JP5311303B2 - アルツハイマー病および癌の治療薬 - Google Patents
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Description
家族性ADの主要な病因遺伝子の産物であるプレセニリン蛋白(presenilin;PS)は、膜結合型アスパラギン酸プロテアーゼであるγ−セクレターゼの触媒サブユニットに一致することが示されている(非特許文献4、非特許文献5)。
Selkoe DJ,Physiol Rev 2001,81(2):741−766.Alzheimer’s disease:genes,proteins,and therapy. Suzuki N et al.Science 264:1336,1994 Iwatsubo T,Odaka A,Suzuki N,Mizusawa H,Nukina N,Ihara Y.Neuron.1994,13(1):45−53, Wolfe MS,Xia W,Ostaszewski BL,Diehl TS,Kimberly WT,Selkoe DJ(1999)、Nature 398(6727):513−517 Li YM,Xu M,Lai MT,Huang Q,Castro JL,DiMuzio Mower J,Harrison T,Lellis C,Nadin A,Neduvelil JG,Register RB,Sardana MK,Shearman MS,Smith AL,Shi XP,Yin KC,Shafer JA,Gardell SJ(2000)、Nature 2000 Jun 8,405(6787):689−94. J Biol Chem.2001 Aug 10;276(32):30018−30023. Oncogene.2005 Sep 22;24(42):6333−6344. Mol Cell Biol.2003 Jan;23(2):655−664. Br J Cancer.2005 Sep 19;93(6):709−718.
また、本発明は、被検抗体を添加して、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質とを反応させることを特徴とするγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、抗ニカストリン抗体、その誘導体またはそれらの断片の、アルツハイマー病および/または癌の治療薬の製造のための使用を提供するものである。
抗ニカストリン抗体、その誘導体またはそれらの断片を投与することを特徴とする、アルツハイマー病および/または癌の治療方法を提供するものである。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質との反応系を用いることにより、γ−セクレターゼ活性を阻害する抗体、すなわち、アルツハイマー病および/または癌の治療に有効な抗体をスクリーニングすることができる。
本発明は、抗ニカストリン抗体およびその誘導体またはそれらの断片を用いたADおよび/または癌の治療薬、当該薬の製造のための使用、アルツハイマー病および/または癌の処置方法である。
ここで、ヒト活性型γ−セクレターゼとは、フラグメント型プレセニリン、ニカストリン、APH−1及びPEN−2の4種の蛋白質を含む分子量250〜500キロダルトン以上の巨大膜タンパク質複合体である。
本発明で用いられる抗ニカストリン抗体はニカストリン蛋白質に特異的に結合するだけでなく、ヒト活性型γ−セクレターゼを中和することが好ましいが、その由来、種類(モノクローナル、ポリクローナル)および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化(CDR移植)抗体などの公知の抗体を用いることができるが、好ましくは、ヒト、キメラ、ヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
具体的には、抗ニカストリン抗体を産生するハイブリドーマから、抗ニカストリン抗体の可変(V)領域をコードするを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.et al.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia製)等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia製)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
本発明で治療可能な癌は、ニカストリンを発現している癌および/またはγ−セクレターゼ依存性の癌であると考えている。
かかる癌としては、肺癌、急性T細胞性リンパ芽球性白血病が挙げられる。
ここで、ニカストリンを発現している癌とは、ニカストリンが発現することによりニカストリン蛋白質を生産している癌をいう。また、γ−セクレターゼ依存性の癌とは、癌細胞の増殖にγ−セクレターゼが必須であり、γ−セクレターゼの活性が阻害されると細胞が増殖抑制または死滅する癌をいう。
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いた癌治療は、当業者公知の方法により行うことができる。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。
後記実施例記載のように、抗ニカストリン抗体は、ニカストリンとC99およびN99などのγ−セクレターゼの基質の反応を阻害することを見出した。
従って、本発明のγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体のスクリーニング方法は、ADや癌の治療薬の探索として有望である。
本発明のスクリーニング方法は、被検抗体を添加して、ニカストリンとγ−セクレターゼの基質、例えば、Notch受容体および/またはAPPの膜内配列を含む一部又は全部からなるポリペプチドとを反応させ、当該ニカストリンと当該基質の反応を検出することによって行う。
または、被検抗体を、ニカストリンとNotchならびに/もしくはAPP配列の一部または全部からなるポリペプチドとが発現している細胞に添加して反応させ、公知の検出方法にて、これらの反応生産物を生成するか否かを確認する。
好ましくは後者の方法である。後者の方法はスクリーニング工程がより簡便であり、さらに公知の検出方法との組み合わせによって短期間で多数の検体を評価でき、被検抗体がγ−セクレターゼ活性を阻害する抗体か否かを評価でき、ADおよび癌の治療薬を迅速に開発することが可能となる。
γセクレターゼの基質であるタンパク質の一部又は全部からなるポリペプチドの由来は、ヒト由来が好ましいが、それに限定されず、イヌ、ネコ、マウス、ハムスター、ショウジョウバエなどヒト以外の種のいかなる由来でもよい。
ニカストリンまたはγ−セクレターゼの基質のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列には、検出方法に応じて、V5、FLAGなどのタグ配列を付加して発現させてもよい。
上記発現させた宿主細胞からニカストリンやNotch受容体およびAPPの膜内配列を含む一部または全部からなるペプチドを、公知の抽出方法により、細胞膜を可溶化して抽出し、適宜精製する。
タグに対応する抗体を添加後、IPし、ついで沈降画分を公知のウェスタンブロットにて解析する。タグに対応する抗体は、予めアガロースビーズなどの担体に結合させていてもよい。
また、一方を担体やアッセイプレートなどに固定し、他方を放射性同位体や蛍光物質などでラベルし、バインディングアッセイを用いてもよい。また、被検抗体に抗原などのタグや放射性同位体などのラベルなどをつけて検出してもよい。
恒常発現細胞を37℃、24時間培養後、被検抗体を添加して、さらに導入遺伝子を発現させる。導入遺伝子の発現誘導は、10mMのn−butylic acidを添加する。37℃、12時間培養後、当該細胞または上清を回収する。
当該細胞を用いる場合は、溶解後、ルシフェラーゼによる発光量の減少するほど、被検抗体がニカストリンとNotch受容体の膜内ペプチドまたはAPPペプチドとの結合を阻害し、Notch受容体の膜内ペプチドおよびAPPペプチド切断を抑制し、γ−セクレターゼ活性阻害率が高い被検抗体であると判断する。
当該上清を用いる場合には、細胞外に放出された、ELISAに対応できる指標を付けたAβペプチドの断片をELISA法により測定する。EILSA反応が少ないほど、被検抗体がニカストリンとNotch受容体またはAPPペプチドとの結合を阻害し、Notch受容体ペプチドまたはAPPペプチドの膜内配列切断を抑制し、γ−セクレターゼ活性阻害率が高い被検抗体であると判断する。
ルシフェラーゼの代わりに、アルカリフォスファターゼ、GFPを用いてもよい。
昆虫細胞(Spodoptera Frugiperda、Sf9)は10%ウシ胎児血清(FBS、Sigma)、penicillin(100U/mL)、streptomycin(100μg/mL)(Invitrogen)を含むGrace’s Insect Media Supplemented(Invitrogen)を用いて27℃で培養を行った。大量培養を行う際には、1Lのスピナーフラスコを用いて、上記培地にさらに0.001% pluronicF−68(Invitrogen)を添加して培養した。
ヒトニカストリンを含むコンストラクト(pBlueBac4.5−NCT)は、pEF6−TOPO/V5−His(Invitrogen)にクローニングされたヒトニカストリンcDNA(pEF6−NCT)(T.Tomita et al.,FEBS Lett.520(2002)117−121)を、C末端側にベクター由来のV5−Hisタグを含んでpBlueBac4.5(Invitrogen)にサブクローニングして作製した。組み換えウイルスの作製はBac−N−Blue Transfection Kit(Invitrogen)に添付されているプロトコールに従い、Bac−N−BlueDNAと作製した各プラスミド4μgをSf9細胞にトランスフェクトした。数回のプラークアッセイによる純化を行い、目的の遺伝子のみを含む組み換えウイルスを調製した。High titer stock作製後、プラークアッセイによりウイルスのタイターチェックを行った。
1回膜貫通型タンパク質であるニカストリンについて、組み換えウイルスを作製し、BV上への発現を確認した。Sf9細胞にmultiplicity of infection(MOI)5で感染させ、12、24、48、72時間後に細胞およびBVを回収し、抗ニカストリンN末端抗体(anti−NCT(N−19)SantaCruz)とanti−His抗体を用いたイムノブロットによりニカストリンの発現を確認したところ、細胞画分に加えてBV画分においても、感染から48時間後に十分な発現が認められたことから、ニカストリンにおいてもSREBP−2(Y.Urano et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.308(2003)191−196)と同様にBV上への発現が可能であることが示された。
BV上にはウイルス由来の膜タンパク質であるgp64が多量に発現しかつ抗原性が高いために、BVをマウスに免疫するとgp64に対する抗体が強く誘導され、目的の抗原に対する抗体を得ることが困難であることから、gp64に対して耐性を示すよう作出されたgp64トランスジェニックマウスを免疫用マウスとして使用した。
ヒトニカストリン発現組み換えウイルス(NCT−BV)を用いて、Sf9細胞(5x108cells/500mL)にMOI5で感染させ、48時間培養した。回収した培養上清から超遠心により抗原となるBVを調製した後、gp64トランスジェニックマウスに対して、5回免疫を行った。
抗血清、および得られたハイブリドーマの培養上清のスクリーニングは、BV−ELISAにより、定法に従い行った。固層化用の抗原として、免疫時に使用したNCT−BV、およびネガティブコントロールとしてSREBP−2とSREBP cleavage−activating protein(SCAP)(Y.Urano et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.308(2003)191−196)を共感染させて得られたSREBP+SCAP−BVまたは外来の遺伝子を含まないWild−BV(20μg/mL in saline)を50μL/well加えた。その結果、野生型BVやSREBP・SCAP発現BVには反応せず、ニカストリン発現BVのみに陽性な反応を示すクローンが多数得られた(図1)。また同様にBVを用いたイムノブロットではPPMX0401、PPMX0410などBV上に発現したニカストリンを認識するクローンが複数得られた(図2)。
COS−7(サル腎臓由来細胞)、HeLa(ヒト子宮頸癌由来細胞)、A549(ヒト肺癌由来細胞)、およびNKO細胞(ニカストリンノックアウトマウス由来線維芽細胞:T.Li et al.,J.Neurosci.23(2003)3272−3277)は、10%FBS、penicillin(100U/mL)、streptomycin(100μg/mL)(Invitrogen)を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM、Sigma)を用いて、37℃、5%CO2中で培養した。
BV−ELISAにより得られた陽性クローンの培養上清について、NCT−BV、Wiled−BVおよびヒト野生型や各変異型ニカストリンを用いて、1xSDS−PAGE sample bufferを加え、SDS−PAGE、イムノブロットを行った。ポジティブコントロールとして抗ニカストリンN末端抗体(N−19)を用いた。動物細胞を用いた一過性の発現では、COS−7細胞へDEAE−dextranを用いて導入し、トランスフェクションから48時間後に細胞を回収した。ヒト野生型ニカストリンにはpEF6−NCTを用いた。また、各変異型ニカストリンのコンストラクト(Δ312、Δ694)は、pEF6−NCTからlongPCR法により作製した(T.Tomita et al.,FEBS Lett.520(2002)117−121)。
抗ニカストリン抗体の解析を目的として、NKO細胞にpEF6−NCTをLipofectAmine(Invitrogen)を用いて遺伝子導入し、10μg/mL Blasticidinを含む培地で選択することにより、ヒトニカストリンを恒常的に発現するNKO細胞(NKO/NCT)細胞を取得した。
ニカストリンは配列上20カ所の予想される糖鎖修飾部位を持ち、高度にN−結合型の糖鎖修飾を受けることが知られている(T.Tomita et al.,FEBS Lett.520(2002)117−121;J.Y.Leem et al.,J.Biol.Chem.277(2002)19236−19249;D.S.Yang et al.,J.Biol.Chem.277(2002)28135−28142;W.T.Kimberly et al.,J.Biol.Chem.277(2002)35113−35117)。
ニカストリンには、糖鎖の修飾の程度により成熟型(分子量約130kDa)または未成熟型(分子量約110kDa)と呼ばれるものが存在し、活性型のγ−セクレターゼ複合体中には、成熟型ニカストリンのみが含まれている。N−結合型糖鎖のうち複合型糖鎖はEndoglycosidase H(Endo H)に対しては耐性であるが、Peptide:N−glycosidase F(PNGase)では切断を受けることが知られている。したがってニカストリンにおいては、EndoH処理により複合型糖鎖修飾を受けた成熟型ニカストリンは分子量が約115kDaとなり、複合型糖鎖を持たない未成熟型は約80kDaとなるが、PNGaseF処理により両方とも約80kDaとなる(D.S.Yang et al.,J.Biol.Chem.277(2002)28135−28142、W.T.Kimberly et al.,J.Biol.Chem.277(2002)35113−35117)。
そこで、抗ニカストリン抗体のエピトープ解析を目的に糖鎖消化実験を行った。
Endo HまたはPNGase処理として、ニカストリン画分に200mM citrate−NAOH pH5.8,0.1% SDS,1% 2−mercaptoethanolを加え、95℃で5分間煮沸した。これに500mU/mL Endoglycosidase H(Roche Applied Sciences)または200U/mLのPNGase F(Roche Applied Sciences)を加え、37℃で終夜反応させた。最後に1/4量の5x sample buffer加えて95℃で5分間煮沸し、反応を停止させた。
Neuraminidase(Sialidase)処理として、ニカストリン画分に50mM Na−Acetate pH5.2,2mM CaCl2,0.5% 2−mercaptoethanolを加え、95℃で5分間煮沸した。これに500mU/mL Neuraminidase(Roche Applied Sciences)を加え、37℃で終夜反応させた。最後に1/4量の5x sample bufferを加えて95℃で5分間煮沸し、反応を停止させた。
各糖鎖消化酵素により処理したサンプルをウェスタンブロット解析した結果、PPMX0401、PPMX0408、PPMX0410はいずれも糖鎖消化されたニカストリンに対して交差性を示すことが明らかとなった(図4)。「○」はEndoH耐性のニカストリンを、「●」は糖鎖が完全に除去されたニカストリンを、「△」はNeuraminidaseによりシアル酸が除去されたニカストリンを表す。
この結果、特にPNGase Fにより完全に糖鎖を除去したニカストリンを認識するという結果は、今回得られた抗体がニカストリンの糖鎖ではなく、ペプチド鎖を認識して結合することを示唆する。
HeLa細胞を細胞破砕buffer(10% glycerolを含むHEPES buffer(10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl Complete inhibitor cocktail(Roche Applied Sciences)))に懸濁しホモジェナイザーにて破砕後、1,500xg、10分間遠心した。さらに上清を100,000xg、1時間超遠心し、得られた沈殿をHeLa細胞膜画分とした。細胞膜画分を1%CHAPSOを含むHEPES bufferにて可溶化し、HeLa細胞膜可溶画分を得た。今回得られた抗ニカストリンモノクローナル抗体を用いて可溶画分からIPした後、各種の抗体でウェスタンブロット解析した。
生化学的検討から、成熟型ニカストリンを含む活性型γ−セクレターゼは脂質ラフトに局在することが報告されている(Urano Y,Hayashi I,Isoo N et al.:Association of active gamma−secretase complex with lipid rafts.J Lipid Res 2005,46:904)。そこで、今回得られた抗体について培養細胞を用いて免疫染色を行い、それぞれの抗体により認識されるニカストリンの細胞内局在を検討した。検討にはHeLa細胞とNKO細胞を用いた。予めポリ−D−リジンでコートしたカバーガラスに細胞を適当な密度で接着させ、PBSで洗浄後4%パラフォルムアルデヒドを含むPBSで固定した。ブロッキングには3%BSAを含むPBSを用い、浸透化する場合にはさらに終濃度0.1%のTritonX−100を加えた。適当な濃度にブロッキング液で希釈した各抗体と室温にて3時間または4℃にて一晩反応させた。二次抗体にはAlexa488または546を結合した抗マウスまたはラビットイムノグロブリン抗体を用いた。
その結果、HeLa細胞において、PPMX0408では顆粒状の構造と細胞膜が染色されたのに対し、PPMX0401ではそのような構造は染色されなかった(図7)。NKO細胞ではPPMX0408によって顆粒状の構造は染色されなかったが、NKO細胞に野生型ニカストリンを導入するとHeLa細胞での結果と同様の染色像を示した(図8)。これらの結果は、PPMX0408により染色される顆粒状の構造はニカストリンに由来することを示す。
PPMX0408およびPPMX0410はγ−セクレターゼ複合体を保持した条件下で、活性型γ−セクレターゼに含まれる成熟型ニカストリンと結合することから、これらの抗体はγ−セクレターゼの活性に影響を与えるものと考えられた。HeLa細胞のミクロソーム画分を1%CHAPSOにより可溶化し、人工基質を用いたin vitro γ−セクレターゼアッセイ系に各抗体を添加して、γ−セクレターゼ活性をde novo合成されたAβの集積を指標にして測定した(Takasugi N,Tomita T,Hayashi I,Tsuruoka M,Niimura M,Takahashi Y,Thinakaran G,Iwatsubo T.:The role of presenilin cofactors in the gamma−secretase complex.Nature 2003,422:438;Takahashi Y,Hayashi I,Tominari Y et al.:Sulindac sulfide is a non−competitive gamma−secretase inhibitor that preferentially reduces Abeta 42 generation.J Biol Chem 2003,278:18664)。
その結果、PPMX0401を終濃度10μg/mL添加した場合のγ−セクレターゼ活性はPBSを添加した場合と同程度であったのに対し、PPMX0408およびPPMX0410を終濃度10μg/mL添加した場合はγ−セクレターゼ活性はPBSを添加した場合と比して約20%阻害された(図11)。このことから、成熟型ニカストリンと結合するこれらの抗体はγ−セクレターゼ阻害活性を有することが考えられる。
まず、Notchシグナル依存的な生存を示す癌細胞株を同定する目的で、HeLa細胞およびA549細胞の生存に対するγ−セクレターゼ阻害剤DAPT(HF.Dovey et al.,J.Neurochem.76(2001)173−181)の影響をMTT法により評価した。各細胞5x103個を96ウェルマルチプレートに播種し、終濃度100μMのDAPTにより72時間処理した。処理時間経過後、PBSに希釈したMTTを終濃度500μg/mLになるよう添加し、37℃にて3−4時間培養した。その後stop solution(10%SDS,0.01M HCl)を添加して反応を停止し、さらに37℃にて一晩静置して生成したformazanを溶解させた。ピペッティングにてformazan溶液を均一に混和し、550nmの吸光度を測定して細胞生存率を算出した。その結果、DAPT処理によってA549細胞では未処理群に比して有意に細胞生存率の低下が見られたが、HeLa細胞では差が見られなかった(図12)。さらに、この細胞生存率の低下がγ−セクレターゼ活性の阻害によるものであることを確認するため、A549細胞の内因性ニカストリンをニカストリンに対するshort interference RNA(siRNA)処理によりノックダウンして、細胞生存率の変化を測定した。その結果、ランダムな配列のsiRNA処理(scramble)に比してニカストリンsiRNAによる処理では、細胞生存率が約20%低下した(図13)。この条件下で内因性ニカストリンの発現は完全に抑制されていた(図14)。これらの結果から、HeLa細胞とは異なり、A549細胞の生存にはγ−セクレターゼ活性が必須であることが考えられる。
急性T細胞性リンパ芽球性白血病(T−cell Acute Lymphoblastic Leukemia、T−ALL)患者から単離・樹立されたTALL−1、ALL−SIL、DND−41の各細胞は、いずれもその増殖にNotchシグナリングが必要であることが報告されている(Weng, A. P., Ferrando, A. A., Lee, W.,Morris, J. P. t., Silverman, L. B., Sanchez−Irizarry, C., Blacklow, S. C.,Look, A. T. and Aster, J. C. (2004). Activating mutations of NOTCH1 in humanT cell acute lymphoblastic leukemia. Science 306, 269−271.)。さらに、TALL−1細胞にはNOTCH1遺伝子に体細胞変異は見出されていないが、ALL−SIL細胞、DND−41細胞ではNOTCH1の細胞外領域とTMIC(Transmembrane−intracellular domain of Notch)の相互作用に関与する領域(HDN)にミスセンス変異が存在し、NICD(Notch intracellular domain)の分解に関与するPEST領域が変異によって欠損していることが報告され(図16)、HDN領域の変異によりリガンド非依存的なヘテロ二量体の解離とshedding、γ−セクレターゼによる切断が起こることやPEST領域の欠損によってNICDの安定性が高まることがNotchシグナリングの異常亢進を引き起こし、これがT−ALLの原因となると考えられている。
まず、TALL−1、ALL−SIL、DND−41の各細胞をγ−セクレターゼ阻害剤で処理した場合に、NOTCH1の代謝がどのような影響を受けるかについて、検討を行った。NOTCH1の細胞内アンキリンリピート領域に対する抗体mN1A(Chemicon、Cat #MAB5352)を用いたウェスタンブロット解析において、全ての細胞でNOTCH1 TMICと思われるバンドが確認できた。さらにALL−SIL、DND−41においてはやや低い位置にNEXT(Notch extracellular truncation)と思われるバンドと、さらにその下にNICDと思われるやや不明瞭なバンドが観察された(図17)。ALL−SILおよびDND−41細胞では、恒常的なNICDの発現がNICDのN末端断端特異抗体Val1744(Cell Signaling、Cat #2421)により確認されたが、TALL−1細胞では見られなかった。次に各細胞の培養上清にγ−セクレターゼ阻害剤YOを10、100、1000nMの濃度で添加して、48時間後に細胞を回収してlysateをウェスタンブロット解析したところ、ALL−SILおよびDND−41細胞ではYO処理によりNICDの消失とTMIC、NEXTの蓄積が観察された(図17)。このことから、少なくともALL−SIL、DND−41細胞の両細胞において恒常的にNotchシグナリングが活性化していることが示唆された。
ニカストリンはγ−セクレターゼ複合体において、基質受容体として機能する可能性が報告されている(Shah S,Lee SF,Tabuchi K,Hao YH,Yu C,LaPlant Q,Ball H,DannCE 3rd,Sudhof T,Yu G.:Nicastrin functions as a gamma−secretase−substrate receptor.Cell 2005,122:435)。
そこで、PPMX0410がγ−セクレターゼと基質との相互作用の阻害を介してγ−セクレターゼ阻害活性を発揮する可能性について検討した。
得られた膜画分を1% CHAPSOを含むHEPES bufferにて可溶化し、ニカストリン画分およびN100画分を得た。
ニカストリン画分をPBSにて適当な濃度に希釈したPPMX0401またはPPMX0410と混合して4℃で終夜反応した後、N100画分を添加してさらに3時間転倒混和した。Bufferは、抗体との混合時には1% CHAPSOを含むHEPES buffer、N100画分を添加後は0.5% CHAPSOを含むHEPES bufferを用いた。
得られたニカストリン・N100混合画分から抗V5抗体を結合したV5−アガロースビーズ(SIGMA)または抗FLAG抗体を結合したM2−アガロースビーズ(SIGMA)を用いてニカストリンおよびN100−FLAGを共沈降し、沈降画分を抗V5抗体でウェスタンブロット解析した(図20)。
したがって、本実験系によりニカストリンの構造依存的なN100との結合を検出可能であると考えられた。
in vitro反応系においてγ−セクレターゼ活性を阻害するPPMX0410が、生細胞においても同様にγ−セクレターゼ活性による切断を抑制するか確認するため、GAL4−UASシステムを利用したレポーター細胞を用いた検討を行った。
C99はAPP(amyloid precursor protein)がBACE(β−site APP cleaving enzyme)による切断を受けて産生される断片であり、γ−セクレターゼの直接の基質となる。
C99にpreproenkephalin由来のシグナルペプチド、および膜貫通領域直下に酵母由来の転写因子であるGAL4を挿入したコンストラクト(SC100G)を作製し、pcDNA3.1/Hygroベクター(invitrogen)にサブクローニングした。
また、Notch受容体の細胞外領域を欠損し、リガンド非依存的にγ−セクレターゼの直接の基質となるNΔE(N99を含む)にGAL4/VP16を結合したコンストラクト(NΔEGV、Taniguchi Y,Karlstrom H,Lundkvist J,Mizutani T,Otaka A,Vestling M,Bernstein A,Donoviel D,Lendahl U,Honjo T.:Notch receptor cleavagedepends on but is not directly executed by presenilins.Proc Natl Acad Sci U.S.A 2002,99:4014)をpcDNA3.1ベクターにサブクローニングした(pcDNA3.1−NΔEGV)。
レポーターコンストラクトとして、pGL3(R2.2)ベクター(promega)のluciferaseの上流にUAS配列を挿入したコンストラクト(UAS−luc)を作製した。さらに、細胞数をモニターするコントロールベクターとして、pcDNA3(invitrogen)にeGFPをサブクローニングした、pcDNA3−eGFPを作製した。HEK293細胞にpcDNA3.1−SC100GおよびUAS−lucを共に、もしくはpcDNA3.1−NΔEGV、UAS−lucとpcDNA3−eGFPを共に、Lipofectamine2000(invitrogen)を用いて遺伝子導入した。HEK/SC100G細胞、HEK/NΔEGV細胞にそれぞれHygromycin(和光純薬)またはG418(CALBIOCHEM)の抗生物質抵抗性マーカーを用いて恒常発現細胞(それぞれHEK/SC100G細胞、HEK/NΔEGV細胞)を選択した。
回収した細胞をlysisバッファー(promega)にて溶解し、得られたlysateをレポーターアッセイに供した。発光基質としてピッカジーン(東洋インキ)を用いた。luciferaseによる発光量の規格化は、HEK/SC100G細胞の場合は蛋白質濃度で、HEK/NΔEGV細胞の場合はeGFPの発光量で行い、得られた値をRelative Light Unit(RLU)とした。また、HEK/SC100G細胞の培養上清中に分泌されたAβ量をELISAにより測定し、luciferaseによる発光量と同様に蛋白質濃度で規格化した。
これらの結果から、PPMX0410は生細胞においてもγ−セクレターゼ活性を阻害し、APPおよびNotch受容体の膜内タンパク質切断を抑制することが示された。
Claims (4)
- 成熟型ニカストリンに結合する抗ニカストリン抗体、または当該抗体のFab、F(ab’)2、もしくはscFvを含有するニカストリンを発現している癌の治療薬。
- 成熟型ニカストリンに結合する抗ニカストリン抗体、または当該抗体のFab、F(ab’)2、もしくはscFvを含有するγ−セクレターゼ依存性癌の治療薬。
- 成熟型ニカストリンに結合する抗ニカストリン抗体、または当該抗体のFab、F(ab’)2、もしくはscFvを含有する肺癌または急性T細胞性リンパ芽球性白血病の治療薬。
- 抗ニカストリン抗体が、寄託番号BP−FERM10808として寄託された細胞株ppmx0410から産生される抗体である請求項1〜3のいずれかに記載の治療薬。
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