KR100747637B1

KR100747637B1 - 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 오씨티-4 유전자 발현 억제용 이중나선 알엔에이

Info

Publication number: KR100747637B1
Application number: KR1020040096780A
Authority: KR
Inventors: 전진현; 김남형; 최혜원; 츄이시앙쑨; 정연복
Original assignee: 전진현; 김남형
Priority date: 2004-11-24
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2007-08-08
Also published as: KR20060057738A

Abstract

본 발명은 포유류 초기 배아 및 줄기세포의 미분화능 유지와 밀접한 관련이 있는 Oct-4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중나선의 RNA의 염기서열로서, 그 염기서열은 SEQ ID No.1-Sense RNA(5'-GAA CAU GUG UAA GCU GCG GTT-3') 와 상보적인 결합을 하는 SEQ ID No.2-Antisense RNA(5'-CCG CAG CUU ACA CAU GUU CTT-3')와 같다.

이들 두 단일나선의 RNA는 적절한 반응 조건에서 생리학적으로 안정적인 이중나선의 RNA를 형성한다. 현재까지 Oct-4 유전자는 초기 배아의 발생 및 분화과정과 배아줄기세포의 미분화능 유지에 있어 매우 중요한 유전자로 알려져 있다. 본 발명의 Oct-4-이중나선 RNA는 생쥐를 포함한 포유류의 초기 배아와 줄기세포에서 다른 유전자의 발현 양상에 영향을 주지 않으면서, 특이적으로 Oct-4 유전자의 단백질 합성을 전사 후 단계(post-transcriptional level)에서 억제할 수 있다. 이는 포유류 초기 배아의 발생 및 분화과정 조절과 배아줄기세포 또는 생식줄기세포의 효율적인 유도 분화에 이용될 수 있다.

포유류, 미분화능, 단백질 합성, Oct-4, 초기 배아, 배아줄기세포, 분화과정

Description

포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 오씨티-4 유전자 발현 억제용 이중나선 알엔에이{Double stranded RNA for inhibition of Oct-4 gene expression in mammalian embryos and stem cells}

도 1은 상단의 전사조절요소들을 포함한 Oct-4 유전자의 배치도이다.

도 2는 생쥐의 초기 배아에 Oct-4 이중나선 RNA를 주입한 후 Oct-4 유전자의 발현 억제효과를 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.

삭제

도 3은 생쥐의 초기 배아에 Oct-4 이중나선 RNA를 주입한 후 Oct-4 유전자의 발현 억제 효과를 세포면역염색방법으로 확인한 사진이다.

본 발명은 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 포유류 초기 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지와 밀접한 관련이 있는 Oct-4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중나선의 RNA로서, 생쥐를 포함한 포유류의 초기 배아와 줄기세포에서 다른 유전자의 발현 양상에 영향을 주지 않으면서, 특이적으로 Oct-4 단백질의 합성을 전사 후(post-transcriptional) 단계에서 억제할 수 있다. 이는 포유류 초기 배아 발생 및 분화과정의 조절과 배아줄기세포 또는 생식줄기세포의 효율적인 유도 분화에 이용할 수 있는 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA에 관한 것이다.

포유류 초기배아에서 특정 유전자의 기능을 확인하기 위하여 종래에는 형질전환 또는 유전자 적중 생쥐가 이용되어 왔으나, 고액의 비용과 장기간의 관찰이 필요하기 때문에 이에 대한 효율적인 개선이 요구되어 왔다. 이러한 단점을 극복하기 위한 대안으로 이중나선 RNA를 이용한 유전자 기능 연구가 시도되어 그 효용성이 확인되었다.

한편, 이중나선 RNA를 이용한 특정 유전자의 발현 억제는 최근에 그 작용 기작이 밝혀지면서 선충류, 초파리류, 어류, 포유류 등 여러 종류의 동물 모델에서 그 효과가 확인되었다.

특정 유전자의 발현을 억제하기 위해 고안되는 이중나선 RNA의 염기서열은 매우 다양하게 존재할 수 있으며, 그 발현 억제효과가 다양하게 나타날 수 있다. 또한, 이러한 이중나선 RNA는 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않고 특이적으로 해당 유전자의 발현을 억제해야 하므로 이중나선 RNA의 염기서열을 선정하는데 주의가 요구된다.

Oct-4 유전자는 초기 배아의 발생과정에서 태아를 형성하는 내세포괴를 형성하는데 필수적인 유전자이며, 생쥐 및 인간의 배아줄기세포의 분화과정에서 그 유전자 발현이 감소되어야 하는 중요한 유전자이다. 따라서 Oct-4 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있다면 미분화 줄기세포를 특정 세포로 분화시키는데 유용하게 이용될 수 있다. Oct-4 유전자는 생쥐와 사람의 발생 초기 단계에서 미분화 관련 유전자의 발현을 증가시켜 분화를 억제하는 기능이 있는 발현조절인자(transcription factor)로서, 4,600bp로 이루어지는데, 5개의 엑손(총 1,440bp)과 4개의 인트론으로 구성되어 있다. 도 1은 상단의 전사조절요소들을 포함한 Oct-4 유전자의 배치도로서, 여기에서 보면 Oct-4 유전자의 상단에는 PP (proximal promoter), PE (proximal enhancer), DE (distant enhancer) 등과 같은 전사조절요소들이 위치하고 있음을 알 수 있다.

이에 본 발명자들은 생쥐와 돼지를 포함한 포유류의 배아 및 줄기세포에서 미분화능 유지와 관련이 있는 Oct-4 유전자의 발현을 효과적으로 억제하여 줄기세포를 특정 세포로의 분화를 유도하는데 효과적으로 사용할 수 있음을 발견하고, 이를 위해 현재 보고되어 있는 생쥐, 돼지, 인간 Oct-4 유전자의 상동부위를 확인하고, 그 중에서 가장 효과적으로 Oct-4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 염기서열을 고안, 합성하고 그 기능을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 포유류 초기 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지와 밀접한 관련이 있는 Oct-4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중나선의 RNA로서, 생쥐를 포함한 포유류의 초기 배아와 줄기세포에서 다른 유전자의 발현 양상에 영향을 주지 않으면서, 특이적으로 Oct-4 단백질의 합성을 전사 후(post-transcriptional) 단계에서 억제할 수 있어 포유류 초기 배아 발생 및 분화과정의 조절과 배아줄기세포 또는 생식줄기세포의 효율적인 유도 분화에 이용할 수 있는 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA를 제공하는 데 있다.

본 발명에 따른 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA는, 하기의 염기서열을 포함하는 이중나선의 RNA이다.

SEQ ID No.1 - Sense RNA (5'-GAA CAU GUG UAA GCU GCG GTT-3')

SEQ ID No.2 - Antisense RNA (5'-CCG CAG CUU ACA CAU GUU CTT-3').

상기한 바의 염기서열을 갖는 각각의 단일나선 RNA를 미국의 Ambion사(Austin, Texas, USA)에 주문하여 화학적으로 합성된 단일나선의 RNA를 공급받았다. 이들 두 단일나선의 RNA를 annealing buffer (6 mM HEPES, 20 mM Potassium Acetate, 0.4 mM Magnesium Acetate)에 혼합하여 90℃에서 1 분, 다시 37℃에서 1시간 동안 처리하여 이중나선의 RNA를 생성하고, 이를 전기영동을 통해 확인한다. 이러한 Oct-4 유전자에 대한 이중나선 RNA는 세포내로 주입 또는 도입되었을 때 다른 유전자의 발현에는 영향을 주지 않고, Oct-4 유전자의 단백질 합성을 전사 후 단계에서 특이적으로 억제한다.

상기한 바의 염기서열은 첨부된 서열목록 1 내지 5에서와 같이 각각의 포유류 Oct-4 유전자 염기 서열에서 고안한 이중나선 RNA의 상동부위를 확인하였으며, 이로부터 이들 상동부위의 염기서열을 합성하였다. 이를 이용하면 포유류의 초기 배아와 줄기세포에서 다른 유전자의 발현 양상에 영향을 주지 않으면서 특이적으로 Oct-4 유전자의 단백질 합성을 전사 후 단계에서 억제할 수 있게 되었다. 이는 포유류 초기 배아의 발생 및 분화과정 조절과 배아줄기세포 또는 생식줄기세포의 효율적인 유도 분화에 이용될 수 있는 것이다.

특히, 본 발명에 따른 이중나선 RNA는 생쥐, 집쥐, 돼지, 소 및 인간을 포함한 대부분의 포유류에서 공통의 염기서열을 가지고 있기 때문에 대부분의 포유류에서 모두 효과적으로 사용이 가능하게 고안된 점을 특징으로 한다.

본 발명에서는 여러 종류의 염기서열 중에서 현재까지 보고된 바가 없는 포유류 배아 및 줄기세포에서 Oct-4 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 Oct-4 이중나선 RNA를 고안하였으며, 그 효과를 확인하기에 이른 것이다.

이렇게 고안된 Oct-4 이중나선 RNA를 생쥐의 수정란에 미세주입하여 다른 유전자의 발현에는 영향을 주지 않고 특이적으로 Oct-4 유전자의 발현이 억제되는 것 을 확인하였다. 따라서, 상기한 바의 본 발명에 따른 Oct-4 이중나선 RNA는 포유류 초기 배아의 발생 능력 조절과 현재 연구가 활발히 진행되고 있는 줄기세포의 유도분화에도 사용이 가능하며, 특히 동물 모델들의 세포에서 이용이 가능하다. 즉, 상기한 바의 본 발명에 따른 Oct-4 이중나선 RNA를 초기 배아에 미세주입하거나 미분화 줄기세포에 도입(transfection)시켜 분화를 촉진할 수 있으며, 미분화 줄기세포로부터 유도 분화된 신경세포, 췌장세포, 심근세포 등과 같은 특정세포들은 파킨슨 병, 당뇨병 또는 심근경색 등과 같은 난치병에서의 비정상세포 또는 퇴화세포를 대체할 수 있는 이식 가능한 세포치료제로서 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시 예 및 비교 예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안 될 것이다.

실시예 1

생쥐 및 인간을 포함한 포유류의 Oct-4 유전자에 대한 이중나선 RNA 염기서열의 고안

첨부된 서열목록에서와 같이 생쥐, 집쥐, 돼지, 소 및 인간 각각의 포유류 Oct-4 유전자 염기 서열에서 고안한 이중나선 RNA의 상동부위를 확인하여 밑줄로서 표시하였다.

실시예 2

생쥐 수정란에 Oct-4 이중나선 RNA의 미세주입 후 효과 확인

고안된 이중나선 RNA의 효용성을 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 과 배란 유도한 후 질전이 확인된 암컷 생쥐를 도살하여 난관을 적출하였다. 난관에서 수정된 1-세포기 배아를 수확하여 KSOM 배양액(Potassium simplex optimized medium)에서 체외배양 하였다. KSOM 배양액의 조성은 하기 표 1에 나타내었다.

성분	함량 (g/ℓ)
염화나트륨(NaCl)	5.55
염화칼륨(KCl)	0.186
인산이수소칼륨(KH₂PO₄)	0.0476
황산마그네슘(MgSO₄ㆍ7H₂O)	0.0493
글루코스(Glucose)	0.036
페니실린 지 칼륨염 (Penicillin G potassium salt)	0.060
스트렙토마이신 황산염 (Streptomycin sulfate)	0.050
락트산 소듐염(Sodium lactate)	1.12
탄산수소나트륨(NaHCO₃)	2.101
염화칼슘(CaCl₂ㆍ2H₂O)	0.252
피루브산 소듐염(Sodium pyruvate)	0.022
에틸렌디아민테트라아세트산나트륨 (Na₂EDTAㆍ2H₂O)	0.0038
엘-글루타민(L-Glutamine)	0.146
페놀레드(Phenol red)	0.001

고안된 이중나선 RNA를 미세조작기를 이용하여 1-세포기 배아에 미세주입 하였다. 미세주입한 배아와 대조군 배아를 포배기까지 체외배양 하여 Oct-4 유전자 발현 억제 효과를 역전사 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR ; Reverse Translation Polymerase chain reaction)과 면역화학염색법으로 확인하였으며, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2은 RT-PCR 방법으로 확인한 Oct-4 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다. 도 2에서 검정색 막대는 이중나선 RNA를 주입한 배아이고, 하얀색 막대는 대조군 배아에서의 RT-PCR 결과이다. 도 2의 a)는 이중나선 RNA를 주입한 배아에서 Oct-4 유전자의 발현이 통계적으로 유의하게(p<0.01) 감소함을 나타내고 있다.

도 2의 b)는 이중나선 RNA를 주입한 배아에서 이-카드헤린(E-cadherin) 유전자 발현이 감소되지 않았음을 나타내고 있다. 도 2의 c)는 이중나선 RNA를 주입한 배아에서 열충격 단백질 70.1(heat shock protein 70.1) 유전자의 발현이 감소되지 않았음을 나타내고 있다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, Oct-4 유전자의 발현만이 유의성 있게 감소하고, 여타 다른 유전자들의 발현에는 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

도 3은 면역세포 염색방법으로 확인한 Oct-4 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 사진이다. 도 3에서 핵은 붉은색으로 염색하였으며, Oct-4에 대한 항체를 이용하여 초록색으로 Oct-4 단백질의 발현을 관찰하였다. 대조군의 배아(A, a, C, c, E, e, G, g, J, j)와 이중 나선 RNA를 주입한 배아(B, b, D, d, F, f, H, h, K, k)를 비교하면 초록색으로 관찰되는 Oct-4 단백질의 발현이 이중 나선 RNA를 주입한 배아에서 현저하게 약하게 염색됨을 확인할 수 있다. 따라서, Oct-4 유전자의 발현만이 유의성 있게 감소하고, 여타 다른 유전자들의 발현에는 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

상기한 실시예들 및 그 결과들에 따르면, 본 발명은 포유류에 이용이 가능한 Oct-4 이중나선 RNA의 염기서열을 고안하고 이를 이용한 Oct-4 유전자의 선택적 발현 억제 효과를 확인할 수 있었으며, 그에 따라 본 발명은 포유류의 초기 배아와 줄기세포에서 다른 유전자의 발현 양상에 영향을 주지 않으면서, 특이적으로 Oct-4 단백질의 합성을 전사 후 단계에서 억제할 수 있으며, 이는 포유류 초기 배아 발생 및 분화과정의 조절과 배아줄기세포 또는 생식줄기세포의 특정 세포로의 효율적인 유도 분화에 이용할 수 있는 매우 유용한 발명인 것으로 고찰된다.

따라서 본 발명에 의하면 포유류 초기 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지와 밀접한 관련이 있는 Oct-4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 이중나선의 RNA로서, 생쥐를 포함한 포유류의 초기 배아와 줄기세포에서 다른 유전자의 발현 양상에 영향을 주지 않으면서, 특이적으로 Oct-4 단백질의 합성을 전사 후(post-transcriptional) 단계에서 억제할 수 있어 포유류 초기 배아 발생 및 분화과정의 조절과 배아줄기세포 또는 생식줄기세포의 효율적인 유도 분화에 이용할 수 있는 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA를 제공하는 효과가 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

상보결합을 하는 하기의 염기서열을 포함하고 있는 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA ;

SEQ ID No.1 - Sense RNA (5'-GAA CAU GUG UAA GCU GCG GTT-3')

SEQ ID No.2 - Antisense RNA(5'-CCG CAG CUU ACA CAU GUU CTT-3')

상보결합된 이중나선 RNA

5'- G A A C A U G U G U A A G C U G C G G T T - 3'

｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜

3'- TT C C G C A G C U U A C A C A U G U U C T T - 5' 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 오씨티-4 유전자 발현 억제용 이중나선 알엔에이.
삭제