JP3170377B2 - 物質の測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料中のガラクトースを
消去した後、試料中の特定の成分、例えば１，５−アン
ヒドログルシトール等を酵素反応を利用して定量する方
法に関する。
消去した後、試料中の特定の成分、例えば１，５−アン
ヒドログルシトール等を酵素反応を利用して定量する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中にはガラクトースが存在し、
成分を分析定量する際に試料中のガラクトースが成分の
測定結果に影響を与える場合がある。かかる場合目的成
分の定量に先だってガラクトースを分解あるいは当該定
量に影響しない物質に変換した後定量が行われる。
成分を分析定量する際に試料中のガラクトースが成分の
測定結果に影響を与える場合がある。かかる場合目的成
分の定量に先だってガラクトースを分解あるいは当該定
量に影響しない物質に変換した後定量が行われる。
【０００３】試料中のガラクトースの消去方法として
は、イオン交換カラムクロマトグラフィーでガラクトー
スを分離する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報、
特開昭６４−６７５６号公報）が知られているが、該方
法は操作が煩雑である。
は、イオン交換カラムクロマトグラフィーでガラクトー
スを分離する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報、
特開昭６４−６７５６号公報）が知られているが、該方
法は操作が煩雑である。
【０００４】１，５−アンヒドログルシトールは糖尿病
の診断マーカーとして知られている。１，５−アンヒド
ログルシトールの定量法としては該物質に酸化酵素を作
用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または
電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られて
いる（特公平３−２４２００号公報）。しかし、１，５
−アンヒドログルシトールを基質とする酸化酵素はいず
れも基質特異性が低く、試料中に共存するガラクトース
とも反応するため、多量のガラクトースが共存する試料
での該方法の使用には問題がある。
の診断マーカーとして知られている。１，５−アンヒド
ログルシトールの定量法としては該物質に酸化酵素を作
用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または
電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られて
いる（特公平３−２４２００号公報）。しかし、１，５
−アンヒドログルシトールを基質とする酸化酵素はいず
れも基質特異性が低く、試料中に共存するガラクトース
とも反応するため、多量のガラクトースが共存する試料
での該方法の使用には問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】試料中のガラクトース
を目的の成分の分析に影響を与えない物質に効率よく変
換することによって目的の成分を正確に定量する方法の
開発が求められている。
を目的の成分の分析に影響を与えない物質に効率よく変
換することによって目的の成分を正確に定量する方法の
開発が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のガラ
クトースに、ガラクトースを基質とする酵素を作用させ
た後、試料中の定量すべき成分を酵素反応を利用して定
量する方法に関する。
クトースに、ガラクトースを基質とする酵素を作用させ
た後、試料中の定量すべき成分を酵素反応を利用して定
量する方法に関する。
【０００７】ガラクトースを基質とする酵素反応として
は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下にガラクト
キナーゼ〔ＥＣ．２．７．１．６〕を作用させることか
らなる反応、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ）またはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）の存在下にガラクトースデヒドロゲ
ナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８；ＥＣ．１．１．１．
１２０〕を作用させることからなる反応、酸素の存在下
にガラクトースオキシダーゼ〔ＥＣ．１．１．３．９〕
を作用させることからなる反応等があげられる。
は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下にガラクト
キナーゼ〔ＥＣ．２．７．１．６〕を作用させることか
らなる反応、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ）またはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）の存在下にガラクトースデヒドロゲ
ナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８；ＥＣ．１．１．１．
１２０〕を作用させることからなる反応、酸素の存在下
にガラクトースオキシダーゼ〔ＥＣ．１．１．３．９〕
を作用させることからなる反応等があげられる。
【０００８】本発明は目的の成分の分析において、試料
中に存在するガラクトースが目的の分析を阻害する場合
に適用することによって大きな効果を期待することがで
きる。本発明は目的の成分を分析する際に用いられる酵
素がガラクトースにも作用する場合のみならず、目的の
成分をガラクトースを経由して定量する際にも適用でき
る。たとえばガラクトースと類似構造を有する１，５−
アンヒドログルシトールの定量、あるいはガラクトース
を経由して定量するフラクトース、アミラーゼ等の定量
等に適用すると効果が著しい。
中に存在するガラクトースが目的の分析を阻害する場合
に適用することによって大きな効果を期待することがで
きる。本発明は目的の成分を分析する際に用いられる酵
素がガラクトースにも作用する場合のみならず、目的の
成分をガラクトースを経由して定量する際にも適用でき
る。たとえばガラクトースと類似構造を有する１，５−
アンヒドログルシトールの定量、あるいはガラクトース
を経由して定量するフラクトース、アミラーゼ等の定量
等に適用すると効果が著しい。
【０００９】本発明を実施するに際しては、緩衝液にガ
ラクトースが共存する試料を加え、これに（１）０．１
〜１０ｍｇ／ｍｌのＡＴＰおよび１〜１００単位／ｍｌ
のガラクトキナーゼ〔ＥＣ．２．７．１．６〕（ガラク
トキナーゼ法）、（２）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＮＡ
Ｄおよび１〜１００単位／ｍｌのガラクトースデヒドロ
ゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８〕（ＮＡＤ依存性ガ
ラクトースデヒドロゲナーゼ法）、（３）０．１〜１０
ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰおよび１〜１００単位／ｍｌのガ
ラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．１２
０〕（ＮＡＤＰ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ
法）または（４）酸素存在下に、１〜１００単位／ｍｌ
のガラクトースオキシダーゼ〔ＥＣ．１．１．３．９〕
（ガラクトースオキシダーゼ法）を加え、５〜４０℃で
１〜３０分間、好ましくは３〜１０分間反応させる。以
上の酵素および基質はいずれも市販されており容易に入
手できる。
ラクトースが共存する試料を加え、これに（１）０．１
〜１０ｍｇ／ｍｌのＡＴＰおよび１〜１００単位／ｍｌ
のガラクトキナーゼ〔ＥＣ．２．７．１．６〕（ガラク
トキナーゼ法）、（２）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＮＡ
Ｄおよび１〜１００単位／ｍｌのガラクトースデヒドロ
ゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８〕（ＮＡＤ依存性ガ
ラクトースデヒドロゲナーゼ法）、（３）０．１〜１０
ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰおよび１〜１００単位／ｍｌのガ
ラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．１２
０〕（ＮＡＤＰ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ
法）または（４）酸素存在下に、１〜１００単位／ｍｌ
のガラクトースオキシダーゼ〔ＥＣ．１．１．３．９〕
（ガラクトースオキシダーゼ法）を加え、５〜４０℃で
１〜３０分間、好ましくは３〜１０分間反応させる。以
上の酵素および基質はいずれも市販されており容易に入
手できる。
【００１０】緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液、グッドの緩衝液等があげられ、ｐＨは５〜１
０である。該緩衝液には必要により、塩化ナトリウム等
の塩、アルブミン等の安定化剤、マンガン、マグネシウ
ム、コバルト等の金属を加えてもよい。またガラクトー
スオキシダーゼにおける酸素は通常は緩衝液中の溶存酸
素を用いるが、必要に応じ通気により供給してもよい。
酸緩衝液、グッドの緩衝液等があげられ、ｐＨは５〜１
０である。該緩衝液には必要により、塩化ナトリウム等
の塩、アルブミン等の安定化剤、マンガン、マグネシウ
ム、コバルト等の金属を加えてもよい。またガラクトー
スオキシダーゼにおける酸素は通常は緩衝液中の溶存酸
素を用いるが、必要に応じ通気により供給してもよい。
【００１１】試料中のガラクトースは、上述の酵素反応
のうちガラクトキナーゼ法によりガラクトース−１−リ
ン酸、ＮＡＤ依存性またはＮＡＤＰ依存性ガラクトース
デヒドロゲナーゼ法によりガラクトノ−１，４−ラクト
ン、ガラクトースオキシダーゼ法によりガラクト−ヘキ
ソジアルドースに変換される。またガラクトキナーゼ法
の系においては、ピルビン酸キナーゼ（０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ）とホスホエノールピルベート（０．１〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ）〔特開平２−１０４２９８号公報〕またはク
レアチンキナーゼ（１〜１００Ｕ／ｍｌ）等ＡＴＰの生
成系を添加することにより反応液中にＡＴＰを生成さ
せ、ＡＴＰの添加量を抑制することができる。
のうちガラクトキナーゼ法によりガラクトース−１−リ
ン酸、ＮＡＤ依存性またはＮＡＤＰ依存性ガラクトース
デヒドロゲナーゼ法によりガラクトノ−１，４−ラクト
ン、ガラクトースオキシダーゼ法によりガラクト−ヘキ
ソジアルドースに変換される。またガラクトキナーゼ法
の系においては、ピルビン酸キナーゼ（０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ）とホスホエノールピルベート（０．１〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ）〔特開平２−１０４２９８号公報〕またはク
レアチンキナーゼ（１〜１００Ｕ／ｍｌ）等ＡＴＰの生
成系を添加することにより反応液中にＡＴＰを生成さ
せ、ＡＴＰの添加量を抑制することができる。
【００１２】該酵素反応によりガラクトースを消去した
後、試料中の定量すべき成分の定量に必要な試薬を加え
て、生成した成分を定量するか、反応前試料中に存在し
た成分の変化を定量することによって目的の成分を定量
できる。
後、試料中の定量すべき成分の定量に必要な試薬を加え
て、生成した成分を定量するか、反応前試料中に存在し
た成分の変化を定量することによって目的の成分を定量
できる。
【００１３】また該酵素反応と特開平２−１０４２９８
号公報等に開示されているグルコースの消去法またはグ
ルコースにＡＴＰの存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホヘ
キソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナー
ゼを作用させてグルコースをフラクトース−１，６−二
リン酸に変換する方法（ヘキソキナーゼ法）を併用し
て、試料中のガラクトースおよびグルコースを消去した
後に、目的の成分を定量することもできる。
号公報等に開示されているグルコースの消去法またはグ
ルコースにＡＴＰの存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホヘ
キソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナー
ゼを作用させてグルコースをフラクトース−１，６−二
リン酸に変換する方法（ヘキソキナーゼ法）を併用し
て、試料中のガラクトースおよびグルコースを消去した
後に、目的の成分を定量することもできる。
【００１４】ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去
を実施するに際しては、グルコースが共存する試料にア
デノシン三リン酸、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソース
イソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼを加
え、要すればマグネシウム塩の存在下に、１５−５０℃
で１分−３０分、好ましくは３分−１０分反応させる。
を実施するに際しては、グルコースが共存する試料にア
デノシン三リン酸、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソース
イソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼを加
え、要すればマグネシウム塩の存在下に、１５−５０℃
で１分−３０分、好ましくは３分−１０分反応させる。
【００１５】該反応における酵素およびその使用量は、
ヘキソキナーゼとして、ヘキソキナーゼ（ＥＣ．２．
７．１．１）またはヘキソキナーゼ タイプＩＶ〔グル
コキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．２）〕を０．５−５０
Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼとして、Ｄ−
グルコース−６−ホスフェイトケトールイソメーラゼ
（ＥＣ．５．３．１．９）を１−１００Ｕ／ｍｌ、６−
ホスホフラクトキナーゼとして、ホスホヘキソキナーゼ
（ＥＣ．２．７．１．１１）を１−１００Ｕ／ｍｌ、が
用いられ、各酵素とも市販品が容易に入手可能である。
またＡＴＰは０．１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いる。
ヘキソキナーゼとして、ヘキソキナーゼ（ＥＣ．２．
７．１．１）またはヘキソキナーゼ タイプＩＶ〔グル
コキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．２）〕を０．５−５０
Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼとして、Ｄ−
グルコース−６−ホスフェイトケトールイソメーラゼ
（ＥＣ．５．３．１．９）を１−１００Ｕ／ｍｌ、６−
ホスホフラクトキナーゼとして、ホスホヘキソキナーゼ
（ＥＣ．２．７．１．１１）を１−１００Ｕ／ｍｌ、が
用いられ、各酵素とも市販品が容易に入手可能である。
またＡＴＰは０．１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いる。
【００１６】つぎに試料中の１，５−アンヒドログルシ
トールの定量について説明する。１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量はそれ自体公知の方法が何れも適用で
きる。例えば緩衝液中、１，５−アンヒドログルシトー
ルに酸化酵素を作用させて生成する過酸化水素と色源体
とをペルオキシダーゼの存在下に反応させ、生成する色
素により呈色する反応液の可視部の吸収を測定すること
により、１，５−アンヒドログルシトールを定量するこ
とができる。
トールの定量について説明する。１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量はそれ自体公知の方法が何れも適用で
きる。例えば緩衝液中、１，５−アンヒドログルシトー
ルに酸化酵素を作用させて生成する過酸化水素と色源体
とをペルオキシダーゼの存在下に反応させ、生成する色
素により呈色する反応液の可視部の吸収を測定すること
により、１，５−アンヒドログルシトールを定量するこ
とができる。
【００１７】本反応における酸化酵素（その使用量）と
しては、例えばソルボースオキシダーゼ（ＥＣ．１．
１．３．１１）（１０−１０００Ｕ／ｍｌ）、ピラノー
スオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．１０）（１−１０
０Ｕ／ｍｌ）が用いられる。ペルオキシダーゼ（ＥＣ．
１．１１．１．７）は１−１００Ｕ／ｍｌの濃度で用い
られる。緩衝液の種類およびｐＨは前記と同義である。
しては、例えばソルボースオキシダーゼ（ＥＣ．１．
１．３．１１）（１０−１０００Ｕ／ｍｌ）、ピラノー
スオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．１０）（１−１０
０Ｕ／ｍｌ）が用いられる。ペルオキシダーゼ（ＥＣ．
１．１１．１．７）は１−１００Ｕ／ｍｌの濃度で用い
られる。緩衝液の種類およびｐＨは前記と同義である。
【００１８】色源体はペルオキシダーゼの存在下に酸化
されて発色する化合物であれば何れも用いることができ
る。例えば、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもし
くはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカ
ップリング系が使用できる。好ましくは生成する色素の
感度の高いものが良く、例えば２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビ
ス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメ
チルアミノフェニル〕アミン（以下ＢＣＭＡと略す）
〔特開昭５９−１８２３６１号公報〕、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチル
アミノフェニル〕アミン〔特開昭５９−１８２３６１号
公報〕、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメ
チルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＭＣＤＰと
略す）〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕、１０−Ｎ
−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＣＣＡＰと略す）
〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕が使用できる。使
用する色源体の量は過酸化水素と等モル量−１０００倍
モル量を用いる。
されて発色する化合物であれば何れも用いることができ
る。例えば、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもし
くはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカ
ップリング系が使用できる。好ましくは生成する色素の
感度の高いものが良く、例えば２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビ
ス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメ
チルアミノフェニル〕アミン（以下ＢＣＭＡと略す）
〔特開昭５９−１８２３６１号公報〕、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチル
アミノフェニル〕アミン〔特開昭５９−１８２３６１号
公報〕、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメ
チルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＭＣＤＰと
略す）〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕、１０−Ｎ
−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＣＣＡＰと略す）
〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕が使用できる。使
用する色源体の量は過酸化水素と等モル量−１０００倍
モル量を用いる。
【００１９】反応温度は１５−５０℃で、反応時間は３
−３０分、好ましくは５−１０分である。
−３０分、好ましくは５−１０分である。
【００２０】以下に試験例で本発明の効果を示す。 試験例１ 精製水、１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌ
またはガラクトース１００ｍｇ／ｄｌを添加した１，５
−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌの３種類の溶液
を検体として、実施例１，３，５および７に示したガラ
クトキナーゼ法とヘキソキナーゼ法の併用、ＮＡＤガラ
クトースデヒドロゲナーゼ法とヘキソキナーゼ法の併
用、ＮＡＤＰガラクトースデヒドロゲナーゼ法とヘキソ
キナーゼ法の併用またはガラクトースオキシダーゼ法と
ヘキソキナーゼ法の併用により１，５−アンヒドログル
シトール量を定量した。また、比較対照として実施例１
の試薬液１からガラクトキナーゼを除く以外は実施例１
と同様の方法により（ヘキソキナーゼ法単独）定量をお
こなった。結果を第１表に示す。
またはガラクトース１００ｍｇ／ｄｌを添加した１，５
−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌの３種類の溶液
を検体として、実施例１，３，５および７に示したガラ
クトキナーゼ法とヘキソキナーゼ法の併用、ＮＡＤガラ
クトースデヒドロゲナーゼ法とヘキソキナーゼ法の併
用、ＮＡＤＰガラクトースデヒドロゲナーゼ法とヘキソ
キナーゼ法の併用またはガラクトースオキシダーゼ法と
ヘキソキナーゼ法の併用により１，５−アンヒドログル
シトール量を定量した。また、比較対照として実施例１
の試薬液１からガラクトキナーゼを除く以外は実施例１
と同様の方法により（ヘキソキナーゼ法単独）定量をお
こなった。結果を第１表に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】第１表によれば、ガラクトース存在下では
本発明方法のみで正確に１，５−アンヒドログルシトー
ル量を定量できることがわかる。
本発明方法のみで正確に１，５−アンヒドログルシトー
ル量を定量できることがわかる。
【００２３】試験例２ 精製水、１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌ
またはガラクトース１００ｍｇ／ｄｌを添加した１，５
−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌの３種類の溶液
を検体として、実施例１３〜１６に示したガラクトキナ
ーゼ法、ＮＡＤガラクトースデヒドロゲナーゼ法、ＮＡ
ＤＰガラクトースデヒドロゲナーゼ法またはガラクトー
スオキシダーゼ法により１，５−アンヒドログルシトー
ル量を定量した。また比較対照として実施例１３の試薬
液３からガラクトキナーゼ、ＡＴＰおよび塩化マグネシ
ウムを除く以外は実施例１３と同様の方法により定量を
おこなった。結果を第２表に示す。
またはガラクトース１００ｍｇ／ｄｌを添加した１，５
−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌの３種類の溶液
を検体として、実施例１３〜１６に示したガラクトキナ
ーゼ法、ＮＡＤガラクトースデヒドロゲナーゼ法、ＮＡ
ＤＰガラクトースデヒドロゲナーゼ法またはガラクトー
スオキシダーゼ法により１，５−アンヒドログルシトー
ル量を定量した。また比較対照として実施例１３の試薬
液３からガラクトキナーゼ、ＡＴＰおよび塩化マグネシ
ウムを除く以外は実施例１３と同様の方法により定量を
おこなった。結果を第２表に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】第２表によれば、ガラクトース存在下では
本発明方法のみで正確に１，５−アンヒドログルシトー
ル量を定量できることがわかる。以下に本発明の実施例
を示す。
本発明方法のみで正確に１，５−アンヒドログルシトー
ル量を定量できることがわかる。以下に本発明の実施例
を示す。
【００２６】
実施例１ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とガラクト
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用。）下記成
分を含有する試薬液を調製し、以下の反応に用いた。
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用。）下記成
分を含有する試薬液を調製し、以下の反応に用いた。
【００２７】試薬液１ ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍｌ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ガラクトキナーゼ ２０単位／ｍｌ ＡＴＰ ５ｍｇ／ｍｌ 塩化マグネシウム ４．９ｍＭ ヘキソキナーゼ ３．２単位／ｍｌ ホスホヘキソースイソメラーゼ ２０単位／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナーゼ ２０単位／ｍｌ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ
【００２８】試薬液２ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ２０ｍｌ フェノール ０．１ｍｇ／ｍｌ ピラノースオキシダーゼ １００単位／ｍｌ ＢＣＭＡ ０．１ｍｇ／ｍｌ
【００２９】１，５−アンヒドログルシトール標準液
（シグマ社製）を精製水で希釈し、５，２，１，０．５
および０．２５ｍｇ／ｄｌの１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液またはブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた
後、試薬液２を０．７５ｍｌ加え、３７℃で５分間反応
させ、７５５ｎｍでの吸光度変化を測定した。得られた
検量線を図１に示す。
（シグマ社製）を精製水で希釈し、５，２，１，０．５
および０．２５ｍｇ／ｄｌの１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液またはブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた
後、試薬液２を０．７５ｍｌ加え、３７℃で５分間反応
させ、７５５ｎｍでの吸光度変化を測定した。得られた
検量線を図１に示す。
【００３０】実施例２ １，５−アンヒドログルシトール２．５３ｍｇ／ｄｌ
（カラムを用いた比色法により定量）を含む血清を１，
５−アンヒドログルシトール標準液希釈液の代わりに用
いる以外は実施例１と同様にして、７５５ｎｍでの吸光
度変化を測定した。血清中の１，５−アンヒドログルシ
トール量を、得られた吸光度変化と実施例１で得た検量
線から算出したところ２．５６ｍｇ／ｄｌであった。
（カラムを用いた比色法により定量）を含む血清を１，
５−アンヒドログルシトール標準液希釈液の代わりに用
いる以外は実施例１と同様にして、７５５ｎｍでの吸光
度変化を測定した。血清中の１，５−アンヒドログルシ
トール量を、得られた吸光度変化と実施例１で得た検量
線から算出したところ２．５６ｍｇ／ｄｌであった。
【００３１】実施例３ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とＮＡＤ依
存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法によるガラクトー
スの消去を併用。）ガラクトキナーゼの代わりに５単位
／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．
１．１．４８〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤを用いる以
外は実施例１と同様の方法により検量線を求めた。得ら
れた検量線を図２に示す。
存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法によるガラクトー
スの消去を併用。）ガラクトキナーゼの代わりに５単位
／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．
１．１．４８〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤを用いる以
外は実施例１と同様の方法により検量線を求めた。得ら
れた検量線を図２に示す。
【００３２】実施例４ 実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログルシト
ール量を実施例３の方法で求めたところ２．５４ｍｇ／
ｄｌであった。
ール量を実施例３の方法で求めたところ２．５４ｍｇ／
ｄｌであった。
【００３３】実施例５ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とＮＡＤＰ
依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法によるガラクト
ースの消去を併用。）ガラクトキナーゼの代わりに５単
位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．
１．１．１２０〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰを用い
る以外は実施例１と同様の方法により検量線を求めた。
得られた検量線を図３に示す。
依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法によるガラクト
ースの消去を併用。）ガラクトキナーゼの代わりに５単
位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．
１．１．１２０〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰを用い
る以外は実施例１と同様の方法により検量線を求めた。
得られた検量線を図３に示す。
【００３４】実施例６ 実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログルシト
ール量を実施例５の方法で求めたところ２．５５ｍｇ／
ｄｌであった。
ール量を実施例５の方法で求めたところ２．５５ｍｇ／
ｄｌであった。
【００３５】実施例７ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とガラクト
ースオキシダーゼ法によるガラクトースの消去を併
用。）ガラクトキナーゼの代わりに２０単位／ｍｌのガ
ラクトースオキシダーゼを用いる以外は実施例１と同様
の方法により検量線を求めた。得られた検量線を図４に
示す。
ースオキシダーゼ法によるガラクトースの消去を併
用。）ガラクトキナーゼの代わりに２０単位／ｍｌのガ
ラクトースオキシダーゼを用いる以外は実施例１と同様
の方法により検量線を求めた。得られた検量線を図４に
示す。
【００３６】実施例８ 実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログルシト
ール量を実施例７の方法で求めたところ２．６０ｍｇ／
ｄｌであった。
ール量を実施例７の方法で求めたところ２．６０ｍｇ／
ｄｌであった。
【００３７】実施例９ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とガラクト
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、ピルビ
ン酸キナーゼ反応にＡＴＰを連鎖させた場合。）ＡＴＰ
量を０．５ｍｇ／ｍｌに減じ、５単位／ｍｌのピルビン
酸キナーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのホスホエノールピルビ
ン酸を加える以外は実施例１と同様の方法により、実施
例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログルシトール
量を定量したところ、２．５５ｍｇ／ｍｌであった。
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、ピルビ
ン酸キナーゼ反応にＡＴＰを連鎖させた場合。）ＡＴＰ
量を０．５ｍｇ／ｍｌに減じ、５単位／ｍｌのピルビン
酸キナーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのホスホエノールピルビ
ン酸を加える以外は実施例１と同様の方法により、実施
例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログルシトール
量を定量したところ、２．５５ｍｇ／ｍｌであった。
【００３８】実施例１０ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とガラクト
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、クレア
チンキナーゼ反応にＡＴＰを連鎖させた場合。）ＡＴＰ
量を０．５ｍｇ／ｍｌに減じ、１０単位／ｍｌのクレア
チンキナーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのクレアチンリン酸を
加える以外は実施例１と同様の方法により、実施例２で
用いた血清中の１，５−アンヒドログルシトール量を定
量したところ、２．５６ｍｇ／ｍｌであった。
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、クレア
チンキナーゼ反応にＡＴＰを連鎖させた場合。）ＡＴＰ
量を０．５ｍｇ／ｍｌに減じ、１０単位／ｍｌのクレア
チンキナーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのクレアチンリン酸を
加える以外は実施例１と同様の方法により、実施例２で
用いた血清中の１，５−アンヒドログルシトール量を定
量したところ、２．５６ｍｇ／ｍｌであった。
【００３９】実施例１１ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とガラクト
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、ＭＣＤ
Ｐを用いた場合。）ＢＣＭＡの代わりに０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＭＣＤＰを用いる以外は実施例１と同様の方法によ
り、実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログル
シトール量を定量したところ、２．５２ｍｇ／ｍｌであ
った。
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、ＭＣＤ
Ｐを用いた場合。）ＢＣＭＡの代わりに０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＭＣＤＰを用いる以外は実施例１と同様の方法によ
り、実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログル
シトール量を定量したところ、２．５２ｍｇ／ｍｌであ
った。
【００４０】実施例１２ （ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去とガラクト
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、ＣＣＡ
Ｐを用いた場合。）ＢＣＭＡの代わりに０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＣＣＡＰを用いる以外は実施例１と同様の方法によ
り、実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログル
シトール量を定量したところ、２．５４ｍｇ／ｍｌであ
った。
キナーゼ法によるガラクトースの消去を併用し、ＣＣＡ
Ｐを用いた場合。）ＢＣＭＡの代わりに０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＣＣＡＰを用いる以外は実施例１と同様の方法によ
り、実施例２で用いた血清中の１，５−アンヒドログル
シトール量を定量したところ、２．５４ｍｇ／ｍｌであ
った。
【００４１】実施例１３ （ガラクトキナーゼ法によるガラクトースの消去。）下
記成分を含有する試薬液を調製し、以下の反応に用い
た。
記成分を含有する試薬液を調製し、以下の反応に用い
た。
【００４２】試薬液３ ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍｌ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ガラクトキナーゼ ２０単位／ｍｌ ＡＴＰ ５ｍｇ／ｍｌ 塩化マグネシウム ４．９ｍＭ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ
【００４３】試薬液４ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０） ２０ｍｌ フェノール ０．１ｍｇ／ｍｌ ピラノースオキシダーゼ １００単位／ｍｌ ＢＣＭＡ ０．１ｍｇ／ｍｌ
【００４４】１，５−アンヒドログルシトール標準液
（シグマ社製）を精製水で希釈し、（５，２，１，０．
５，０．２５ｍｇ／ｄｌ）の１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液またはブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
３を２．２５ｍｌ加え、ガラクトース消去用酵素を３７
℃で１０分間反応させた後、試薬液４を０．７５ｍｌ加
え１，５−アンヒドログルシトール定量用酵素を３７℃
で５分間反応させ、７５５ｎｍでの吸光度変化を測定し
た。得られた検量線を図５に示す。
（シグマ社製）を精製水で希釈し、（５，２，１，０．
５，０．２５ｍｇ／ｄｌ）の１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液またはブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
３を２．２５ｍｌ加え、ガラクトース消去用酵素を３７
℃で１０分間反応させた後、試薬液４を０．７５ｍｌ加
え１，５−アンヒドログルシトール定量用酵素を３７℃
で５分間反応させ、７５５ｎｍでの吸光度変化を測定し
た。得られた検量線を図５に示す。
【００４５】実施例１４ （ＮＡＤ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法による
ガラクトースの消去。）ガラクトキナーゼの代わりに５
単位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．
１．１．１．４８〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤを用い
る以外は実施例１３と同様の方法により検量線を求め
た。得られた検量線を図６に示す。
ガラクトースの消去。）ガラクトキナーゼの代わりに５
単位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．
１．１．１．４８〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤを用い
る以外は実施例１３と同様の方法により検量線を求め
た。得られた検量線を図６に示す。
【００４６】実施例１５ （ＮＡＤＰ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法によ
るガラクトースの消去。）ガラクトキナーゼの代わりに
５単位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．
１．１．１．１２０〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰを
用いる以外は実施例１３と同様の方法により検量線を求
めた。得られた検量線を図７に示す。
るガラクトースの消去。）ガラクトキナーゼの代わりに
５単位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．
１．１．１．１２０〕および５ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰを
用いる以外は実施例１３と同様の方法により検量線を求
めた。得られた検量線を図７に示す。
【００４７】実施例１６ （ガラクトースオキシダーゼ法によるガラクトースの消
去。）ガラクトキナーゼの代わりに２０単位／ｍｌのガ
ラクトースオキシダーゼを用いる以外は実施例１３と同
様の方法により検量線を求めた。得られた検量線を図８
に示す。
去。）ガラクトキナーゼの代わりに２０単位／ｍｌのガ
ラクトースオキシダーゼを用いる以外は実施例１３と同
様の方法により検量線を求めた。得られた検量線を図８
に示す。
【００４８】
【発明の効果】本発明により、ガラクトースを含む試料
において、ガラクトースにも反応する酵素を用いた物質
を正確に定量する方法が提供される。
において、ガラクトースにも反応する酵素を用いた物質
を正確に定量する方法が提供される。
【図１】 ヘキソキナーゼ法併用下のガラクトキナーゼ
法による１，５−アンヒドログルシトールの検量線。
法による１，５−アンヒドログルシトールの検量線。
【図２】 ヘキソキナーゼ法併用下のＮＡＤ依存性ガラ
クトースデヒドロゲナーゼ法による１，５−アンヒドロ
グルシトールの検量線。
クトースデヒドロゲナーゼ法による１，５−アンヒドロ
グルシトールの検量線。
【図３】 ヘキソキナーゼ法併用下のＮＡＤＰ依存性ガ
ラクトースデヒドロゲナーゼ法による１，５−アンヒド
ログルシトールの検量線。
ラクトースデヒドロゲナーゼ法による１，５−アンヒド
ログルシトールの検量線。
【図４】 ヘキソキナーゼ法併用下のガラクトースオキ
シゲナーゼ法による１，５−アンヒドログルシトールの
検量線。
シゲナーゼ法による１，５−アンヒドログルシトールの
検量線。
【図５】 ガラクトキナーゼ法による１，５−アンヒド
ログルシトールの検量線。
ログルシトールの検量線。
【図６】 ＮＡＤ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ
法による１，５−アンヒドログルシトールの検量線。
法による１，５−アンヒドログルシトールの検量線。
【図７】 ＮＡＤＰ依存性ガラクトースデヒドロゲナー
ゼ法による１，５−アンヒドログルシトールの検量線。
ゼ法による１，５−アンヒドログルシトールの検量線。
【図８】 ガラクトースオキシゲナーゼ法による１，５
−アンヒドログルシトールの検量線。
−アンヒドログルシトールの検量線。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−104298（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−185397（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−141892（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−69199（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−79780（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66
Claims (14)
- 【請求項１】 試料中のガラクトースに、ガラクトキナ
ーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼおよびガラクトー
スオキシダーゼからなる群より選ばれるガラクトースを
基質とする酵素を作用させ試料中のガラクトースを消去
した後、試料中の１，５−アンヒドログルシトールを酵
素反応を利用して定量する方法。 - 【請求項２】 アデノシン三リン酸の存在下にガラクト
キナーゼを作用させてガラクトースを消去する請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の
存在下にガラクトースデヒドロゲナーゼを作用させてガ
ラクトースを消去する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 ガラクトースオキシダーゼを作用させて
ガラクトースを消去する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 １，５−アンヒドログルシトールの定量
が１，５−アンヒドログルシトールに酸化酵素を作用さ
せ、基質もしくは生成する物質の変化を定量することに
よって行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 酸化酵素が、ソルボースオキシダーゼま
たはピラノースオキシダーゼである請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 アデノシン三リン酸の存在下、ヘキソキ
ナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホス
ホフラクトキナーゼを作用させ試料中のグルコースを消
去する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 ガラクトキナーゼ、ガラクトースデヒド
ロゲナーゼおよびガラクトースオキシダーゼからなる群
より選ばれるガラクトースを基質とする酵素および１，
５−アンヒドログルシトール定量用酵素を含有する１，
５−アンヒドログルシトール定量用試薬。 - 【請求項９】 ガラクトースを基質とする酵素がガラク
トキナーゼであり、アデノシン三リン酸を含有する請求
項８記載の試薬。 - 【請求項１０】 ガラクトースを基質とする酵素がガラ
クトースデヒドロゲナーゼであり、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸を含有する請求項８記載の試薬。 - 【請求項１１】 ガラクトースを基質とする酵素がガラ
クトースオキシダーゼである請求項８記載の試薬。 - 【請求項１２】 １，５−アンヒドログルシトール定量
用酵素が１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素であ
る請求項８〜１１のいずれかに記載の試薬。 - 【請求項１３】 １，５−アンヒドログルシトール酸化
酵素が、ソルボースオキシダーゼまたはピラノースオキ
シダーゼである請求項１２記載の試薬。 - 【請求項１４】 アデノシン三リン酸、ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフ
ラクトキナーゼを含有する請求項８〜１３のいずれかに
記載の試薬。
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|---|---|---|---|
| JP01192593A JP3170377B2 (ja) | 1993-01-27 | 1993-01-27 | 物質の測定法 |
| EP94100933A EP0608795A1 (en) | 1993-01-27 | 1994-01-24 | Method for enzymatic determination of substrate after enzymatically removing galactose |
| US08/186,045 US5426033A (en) | 1993-01-27 | 1994-01-25 | Method for enzymatic determination of substrate after enzymatically removing galactose |
| CA002114199A CA2114199A1 (en) | 1993-01-27 | 1994-01-25 | Method for enzymatic determination of substrate after enzymatically removing galactose |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01192593A JP3170377B2 (ja) | 1993-01-27 | 1993-01-27 | 物質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06217799A JPH06217799A (ja) | 1994-08-09 |
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Family
ID=11791267
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01192593A Expired - Fee Related JP3170377B2 (ja) | 1993-01-27 | 1993-01-27 | 物質の測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5426033A (ja) |
| EP (1) | EP0608795A1 (ja) |
| JP (1) | JP3170377B2 (ja) |
| CA (1) | CA2114199A1 (ja) |
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| US5871949A (en) * | 1996-12-04 | 1999-02-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
| US20040018409A1 (en) * | 2002-02-28 | 2004-01-29 | Shiqiang Hui | Solid oxide fuel cell components and method of manufacture thereof |
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| JP5166284B2 (ja) * | 2006-12-14 | 2013-03-21 | 日本化薬株式会社 | 全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
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| ATE4328T1 (de) * | 1980-09-19 | 1983-08-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von glycerin. |
| JPS57163482A (en) * | 1981-03-31 | 1982-10-07 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | Novel yeast having specific saccharide utilization |
| AU590883B2 (en) * | 1985-05-28 | 1989-11-23 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
| DE3784610T2 (de) * | 1986-09-22 | 1993-09-23 | Nippon Kayaku Kk | Verfahren zur bestimmung von 1,5-anhydroglucitol und ausruestung dafuer. |
| JPH0771514B2 (ja) * | 1988-10-12 | 1995-08-02 | 天野製薬株式会社 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
| DE4242794A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Nitto Boseki Co Ltd | Quantitative automated determn. of 1,5-anhydro:glucitol - using pyranose oxidase from Basidiomycetes fungi no.52 |
| DE4321807C2 (de) * | 1992-06-30 | 1996-08-14 | Nitto Boseki Co Ltd | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol und Testpack |
-
1993
- 1993-01-27 JP JP01192593A patent/JP3170377B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
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