試料は二重に(in duplicate)アッセイする。本発明のアッセイの感度(検出限界)は約10μg/Lである。感度は、ゼロ結合値の標準偏差の2倍に相当する検出可能質量と定義される。通常、標準曲線は20〜100μg/Lの範囲で直線的となる。実施例に記載するアッセイのアッセイ内及びアッセイ間変動係数はそれぞれ<6.5%及び<12%だった。

必ずしもRIAと同等の感度は有していないが、放射性同位体以外の標識を使用するアッセイ法も利点を有し、RIAの代わりに使用し得ることは、当業者には理解されることである。例えば、酵素免疫測定法(ELISA)は、ELISAマイクロタイタプレートリーダ及び多くの研究・臨床機関で容易に利用可能な試薬を使用して、容易に自動化することができる。アッセイにおいて抗体が結合した抗原の量を定量化する点では放射性同位体ほど有用ではないが、蛍光、化学発光、生物発光標識には目視により検出可能であるという利点がある。

PCRアッセイ

また、生体試料中のYKL-40の存在を検出し、定量化するためにイムノアッセイ以外の手段を使用し得ることも当業者には理解される。例えば、YKL-40をコードするポリヌクレオチドは、公知の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を使用して検出することができる。従って、本発明の方法の一実施形態では、PCRアッセイを使用してYKL-40レベルを測定する。定量的PCRを行うための好ましい方法は、標的YKL-40遺伝子テンプレートと配列又は大きさが異なる競合体(competitor)をもたらす1以上の塩基対の誘発突然変異を含む競合テンプレートを使用して行う競合PCR法である。プライマーの1つをビオチン化(又は好ましくはアミノ化)し、得られるPCR産物の一方の鎖(通常はアンチセンス鎖)を、アミノ-カルボキシル、アミノ-アミノ、ビオチン-ストレプトアビジン又はその他の適当な結合を介して、適当な反応物質に結合させておいた固相担体に固定することができる。最も好ましくは、PCR産物、固相担体、反応物質の間の結合は共有結合であり、それによって変性条件下において結合を確実に維持することができる。

PCR産物のアミノ化又はビオチン化鎖を固定した後、未結合の相補鎖をアルカリ変性洗浄によって分離し、反応環境から除去する。標的核酸及び競合核酸に対応する配列特異的オリゴヌクレオチド(sequence-specific oligonucleotide(SSO))を検出タグで標識する。次に、除去した未結合のセンス鎖からの競合物が存在しない状態でSSOをアンチセンス鎖にハイブリダイズする。適当なアッセイ試薬を添加し、使用した検出タグ及び固相担体手段に適したELISA測定手段(好ましくはELISAマイクロプレートリーダー)を使用してハイブリダイゼーション度を測定する。標的テンプレート及び競合物テンプレートを含むテンプレートを増幅するPCR反応から得られた標準曲線を使用して測定値を比較し、標的核酸の含有量を導出する。この方法は、定量的であり、PCRサイクル数に依存せず、SSOプローブとPCR産物中の相補鎖との競合に影響を受けないという点で有利である。

あるいは、ポリメライゼーション工程の一部及びハイブリダイゼーション工程全体を固相担体上で行うことができる。この方法では、PCR産物の鎖ではなく、ヌクレオチド・ポリメライゼーション・プライマー(好ましくはオリゴヌクレオチド)が固相担体に捕捉される。次に、標的核酸及び競合核酸PCR産物の溶液を固相担体に添加し、ポリメライゼーション工程を行う。上述した変性条件下で、ポリメライゼーション生成物の結合していないセンス鎖を除去する。

競合核酸に対する標的核酸の比率は、適当な測定手段(好ましくはELISAリーダー)及び上述した標準曲線を使用して標識オリゴヌクレオチドSSOプローブを検出することによって決定することができる。この方法は非常に効率が良いため、ポリメライゼーション工程における連鎖反応は不要であり得、方法を行うために要する時間を短縮することができる。また、最終ポリメライゼーション生成物をハイブリダイゼーションのために反応チューブから固相担体に移す必要がないため、精度が高まり、それらの損失又はダメージの可能性が制限される。ただし、特定の試料において必要な場合には、PCRを使用して別々の反応チューブ内で標的核酸及び競合核酸を増幅した後、固相担体上で最終的なポリメライゼーションを行うことができる。

当業者に公知の、結合したPCR産物の形成を示す異なる検出可能なシグナルをもたらすことができる分子(例えば、標的PCR産物及び競合PCR産物の形成を示す異なる色を形成する標識ヌクレオチド発色団)を、反応の最後の数サイクルにおいて反応液に添加することができる。また、競合核酸に対する標的核酸の比率は、ELISA又はその他の適切な測定手段及び固定されたハイブリダイゼーションプライマーの3'末端に結合した検出タグと反応することができる試薬を使用して決定することもできる。また、この方法は、従来の非競合的PCR法を行うことによって(定量化することなく)特定の遺伝子が試料に存在するか否かを検出するために使用することができる。

上記方法に使用する適当なプライマーの選択方法は、当業者は理解するか、又は容易に確認することができる。上述した方法のさらなる詳細に関しては、Kohsaka, et al.,Nuc.Acids Res.,21:3469-3472,1993;Bunn et al.,米国特許第5,213,961号;Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Acad.Press,1990を参照されたい。これらの文献の開示内容は、定量的PCR法の最新技術の説明のみを目的として上記参照によって本願明細書に援用する。

参照レベル

YKL-40レベルの上昇は不特定疾患又は障害の存在を示すものであり、不特定疾患又は障害の存在を診断するために使用することができる。所与の被験者のYKL-40レベルが上昇しているか否かは、測定したYKL-40レベルを参照レベルと比較することによって決定することができる。参照レベルは、例えば、不特定疾患又は障害の重症度の上昇をそれぞれ反映する1つ以上の参照レベルであってもよく、同一の被験者の過去の試料に対する測定によって得られた1つ以上の参照レベルであってもよい。

YKL-40のレベルは、例えば様々な疾患又は健康な個体(正常レベルの指標を提供する)について今までに報告されてきている。しかしながら、過去に報告された健康な個体の「正常」YKL-40レベルは、その「健康な個体」がその後も健康な状態だったか否かを調査する追跡調査によって裏付けられていない。従って、過去に報告されたYKL-40レベルは、試料採取時点において未確認の病気にかかっていた可能性のある個体を含み、真の「正常レベル」を表すものではない。そのような過去に報告された(例えば健康な個体から得られた)YKL-40レベルはまた、例えば年齢の影響を考慮していない平均のレベルであった。

本発明の実施例から明らかなように、本願発明者らは真の「正常レベル」を表す方法を特定した。この正常レベルは、多数の健康な個体の集団に基づいて特定したものであり、真の「健康な個体」であったか否かを確認するために当該個体について時間経過と共に追跡調査を行った。予期せぬことに、本願発明者らは、本発明の方法により、被験者における疾患又は障害(例えば、不特定疾患又は障害)の存在を診断するために、この特定された「正常レベル」を使用することができることを見出した。また、本願発明者らは、年齢はYKL-40レベルに大きな影響を与え、本発明の方法を使用する際に年齢の影響を考慮すべきであることを見出した。

YKL-40参照レベルは様々な方法で表すことができる。従来は、参照レベルは様々な年齢の健康な個体の群に由来するものである場合があった。本願発明者らは、YKL-40レベルに対する年齢の影響を調べ、測定したYKL-40レベルは特定年齢層のYKL-40レベルと比較することが好ましいことを見出した。

特定年齢層の個体は、同一年又は特定の10年間に生まれた個体を含むことができ、0〜10歳、10〜20歳、20〜30歳、30〜40歳、40〜50歳、50〜60歳、60〜70歳、70〜80歳、80〜90歳又は90〜100歳の個体を含む群等のように分類することもできる。当該区間は、2歳の年齢差、3、4又は5歳、6、7、8、9又は10歳の年齢差(上記)、12、15又は20歳以上の年齢差を包含するものとすることができる。また、当該区間は上限のない状態(例えば、20歳、30歳、40歳、50歳又は60歳を超えた個体等)としてもよい。

本願発明者らは、男性と女性の血漿YKL-40レベルには統計的に差がないことを見出した(実施例1を参照)。従って、参照レベルの算出の基礎となる個体群は、両性混合又は同性の個体群であってもよい。また、参照レベルは、疾患又は障害の存在について診断を受けるのと同一の個体からも得ることができる。例えば、疾患又は障害の診断前(発病前)又は疾患又は障害の症状が出る前(発症前)に得られた1つ以上の試料のYKL-40レベルを測定することができる。

本発明の好適な実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体から得た試料中のYKL-40レベルを測定することによって得られた平均レベルであり、より好ましくは、そのようにして得られた平均レベルは年齢調整平均レベルである。

具体的には、本発明の一実施形態では、当該平均レベルは、約14〜約168μg/L(2.5〜97.5%パーセンタイル値)の血漿YKL-40レベル、好ましくは約124μg/L(95%パーセンタイル値)未満の血漿YKL-40レベル、より好ましくは約92μg/L(90%パーセンタイル値)未満の血漿YKL-40レベルである。好ましくは、当該平均レベルは、約35〜約55μg/L(例えば約40〜約50μg/L)の血漿YKL-40レベルである。さらに具体的な本発明の別の実施形態では、中央値(レベル)は約42μg/Lの血漿YKL-40レベルである。男性及び女性において血漿YKL-40レベルは年齢と共に上昇し、男性と女性の間で血漿YKL-40の差は見られない。これらの血漿YKL-40レベルは、多数の健康被験者の集団の試料から(及びその集団を研究することにより)見出したものであり、本発明の方法において使用することができる、根拠に裏打ちされた血漿YKL-40参照レベルである(実施例1を参照)。

本発明が年齢調整平均レベルを使用する場合、当該平均レベルは、女性の場合には1歳当たり0.5μg/Lを加えることによって年齢調整し、男性の場合には1歳当たり0.8μg/Lを加えることによって年齢調整することができる。この年齢調整は、例えば、本発明の第3及び第4の態様に適しているように、同一の被験者について過去に測定したYKL-40レベルに対して行うことが好ましい。あるいは、参照レベルは、健康な個体の年齢分布亜集団(即ち上述した個体の特定年齢層(例えば、特定の10年間に生まれた個体))の試料におけるYKL-40レベルを測定することによって得られた1組の年齢依存YKL-40参照レベル(例えば、1つ以上のYKL-40参照レベル)であってもよい。例えば、1組の参照レベルは、30〜39歳、40〜49歳、50〜59歳、60〜69歳の年齢層の健康な個体の群の平均血漿YKL-40レベルであってもよい。好ましいYKL-40年齢依存参照レベルの組を以下に記載する。

本発明の方法の一実施形態では、前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つは、健康な個体において測定されたYKL-40の75パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。

本発明の方法の別の実施形態では、前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つは、健康な個体において測定されたYKL-40の85パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。

本発明の方法の別の実施形態では、前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つは、健康な個体において測定されたYKL-40の90パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。

本発明の方法の別の実施形態では、前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つは、健康な個体において測定されたYKL-40の95パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。

本発明の方法の別の実施形態では、前記1つ以上のYKL-40参照レベルの1つは、健康な個体において測定されたYKL-40の97.5パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。

本発明の方法の好適な実施形態では、前記1つ以上のYKL-40参照レベルは、健康な個体の試料において測定した1組のYKL-40参照レベルを含み、第1の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の中央値であり、第2の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の75パーセンタイル値であり、第3の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の85パーセンタイル値であり、第4の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の90パーセンタイル値であり、第5の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の95パーセンタイル値であり、第6の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の97.5パーセンタイル値であり、第7の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の中央値の4.5倍(factor 4.5)であり、第8の参照レベルは健康な個体のYKL-40濃度の中央値の5倍(factor 5)である。

参照レベルはカットオフ値を使用して特定することもできる。カットオフ値は、通常は、所定のカットオフ値を超えるYKL-40レベルを有する個体群及び所定のカットオフ値未満のYKL-40レベルを有する個体群に複数の個体を二分する値である。カットオフ値は、任意の種類の生体試料において測定されるか、又は当業者によって選択される、生理的なYKL-40レベルを表す任意の数値であることができる。

カットオフ値は、個体があるカテゴリーに含まれるか否かを示すために使用することができる。本発明の場合にはこれは、不特定疾患の存在又は不特定疾患若しくは障害の異なる重症度の段階(本発明の第4の態様におけるように)に対応する。

本発明の一実施形態では、YKL-40参照レベルは年齢調整カットオフ値、例えば血清1リットル当たり約80μg、例えば血清1リットル当たり約90μg、約100μg、約110μg、約120μg又は約130μgのYKL-40のカットオフ値である。好ましくは、YKL-40参照レベルは血清1リットル当たり約100μgである。年齢調整は本願明細書に記載する方法で行うことができる。

従って、本発明の好適な実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体の血漿YKL-40濃度の90パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値であり、例えば、約50歳の被験者では92μg/Lの血漿YKL-40値であり、約60歳の被験者では111μg/Lの血漿YKL-40値である。より好ましくは、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血漿YKL-40濃度の95パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値であり、例えば、約50歳の被験者では100μg/Lの血漿YKL-40値であり、約60歳の被験者では124μg/Lの血漿YKL-40値である。95パーセンタイル血漿中レベルを年齢調整し、カットオフ値として使用する場合には、YKL-40レベルの潜在的な個体差はより幅広く許容される。95パーセンタイル値の使用、さらには97.5パーセンタイル値の使用すらも、一人の被験者に注目して本発明の方法を使用する場合に適切であり得る。ただし、本発明の方法においても、90パーセンタイル血漿YKL-40レベルを使用することが好ましい場合もある。例えば、まだ症状を引き起こしていない不特定疾患を見出すスクリーニングの目的のために本発明の方法を使用する場合である。同様に、例えばスクリーニングの場合には、健康な個体における血漿YKL-40レベルの70パーセンタイル値、75パーセンタイル値又は85パーセンタイル値を使用することが適している場合もある。パーセンタイル値は所望の感度に応じて選択する。例えばカットオフ値として選択するパーセンタイル値が低い程、より高い感度が得られる。低いパーセンタイル値を使用することにより、疾患又は障害にまだごく僅かしか冒されていない(例えば、疾患又は障害の初期段階にある)被験者を発見することができる。ただし、低いパーセンタイル値を選択すると、実際には不特定疾患又は障害に罹患していないにもかかわらず、生物学的な個体差のためにスクリーニングにおいて不特定疾患又は障害に罹患しているとみなされる被験者の割合が上昇する。

従って、測定された試料中のYKL-40レベルが1つ以上の参照レベルよりも高いか否かを判定することにより、本発明の第4の態様において不特定疾患又は障害の重症度を分類することができる。すなわち、測定された試料中のYKL-40レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することによって不特定疾患又は障害の分類が得られ、ここで、YKL-40のレベルが高い程、不特定疾患又は障害の重症度が高いと分類される。

また、カットオフ値は、3610人の健康被験者において定義された以下のパーセンタイル値に対応する血漿YKL-40レベルとして、年齢に応じて定義することができる。
70パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.1+0.02×年齢(歳)として定義される)
75パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.2+0.02×年齢(歳)として定義される)
90パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.5+0.02×年齢(歳)として定義される)
95パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.6+0.02×年齢(歳)として定義される)

また、カットオフ値は、3610人の健康被験者において定義された以下のパーセンタイル値に対応する血漿YKL-40レベルとして、年齢に応じて定義することができる。
70パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.1+0.02×年齢(歳)として定義される)
75パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.2+0.02×年齢(歳)として定義される)
85パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.4+0.02×年齢(歳)として定義される)
90パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.5+0.02×年齢(歳)として定義される)
95パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.6+0.02×年齢(歳)として定義される)
97.5パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.9+0.02×年齢(歳)として定義される)

本発明の方法の好適な実施形態では、被験者の年齢を使用して上記式に従ってYKL-40参照レベルが算出される。図3A及び図3Bにこれらの式を示す。図3A及び図3Bは、計算を必要とすることなくカットオフ値を決定できる、より直接的なアプローチにおいて使用することができる。また、図3A及び図3Bにより、測定されたYKL-40レベル及び被験者の年齢を90パーセンタイル値及び95パーセンタイル値と即座に比較することができる。これにより、測定されたYKL-40レベルが参照レベルとどの程度異なるかを即座に示すことができる。上記90パーセンタイル値の式を使用すれば、約20歳、約30歳、約40歳、約50歳、約60歳及び約70歳の被験者のカットオフ値は、それぞれ約49μg/L、約60μg/L、約74μg/L、約90μg/L、約110μg/L及び約134μg/LのYKL-40レベルとなる。上記95パーセンタイル値の式を使用すれば、約20歳、約30歳、約40歳、約50歳、約60歳及び約70歳の被験者のカットオフ値は、それぞれ約55μg/L、約67μg/L、約81μg/L、約99μg/L、約122μg/L及び約148μg/LのYKL-40レベルとなる。

本発明の方法の一実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの70パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。より好ましくは、年齢調整カットオフ値は、ln(血漿YKL-40)=3.1+0.02×年齢(歳)として定義される70パーセンタイル値である。

本発明の方法の別の実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの75パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。より好ましくは、年齢調整カットオフ値は、ln(血漿YKL-40)=3.2+0.02×年齢(歳)として定義される75パーセンタイル値である。

本発明の方法の別の実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの85パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。より好ましくは、年齢調整カットオフ値は、ln(血漿YKL-40)=3.4+0.02×年齢(歳)として定義される85パーセンタイル値である。

本発明の方法の別の実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの90パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。より好ましくは、年齢調整カットオフ値は、ln(血漿YKL-40)=3.5+0.02×年齢(歳)として定義される90パーセンタイル値である。

本発明の方法の別の実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの95パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。より好ましくは、年齢調整カットオフ値は、ln(血漿YKL-40)=3.6+0.02×年齢(歳)として定義される95パーセンタイル値である。

本発明の方法の別の実施形態では、YKL-40参照レベルは、健康な個体における血清又は血漿YKL-40レベルの97.5パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値である。より好ましくは、年齢調整カットオフ値は、ln(血漿YKL-40)=3.9+0.02×年齢(歳)として定義される97.5パーセンタイル値である。

本発明の方法の一実施形態では、YKL-40参照レベルは、この直前に記載した、70パーセンタイル値、75パーセンタイル値、85パーセンタイル値、90パーセンタイル値、95パーセンタイル値及び97.5パーセンタイル値に対応する年齢調整カットオフ値の2つ以上として定義される、YKL-40年齢依存カットオフ値の組である。

本発明の第1又は第4の態様の別の好適な実施形態では、YKL-40参照レベルは、例えば、好ましくは上記式によって算出される、70パーセンタイル値、75パーセンタイル値、85パーセンタイル値、90パーセンタイル値、95パーセンタイル値及び97.5パーセンタイル値の2つ以上によって定義される、YKL-40年齢依存カットオフ値の組である。YKL-40年齢依存カットオフ値の組は、例えば、20〜29歳、30〜39歳、40〜49歳等の年齢層の組について算出することができ、例えば、カットオフ値はその年齢層における最高値である。本発明の第1又は第4の態様の好適な実施形態では、カットオフ値の組は以下の通りである。

本発明の方法に使用する好ましい年齢依存カットオフ値のより詳細な組は、同様に上記式によって得られる。

上述したように、YKL-40年齢依存参照レベルの組を本発明の方法において使用することができる。健康被験者のYKL-40年齢依存参照レベルの好ましい組は上記式によって算出することができる。従って、本発明の方法において使用する年齢依存参照レベルの好ましい組は以下の通りである。

本発明の方法に使用する好ましい年齢依存参照レベルのさらに詳細な組は、同様に上記式によって得られる。

本発明の別の実施形態では、試料中のYKL-40のレベルが約25%以上、例えば、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約100%以上、約110%以上、約120%以上、約130%以上又は約150%以上上昇した場合に、試料中のYKL-40の測定レベルが参照レベルよりも高く、不特定疾患又は障害の存在を示しているとみなされる。

本発明の第3及び第4の態様に関連して上述したように、参照レベルは過去に同一の被験者から得たものであってもよい。従って、本発明の第3の態様に係る方法は、被験者における不特定疾患又は障害の存在を診断するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
ii)前記YKL-40レベルを、前記被験者について過去に測定したYKL-40レベルであるYKL-40参照レベルと比較することを含み、
前記YKL-40参照レベルと比べて1.10倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す方法である。好ましくは、YKL-40参照レベルは、必要に応じて、女性の場合には1歳当たり0.5μg/Lを加え、男性の場合には1歳当たり0.8μg/Lを加えることによって得られる年齢調整参照レベルである。このような年齢調整参照レベルは、例えば、過去に得た参照レベルが3年以上、例えば5年以上、8年以上又は10年以上前のものである場合に適切であり得る。例えば、過去に得た参照レベルが10年よりも前に得たものである場合である。

使用する参照レベルが過去に同一の被験者において測定したものである場合、試料中のYKL-40レベルが約109%以上上昇した場合に、測定した試料中のYKL-40レベルが参照レベルよりも有意に高く、不特定疾患又は障害の存在を示すとみなされる。例えば、過去に測定したYKL-40レベルが50μg/Lである場合、109%上昇したYKL-40レベルは、50μg/L+(50×1.09)μg/L=50μg/L+54.5μg/L=104.5μg/Lと計算される。約109%以上の上昇には、方法に起因する変動(method variation)、生物学的変動又はYKL-40レベルに影響を及ぼし得るその他の要因が含まれる(詳細については実施例2を参照)。

上述したように、YKL-40レベルの平均上昇率は、女性の場合には1歳当たり0.5μg/Lであり、男性の場合には1歳当たり0.8μg/Lであることを、本願発明者らは見出した。従って、YKL-40測定レベルが過去に測定した同一の被験者のYKL-40レベルと比較して上述した値よりも上昇した場合には、不特定疾患若しくは障害の存在する可能性、又は、例えば未発見だった既存の不特定疾患若しくは障害がより重症になっている可能性がある。従って、YKL-40の上昇(上記109%未満の上昇を除く)は、疾患若しくは障害の存在又は疾患若しくは障害の悪化を示し得る。そのため、例えば、約25歳の女性について過去に測定したYKL-40レベルが約60μg/Lであり、5年後にYKL-40レベルを新たに測定した場合、年齢による上昇は約2.5μg/Lのはずである(すなわち、新たな年齢補正値は約62.5μg/Lである)。それにも関わらず測定値が約66μg/Lであれば、不特定疾患又は障害が存在し得ることを示すものとなる。

同一の個体の過去の測定値から参照レベルを得る本発明の方法の好適な実施形態では、YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍、より好ましくは少なくとも1.25倍、例えば1.30倍又は1.40倍、さらに好ましくは少なくとも1.50倍、例えば1.60倍又は1.70倍又は1.75倍、さらに好ましくは少なくとも1.75倍、例えば1.80倍又は1.90倍又は2倍、最も好ましくは少なくとも2倍、例えば2.10倍又は2.20倍又は2.25倍又は2.50倍に上昇した試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す。例えば、50μg/Lの参照レベルと比較して1.10倍に上昇したYKL-40レベルは、50μg/L×1.10=55μg/Lと計算される(即ち、新たなYKL-40レベルは55μg/Lである)。

上記のことから、上昇率が高い程、不特定疾患又は障害が存在する示唆が強いこととなる。本発明の第3の態様の好適な実施形態では、同一の個体の過去の測定値から得られた参照レベルの2倍、例えば少なくとも2倍に上昇した試料中のYKL-40レベルは不特定疾患又は障害の存在を示す。少なくとも2倍の上昇は、上記109%以上の有意な上昇に対応する。

例えば、同一の被験者の過去に測定したYKL-40レベルが、不特定疾患又は障害が存在していることが予想されるレベルに既にあった場合(本発明の第1の態様を参照)、時間の経過に伴う上昇は、当該不特定疾患又は障害が悪化していない限り、1歳当たり0.5μg/L(女性)又は0.8μg/L(男性)の年齢依存的な上昇を超えないと予測される。この場合、上昇率は低いことが特に好ましい。従って、好ましくは、YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍に上昇した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患若しくは障害の存在又は不特定疾患若しくは障害の悪化を示す。

また、参照レベルを同一の個体の過去の測定値から得る本発明の方法の一実施形態では、参照レベルの0.90倍に低下した試料中のYKL-40レベルは、より良い方向への変化が起こったことを示す。従って、一実施形態では、YKL-40参照レベルの少なくとも0.90倍、より好ましくは少なくとも0.80倍、例えば0.70倍、さらに好ましくは少なくとも0.60倍、さらに好ましくは少なくとも0.50倍、最も好ましくは少なくとも0.48倍、例えば0.45倍又は0.43倍又は0.40倍又は0.38倍に低下した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す。例えば、100μg/Lの参照レベルと比較して0.90倍に低下したYKL-40レベルは、100μg/L×0.90=90μg/Lと計算される(即ち、低下した新たな血漿YKL-40レベルは90μg/Lである)。濃度が少なくとも例えば0.90倍に低下したと記載される場合は、濃度が0.90倍、又は例えば0.80倍、0.70倍等に低下した(すなわち、100μg/Lのレベルが90μg/L以下の値に低下した)ことを意味する。

本発明の第3の態様のより好適な実施形態では、YKL-40参照レベルに対して52%低下した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す。例えば、過去に測定したYKL-40レベルが100μg/Lである場合、52%低下したYKL-40レベルは、100μg/L-(100×0.52)μg/L=100μg/L-52μg/L=48μg/Lと計算される。約52%の低下には、方法に起因する変動、生物学的変動又はYKL-40レベルに影響を及ぼし得るその他の要因が含まれる(詳細については実施例2を参照)。

本発明の第4の態様に関連して、1つ以上の参照レベルに対する試料中のYKL-40レベルの上昇を決定することによって不特定疾患又は障害の重症度を分類することが特に好ましい。従って、一実施形態では、YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍、より好ましくは少なくとも1.25倍、例えば1.30倍又は1.40倍、さらに好ましくは少なくとも1.50倍、例えば1.60倍又は1.70倍又は1.75倍、さらに好ましくは少なくとも1.75倍、例えば1.80倍又は1.90倍又は2倍、最も好ましくは少なくとも2倍、例えば2.10倍又は2.20倍又は2.25倍又は2.50倍に上昇した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す。上昇を決定するためのこれらの値の使用は、本発明の他の態様に関連して上述した。

本発明の第4の態様のより好適な実施形態では、YKL-40参照レベルに対して109%上昇した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す。例えば、過去に測定したYKL-40レベルが50μg/Lである場合、109%上昇したYKL-40レベルは、50μg/L+(50×1.09)μg/L=50μg/L+54.5μg/L=104.5μg/Lと計算される。

同様に、本発明の第4の態様に係る不特定疾患又は障害の重症度の分類は、1つ以上の参照レベルに対する試料中のYKL-40レベルの低下を測定することによって行うことができる。従って、一実施形態では、YKL-40参照レベルの少なくとも0.90倍、より好ましくは少なくとも0.80倍、例えば0.70倍、さらに好ましくは少なくとも0.60倍、さらに好ましくは少なくとも0.50倍、最も好ましくは少なくとも0.48倍、例えば0.45倍又は0.43倍又は0.40倍又は0.38倍に低下した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す。上昇を決定するためのこれらの値の使用は、本発明の他の態様に関連して上述した。

本発明の第4の態様のより好適な実施形態では、YKL-40参照レベルに対して52%低下した試料中のYKL-40レベルは、不特定疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す。

本発明の第4の態様の好適な実施形態は、被験者における不特定疾患又は障害の重症度を分類するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
ii)前記YKL-40レベルを、前記被験者について過去に測定したYKL-40レベルである1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することを含み、
前記YKL-40参照レベルの少なくとも1.10倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示し、
前記YKL-40参照レベルの少なくとも0.90倍に低下した前記試料中のYKL-40レベルが、前記疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す方法に関する。

上記のことから、より上昇率が高い程、疾患又は障害はより重症度の高い段階に進んだことになる。本発明の第4の態様の好適な実施形態では、同一の個体の過去の測定値から得られたYKL-40参照レベルの2倍、例えば少なくとも2倍に上昇した試料中のYKL-40レベルは、疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す。

他のバイオマーカー

YKL-40は、不特定疾患の存在についての、又は不特定疾患若しくは障害の重症度を分類するための、独立した汎用バイオマーカーであり、独立して使用することができる。ただし、C反応性タンパク質(CRP)、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、ペントラキシン3、IIA型分泌性ホスホリパーゼA2、細胞間接着分子1、心臓由来脂肪酸結合タンパク(H-FABP)、ミオシン軽鎖1(MLC-1)、P-セレクチン、CKMB等の、他の公知のバイオマーカーと組み合わせてYKL-40を使用することもできる。これらの他のバイオマーカーのうち、UPAR及び可溶性UPAR、並びに細胞間接着分子1及び可溶性細胞間接着分子1等、可溶性及び不溶性の形態のタンパク質の両方が本発明に関係する。上記マーカーのレベルは、血液、血清、血漿又は組織試料等の生体試料において測定することができ、また、イムノアッセイ、PCRアッセイ又は数種類のアッセイ法の組み合わせ等の、利用可能なあらゆる手段によって測定することができる。

本発明の一態様は、YKL-40レベル及び他のバイオマーカーのレベルの組み合わせによって被験者を診断するための手段を提供し、当該他のバイオマーカーは、これらに限定されるものではないが、C反応性タンパク質(CRP)、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMB、好ましくは、C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択される。これらの他のバイオマーカーのうち、C反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質及びホモシステインが特に好ましい。

本発明の本態様の一実施形態では、当該追加のバイオマーカーが、C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択され、より好ましくは、C反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質及び/又はホモシステインから選択される。

上述した実施形態は、必要な医療機器又は試料採取機器並びに当該機器の使用方法及びアッセイの実行方法に関する取扱説明書と共に、キットに組み込むことができる。

生体試料

生体試料は、被験者から得られた試料である。生体試料は、組織、血液、血清、血漿試料、尿、脳脊髄液、滑液、腹水及び唾液からなる群から選択される試料であってもよい。本発明に特に適した生体試料は、血液、血清又は血漿試料であり、より好ましくは、生体試料は血清又は血漿である。当業者ならば、特定の疾患又は障害又は一般的な健康状態の診断における使用に最も適したアッセイ試料源を容易に判断することができる。

被験者

本願明細書における被験者は、種(好ましくは哺乳動物種)の一員を意味する。あらゆる哺乳動物種が本発明の対象であるが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル及びヒトのいずれかの種が特に適している。最も好ましくは、本発明の対象となる被験者はヒトである。本願明細書では、被験者は患者又は個体ともいう。

器具

本発明の別の態様は、不特定疾患又は障害の存在を診断するための器具(device)であって、試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、前記YKL-40の測定レベルを少なくとも1つのYKL-40参照レベルと比較するための手段と、を含む器具に関する。試料中のYKL-40レベルを測定するための手段は、例えば、イムノアッセイ、PCRアッセイ又は酵素アッセイ等の上述したアッセイ法のいずれかを使用する試験システムであってもよい。当該器具においてはイムノアッセイが好ましい。

本発明に係る器具は、例えば、生体試料におけるYKL-40レベルを測定するために固体担体に取り付けられた、迅速、定性的及び/又は定量的である試験システムを含むことができる。

当該固体担体は、上記アッセイ、特にイムノアッセイを行う際に任意の相(phase)で使用することができ、ディップスティック、膜、吸収性パッド、ビーズ、マイクロタイターウェル、試験チューブ等が挙げられる。事前に最小限の訓練しか受けていないか、又は全く訓練を受けていない試験者又は自己診断する患者が、容易に使用できる検査器具が好ましい。そのような好ましい検査器具としては、ディップスティック及び膜アッセイ・システムが挙げられる。そのような従来の試験システムの調製と使用については、特許文献、医学文献及び科学文献に広く記載されている。スティックを使用する場合には、抗YKL-40抗体をスティックの一端に結合させ、抗体を結合させたその端部を生体試料内又は生体試料上に浸すことができるようにする。あるいは、試料は、ピペット、滴下具(dropper)、ピンセット等を使用して、抗体でコーティングされたディップスティック又は膜に塗布するか、又は身体からスティックに直接噴きかけることができる。従って、本発明の本態様の好適な実施形態では、当該器具はディップスティックである。

本発明の本態様では、液体である、又は液体に転換することができる生体試料が好ましい。特に、体液として身体から得られる生体試料が好ましく、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、腹水、***、唾液が例として挙げられる(これらに限定されない)。血清及び血漿試料がより好ましい。

抗YKL-40抗体は、IgA、IgG、IgM、Fabフラグメント等のアイソタイプであることができる。抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988に記載された方法によって製造することができる。上記文献の開示内容はこの参照によって本願明細書に援用する。イムノアッセイについての節も参照されたい。抗体は、直接又は間接的な手段によって固体担体に結合させることができる。間接的な結合により、YKL-40結合部位をアッセイ溶液に最大限暴露することができる。これは、YKL-40結合部位が担体への結合には使用されないためである。ポリクローナル抗体はYKL-40の異なる複数のエピトープを認識してアッセイ感度を高めることができるため、ポリクローナル抗体を使用することができる。あるいは、抗YKL-40モノクローナル抗体を使用することもできる。

固体担体は、YKL-40抗体を固体担体に結合した後に好ましくは非特異的にブロックされる。隣接領域の非特異的ブロッキングは、(誘導体化)ウシ血清アルブミン、他の動物のアルブミン、動物全血清、カゼイン、脱脂乳等を使用して行うことができる。

YKL-40特異的抗体が結合した固体担体に試料を添加し、抗体を介してYKL-40を固体担体に結合させる。試料の過剰及び未結合成分を除去し、好ましくは固体担体を洗浄し、抗体-抗原複合体を固体担体上に保持させる。固体担体は、Tween-20、Tween-80又はドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を含む洗浄液で洗浄することができる。

YKL-40を固体担体に結合させた後、YKL-40と反応する第2の抗体を添加する。第2の抗体は、好ましくは可視標識によって標識することができる。標識は可溶性又は粒子状であってもよく、染色した免疫グロブリン結合物質、単純色素、色素ポリマー、染色したラテックスビーズ、色素含有リポソーム、染色した細胞若しくは微生物、又は金属、有機、無機若しくは色素固体を含むことができる。標識は、周知の様々な手段によってYKL-40抗体に結合させることができる。本発明のいくつかの実施形態では、標識はシグナル生成系にカップリングさせることができる酵素であってもよい。可視標識の例としては、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチンが挙げられる。多くの酵素-色素原又は酵素-基質-色素原の組み合わせが知られており、酵素結合アッセイに使用することができる。

試料と同時に、既知量のYKL-40に対して、同様の工程を行うことができ、それはアッセイの標準とすることができる。

固体担体を再び洗浄して未結合標識化抗体を除去し、標識化抗体を可視化し、定量化する。通常、標識の蓄積は目視により検出することができる。目視検出により、使用する標識に応じて異なる色、例えば、赤色、黄色、茶色又は緑色を検出することができる。蓄積された標識は、反射率分析器、動画像分析器等の光学的検出装置によって検出することもできる。蓄積された標識の可視強度は、試料中のYKL-40濃度と相関を有し得る。蓄積された標識の可視強度とYKL-40の量の相関は、当該可視強度を一組の参照標準試料と比較することによって得ることができる。好ましくは、当該標準試料は未知試料と同様にアッセイされ、より好ましくは、試料と同時に、同一又は異なる固体担体上でアッセイされたものである。使用する標準試料(YKL-40)の濃度は、溶液1リットル当たり約1μgから約1mgの範囲内であり得、血清試料の場合の好ましい範囲は40〜400μg/Lである。好ましくは、異なる濃度を有する複数のYKL-40標準試料を使用し、色強度の比較による未知の試料の定量化の精度を高める。例えば、110μg/LのYKL-40と同様の色強度は、200μg/LのYKL-40と同様の色強度と比較して陰性(negative)であるとみなすことができる。

このようにして、上述したディップスティック又は他の固体担体試験システム等の器具を、1つ以上の標準/対照フィールドとの比較によって生体試料におけるおおよそのYKL-40レベルを測定するために使用することができる。このようにして、YKL-40の濃度が、当該器具の標準/対照フィールドに添加した2種類のYKL-40濃度間の範囲にあることを確認することができる。あるいは、YKL-40の濃度がYKL-40のカットオフ値を超えるか、カットオフ値未満であるかを判断することができ、この場合、カットオフ値として選択された濃度がディップスティックの対照フィールドに適用される。器具内及び/又は器具上において利用可能な参照レベル/標準は複数でもよいし、単一でもよい。後者の場合には、試料中のYKLレベルを1つの参照レベルと比較する(すなわち、試料中のYKLレベルが参照レベルを超えるか、参照レベル未満であるかを判定する)、イエス/ノー試験として、当該器具を使用することができる。本発明に係る器具の好適な実施形態では、当該器具はカットオフ値を示す単一の参照レベルを含む。参照レベルは、「参照レベル」と題する節に記載した任意の参照レベルであってもよい。

容器を各工程後に洗浄するならば、各工程を試験チューブ等の同一の容器内で行うこともできるが、各工程のために3つの別々の容器(試料の容器、洗浄用容器及び検出可能な標識を発色(developing)させるための容器)を使用することによって、本発明に係る高速かつ簡便なオンサイトアッセイ(on-site assay)を最も首尾よく行うことができる。

従って、本発明の一つの目的は、生体試料が由来する個体のYKL-40参照レベルに基づく分類において使用するための生体試料のYKL-40レベルを、ディップスティックを使用して測定することにある(図9A及び図9Bを参照)。

本発明の本態様の別の実施形態では、当該器具は、YKL-40以外の追加のバイオマーカーをアッセイするための手段をさらに含み、当該追加のバイオマーカーは、例えば以下の非限定的な群から選択される1つ以上のバイオマーカーである:C反応性タンパク(CRP)、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、ペントラキシン3、IIA型分泌性ホスホリパーゼA2、細胞間接着分子1、心臓由来脂肪酸結合タンパク(H-FABP)、ミオシン軽鎖1(MLC-1)、P-セレクチン及びCKMB。好ましくは、当該器具は、C反応性タンパク質及び/又は脳性ナトリウム利尿タンパク質及び/又はホモシステインをアッセイするための手段を含む。

本発明の本態様の一実施形態では、当該器具は、C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択される追加のバイオマーカー、より好ましくは、C反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質及び/又はホモシステインをアッセイするための手段を含む。

当該器具に関連して、少なくとも1つの参照レベルは、「参照レベル」と題する節に記載した任意の参照レベルであってもよい。本発明に係る器具の一実施形態では、当該器具はカットオフ値を示す単一の参照レベルを含む。

本発明の本態様の別の実施形態では、当該器具は、測定されたYKL-40レベルを年齢調整YKL-40参照レベルの組と比較するための手段を含む。

本発明の本態様の別の実施形態では、当該器具は、測定されたYKL-40レベルを以下の表に定義する年齢依存カットオフ値の組と比較するための手段を含む。

キット(Kit of parts)

本発明に従ってYKL-40をアッセイするために必要な全ての材料と試薬はキットにまとめることができ、そのようなキットは、少なくとも、個体から得た生体試料におけるYKL-40レベルを評価するための構成要素と、そのやり方に関する説明書と、を含む。

前記構成要素は、イムノアッセイ等のYKL-40レベルを検出する方法であってもよく、YKL-40検出に特異的なイムノアッセイを行うために必要な構成部分であってもよい。必要に応じて、キットは、YKL-40を検出し、生体試料中のYKL-40レベルを測定するためのPCRアッセイを行うための構成要素をさらに又は代替として含むことができる。当該キットは、1以上の生体試料を得るための機器をさらに含むことができ、前記機器は例えば注射器、バイアル等であってもよい。当該キットは、一回の使用又は反復使用のために包装することができ、含まれる構成要素は、例えば一回の使用後に処分される使い捨てであってもよく、反復使用することができる品質のものであってもよい。

本発明の別の態様は、
i)試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、
ii)前記測定されたYKL-40レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較するための手段と、
iii)必要に応じて、前記試料を提供した患者の年齢に応じて前記YKL-40参照レベルを調整する方法に関する説明書と、
を含むキットに関する。

当該少なくとも1つの参照レベルは、「参照レベル」と題する節に記載した任意のYKL-40参照レベルであってもよい。

試料中のYKL-40レベルを測定するための手段は、既知の濃度のYKL-40を含む1以上の溶液、洗浄液、直接又は間接的に基質への作用を介した酵素の作用によって色又は明度が変化する色素原の溶液、検出することができるように標識に結合された抗YKL-40抗体、溶液を移すためのピペット、溶液のための試験チューブ、特に当該試験チューブに挿入するように構成され、抗YKL-40ポリクローナル抗体を表面に担持した固体担体を含むことができる。また、当該キットは、1以上の試料を同時又は個別に測定するために使用される、抗YKL-40抗体を担持した1以上の固体担体と、標識を発色させるために必要な試薬と、をさらに含むことができる。測定されたYKL-40レベルを1つ以上のYKL-40参照レベルと比較するための手段は、未知試料と共にその都度アッセイすることができるYKL-40標準試料であってもよい。そのようなキットは、各試薬のための別々の容器を含む。

上記試験キットにおいて、試薬は貯蔵ボトルから供給するか、又は、1以上の試験チューブに試薬若しくは対照を予め充填しておくことができる。

キットの構成要素は、乾燥状態又は凍結乾燥状態で提供することができる。試薬又は構成要素を乾燥状態で提供する場合には、通常は適当な溶媒を添加して元に戻す。当該溶媒を別の容器手段によって提供することもできる。

本発明のキットは、通常、バイアル又はチューブ等の試薬を、市販するために厳重に閉じこめる手段(例えば、所望のバイアルを保持する射出又はブロー成型プラスチック容器)を含む。また、キットは、アッセイ方法に関する1組の取扱説明書を含む。

本発明の本態様の別の実施形態では、キットは、YKL-40以外の追加のバイオマーカーのアッセイを行うための手段を含み、当該追加のバイオマーカーは、例えば以下の非限定的な群から選択される1以上のバイオマーカーである:C反応性タンパク(CRP)、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、ペントラキシン3、IIA型分泌性ホスホリパーゼA2、細胞間接着分子1、心臓由来脂肪酸結合タンパク(H-FABP)、ミオシン軽鎖1(MLC-1)、P-セレクチン及びCKMB。

本発明の本態様の一実施形態では、当該キットは、C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群、より好ましくは、C反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質及び/又はホモシステインから選択される追加のバイオマーカーをアッセイするための手段を含む。

好ましくは、当該キットは、C反応性タンパク質及び/又は脳性ナトリウム利尿タンパク質及び/又はホモシステインを測定するための手段を含む。

本発明に係るキットは、「器具」と題する節に記載した本発明に係る器具をさらに含むことができる。

本願に引用した全ての特許文献と非特許文献は、参照によって本願明細書に援用する。

以下の実施例は例示のみを目的とするものであり、添付請求項に記載された本発明の範囲を限定するものではない。

実施例1

正常(健康)被験者の血漿YKL-40レベル及び独立した危険因子としての血漿YKL-40

方法

参加者

デンマーク人の一般集団についての前向き調査(Copenhagen City Heart Studyの1991〜1994年の検査)を使用した(Bojesen et al,2003;Nordestgaard et al,2007;Schnohr et al,2002)。コペンハーゲン居住者の性別及び年齢を5歳区間の群に階層化し、20歳以上の参加者をランダムに選択した。参加を募った17180人の被験者のうち、10135人が参加し、8899人の参加者からYKL-40測定のために血漿を採取した。参加者固有のCentral Person Registry番号を使用して、1991〜1994年のベースラインから2007年7月まで、参加者を16年間追跡した。追跡は100%完全だった。約99%がデンマーク系の白人だった。血液採取時(1991〜1994年)に、1763人の参加者が、血漿YKL-40レベルの増加を伴うことが知られている疾患(癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患又は肺炎)に罹患していた。追跡中に、さらに3526人がこれらの疾患の少なくとも1つを発病した。3059人が死亡した。3610人の参加者が追跡終了時まで健康だった。

2001〜2003年の検査において、Copenhagen City Heart Study群の929人の参加者の血液試料中の血漿YKL-40レベルを再び測定した。これらの参加者は1991〜1994年及び2001〜2003年の検査において疾患に全く罹患していないとして選定され、回帰希釈バイアス(regression dilution bias)の補正を可能とした(Clarke R,1999)。

参加者は自己記入質問書に書き込み、その内容は出席日に参加者と調査官によって確認された。参加者は喫煙習慣に関して申告し、喫煙習慣が全くなかった者、過去に喫煙習慣があった者及び現在喫煙習慣がある者に細分した。

エンドポイント

参加者固有のDanish Central Person Registry番号を使用して、死亡及び病気に関する情報を3つの集団登録簿から集めた。死亡に関する情報は、Danish Civil Registry Systemから得た(Juel et al,1999)。1976年から2007年7月までのICD8及びICD10コードにおける病気に関する情報はDanish Patient Registry(34)から入手し、血漿YKL-40レベルの増加を伴う疾患(虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患又は肺炎)ごとに細分した。癌の診断は、デンマークにおける全ての癌の98%を認定する(35,36)Danish Cancer Registry(1947年から2004年)及びDanish Patient Registry(2004年から2007年7月)から入手した。

倫理

全ての参加者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。調査は、Herlev病院及びデンマーク倫理委員会(No.100.2039/91及び01-144/01、Copenhagen and Frederiksberg committee)によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って行われた。

YKL-40分析

血漿YKL-40レベルは、12〜15年にわたって-80℃で凍結した試料を使用し、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートウェル、ビオチン化Fabモノクローナル捕捉抗体、アルカリホスファターゼで標識されたポリクローナル検出抗体を使用して市販の2部位サンドイッチ型酵素免疫測定法(ELISA)(Quidel,米国カリフォルニア州サンディエゴ)(Harvey et al.1998)によって二重に測定した。ELISAの回収率は102%であり、検出限界は10μg/Lだった。アッセイ内変動係数は、5%(40μg/L)、4%(104μg/L)、4%(155μg/L)だった。アッセイ間変動係数は<6%だった。

統計分析

STATAバージョン10.0(Stata Corp LP、テキサス州College Station)を使用した。両側P<0.05を有意であるとみなした。Mann-Whitney順位和検定とスピアマンのρ相関係数を使用した。血漿YKL-40レベルは、性別及び10年ごとの年齢層の群における血漿YKL-40レベルのパーセンタイル値に応じて区分に階層化した。当該パーセンタイル値区分は、0〜33%、34〜66%、67〜90%、91〜95%、96〜100%であった。表3では、3つのパーセンタイル値区分(0〜33%、34〜90%、91〜100%)のみを使用した。

Kaplan-Meier曲線を使用して、全ての参加者について左側切断年齢及び追跡時間に対して累積生存率をプロットした。また、Kaplan-Meier曲線を使用して、癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患及び喘息に罹患した参加者のサブグループについて、追跡時間に対して累積生存率をプロットした。血漿YKL-40レベルのパーセンタイル値区分間の差をログランク検定を使用して調べた。死亡のハザード比及び95%信頼区間をCox回帰分析を使用して算出した。ハザード比は、血液採取時点の性別、年齢(十分位数)、喫煙習慣(なし/過去にあり/現在あり)等のその他の危険因子に応じて調整した。傾向検定では、0、1、2、3、4、又は0、1、2(表3の結果についてのみ)とラベルした漸増的な血漿YKL-40区分を連続型変数としてCox回帰分析において使用した。傾向検定のP値は、YKL-40区分のあるモデルにネストされたYKL-40区分のないモデルの尤度比検定のカイ2乗値(1df)を使用して算出した。Schonefeld残差に基づいて時間の経過に伴う危険の比例性を調べたが、逸脱(violation)は見られなかった。ベースライン共変量に関する情報は99%を超えて完全だった。共変量に関する不完全な情報を有する個体は多因子解析から除いた。ハザード比は、ノンパラメトリック方法を使用して回帰希釈バイアスについて補正した(Clarke et al,1999)。補正では、1991〜1994年のベースライン検査及び2001〜2003年のフォローアップ検査の両方に参加した929人の健康な個体の血漿YKL-40値を使用した。ただし、主な分析は全ての参加者(8899人)に対して行った。0.8042の回帰希釈率(regression dilution ratio)を算出した。

血液採取時点の共変量(性別、年齢(<50歳、50〜70歳、>70歳)、喫煙習慣(なし/過去にあり/現在あり))を含むポアソン回帰モデルからの回帰係数を使用して、血漿YKL-40パーセンタイル値区分による絶対10年死亡率(absolute 10-year mortality)を推定した。絶対死亡率は、推定発生率(事象/10年)(%)として示される。

結果

健康な参加者の血漿YKL-40

調査対象集団は、20〜95歳(平均:59歳)の8899人の参加者(女性:56%)からなっていた。表4に、年齢と性別について調整した血漿YKL-40パーセンタイル値区分による全ての参加者のベースライン特性を示す。7136人(80%)の参加者は、1991〜1994年の血液採取時点で既知の疾患に全く罹患していなかった。16年間の追跡期間中に、3576人が疾患を発病し、3610人の参加者が追跡終了時まで健康だった。これらの健康な参加者の血漿YKL-40レベルの中央値は42μg/Lだった(2.5%〜97.5%パーセンタイル値範囲:14〜168μg/L:90%パーセンタイル値 92μg/L:95%パーセンタイル値 124μg/L)。男性及び女性において、血漿YKL-40レベルは年齢と共に上昇した(傾向検定 p<0.0001)(図1)。血漿YKL-40レベルと年齢とのスピアマンρ相関係数は0.41だった(p<0.0001)。男性及び女性において血漿YKL-40の差はなかった(Mann-Whitney U:p=0.27)。

第1回目のYKL-40レベル測定を1991〜1994年の検査時に採取した血液によって行い、第2回目のYKL-40測定を2001〜2003年の検査時に採取した血液によって行った929人の健康な参加者(女性:463人、男性:466人)の群における血漿YKL-40濃度を図2に示す。平均上昇率は、女性の場合には0.5μg/L/歳(四分位範囲:-0.6〜2.1μg/L/歳)であり、男性の場合には0.8μg/L/歳(四分位範囲:-0.3〜2.9μg/L/歳)だった。これは、健康を維持している被験者では血漿YKL-40が非常に安定していることを示し、回帰希釈率は0.8042と算出された。男女の間には統計的な差はなかった。

1991〜1994年の血液採取時に既知の疾患に罹患しておらず、16年間の追跡期間にわたって健康を維持した(すなわち、死亡したり、癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、肺炎を発病したりしなかった)2116人の健康な女性及び1494人の健康な男性の群におけるYKL-40の血漿中濃度を図3に示す。図3は、これらの健康な参加者の平均血漿YKL-40濃度、70%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.1+0.02×年齢(歳)として定義される)、75%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.2+0.02×年齢(歳)として定義される)、90%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.5+0.02×年齢(歳)として定義される)、95%パーセンタイル値(ln(血漿YKL-40)=3.6+0.02×年齢(歳)として定義される)を示す。女性と男性の数値を組み合わせた。

血清CRPとは対照的に(Kushner et al, 2006)、男女間に血漿YKL-40レベルの差はなかった。また、健康な参加者の大集団において血漿YKL-40レベルが経時的に安定していることが証明された。

第1回目のYKL-40測定を1991〜1994年の検査時に採取した血液によって行い、第2回目のYKL-40測定を2001〜2003年の検査時に採取した血液によって行った929人の健康な参加者(女性:463人、男性:466人)の群における血漿YKL-40濃度の上昇率の中央値は、女性の場合には0.5μg/L/歳(四分位範囲:-0.6〜2.1μg/L/歳)であり、男性の場合には0.8μg/L/歳(四分位範囲:-0.3〜2.9μg/L/歳)だった。男女間の差は有意ではなかった。

血漿YKL-40濃度の中央値は、健康を維持した参加者よりも、発病事象(癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患及び喘息)のあった参加者において高かった(表1)。

血清C反応性タンパク質(CRP)(炎症バイオマーカー)の僅かな上昇によって健康な個体及び疾患に罹患した個体の両方で死亡が予測されることが示されているため(Kushner et al, 2006)、血漿CRPレベルが低い(≦1.75mg/L)参加者における血漿YKL-40レベルの予測的意義も調べた。血漿YKL-40濃度の予測的意義がCRPとは独立しているか否かが調べられた。低い血漿CRP濃度(≦1.75mg/L)を有する4453人の参加者において、死亡のハザード比は、血漿YKL-40パーセンタイル値区分0〜33%に対して、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が34〜66%の場合には1.0(95% CI、0.8〜1.2)、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が67〜90%の場合には1.4(1.1〜1.7)、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が91〜95%の場合には2.3(1.6〜3.3)、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が96〜100%の場合には3.4(2.5〜4.8)( log₁₀傾向p値:12.1)であった。血漿CRPレベルが>1.75mg/Lの参加者でも同様な結果が見られた(log₁₀傾向p値:18.3)(表2)。従って、これらの被験者では、血漿YKL-40レベルが上昇すると死亡のハザード比が高い有意性をもって上昇し、血漿YKL-40は血漿CRPとは独立であることが確認された。

高い血漿YKL-40レベルと高い死亡の危険性は、特定の種類の疾患に関連しているというわけではなく、1991〜1994年の血液採取時の前、又は16年間の追跡期間において、癌、虚血性心臓血管疾患、肝臓疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患と診断された参加者において見られた。

高い血漿YKL-40レベルと高い死亡の危険性との連関は、喫煙状況と死亡の危険性との連関と同等又はそれより高かった。また、喫煙状況、年齢、性別を含む多変量Cox分析により、血漿YKL-40が独立した危険因子であることが示された。すなわち、血漿YKL-40パーセンタイル値区分は、年齢、性別、血漿CRP、喫煙状況又は疾患(血漿YKL-40上昇を伴う癌、虚血性心臓血管疾患及び他の疾患)にかかわらず早期死亡のリスク因子であることが示された。血漿YKL-40の上昇は喫煙に連関していた(傾向、p<0.0005)。

デンマーク人の成人一般集団におけるこの調査により、高い血漿YKL-40濃度は早期死亡を予測するものであることが判明した。高い血漿YKL-40レベルを有する参加者と低い血漿YKL-40レベルを有する参加者との間の生存年齢の中央値の差は14歳であり、血液採取から15年の追跡期間後において生存している参加者の割合の差は26%だった。

特徴がよく理解された被験者の大規模な群において、長い追跡期間にわたって、追跡調査におけるロスを伴わずに、血漿YKL-40の予測的意義を評価したことが本調査の強みである。

一般集団における死亡のリスク因子としての血漿YKL-40

16年間の追跡期間中に8899人の参加者のうちの3059人が死亡した。血漿YKL-40の上昇(5つの性別及び10年年齢層パーセンタイル値区分に分割)は、全ての原因の早期死亡のリスク増大と連関していた(ログランク検定、p=3.8*10^-46)(表3及び図4A)。低い血漿YKL-40レベルを有する参加者(パーセンタイル値0〜33%)の生存年齢中央値は83歳であり、15年生存率は70%だったのに対し、高い血漿YKL-40レベルを有する参加者(パーセンタイル値96〜100%)の生存年齢中央値は69歳であり、15年生存率は44%だった。従って、血漿YKL-40上昇の、生存年齢中央値及び15年生存率に対する影響は、喫煙状況による影響と同等であるか又はそれより高くすらあった(表3及び図4A)。

複数の因子(性別、年齢、及び血液採取時の喫煙状況)によって調整した死亡全般のハザード比は、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が0〜33%の場合に対して、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が34〜66%の場合には1.2(95% CI、1.1〜1.3)、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が67〜90%の場合には1.6(1.4〜1.8)、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が91〜95%の場合には2.3(1.9〜2.8)、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が96〜100%の場合には2.8(2.4〜3.4)だった(p-傾向、p=1.0*10^-37)。これらの推定値は、変死(violent death)について調整した後でも一定のままだった(表2)。死亡のハザード比(HR)は、血漿YKL-40レベルに応じて、性別及び10年年齢層パーセンタイル値区分において算出した。

癌に罹患した参加者、虚血性心血管疾患に罹患した参加者及びその他の疾患に罹患した参加者においては、血漿YKL-40パーセンタイル値区分の上昇と多因子調整死亡ハザード比の上昇との間で非常に有意な連関が見られた(log₁₀傾向p値 11.4、12.5、15.1)(表2)。

絶対10年死亡率

最も低い絶対10年死亡率は、50歳未満の喫煙したことのない女性の血漿YKL-40パーセンタイル値区分0〜33%において見られた1.2%だった(図4B)。絶対10年死亡率は女性よりも男性で高く、年齢が上昇すると共に上昇し、喫煙状況が「なし」→「過去にあり」→「現在あり」という順で上昇した。最も高い絶対10年死亡率は、血漿YKL-40パーセンタイル値区分が96〜100%の70歳を超える喫煙者の男女において見られた78%及び90%だった(図4B)。

結論として、一般集団からの被験者についてのこの大規模な前向き調査において、喫煙の有無にかかわらず、高い血漿YKL-40濃度と早期死亡との間に強い連関が見出された。

実施例2

健康被験者の血清YKL-40濃度の、一日の、週毎の、及び長期的な、変動

材料及び方法

参照区間(Reference Interval)

245人の健康被験者(女性/男性:134/111、年齢中央値:49歳、範囲:18〜79歳)から血清を採取した。

一日の変動

16人の健康被験者(女性/男性:10/6、年齢中央値:48歳、範囲:32〜66歳)から、24時間中に7回(1日目:午前10時、午後1時、午後4時、午後7時、午後10時、 2日目:午前7時、午前10時)、血清を採取した。

3週間における日毎の変動

病院職員から募集した38人の被験者(女性/男性:21/17、年齢中央値:41歳、範囲:22〜66歳)から、3週間中に5回(1、2、8、15、22日目)、午前8時に血清を採取した。8日目には、午後2時にも試料を採取した。

2年間における週毎の変動

病院職員から募集した23人の被験者(女性/男性:14/9、年齢中央値:42歳、範囲:31〜66歳)から、3週間中に5回(1、2、8、15、22日目)、午前8時に血清を採取し、6、12、24ヵ月後に採取を繰り返した。

3年間における変動

30人の健康な女性(年齢中央値:48歳、範囲:24〜62歳)から、4週間中に5回(1、8、15、22、29日目)、午前8時から午前10時の間に血清を採取し、21人の被験者については3年後に採取を繰り返した。

運動後の変動

14人の健康被験者(女性/男性:10/4、年齢中央値:50歳、範囲:35〜64歳)から、身体運動前、自転車エルゴメータを使用した25分間の2段階運動プログラムの直後、並びに運動の1時間後及び3時間後に、血清を採取した。本調査に含まれた健康被験者は、病歴を有しておらず、いかなる症状も経験しておらず、疾患の兆候を有しておらず、いかなる薬も服用していなかった。

倫理

調査は、地域科学倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って行われた。被験者は口頭及び書面で調査について説明を受け、全員が書面によるインフォームドコンセントを提出した。全ての被験者に、いつでも調査への参加を止めることができることを伝えた。

YKL-40 ELISA

病気のプロセスとは無関連で、方法に起因する変動性(methodological variability)による血清YKL-40の変化を最小限にするために、血液試料の適切な取り扱いが重要である(Johansen et al.,2006,A;Johansen et al.,2006,B;Harvey et al.,1998)。血液試料は室温で凝固させ、0.5〜2時間以内に最低2500gで10分間遠心分離し、血清を-80℃で分析時まで保存した。血清YKL-40濃度は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートウェル、ビオチン化Fabモノクローナル捕捉抗体、アルカリホスファターゼで標識されたポリクローナル検出抗体を使用して、市販の2部位サンドイッチ型酵素免疫測定法(ELISA)(Quidel社,米国カリフォルニア州サンディエゴ)(Harvey et al.1998)によって二重に測定した。ELISAの回収率は102%であり、検出限界は20μg/Lだった(Johansen et al.,2006,B;Harvey et al.,1998)。アッセイ内変動係数(CV)は≦5.0%であり、アッセイ間CVは≦10.2%だった(個人観察)。各被験者の試料を同一のELISAプレート上で分析した。

統計分析

血清YKL-40の記述統計は、中央値又は幾何平均、変動係数、95%信頼区間及び範囲によって示した。血清YKL-40の分布は非対称であり、従って対数変換(自然)を統計的推定に使用した。基準範囲は、対数スケールのYKL-40の線形回帰を使用して推定した。経時的に分析した血清YKL-40の変動(24時間、3週間、6カ月、12カ月、24カ月、3年間における変動性)をCVによって表し、YKL-40 ELISAのアッセイ内及びアッセイ間CVと比較した。被験者内、被験者間及びラウンド間の分散成分を、対数変換され(複合モデル)、幾何平均の変動係数で示されるYKL-40のランダム効果モデルを想定して推定した(Kirkwood,1979)。単一個体におけるYKL-40の2つの測定値間の差の95%信頼限界は対数スケール上で算出し、逆変換した。全変動に対する被験者間の相対的均一性は級内相関係数によって推定した。長期的な日々変動と身体運動の分析における血清YKL-40は、反復測定による一般線形モデルを使用して分析した。P値<5%を有意であるとみなした。多重試験のP値は、ボンフェローニの補正を使用して補正した。全ての統計計算はSAS(9.1、SAS Institute、米国ノースカロライナ州ケーリー)を使用して行った。

結果

健康被験者では、血清YKL-40レベルの中央値は43μg/L(範囲:20〜184μg/L;5-95%区間:20〜124)であり、男女間で差はなかった(P=0.54)。血清YKL-40レベルは年齢と共に上昇した(ρ=0.45;P<0.0001)。血清YKL-40レベルを従属変数(対数変換)とし、年齢及び性別を説明変数として、線形回帰によって年齢及び性別について調整した血清YKL-40濃度の正規化基準範囲を作成した。上限は、所与の年齢及び性別についての95パーセンタイル値と定義した。年齢調整した被験者間CVは45%だった。

図5は、24時間のうち7時点で測定された、各個人における血清YKL-40の1日の変動を示す。平均血清YKL-40レベルは午前10時から午後10時までに23%上昇したが(P=0.01)、多重試験について補正した場合には有意ではなかった。その他の有意な差は観察されなかった。

25分の自転車エクササイズ後に血清YKL-40レベルの変化は見られなかった(P>0.08、直線モデル)。

図6は、3週間のうち6時点で測定された、各個人における血清YKL-40レベルの週毎の変動を示す(1、2、8、15、22日目の午前8時)。各被験者の血清YKL-40レベルの測定日間CVの中央値は16%だった。8日目には試料を午前8時と午後2時に採取し、血清YKL-40濃度は僅かに上昇していた(47μg/Lから52μg/L、8%の差、P<0.0001)。

図7は、3週間のうちの5時点で測定された、各個人における血清YKL-40レベルの変動(1、2、8、15、22日目の午前8時、第1ラウンド)、並びに、6カ月後(第2ラウンド)、12カ月後(第3ラウンド)及び24カ月後(第4ラウンド)に繰り返した際の血清YKL-40レベルの変動を示す。各被験者の血清YKL-40レベルの測定日間CVの中央値は、全体で16%(範囲:0〜92%)、第1ラウンドでは16%(範囲:0〜63%)、第2ラウンドでは19%(範囲:5〜92%)、第3ラウンドでは15%(範囲:0〜64%)、第4ラウンドでは21%(範囲:0〜47%)だった。4つのラウンドにわたって系統的な上昇又は減少は検出されなかった(P=0.09)。血清YKL-40レベルが対数変換された、ランダム効果モデルを使用した分散成分の推定では、被験者内CVが27.3%、24ヶ月中のCVが8.8%だった。経時的変動及びアッセイ間変動を含んだ被験者内CVは24ヶ月の期間において30.2%だった。24カ月間の級内相関係数は72.4%だった。アッセイ間変動を含んだ被験者内血清YKL-40レベルの推定変動は、第2のYKL-40測定値が52%減少するか又は102%上昇した場合には、同一の被験者の2つの測定値間の差についての95%信頼限界となり、この規模の差は有意であって、分析前のコンディション、方法に起因する変動及び正常な生物学的変動を反映しているだけではない。

図8は、1ヶ月のうちの5時点で測定された、各個人における血清YKL-40レベルの週毎の変動及び3年後の同様な変動を示す。血清YKL-40レベルのCVの中央値は17%(第1ラウンド)及び13%(第2ラウンド)だった。両方のラウンドにおいて分析された被験者では(n=21)、2つの期間の間に血清YKL-40レベルの変化は見られなかった(P>0.37、直線モデル)。血清YKL-40レベルが対数変換された、ランダム効果モデルを使用した分散成分の推定では、被験者内CVが26.0%、3年間におけるCVが7.3%だった。経時的変動及びアッセイ間変動を含んだ被験者内CVは28.8%だった。被験者内変動及び経時的変動を含んだ被験者間変動は54%だった。3年間の級内相関係数は72.2%であり、被験者間変動と比較して被験者内変動が相対的に低いことを示している。

結論

本調査により、短期間、及び最大3年間の長期サンプリング期間にわたって、健康被験者における血清YKL-40レベルは、アッセイ間変動を含んだ被験者内CVが約30%の範囲で安定していることが証明された。血清YKL-40レベルの被験者間変動は正規化基準範囲を決定する分析において45%であり、本調査における健康被験者に対するその他の分析と同様だった。

2年間及び3年間の級内相関係数は72.4%及び72.2%であり、被験者間変動と比較して被験者内変動が相対的に低いことを示している。本調査において見出された級内相関は、他の血清学的マーカーの級内相関と同様であり、例えば、Ockene et al.は高感度C反応性タンパク質について66%の級内相関を報告している(Ockene et al.,2001)。

アッセイ間変動を含んだ、健康被験者内の血清YKL-40レベルのこの推定変動によって、>109%の上昇又は>52%の減少が有意であり、分析前のコンディション、方法に起因する変動及び正常な生物学的変動を反映しているだけではないとみなされることが断定された。

結論として、本調査により、血清YKL-40レベルは1日の間に有意に変動せず、また、身体運動の影響も無いことが示された。血清YKL-40レベルは被験者間変動と比較して被験者内変動が相対的に低いことが実証され、YKL-40は信頼できるバイオマーカーであることが確認された。

Claims

被験者における不特定の疾患又は障害の存在を判定するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
ii)前記YKL-40の測定レベルを、以下に定義されるYKL-40年齢依存カットオフ値の組：
70パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.1+0.02×年齢(歳)
75パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.2+0.02×年齢(歳)
85パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.4+0.02×年齢(歳)
90パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.5+0.02×年齢(歳)
95パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.6+0.02×年齢(歳)
97.5パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.9+0.02×年齢(歳)
から選択されるYKL-40参照レベルと比較すること、を含み
ここで、上記カットオフ値を超える前記試料中のYKL-40レベルは不特定の疾患又は障害の存在を示す、方法。
被験者における不特定の疾患又は障害の存在を判定するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
ii)前記YKL-40の測定レベルを、以下の表によって定義されるYKL-40年齢依存カットオフ値の組：
から選択されるYKL-40参照レベルと比較すること、を含み
ここで、上記カットオフ値を超える前記試料中のYKL-40レベルは不特定の疾患又は障害の存在を示す、方法。
前記YKL-40年齢依存参照レベルの組が以下の表によって定義される、請求項1に記載の方法。
被験者における不特定の疾患又は障害の重症度を分類するための方法であって、
i)前記被験者から得た試料中のYKL-40のレベルを測定し、
ii)前記YKL-40の測定レベルを、以下に定義されるYKL-40年齢調整カットオフ値の組：
70パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.1+0.02×年齢(歳)
75パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.2+0.02×年齢(歳)
85パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.4+0.02×年齢(歳)
90パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.5+0.02×年齢(歳)
95パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.6+0.02×年齢(歳)
97.5パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.9+0.02×年齢(歳)
から選択される1つ以上のYKL-40参照レベルと比較すること、
又は、
前記YKL-40の測定レベルを、同一の被験者について過去に測定した1つ以上のYKL-40レベルであるYKL-40参照レベルと比較すること（ここで、前記YKL-40参照レベルの少なくとも1.60倍以上に上昇した前記試料中のYKL-40レベルは、不特定の疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示し、前記YKL-40参照レベルの少なくとも0.60倍に低下した前記試料中のYKL-40レベルは、不特定の疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す）、
を含み、
前記不特定の疾患又は障害の重症度を前記比較から推定する方法。
同一の被験者について過去に測定した前記1つ以上のYKL-40参照レベルが、女性の場合には1歳当たり0.5μg/Lを加えることによって年齢調整し、男性の場合には1歳当たり0.8μg/Lを加えることによって年齢調整した血漿YKL-40レベルである、請求項4に記載の方法。
同一の被験者について過去に測定した前記YKL-40参照レベルの少なくとも1.70倍に上昇した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す、請求項4又は5に記載の方法。
同一の被験者について過去に測定した前記YKL-40参照レベルの少なくとも0.50倍に低下した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
前記YKL-40参照レベルに対して109%上昇した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の高い段階に進んだことを示す、請求項4〜7のいずれかに記載の方法。
前記YKL-40参照レベルに対して52%低下した前記試料中のYKL-40レベルが、不特定の疾患又は障害がより重症度の低い段階に進んだことを示す、請求項4〜8のいずれかに記載の方法。
前記試料中におけるYKL-40測定レベルを、前記1つ以上のYKL-40参照レベルと比較することによって前記不特定の疾患又は障害が分類され、ここで、前記YKL-40測定レベルが高い程、前記不特定の疾患又は障害の重症度が高いと分類される、請求項4〜9のいずれかに記載の方法。
前記不特定の疾患又は障害が、C反応性タンパク質レベルの上昇をもたらさない1以上の疾患若しくは障害又は疾患群若しくは障害群である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
前記YKL-40レベルを測定するのと同一の試料において、1つ以上の追加のバイオマーカーのレベルを測定する、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
前記1つ以上の追加のバイオマーカーが、C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
不特定の疾患又は障害の存在を診断するための器具であって、
試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、
前記YKL-40測定レベルを、以下に定義されるYKL-40年齢調整参照レベルの組：
70パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.1+0.02×年齢(歳)
75パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.2+0.02×年齢(歳)
85パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.4+0.02×年齢(歳)
90パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.5+0.02×年齢(歳)
95パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.6+0.02×年齢(歳)
97.5パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.9+0.02×年齢(歳)
と比較するための手段とを含む、器具。
不特定の疾患又は障害の存在を診断するための器具であって、
試料中のYKL-40レベルを測定するための手段と、
前記YKL-40測定レベルを、以下の表に定義する年齢依存カットオフ値の組：
と比較するための手段とを含む、器具。
i)試料中のYKL-40のレベルを測定するための手段と、
ii)前記YKL-40の測定レベルを、以下に定義されるYKL-40年齢調整参照レベルの組：
70パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.1+0.02×年齢(歳)
75パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.2+0.02×年齢(歳)
85パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.4+0.02×年齢(歳)
90パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.5+0.02×年齢(歳)
95パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.6+0.02×年齢(歳)
97.5パーセンタイル値： ln(血漿YKL-40 μg/l)=3.9+0.02×年齢(歳)
から選択される1つ以上のYKL-40参照レベルと比較するための手段と、
iii)前記試料を提供した被験者の年齢に応じて前記YKL-40参照レベルを年齢調整するやり方に関する説明書と、
を含むキット。
C反応性タンパク質、ESR、癌胎児性抗原(CEA)、CA-125、ヒト上皮細胞成長因子受容体2(HER2)、CA19-9、乳酸脱水素酵素(LDH)、メタロプロテイナーゼ1組織阻害因子(TIMP-1)、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-α、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端ペプチド(P-III-NP)、単球遊走因子1、フィブリンDダイマー、成長分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク関連ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及びCKMBからなる群から選択される追加のバイオマーカーをアッセイするための手段をさらに含む、請求項16に記載のキット。