JP5280451B2 - 脱落膜由来幹細胞または脂肪由来幹細胞を含有する尿失禁の細胞治療剤 - Google Patents
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Description
本発明において使用された用語「幹細胞」とは、組織及び器官の特殊化された細胞を形成するように非制限的に再生可能なマスター細胞のことを言う。幹細胞は発達可能な万能性または多能性細胞である。幹細胞は2つの娘幹細胞、または一つの娘幹細胞と一つの由来(「転移」)細胞に***することができ、この後、組織の成熟で且つ完全な形態の細胞に増殖される。
胎盤は妊娠中に胎児のために生成されるものであり、一般的に重さ500g、直径15−20cm、厚さ2−3cm程度の円盤状となっている。胎盤の一方は母体と接しており、他方は胎児と接しており、その間の空間に母体の血液が入れられていて胎児に栄養分を供給することになる。胎盤は羊膜、絨毛膜及び脱落膜の3層から構成されている。羊膜は胎児を取り囲んでいる薄くて透明な膜であり、羊水が入れられており、羊膜には胎児の幹細胞が存在する。脱落膜は受精卵が子宮に着床されるために子宮の上皮細胞が変形されて形成された膜であって、母体の幹細胞が存在する。本発明においては前記脱落膜から幹細胞を分離した。
胎盤の脱落膜から分離された胎盤の脱落膜由来幹細胞は均質であり、しかも、無菌的である。なお、幹細胞はヒトに投与されるのに適した形態(すなわち、薬学的等級)で容易に得られる。
本発明の方法により得られた胎盤の脱落膜由来幹細胞は筋細胞への分化をはじめとする、特定の細胞系統(lineages)によって分化するように誘導可能である。特定の実施態様において、本発明の方法により得られた胎盤の脱落膜由来幹細胞は移植及び生体外処理プロトコールにおける使用のために分化するように誘導される。特定の実施態様において、本発明の方法により得られた胎盤の脱落膜由来幹細胞は特定細胞類型に分化するように誘導され、治療遺伝子生成物を提供するように遺伝子的に設計される。
本発明の胎盤の脱落膜由来幹細胞は、身体の組織または器官が、目的とする細胞集団、例えば、胎盤の脱落膜由来幹細胞または胎盤の脱落膜由来細胞集団の生着、移植または注入により強化、治療または代替される様々な種類の治療プロトコルに使用可能である。前記本発明の胎盤の脱落膜由来幹細胞は存在する組織を代替または強化させて、新規または変化された組織にしたり、生物学的組織または構造と結合することができる。
本発明の脂肪由来幹細胞は、ヒト脂肪組織の脂肪吸入術において付随的に得られる脂肪組織から純粋に分離してフラスコ培養容器に付着して生長する脂肪由来間葉幹細胞から得られる。
(a)CD73、CD90、CD29、CD44及びCD105に対していずれも陽性の免疫学的特性を示し、CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14及びHLA−DRに対していずれも陰性の免疫学的特性を示す。
(b)プラスチックに付着して成長し、紡錘状の形態学的特性を示し、CORM−2含有培地において球体を形成して未分化状態で長期間維持可能である。
本発明に係る胎盤の脱落膜由来幹細胞または脂肪由来幹細胞を含有する尿失禁細胞治療剤は、前記胎盤の脱落膜由来幹細胞または脂肪由来幹細胞が内尿道括約筋の機能向上を示す尿漏出圧上昇及び外尿道括約筋の機能向上を示す尿道括約筋の収縮力を増加させる原理に基づくものである。
胎盤の脱落膜とは、受精卵が子宮に着床されるために子宮の上皮細胞が変形されて形成された膜のことを言う。
(1)胎盤の脱落膜由来幹細胞の分離及び培養
本出願人の先特許出願(大韓民国公開特許10−2007−0101756A)に記載された下記の方法により胎盤から脱落膜を分離した。
この実施例において利用された脂肪由来幹細胞は本出願人の先特許出願(大韓民国登録特許第10−0679642号)に記載された方法によって分離された脂肪由来幹細胞であって、具体的には、脂肪吸入を通じて腹部から採取された脂肪組織を分離してPBSにより洗浄し、組織を細切した後、コラーゲン分解酵素タイプ1(1mg/mL)を添加したDMEM培地を用いて37℃において2時間かけて分解した。次に、PBSにより洗浄した後、1000rpmにて5分間遠心分離した。上澄液は除去し、底面に残留しているペレットはPBSにより洗浄した後、1000rpmにて5分間遠心分離した。100μmメッシュを用いて浮遊物を除去した後、PBSにより再洗浄した。DMEM培地において培養し、一晩経過後に培養容器の底面に付着した細胞はPBSにより洗浄し、ケラチノサイトSFM培地を2日おきに交替しながら培養して多分化能幹細胞を分離した。
前記分離されたヒト胎盤の脱落膜由来多能性幹細胞の増殖方法により得られた幹細胞の増殖率を調査した。それぞれ異なるヒト個体の胎盤の脱落膜サンプルから採取した胎盤の脱落膜由来幹細胞を実施例1の分離方法と同様にして得た後、75フラスコに2x105ずつ接種した。
CPDL=ln(Nf/Ni)/ln2
(Ni=初期に接種した細胞数、Nf=最終細胞数)
の式により表わすことができる。
実施例1において得られた胎盤の脱落膜由来多能性幹細胞をPBSにより洗浄し、トリプシン処理した後、細胞を回収して5分間1000rpmにて遠心分離した。上澄液を捨て、5%FBS及びPBSの混合液を入れて洗浄した後、1000rpmにて5分間遠心分離した。上澄液を捨てた後、細胞をPBSに浮遊させてサンプル数に見合う分だけ1x105細胞を分注した。各ウェルに抗体(R−phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)を入れ、4℃において40分間インキュベーションした。インキュベーション後に1000rpmにて5分間遠心分離した。上澄液を除去した後にPBSにより洗浄し、1000rpmにて5分間遠心分離した。再度、前記上澄液除去後にPBSにより洗浄し、1000rpmにて5分間遠心分離する過程を繰り返し行った。上澄液を除去した後に1%パラホルムアルデヒドを入れてシングル化し、フローサイトメータを用いて分析した。その結果、表1に示すように、本発明の胎盤の脱落膜由来幹細胞はCD29、CD90、Oct−4、SSEA−4及びクリプト−1に対していずれも陽性の免疫学的特性を示し、CD31及びCD45に対していずれも陰性の免疫学的特性を示すことが分かる(図4)。
前記実施例1において得られた胎盤の脱落膜由来幹細胞をPBSにより3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSにより30分間固定した。PBSにより3回洗浄した後、0.1%トリトンX100を含有するPBSにより10分間浸透させる。PBSにより3回洗浄した後、ブロッキングバッファ(5%山羊血清)を処理して4℃において1時間かけて反応させ、一次抗体を含有するブロッキングバッファに一晩反応させる。PBSにより3回洗浄し、2次抗体により暗室において1時間かけて反応させた。PBSにより3回洗浄した後にマウントした。その結果、図5に示すように、本発明に係る分化能幹細胞はヒト胚幹細胞のマーカーであるOct4とSSEA−4に対して陽性反応を示した。
実施例1において得られた胎盤の脱落膜由来多能性幹細胞を10ng/mLフィブロネクチンがコーティングされているフラスコに分注した後に10μM5’−アザサイチジンを用いて24時間かけて前処理を行う。前処理後にSKBM培地(Cambrex, Co.)を用いて10日間培養した後に免疫染色を実施した。
1)実験群動物モデルの準備
胎盤の脱落膜由来幹細胞が尿漏出圧に及ぼす影響を測定するための動物実験を実施するために、雌性ヌードマウス56匹を使用した。前記56匹の雌性ヌードマウスをそれぞれ正常群14匹(n=14)、対照群(陰部神経切断群)14匹(n=14)、及び実験群1(陰部神経切断2週後に胎盤の脱落膜由来幹細胞105細胞を注入した群)14匹(n=14)と実験群2(陰部神経切断2週後に胎盤の脱落膜由来幹細胞107細胞を注入した群)14匹(n=14)に分けて実験を実施した。このとき、それぞれの群はさらに4週群7匹(n=7)及び8週群7匹(n=7)に分けて、4週及び8週に尿漏出圧を測定した。
前記雌性ヌードマウスをウレタン(1.2g/kg)により麻酔させ、T9−T10レベルにおいて脊髄切断を行った後、下腹部に縦切開を入れることにより、膀胱を剥離したPE−90カテーテルを用いて恥骨上部膀胱瘻形成術を行った。
1)実験群動物モデルの準備
脂肪由来幹細胞が尿漏出圧に及ぼす影響を測定するための動物実験を実施するために、雌性ヌードマウス56匹を使用した。前記56匹の雌性ヌードマウスをそれぞれ正常群14匹(n=14)、対照群(陰部神経切断群)14匹(n=14)、及び実験群1(陰部神経切断2週後に脂肪由来幹細胞105細胞を注入した群)14匹(n=14)と実験群2(陰部神経切断2週後に脂肪由来幹細胞107細胞を注入した群)14匹(n=14)に分けて実験を実施した。このとき、それぞれの群はさらに4週群7匹(n=7)及び8週群7匹(n=7)に分けて、4週及び8週に尿漏出圧を測定した。
前記雌性ヌードマウスをウレタン(1.2g/kg)により麻酔させ、T9−T10レベルにおいて脊髄切断を行った後、下腹部に縦切開を入れることにより、膀胱を剥離したPE−90カテーテルを用いて恥骨上部膀胱瘻形成術を行った。
1)実験群動物モデルの準備
胎盤の脱落膜由来幹細胞が尿道括約筋の収縮力に及ぼす影響を測定するための動物実験を実施するために、雄性マウス56匹を使用した。前記56匹の雄性マウスをそれぞれ正常群14匹(n=14)、対照群(陰部神経切断群)14匹(n=14)、及び実験群1(陰部神経切断2週後に胎盤の脱落膜由来幹細胞105細胞を注入した群)14匹(n=14)と実験群2(陰部神経切断2週後に胎盤の脱落膜由来幹細胞107細胞を注入した群)14匹(n=14)に分けて実験を実施した。このとき、それぞれの群はさらに4週群7匹(n=7)及び8週群7匹(n=7)に分けて、4週及び8週に尿道括約筋の収縮力を測定した。
前記雄性マウスの尿道をそれぞれ得た後に螺旋状に尿道を切開して尿道組織断片(102mm)を準備した。器官浴(organ bath)実験においてバーティカルチャンバー(体積20mL)にCO2/重炭酸塩容器緩衝液(bicarbonate buffered Tyrode solution)を満たした後、尿道組織断片を固定し、その後、アセチルコリン薬物を用いて尿道括約筋収縮力を調べてた(図12)。
1)実験群動物モデルの準備
脂肪由来幹細胞が尿道括約筋の収縮力に及ぼす影響を測定するための動物実験を実施するために、雄性マウス56匹を使用した。前記56匹の雄性マウスをそれぞれ正常群14匹(n=14)、対照群(陰部神経切断群)14匹(n=14)、及び実験群1(陰部神経切断2週後に脂肪由来幹細胞105細胞を注入した群)14匹(n=14)と実験群2(陰部神経切断2週後に脂肪由来幹細胞107細胞を注入した群)14匹(n=14)に分けて実験を実施した。このとき、それぞれの群はさらに4週群7匹(n=7)及び8週群7匹(n=7)に分けて、4週及び8週に尿道括約筋の収縮力を測定した。
前記雄性マウスの尿道をそれぞれ得た後に螺旋状に尿道を切開して尿道組織断片(102mm)を準備した。器官浴実験においてバーティカルチャンバー(体積20mL)にCO2/重炭酸塩容器緩衝液を満たし、尿道組織断片を固定した後、アセチルコリン薬物を用いて尿道括約筋収縮力を調べてた(図12)。
前記実施例6及び8に従い4週及び8週に尿漏出圧及び尿道括約筋収縮力を測定した後、それぞれの尿道組織を採取して液化窒素において既に冷却された2−メチルブタンを用いて組織の損傷なしに冷凍した。尿道組織を冷却切片した後にH/E染色を行い、幹細胞の平滑筋及び骨格筋への分化を観察するためにDAPI、筋肉アクチン(α−SMA)及びミオシン重鎖(MyHC)免疫染色を行って蛍光顕微鏡により観察した。
前記実施例7及び9に従い4週及び8週に尿漏出圧及び尿道括約筋収縮力を測定した後、それぞれの尿道組織を採取して液化窒素において既に冷却された2−メチルブタンを用いて組織の損傷なしに冷凍させた。尿道組織を冷却切片した後にH/E染色を行い、幹細胞の平滑筋及び骨格筋への分化を観察するためにDAPI、筋肉アクチン(α−SMA)及びミオシン重鎖(MyHC)免疫染色を行って蛍光顕微鏡により観察した。
Claims (1)
- 胎盤若しくは生理血の脱落膜由来幹細胞を有効成分として含有する尿失禁細胞治療剤において、前記胎盤の脱落膜由来幹細胞は、以下の特性を表すことを特徴とする尿失禁細胞治療剤:
(a)CD29及びCD90に対して陽性の免疫学的特性を示し、CD31及びCD45に対して陰性の免疫学的特性を示す;
(b)Oct4、SSEA−4及びクリプト−1に対して陽性の免疫学的特性を示す;
(c)プラスチックに付着して成長し、円形または紡錘状の形態学的特性を示し、SFM培地において球体を形成して未分化状態で長期間維持可能である;及び
(d)筋細胞に分化する能力を有する。
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