CN101801352B - 用于治疗小便失禁的含有来自蜕膜或脂肪的干细胞的细胞治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗小便失禁的细胞治疗剂，具体涉及用于治疗小便失禁的含有来自胎盘或月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪组织的干细胞的细胞治疗剂。来自蜕膜的干细胞或者来自脂肪组织的干细胞显示出了使漏尿点压力增加和提高尿道***收缩性的作用，因此作为治疗小便失禁的试剂十分有用。

Description

用于治疗小便失禁的含有来自蜕膜或 脂肪的干细胞的细胞治疗剂
技术领域
本发明涉及用于治疗小便失禁的细胞治疗剂，更具体地，涉及含有来自胎盘或者月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪组织的干细胞的用于治疗小便失禁的细胞治疗剂。
背景技术
干细胞指的是不仅具有自我复制能力而且具有分化成至少两个细胞能力的细胞，它可以分为全能干细胞、多功能性干细胞和多潜能性干细胞。
全能干细胞是具有能够发育成一个完整个体的全能性质的细胞，并且在***和***受精之后直到8细胞阶段时细胞都具有这些特性。当这些细胞被分离并移植到子宫中时，它们可发育成一个完整个体。多功能性干细胞是来源于外胚层、中胚层和内胚层的能够发育成不同细胞和组织的细胞，多功能性干细胞来自于在受精4-5天之后产生的胚泡内的内细胞团。这些细胞被称为“胚胎干细胞”，并可分化成各种其他组织细胞，但不能形成新的生物体。多潜能性干细胞是这样的干细胞，其仅仅能够分化成针对含有这些细胞的组织和器官的细胞。
多潜能性干细胞首先从成人骨膜中分离(Y.Jiang等人，Nature，418：41，2002)，随后也在其他各种成人组织中发现(C.M.Verfaillie，Trends Cell Biol.，12：502，2002)。换言之，虽然骨膜是最广为人知的干细胞源，但是也在皮肤、血管、肌肉和大脑中发现了多潜能性干细胞(J.G.Tomas等人，Nat.Cell Biol.，3：778，2001；M.Sampaolesi等人，Science，301：487，2003；Y.Jiang等人，Exp.Hematol.，30：896，2002)。但是，在成人组织诸如骨膜中的干细胞非常少，并且在不诱导分化时这些细胞很难培养，从而在缺少专一性筛选培养基的情况下同样难以培养。也就是说，在体外保持分离的干细胞非常困难。
近来发现，脂肪组织成为多潜能性干细胞的新来源(B.Cousin等人，BBRC.，301：1016，2003；A.Miranville等人，Circulation，110：349，2004；S.Gronthos等人，J.Cell Physiol.，189：54，2001；M.J.Seo等人，BBRC.，328：258，2005)。即，据报道，通过抽脂术得到的人脂肪组织中含有一组未分化的细胞，其具有分化成脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞和成软骨细胞的能力(P.A.Zuk等人，Tissue Eng.，7：211，2001；A.M.Rodriguez等人，BBRC.，315：255，2004)。脂肪组织具有的优点在于它可以大量提取，因此它作为克服现有技术缺陷的新的干细胞源而引起注意。而且，近来使用动物模型实验的研究表明，来自脂肪组织的细胞具有再生肌肉和刺激神经血管分化的能力。因此，这些来自脂肪组织的细胞作为新的干细胞来源而受到关注。
本发明的发明人以前在含有胶原酶和bFGF的培养基中培养过精细切割的胎盘组织，从培养液中分离胎盘干细胞，然后使分离的干细胞分化成肌细胞、成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞和胰腺β细胞(韩国专利申请No.2007-0101756A)。
同时，女性的小便失禁是由尿道和膀胱的松垂引起的，这种松弛是由频繁生育和老化导致的***神经损伤引起的盆底肌肉弱化所造成的。目前，韩国女性小便失禁患者的数目大约为4,000,000-5,000,000，并且随着老龄妇女数目的迅速增加而逐年增加。因此，女性小便失禁正逐渐成为世界范围内的一个严重的社会问题。为了治疗小便失禁患者，使用了用于支持尿道和膀胱的注射治疗或者外科手术治疗。目前，作为侵入性方法的外科手术治疗具有的一个问题是会出现并发症，注射治疗具有的问题是由于其采用昂贵的物质，因此不容易应用于所有患者，并且其成功率仅为50-60％，从而再次需要注射和外科手术。
干细胞注射治疗不需要麻醉，并且干细胞可以很容易地注射到尿道***中。因此，如果干细胞注射治疗能够改善尿道***的收缩性并提高漏尿点的压力，则干细胞治疗可有利地用于治疗小便失禁。但是，目前还没有关于将干细胞用于治疗小便失禁的研究。
因此，本发明的发明人付出了许多努力来开发含有干细胞的用于治疗小便失禁的试剂，结果发现，来自胎盘蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞对于小便失禁的治疗是有效的，由此完成了本发明。
发明内容
因此本发明的主要目的在于提供用于治疗小便失禁的细胞治疗剂，其含有作为活性成分的来自胎盘或者月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞。
本发明的另一目的在于提供一种制备用于治疗小便失禁的细胞治疗剂的方法，所述细胞治疗剂含有作为活性成分的来自胎盘或者月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞。
本发明又一目的在于提供来自胎盘或者月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞在防止小便失禁上的用途。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明显。
附图简要说明
图1示出了来自胎盘蜕膜的间叶干细胞(MSC)的形态的显微照片。
图2示出了作为来自蜕膜的干细胞的传代数的函数的累计群体倍增水平(cumulative population doubling level，CPDL)的图表。
图3示出了形成球形的在SFM培养基中培养的第一代蜕膜细胞的照片。
图4示出了通过使用流式细胞仪(FACS)分析来自蜕膜的MSC表面抗原得到的结果的照片。
图5示出了使用标记抗体进行的免疫细胞化学分析结果的照片[A：OCT4；B：SSEA4；以及C：CD44，CD54和对照]。
图6示出了OCT4的RT-PCR结果[1道：标记物；2道：RT-反应对照；3道：羊膜干细胞；4道：来自蜕膜的干细胞，以及5道：PCR-反应对照]。
图7示出了在肌生成中，在MM-3160培养基(用于肌原分化的SKBM培养基)中的来自蜕膜的干细胞诱导10天时的免疫细胞化学分析(αMyosin-FITC)结果的显微照片。
图8示出了裸鼠的***神经被切断的照片。
图9示出了使用倾斜台测定漏尿点压力的过程的照片(A和B)。
图10示出了根据实施例6中得到的结果的漏尿点压力测定的结果的图表(A：4周时的漏尿点压力，B：8周时的漏尿点压力，N：正常组，D：对照组，P1：实验组1，以及P2：实验组2)。
图11示出了根据实施例7中得到的结果的漏尿点压力测定结果的图表(A：4周时的漏尿点压力，B：8周时的漏尿点压力，N：正常组，D：对照组，A1：实验组1，以及A2：实验组2)。
图12示出了使用器官浴槽测定尿道***收缩性的过程的照片(A和B)。
图13示出了根据实施例8中得到的结果的通过电场刺激测定的尿道***收缩性的图表(A：4周时的尿道***收缩性，B：8周时的尿道***收缩性，N：正常组，D：对照组，P1：实验组1，以及P2：实验组2)。
图14示出了根据实施例8中得到的结果的通过乙酰胆碱给药测定的尿道***收缩性的图表(A：4周时的尿道***收缩性，B：8周时的尿道***收缩性，N：正常组，D：对照组，P1：实验组1，以及P2：实验组2)。
图15示出了根据实施例9中得到的结果的通过电场刺激测定的尿道***收缩性的图表(A：4周时的尿道***收缩性，B：8周时的尿道***收缩性，N：正常组，D：对照组，P1：实验组1，以及P2：实验组2)。
图16示出了根据实施例9中得到的结果的通过乙酰胆碱给药测定的尿道***收缩性的图表(A：4周时的尿道***收缩性，B：8周时的尿道***收缩性，N：正常组，D：对照组，P1：实验组1，以及P2：实验组2)。
图17示出了实施例10中进行的雌性裸鼠尿道组织的H/E染色、SMA免疫染色和MyHC免疫染色的结果。
图18示出了根据实施例10中得到的结果的雄鼠尿道组织的H/E免疫染色结果。
图19示出了根据实施例11得到的结果的雌性裸鼠尿道组织的H/E染色、SMA免疫染色和MyHC免疫染色的结果。
图20示出了根据实施例11中得到的结果的雄鼠尿道组织的H/E免疫染色结果。
具体实施例
在一个方面，本发明涉及用于治疗小便失禁的细胞治疗剂，其含有作为活性成分的来自胎盘或者月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞。
在本发明中，来自胎盘蜕膜的干细胞具有以下特征：(a)对CD29和CD90显示免疫表型阳性，但对CD31和CD45显示免疫表型阴性；(b)对Oct4、SSEA-4和Cripto-1显示免疫表型阳性；(c)附着在塑料上生长，形态特征为圆形或纺锤形，并在SFM培养基中形成球形以便长期保持未分化状态；以及(d)具有分化成肌细胞的能力。
1、术语定义
在本文中，术语“干细胞”指的是可无限复制以形成组织和器官的专门细胞的主细胞，包括发育的多功能性干细胞和多潜能性干细胞。干细胞可分化成两个子体干细胞，或者一个子体干细胞和一个祖细胞(“过渡细胞”)，该祖细胞然后增殖形成组织的成熟的完全成形的细胞。
在本文中，术语“分化”指的是在细胞***、增殖或生长过程中细胞的结构或功能专门化的现象，也就是说，有机体的细胞或组织的特征或功能发生变化以便执行给定的工作。一般说来，该术语指的是相对简单的***被分成两种或多种性质不同的分***的现象。例如，其意味着在开始彼此相同的任何生物***各部分之间的性质出现不同，例如，在个体发育中开始彼此性质相同的受精卵各部分之间出现差异，如头或身体，或者在细胞之间出现诸如肌肉细胞或神经细胞的差异，或者生物***由于该结果而被分成性质不同的部分或分***。
在本文中，术语“细胞治疗剂”指的是用于治疗、诊断和预防目的的药物，其含有通过从人类、培养物和特定手术(由US FDA提供)中分离制备的细胞或组织。特别地，细胞治疗剂是一种用于治疗、诊断和预防目的的药物，其通过一系列的体外增殖、分选活的自体、异体和异种细胞，或者通过其他方式改变细胞的生物学性质而用于恢复组织和细胞的功能。根据细胞的分化水平，细胞治疗剂广义上被分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂。本发明特别涉及含有来自蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞的细胞治疗剂。
2、来自蜕膜的干细胞的分离和纯化
胎盘是在怀孕过程中为了胚胎而形成的，一般来说为盘形，重大约500g、直径大约15-20cm、厚度为2-3cm。胎盘的一侧与母体接触，另一侧与胚胎接触。胎盘的间隙含有母体血液以便为胚胎供应养分。胎盘包括三层：羊膜、绒毛膜和蜕膜。羊膜是围绕胚胎的薄的透明膜并含有羊水，胚胎干细胞存在于羊膜中。蜕膜是在子宫的上皮细胞改性以使受精卵可移植到子宫壁上的过程中形成的一种膜。蜕膜含有母体干细胞。在本发明中，干细胞分离自蜕膜。
根据本发明的从人胎盘分离的来自蜕膜的干细胞被归类为自体成体干细胞，其不引起伦理问题，因为它们来自胎盘组织。
干细胞通常通过下列方法从胎盘蜕膜中分离并纯化。哺乳动物的胎盘(优选人胎盘)从子宫排出之后，将蜕膜与胎盘分离，处理并培养以产生多潜能性干细胞、胎盘蜕膜干细胞和其他生物材料。来自胎盘蜕膜的干细胞是从自子宫排出的胎盘中获得的。在优选实施例中，在生长因子例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的存在下对胎盘进行培养。
在本发明中，通过下列方法从人胎盘蜕膜中分离并纯化干细胞。将蜕膜组织从人胎盘组织样品中分离并使用PBS清洗，然后将蜕膜组织精细切割。将精细切割的蜕膜组织转移到100-mm皿中，在含有胶原酶(1mg/ml)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，Gibco)中37℃下化学降解一小时。
将化学分解后的组织用100-μm筛过滤以除去未分解组织，然后1200rpm离心1-10分钟。吸去上清，将保留在底部的微团用PBS清洗，然后1200rpm离心1-10分钟。将保留在底部的微团作为单细胞进行悬浮，然后在含有bFGF的DMEM培养基中培养。此时，间叶干细胞附着到底部，其他细胞被悬浮。
这些来自胎盘蜕膜的干细胞附着在塑料上并显示圆形和纺锤形的形态特征。两天后，使用PBS清洗未附着到皿底的细胞并进行培养，同时以2-3天为间隔更换培养基，由此得到分离自人胎盘的来自蜕膜的干细胞的溶液。
测定分离的来自蜕膜的干细胞的增殖率，从结果可以看出，这些细胞在CPDL中逐渐增加，直到传代数达到12，结果表明这些细胞具有较高的增殖率(图2)。
从胎盘蜕膜中得到的干细胞在SFM培养基中形成球形，由此可长期保持在未分化状态(图3)。在本发明中使用的SFM培养基的一个例子是含有2％B27、500mM 2-巯基乙醇、1μg/ml皮质醇、5μg/ml胰岛素、20ng/ml EGF和20ng/ml bFGF的MEBM(哺乳动物上皮细胞基本培养基)。
通过使用标准细胞测定技术测定形态和细胞表面标记物的变化，例如用流式细胞仪、细胞分选计、免疫细胞化学(诸如使用组织特异性或者细胞标记物特异性抗体染色)、荧光活化细胞分选(FACS)、磁活化细胞分选(MACS)，或通过使用光学显微镜或共焦显微镜测定细胞形态，或者通过使用本领域公知的技术诸如PCR和基因表达谱测定基因表达变化，由此可对增殖细胞的数目和类型轻松进行监测。
在优选实施例中，来自胎盘或者月经液的蜕膜的干细胞使用本领域已知的技术分选，例如密度梯度离心、磁细胞分离、流式细胞仪和其他细胞分离方法。
从上面得到的来自胎盘或月经液的蜕膜的干细胞培养液得到表达所需表面抗原的多潜能性干细胞的方法，其包括使用具有分选功能的流式细胞仪的FACS方法(Int.Immunol.，10(3)：275，1998)，使用磁珠的方法，以及使用专一性识别多潜能性干细胞的抗体的淘选方法(J.Immunol.，141(8)：2797，1998)。而且，用于从大量培养液中得到多潜能性干细胞的方法包括一种方法，其中专一性识别在细胞表面上表达的分子的抗原(此后称为“表面抗原”)被单独使用或者作为柱而结合使用。
流式细胞仪分选法可包括水滴电荷法和细胞捕获法。在一个实施例中，用不同的荧光标记物标记细胞表面的标记物专一性的抗体或者配体。细胞经过细胞分选器被处理，允许细胞基于它们与使用的抗体结合的能力而分离。FACS-分选的微粒可直接沉积到96孔或384孔板的单个孔中以利于分离和克隆。
在这些方法的任何一种中，专一性识别细胞表面上的抗原的抗体被荧光标记，与在细胞表面上表达的分子结合的抗体发出的荧光的强度被转化成电信号，从而可对抗原的表达量进行定量。还能够通过使用的荧光类型的组合来分离表达多种表面抗原的细胞。在这种情况下可使用的荧光的例子包括FITC(异硫氰酸荧光素)，PE(藻红蛋白)，APC(藻蓝蛋白)，TR(德克萨斯红)，Cy 3，CyChrome，Red 613，Red 670，，TRI-Color，Quantum Red等等。
使用流式细胞仪的FACS方法包括：一种方法，其中收集上述干细胞培养液，细胞通过离心从其中分离并使用抗体直接染色；和另一种方法，其中细胞在合适培养基中培养并生长，然后使用抗体染色。细胞的染色如下进行，将识别表面抗原的初级抗体与靶细胞样品混合并在4℃下将混合物培养30分钟到1小时。当初级抗体被荧光标记时，清洗后使用流式细胞仪分离细胞。当初级抗体没有被荧光标记时，与初级抗体反应的细胞和具有与初级抗体结合活性的荧光标记的次级抗体在清洗后混合，混合物在4℃下培养30分钟到1小时。清洗后，使用初级和次级抗体染色的细胞使用流式细胞仪分离。
上述用于分离和纯化来自蜕膜的干细胞的方法也可以应用于本发明的来自脂肪的干细胞。
3、来自胎盘蜕膜的干细胞的特性
分离自胎盘蜕膜的干细胞是同源且无菌的。此外，得到的干细胞形式上适于给药到人类，也就是说，它们是医药级的。
在长期培养后，细胞可具有CD-系列表面抗原标记物的特征，例如CD29(单核细胞标记物)、CD31(内皮细胞和干细胞标记物)、CD45(造血细胞标记物)和CD90(单核干细胞标记物)，并可应用于FACS分析。
通过本发明的方法得到的优选的来自胎盘蜕膜的干细胞可通过具有下列特征的细胞表面标记物的存在来识别：对CD29和CD90显示免疫表现型阳性，但对CD31和CD45显示免疫表现型阴性。所述细胞表面标记物根据本领域公知的方法进行常规测定，例如通过流式细胞仪，接着清洗并使用抗细胞表面标记物抗体染色。
而且，根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞可使用被认为是对于干细胞的未分化标记物的Oct4、SSEA-4和Cripto-1标记物识别(图4、5和6)。Oct4是公知的用于干细胞的未分化标记物，并且其通常用于检测Oct4表达能力以便识别出于未分化状态的干细胞，如同在题为“Monoclonal antibodyspecific to human embryonic stem cells”的韩国专利申请No.10-2004-0105716、题为“Double-stranded RNA for inhibition of expression ofOct4 gene that maintains undifferentiated state of mammalian embryonic stemcells”的韩国专利申请No.10-2004-0096780、题为“Human umbilical cordblood-derived multipotent stem cells having increased ability to proliferate due toosteoblast-based structure and preparation method thereof”的韩国专利申请No.10-2006-0092128以及类似专利申请中公开的那样。而且，公知的是SSEA4(阶段特异性胚胎抗原4)和Cripto-1存在于人胚胎干细胞表面上。
Oct4的表达使用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)与FACS一起确认。RT-PCR方法是本领域已知的技术。RT-PCR技术包括使用特定区域的RNA作为模板合成相应的cDNA并使用cDNA进行PCR扩增，并包括下列步骤：(1)使用逆转录酶由RNA制备cDNA，以及(2)使用cDNA扩增特定区域，并且步骤(2)与由基因组DNA扩增特定基因区域的方法相同。与通过诸如Northern印迹杂交的方法进行RNA分析相比，该方法更为简单，并且其可以测定基因的碱基序列。因此，该方法主要在研究碱基序列和mRNA转录水平方面非常有用。
本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞在Oct4、SSEA4和Cripto-1的表达上呈阳性(图4、5和6)。
4、来自胎盘蜕膜的干细胞的分化
根据本发明的方法得到的来自胎盘蜕膜的干细胞可被诱导分化成特定细胞系，包括分化成肌细胞。在特定实施方式中，根据本发明的方法得到的来自胎盘蜕膜的干细胞被诱导分化，以便在移植和体外治疗方案中使用。在特定实施方式中，根据本发明的方法得到的来自胎盘蜕膜的干细胞被诱导分化成特定细胞类型，并且被基因工程化以提供治疗性基因产品。
来自胎盘蜕膜的干细胞分化成特定肌细胞可根据本领域已知的任何方法测定，通过使用氮杂胞苷对胎盘蜕膜干细胞进行一天的预处理，然后在SKBM培养基(Cambrex，Co.)中培养预处理的细胞，来自胎盘蜕膜的干细胞可被诱导分化成肌细胞。
可通过本领域公知的方法来确定已经干细胞是否已分化成肌细胞，例如使用诸如流式细胞仪或者免疫细胞化学等技术测定形态变化和细胞表面标记物(例如使用组织特异性或者细胞标记物特异性抗体对细胞进行染色)，或者通过使用光学显微镜或者共聚焦显微镜检查细胞的形态，或者通过使用本领域公知的技术诸如PCR和基因表达谱测定基因表达的变化。
5、来自胎盘蜕膜的干细胞的用途以及由其分化的细胞
根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞可用于众多的治疗方案中，其中身体组织或器官通过所需细胞群诸如来自胎盘蜕膜的干细胞群的移入、移植或注入而扩增、修复或者替换。本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞可被用于替换或扩增现有组织以生长新的或者替代的组织，或者将组织与生物组织或结构结合。
在本发明的优选实施例中，来自胎盘蜕膜的干细胞可在自体或异体移植中使用，包括HLA-匹配和HLA-不匹配的造血移植。
本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞可在典型地使用祖细胞的治疗或研究方案中代替特定种类的祖细胞使用(例如软骨细胞、干细胞、造血细胞、胰腺薄壁细胞、成神经细胞、肌肉祖细胞等)。
另外，本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞可被制成注射制剂(例如WO96/39101，其全部内容通过引用而结合到本文中)。在替代实施例中，本发明的细胞和组织可使用可聚合或交联水凝胶来制备，如在US 5709854、5516532和5654381中描述的那样，这些专利的全部内容都通引用而结合到本文中。
6、来自脂肪的干细胞及其用途
本发明的来自脂肪的干细胞从通过抽脂术获得的脂肪组织中而得到，其附着在塑料培养皿上生长。
特别地，本发明的来自脂肪的干细胞是根据由本申请的申请人递交的韩国专利申请No.10-2007-0050624、韩国专利申请No.10-2007-0042645、韩国专利注册No.10-0679642或者韩国专利注册No.10-0788632公开的内容分离并培养的来自脂肪组织的干细胞。
来自脂肪的干细胞具有如下特征：
(a)对CD73、CD90、CD29、CD44和CD105全部都显示阳性免疫应答，并对CD133、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR全部都显示阴性免疫应答；并且
(b)附着在塑料材料上生长，显示纺锤形形态特征，并在含有CORM-2的培养基中形成球形以便长期保持未分化状态。
在本发明中，为了本发明的干细胞的球形培养，分离的来自脂肪的多潜能性干细胞在含有CORM-2的MEBM培养基中培养，结果它们在接种后3天开始形成球形。这表明来自脂肪的干细胞保持未分化状态，因此具有高增殖率。
而且，为了根据(但不限于)在上述专利文献中描述的免疫学性质分析而检查来自脂肪的干细胞的免疫学特性，使用PBS清洗来自脂肪的干细胞并用胰蛋白酶处理。收集处理后的细胞并以1000rpm离心5分钟。弃去上清之后，使用2％FBSP和PBS混合物清洗细胞，接着以1000rpm离心5分钟。此后，弃去上清，然后将细胞悬浮在PBS中并以1x105个细胞的密度将每种样品分散到孔板中。将抗体(R-共轭藻红蛋白鼠抗-人单克隆抗体)放置到每个孔中，并且在冰上培养40分钟以诱导其结合。培养后，将细胞悬浮液以1000rpm离心5分钟。弃去上清之后，使用PBS清洗细胞两次。然后，使用1％多聚甲醛固定细胞，得到的多潜能性干细胞的表面抗原通过FACS进行分析。结果，本发明的来自脂肪的多潜能性干细胞对于CD73(91％)、CD90(97％)、CD29(96％)、CD44(83％)和CD105(80％)呈阳性。而且，分析了用于其它抗原的多潜能性干细胞的免疫表现型，结果，这些细胞对于CD133、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR呈阴性。
将来自脂肪的多潜能性干细胞分别储存在生理盐水、生理盐水+蔗糖、生理盐水+蔗糖+5％白蛋白以及PBS+蔗糖中，然后分析其形成球形的能力。为此，将来自脂肪的多潜能性干细胞以5x104-1x105个细胞/mL的浓度接种到含有无血清MEBM培养基(含有10μM CORM-2、5ml抗生素-抗真菌素溶液(100X)、1μg/ml皮质醇、5μg/mL胰岛素、20ng/mL EGF、40ng/mLFGF、B27和β-巯基乙醇)的6孔培养板的每个孔中并进行培养。结果，接种后3-7天干细胞开始形成球形，并且甚至在接种后7-10天干细胞也增殖形成球形。
在本发明的一个实施例中，来自脂肪的干细胞通过如下方式得到：制备原材料，该原材料含有通过抽脂术或者具有连接的导管的一次性注射器得到的肿胀液和脂肪组织，将原材料进行支原体试验和无菌试验，从原材料中选择满足质量标准的样品，将所选样品离心成脂肪层和水层，使用胶原酶溶液对水层样品进行预处理，然后在上述专利文献公开的培养基中培养得到的细胞。
根据本发明得到的来自脂肪的干细胞可用于各种各样的治疗方案，其中身体的组织或器官通过所需细胞群如来自脂肪的干细胞或者来自脂肪组织的干细胞群的移入、移植或注入而扩增、修复或者替换。本发明的来自脂肪的干细胞可用于替换或扩增现有组织以生长新的或者替代组织，或者将组织与生物组织或结构结合。
根据本发明的方法得到的来自脂肪的干细胞可被诱导分化成特定细胞谱系，包括分化成肌细胞。在一特定实施方式中，根据本发明的方法得到的来自脂肪的干细胞被诱导分化以便在移植和体外治疗方案中使用。在特定实施方式中，根据本发明的方法得到的来自脂肪的干细胞被诱导分化成特定细胞类型，并且被基因工程化以提供治疗性基因产品。来自脂肪的干细胞分化成特定肌细胞可根据本领域已知的任何方法测定。
可通过本领域公知的方法来确定干细胞是否已经分化成肌细胞，例如使用诸如流式细胞仪或者免疫细胞化学等技术测定形态变化和细胞表面标记物(例如使用组织特异性或者细胞标记物特异性抗体对细胞进行染色)，或者通过使用光学显微镜或者共聚焦显微镜检查细胞的形态，或者通过使用本领域公知的技术诸如PCR和基因表达谱测定基因表达变化。
7、用于治疗小便失禁的含有来自胎盘蜕膜或脂肪的干细胞的试剂的开发
本发明的用于治疗小便失禁的含有来自胎盘蜕膜或脂肪的干细胞的细胞治疗剂基于以下原理：来自胎盘蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞可增加漏尿点压力，表现为内部尿道***功能的改善，同时增加尿道***的收缩性，表现为外部尿道***功能的改善。
在本文中，术语“漏尿点压力”指的是尿液泄露时的膀胱内压或者Valsalva漏尿点压力，并且漏尿点压力的降低是小便失禁的主要原因。
在本发明中，为了测定来自胎盘蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞对小便失禁特别是漏尿点压力的治疗效果，将雌性裸鼠分成正常组、对照组和实验组。然后，增加正常组、对照组(其中***神经被切除)和实验组(其中***神经被切除，然后注射来自胎盘蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞)每组的膀胱内压，并且测定每组中的漏尿点压力。结果证明，根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞增加了漏尿点压力，因此可被用作治疗小便失禁的试剂。
尿道***由于自身的收缩性而起到调节排尿的作用，尿道***收缩性减弱也是小便失禁的主要原因。
在本发明中，为了测定来自胎盘蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞对小便失禁特别是尿道***收缩性的治疗效果，将雄鼠分成正常组、对照组和实验组。然后，对每组的尿道组织部分施加电场刺激或者乙酰胆碱药物，测定每组中尿道***的收缩性。结果证明，根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞增加了尿道***的收缩性，因此可被用作治疗小便失禁的细胞治疗剂。
8、用于治疗小便失禁的含有来自胎盘蜕膜的干细胞、来自月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞的细胞治疗剂
在本文中，术语“胎盘蜕膜”指的是在子宫的上皮细胞改性过程中形成的一种膜，使受精卵可移植到子宫壁上。
在本文中，月经液含有***、***分泌物、子宫细胞、子宫上皮细胞和毛细血管血液，主要由形成细胞的蛋白质及类似物组成。这里，从子宫流出并包含在月经液中的子宫上皮细胞被称为“月经液蜕膜”。
来自脂肪的干细胞从通过抽脂术收集的脂肪组织中获得，并附着到塑料上生长。
如上所述，胎盘蜕膜和月经液蜕膜主要由子宫上皮细胞组成。在本发明的实施例中，仅仅专门证明了来自胎盘蜕膜的干细胞对小便失禁的治疗效果，但可以很容易推断来自月经液蜕膜的干细胞也具有治疗小便失禁的效果。此外，来自脂肪的干细胞也具有多潜能性，因此可以很容易推断来自脂肪的干细胞也可用于治疗小便失禁。因此，对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明不仅能够实现将含有胎盘蜕膜的干细胞的用于治疗小便失禁的细胞治疗剂，而且还能够实现将含有月经液蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞的用于治疗小便失禁的细胞治疗剂。
实施例
随后，将参照实施例进一步对本发明进行描述。但是，应当理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，而非对本发明的范围的限制。
实施例1：根据本发明的干细胞的分离和培养
(1)来自胎盘蜕膜的干细胞的分离和培养
根据以本申请的申请人的名义提交的韩国专利公开No.10-2007-0101756A中描述的方法从胎盘中分离蜕膜。特别地，根据韩国大学医学中心的机构审查委员会的指导，在韩国大学医学中心Guro医院里，在正常分娩和早产的过程中收集胎盘并将其用于研究目的。将胎盘组织放入含有抗生素的生理盐水中，在此状态下将其转移到实验室。使用PBS清洗转移到实验室的胎盘组织以除去血细胞和各种其他组织，或者使用溶血缓冲液处理组织以除去血细胞，或者使用镊子小心地分离构成胎盘的羊膜、绒毛膜、蜕膜和胎盘床组织。
将分离的蜕膜组织置于100-mm皿中并使用消毒剪刀精细切割成1-2mm的尺寸。然后，将切割的组织置于含胶原酶的培养基中并在恒温箱中在37℃培养1-4小时，此后将用胶原酶处理过的组织经过100-目金属丝网过滤。将由此分离的细胞置于75-烧瓶中并在含有bFGF的DMEM中在5％CO2条件下于37℃培养(图1)。
(2)来自脂肪的干细胞的分离和培养
在该实施例中使用的来自脂肪的干细胞根据以本申请的申请人的名义提交的韩国专利注册No.10-0679642中描述的方法进行分离。特别地，通过抽脂术从腹部区域分离脂肪组织，并使用PBS清洗然后精细切割。切割的组织在含有1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM中于37℃下消化2小时。消化的组织使用PBS清洗然后以1000rpm离心5分钟。吸去上清，使用PBS清洗保留在底部的微团然后以1000rpm离心5分钟。得到的微团经过100μm筛过滤以去除杂质，接着使用PBS清洗。将得到的细胞在DMEM培养基(10％FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸)中培养。过夜后，使用PBS清洗未附着的细胞，并在角化细胞-SFM培养基(含有2mM NAC，0.2mM抗坏血酸，0.09mM钙，5ng/ml rEGF，50μg/ml BPE，5μg/ml胰岛素和74ng/ml皮质醇)中培养，同时以两天为间隔更换培养基，由此分离出多潜能性干细胞。
实施例2：来自胎盘蜕膜的干细胞的增殖率检查
检查了根据上述来自人胎盘蜕膜组织的多潜能性干细胞的增殖方法得到的干细胞的增殖率。通过在实施例1中描述的分离方法，从不同的人类个体的胎盘蜕膜组织样品获得了来自胎盘蜕膜的干细胞，然后将其以2x105个细胞的密度接种到75-烧瓶中。
CPDL是表示细胞增殖率的指数，并以下列方程表示：
CPDL＝ln(Nf/Ni)/ln2
其中，Ni：初始接种细胞数；Nf：最终细胞数
来自蜕膜的干细胞的CPDL根据传代数进行观察，结果，细胞在第12代显示大约30的CPDL值。该CPDL值与来自人脂肪组织的干细胞的CPDL值类似(Lin等人，stem cells and development，14：92，2005；Zuk等人，Tissueeng.，7：211，2001)。这些结果表明，根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞具有非常高的增殖率(图2)。
实施例3：来自胎盘蜕膜的多潜能性干细胞的免疫学性质
将在实施例1中得到的来自胎盘蜕膜的多潜能性干细胞使用PBS清洗并用胰蛋白酶处理。然后，收集细胞并以1000rpm离心5分钟。弃去上清之后，将细胞悬浮在PBS中并以1x105个细胞的密度分散到多孔板的每个孔中。将抗体(R-共轭藻红蛋白鼠抗-人单克隆抗体)放置到每个孔中，并且将细胞在4℃下培养40分钟。培养后，将细胞培养液以1000rpm离心5分钟。弃去上清之后，使用PBS清洗细胞并以1000rpm离心5分钟。然后，弃去上清之后，使用PBS清洗细胞并以1500rpm离心5分钟。弃去上清之后，使用1％多聚甲醛固定细胞，并使用流式细胞仪进行分析。分析的结果为，根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞的免疫学性质可如下表1所示，细胞对CD29、CD90、Oct-4、SSEA-4和Cripto-1呈免疫表现型阳性，但对CD31和CD45呈阴性(图4)。
表1：来自胎盘蜕膜的干细胞的表面抗原分析(FACS分析)
抗原 蜕膜-MSCs
CD29 +
CD31 -
CD45 -
CD90 +
Oct-4 +
SSEA-4 +
Cripto-1 +
实施例4：来自胎盘蜕膜的多潜能性干细胞的Oct4和SSEA-4表达的分析
将在实施例1中得到的来自胎盘蜕膜的干细胞用PBS清洗三次并使用含有4％多聚甲醛的PBS固定30分钟。使用PBS清洗3次后，将细胞用含有0.1％Triton-X100的PBS渗透10分钟。使用PBS清洗3次后，使用封闭缓冲液(5％羊血清)处理细胞并在4℃下培养1小时，然后使细胞与含有初级抗体的封闭缓冲液反应过夜。在使用PBS清洗3次后，细胞与次级抗体在暗房里反应1小时。在使用PBS清洗3次后，将细胞固定。结果，如图5所示，根据本发明的多潜能性干细胞对作为人胚胎干细胞标记物的Oct4和SSEA-4呈阳性。
而且，使用RT-PCR分析Oct4的表达。RT反应在37℃进行50分钟，在70℃进行10分钟；PCR反应在95℃进行10分钟，40个循环，每个循环包括95℃30秒，58℃40秒以及72℃1分钟，然后72℃10分钟。结果，如图6所示，可以看出来自蜕膜的干细胞在800bp处表达。
实施例5：来自胎盘蜕膜的多潜能性干细胞分化成肌细胞
将在实施例1中得到的来自胎盘蜕膜的干细胞分散到涂覆10ng/ml纤粘蛋白的烧瓶中，然后使用10μM 5′-氮杂胞苷预处理24小时。预处理之后，将细胞在SKBM(Cambrex，Co.)培养基中培养10天，接着进行免疫染色。
结果，根据本发明的来自胎盘组织的多潜能性干细胞对作为肌细胞特异性抗原的肌球蛋白呈阳性。该结果表明，根据本发明的来自人胎盘组织的多潜能性干细胞分化成肌细胞(图7)。
实施例6：注射了来自胎盘蜕膜的干细胞的雌性裸鼠的漏尿点压力测定
(1)实验动物模型的制备
为了测定来自胎盘蜕膜的干细胞对漏尿点压力的效果，使用了56只雌性裸鼠。将雌性裸鼠分成正常组(n＝14)，对照组(n＝14；其中***神经被切除)，实验组1(n＝14；在***神经切除2周后注射105个来自胎盘蜕膜的干细胞)，和实验组2(n＝14；在***神经切除2周后注射107个来自胎盘蜕膜的干细胞)。将每组再分成4周组(n＝7)和8周组(n＝7)，并在4周和8周时测定漏尿点压力。
对照组的制备：使用三氟溴氯乙烷将14只雌性裸鼠麻醉，并且将坐骨直肠窝双向解剖以切除***神经。然后，将***神经电灼大约2cm，然后缝合皮肤。
实验组1和2的制备：使用三氟溴氯乙烷将28只雌性裸鼠麻醉，通过低中线切口打开腹部，然后剥离膀胱和尿道(图8)。在***神经切除2周后出现小便失禁时，使用显微镜通过10-ml Hamilton注射器将在实施例1中得到的105个来自胎盘蜕膜的干细胞注射到14只鼠中(实验组1)，并将另外14只注射107个细胞(实验组2)。
(2)漏尿点压力测定
使用氨基甲酸乙酯将雌性裸鼠麻醉(1.2g/kg)，并在T9-T10的水平下切除脊髓。然后，通过低中线切口打开腹部以剥离膀胱，随后使用PE-90导管对膀胱进行耻骨上膀胱造口术。
为了测定漏尿点压力，将正常组、对照组和实验组的每组雌性裸鼠置于垂直倾斜/膀胱压力加紧模型中(图9)。将150ml生理盐水连接到PE-90管中，生理盐水的高度每次都略微增加以便增大实验鼠的膀胱压力。在尿液泄露开始时记录的压力被定义为LPP(漏尿点压力)。
如图10所示，正常组(N)，对照组(D)，实验组1(P1)和实验组2(P2)在4周时的漏尿点压力分别为22.8±0.9、11.6±0.6、20.4±0.8和21.5±0.9cmH2O(图10A)，在8周时的漏尿点压力分别为22.6±0.8、11.5±0.7、20.6±0.6和22.5±0.8cmH2O(图10B)。因此，从统计学上讲，在4周和8周时，正常组和实验组1和2的漏尿点压力都高于对照组的漏尿点压力，并且对照组的漏尿点压力低于正常组的漏尿点压力。因此，在以实施例1中制备的来自胎盘蜕膜的干细胞给药的实验组1和2中，漏尿点压力增加到与正常组类似的水平，表明来自胎盘蜕膜的干细胞起到增加漏尿点压力的作用。
实施例7：注射了来自脂肪的干细胞的雌性裸鼠的漏尿点压力的测定
(1)实验动物模型的制备
为了测定来自脂肪的干细胞对漏尿点压力的效果，使用56只雌性裸鼠。将雌性裸鼠分成正常组(n＝14)，对照组(n＝14；其中***神经被切除)，实验组1(n＝14；在***神经切除2周后注射105个来自脂肪的干细胞)，和实验组2(n＝14；在***神经切除2周后注射107个来自脂肪的干细胞)。将每组再分成4周组(n＝7)和8周组(n＝7)，并在4周和8周时测定漏尿点压力。
对照组的制备：使用三氟溴氯乙烷将14只雌性裸鼠麻醉，并且将坐骨直肠窝双向解剖以切除***神经。然后，将***神经电灼大约2cm，然后缝合皮肤。
实验组1和2的制备：使用三氟溴氯乙烷将28只雌性裸鼠麻醉，通过低中线切口打开腹部，然后剥离膀胱和尿道(图8)。在***神经切除后2周出现小便失禁时，用显微镜通过10-ml Hamilton注射器将在实施例1中得到的105个来自脂肪的干细胞注射到14只鼠中(实验组1)，并将另外14只注射107个细胞(实验组2)。
(2)漏尿点压力测定
使用氨基甲酸乙酯将雌性裸鼠麻醉(1.2g/kg)，并在T9-T10的水平下切除脊髓。然后，通过低中线切口打开腹部以剥离膀胱，随后使用PE-90导管对膀胱进行耻骨上膀胱造口术。
为了测定漏尿点压力，将正常组、对照组和实验组的每组雌性裸鼠置于垂直倾斜/膀胱压力加紧模型中(图9)。将150ml生理盐水连接到PE-90管，生理盐水的高度每次都略微增加以便增大实验鼠的膀胱压力。在尿液泄露开始时记录的压力被定义为LPP(漏尿点压力)。
如图11所示，正常组(N)，对照组(D)，实验组1(P1)和实验组2(P2)在4周时的漏尿点压力分别为22.8±0.9、11.6±0.7、18.7±0.9和19.2±0.7cmH2O(图10A)，在8周时的漏尿点压力分别为22.6±0.9、11.5±0.7、20.4±0.7和21.5±0.8cm H2O(图11B)。因此，可以确认，在以本发明的来自脂肪的干细胞给药的实验组A1和A2中，漏尿点压力在4周和8周时都增加了。而且，A2组漏尿点压力高于A1组的漏尿点压力，但二者之间没有统计学上的差异(图11)。
实施例8：注射了来自胎盘蜕膜的干细胞的雄鼠的尿道***收缩性的测定
(1)实验动物模型的制备
为了测定来自胎盘蜕膜的干细胞对尿道***收缩性的影响，使用56只雄鼠。将雄鼠分成正常组(n＝14)，对照组(n＝14；其中***神经被切除)，实验组1(n＝14；在***神经切除2周后注射105个来自胎盘蜕膜的干细胞)，和实验组2(n＝14；在***神经切除2周后注射107个来自胎盘蜕膜的干细胞)。将每组再分成4周组(n＝7)和8周组(n＝7)，并在4周和8周时测定尿道***收缩性。
对照组的制备：使用三氟溴氯乙烷将14只雄鼠麻醉，并且将坐骨直肠窝双向解剖以切除***神经。然后，将***神经电灼大约2cm，然后缝合皮肤。
实验组1和2的制备：使用三氟溴氯乙烷将28只雄鼠麻醉，通过低中线切口打开腹部，然后剥离膀胱和尿道(图8)。在***神经切除后2周出现小便失禁时，用显微镜通过10-ml Hamilton注射器将在实施例2中得到的105个来自胎盘蜕膜的干细胞注射到14只鼠中(实验组1)，并将另外14只注射107个细胞(实验组2)。
(2)尿道***收缩性的测量
获得每只雄鼠的尿道后，将尿道螺旋切割，由此制备尿道组织切片(10×2mm)。在器官浴槽实验中，使用CO2/重碳酸盐缓冲的Tyrode溶液对垂直室(vertical chamber)(20-ml体积)进行灌注，然后将尿道组织切片固定在室中。然后，使用乙酰胆碱检查尿道组织切片中尿道***收缩性(图12)。
结果，如图13所示，当在雄鼠实验中进行现有技术中常规使用的电场刺激(EFS，60V)时，正常组(N)，对照组(D)，实验组1(P1)和实验组2(P2)的尿道***收缩值在4周时分别为：0.45±0.06、0.34±0.02、0.39±0.02和0.45±0.05g/张力，在8周时分别为：0.44±0.06、0.35±0.02、0.41±0.04和0.46±0.03g/张力。因此，在电场刺激实验中，实验组在4周和8周时都显示出比对照组更高的尿道***收缩性，并显示与正常组类似或更高的尿道***收缩性。另外，实验组2显示出比实验组1更高的尿道***收缩性。
同时，如图14所示，将测试样品使用乙酰胆碱(Ach)处理时，正常组(N)，对照组(D)，实验组1(P1)和实验组2(P2)的尿道***收缩值在4周时分别为：0.54±0.04、0.28±0.03、0.52±0.02和0.54±0.03g/张力(图14A)，在8周时分别为：0.56±0.03、0.3±0.02、0.56±0.04和0.59±0.04g/张力(图14B)。因此，当以乙酰胆碱给药时，正常组和实验组1和2中尿道***收缩性都高于D组，并且实验组2显示了比实验组1更高的尿道***收缩性，但二者之间不存在统计学上的差别。换言之，不能得出实验组2显示比实验组1更高的尿道***收缩性的结论。
实施例9：使用来自脂肪干细胞给药的雄鼠尿道***收缩性的测定
(1)实验动物模型的制备
为了测定来自脂肪的干细胞对尿道***收缩性的影响，使用56只雄鼠。将雄鼠分成正常组(n＝14)，对照组(n＝14；其中***神经被切除)，实验组1(n＝14；在***神经切除2周后注射105个来自脂肪的干细胞)，和实验组2(n＝14；在***神经切除2周后注射107个来自脂肪的干细胞)。将每组再分成4周组(n＝7)和8周组(n＝7)，并在4周和8周时测定尿道***收缩性。
对照组的制备：使用三氟溴氯乙烷将14只雄鼠麻醉，并且将坐骨直肠窝双向解剖以切除***神经。然后，将***神经电灼大约2cm，然后缝合皮肤。
实验组1和2的制备：使用三氟溴氯乙烷将28只雄鼠麻醉，通过低中线切口打开腹部，然后剥离膀胱和尿道(图8)。在***神经切除后2周出现小便失禁时，用显微镜通过10-ml Hamilton注射器将在实施例1中得到的105个来自脂肪的干细胞注射到14只鼠中(实验组1)，并将另外14只注射107个细胞(实验组2)。
(2)尿道***收缩性的测定
获得每只雄鼠的尿道后，将尿道螺旋切割，由此制备尿道组织切片10×2mm)。在器官浴槽实验中，使用CO2/重碳酸盐缓冲的Tyrode溶液对垂直室(vertical chamber)(20-ml体积)进行灌注，然后将尿道组织切片固定在室中。然后，使用乙酰胆碱检查尿道组织切片中尿道***的收缩性(图12)。
结果，如图15所示，当在雄鼠实验中进行现有技术中常规使用的电场刺激(EFS，60V)时，正常组(N)，对照组(D)，实验组1(A1)和实验组2(A2)的尿道***收缩值在4周时分别为：0.46±0.08、0.32±0.03、0.35±0.03和0.38±0.03g/张力，在8周时分别为：0.44±0.06、0.31±0.02、0.39±0.02和0.44±0.05g/张力。因此，在电场刺激实验中，N组和A组的尿道***收缩性在4周和8周时都高于D组，并且A2与A1之间没有差别。
同时，如图16所示，将测试样品使用乙酰胆碱(Ach)给药时，正常组(N)，对照组(D)，实验组1(A1)和实验组2(A2)的尿道***收缩值在4周时分别为：0.54±0.05、0.29±0.04、0.48±0.03和0.51±0.05g/张力，在8周时分别为：0.55±0.05、0.29±0.03、0.55±0.02和0.54±0.05g/张力。因此，当以乙酰胆碱给药时，正常组和实验组1和2中尿道***的收缩性都高于D组，并且实验组1与实验组2之间没有差别。
实施例10：注射了来自胎盘蜕膜的干细胞的鼠组织的免疫染色
根据上述实施例6-8在4周和8周测定了漏尿点压力和尿道***收缩性之后，收集每种尿道组织并使用已经在液氮中冷却的2-甲基丁烷无损伤冷冻。将尿道组织冷却并切片，然后进行H/E染色。同样，为了观察干细胞分化成平滑肌和骨骼肌，使用DAPI、肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白重链(MyHC)对组织进行免疫染色，并在荧光显微镜下进行观察。
结果，如图17所示，在根据实施例6的雌性裸鼠的正常尿道***中，平滑肌丰富，并且骨骼肌被微弱染色(图17的“A”、“B”和“C”)。在***神经切除后，可观察到平滑肌的数量减少(图17的“D”，“E”和“F“)。当在4周(图17的“G”、“H”“I”)和8周(图17的“J“、”K“和”L“)注射来自胎盘蜕膜的干细胞时，平滑肌被染成浅绿色，表明平滑肌的数量增加。而且，在平滑肌之间，观察到被红色和绿色共染的黄细胞。在MyHC染色中，骨骼肌被染成非常微弱的绿色，并且在平滑肌细胞之间注射的细胞显示红色。
而且，如图18所示，如上所述，因为雄鼠的尿道在实施例8中被螺旋切割，所以不能观察到最初的尿道形状；但是，在尿道***收缩性实验之后可以观察到PKH在组织中表达(图18的“A“和”B“)，表明注射的来自胎盘蜕膜的干细胞有助于尿道***的收缩。作为参考，PKH是用于活细胞荧光染色的物质，并且在该实施例中，来自胎盘蜕膜的干细胞在注射之前被PKH(红色)标记。
总之，在其中构建了与小便失禁患者类似的强迫性小便失禁的动物模型的实施例6到8中，来自胎盘蜕膜的干细胞的注射增加了小便失禁裸鼠模型的漏尿点压力，并增加了小便失禁鼠模型的尿道***收缩性。漏尿点压力没有根据注射的干细胞数目发生极大改变，但是尿道***的收缩性随着注射的干细胞的数目增加而增加。这表明根据本发明的来自胎盘蜕膜的干细胞也可被用作小便失禁患者的极佳的细胞治疗剂。
如上所述，胎盘蜕膜和月经液蜕膜主要由子宫上皮细胞构成。在本发明的实施例中，仅特别证明了来自胎盘蜕膜的干细胞的小便失禁的治疗效果，但可以很容易推断，来自月经液蜕膜的干细胞也具有治疗小便失禁的效果。
实施例11：注射了来自脂肪的干细胞的鼠组织的免疫染色
根据上述的实施例7-9在4周和8周测定了漏尿点压力和尿道***收缩性后，收集每种尿道组织并使用已经在液氮中冷却的2-甲基丁烷无损伤冷冻。将尿道组织冷冻并切片，然后进行H/E染色。同样，为了观察干细胞分化成平滑肌和骨骼肌，使用DAPI、肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白重链(MyHC)对组织进行免疫染色，并在荧光显微镜下进行观察。
结果，如图19所示，在实施例7中制备的裸鼠的正常尿道***中，平滑肌丰富，并且骨骼肌被微弱染色(图19的“A”、“B”和“C”)。在***神经切除之后，可观察到平滑肌的数量减少(图19的“D”，“E”和“F“)。当注射(8周时)来自脂肪的干细胞时，平滑肌被染成绿色，表明平滑肌的数量增加。而且，在平滑肌之间，观察到被红色和绿色共染的黄细胞。在MyHC染色中，骨骼肌被染成非常微弱的绿色，并且在平滑肌细胞之间注射的细胞显示红色。
而且，如图20所示，如上所述，因为雄鼠的尿道在实施例9中被螺旋切割，所以不能观察到最初的尿道形状；但是，在尿道***收缩性实验之后可以观察到PKH在组织中表达(8周；图20的“A“和”B“)，表明注射的来自脂肪的干细胞有助于尿道***的收缩。作为参考，PKH是用于活细胞荧光染色的物质，并且在该实施例中，来自脂肪的干细胞在注射之前被PKH(红色)标记。
工业实用性
如上所述，根据本发明的来自胎盘或月经液的蜕膜的干细胞或者来自脂肪的干细胞具有极好地分化成肌细胞的能力，因此显示出了使漏尿点压力增加和提高尿道***收缩性的效果。所以，干细胞可用作治疗小便失禁的试剂。
虽然已经根据特定特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅用于优选实施例，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。

Claims (1)

1.来自胎盘蜕膜的干细胞在制备用于治疗小便失禁的细胞治疗剂中的应用，其中所述来自胎盘蜕膜的干细胞是作为活性成分使用并且具有如下特征：
(a)对CD29和CD90显示免疫表现型阳性，但对CD31和CD45显示免疫表现型阴性；
(b)对Oct4、SSEA-4和Cripto-1显示免疫表现型阳性；
(c)附着在塑料上生长，具有圆形或者纺锤形的形态特征，并在SFM培养基中形成球形以便长期保持未分化状态；以及
(d)具有分化成肌细胞的能力。
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