JP5260963B2 - 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 - Google Patents
粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5260963B2 JP5260963B2 JP2007550198A JP2007550198A JP5260963B2 JP 5260963 B2 JP5260963 B2 JP 5260963B2 JP 2007550198 A JP2007550198 A JP 2007550198A JP 2007550198 A JP2007550198 A JP 2007550198A JP 5260963 B2 JP5260963 B2 JP 5260963B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- powder
- plant
- agrobacterium
- plant material
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 160
- 239000000843 powder Substances 0.000 title claims description 159
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims description 73
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 245
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 156
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 98
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 93
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 89
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 42
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 41
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 25
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 25
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 21
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 20
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 20
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 16
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 16
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 15
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 claims description 9
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 claims description 4
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 claims description 3
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000241602 Gossypianthus Species 0.000 claims 1
- 244000234281 Tamarix gallica Species 0.000 claims 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 56
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 33
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 31
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 28
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 22
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 21
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 16
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 11
- 101150085703 vir gene Proteins 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000005337 ground glass Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 7
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 6
- 235000005043 Oryza sativa Japonica Group Nutrition 0.000 description 6
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 6
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 4
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 4
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 4
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 4
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 239000011812 mixed powder Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 4
- 101150076562 virB gene Proteins 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FLUSEOZMBNGLSB-HNTFPEDGSA-N (2S,3R,4R,5R,6R)-2-bromo-3-chloro-3,4,5,6-tetrahydroxy-4-(1H-indol-2-yl)oxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)O[C@](Br)(C(O)=O)[C@](O)(Cl)[C@@]1(O)C1=CC2=CC=CC=C2N1 FLUSEOZMBNGLSB-HNTFPEDGSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- 101100049353 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) virC gene Proteins 0.000 description 2
- 101100484788 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) virD gene Proteins 0.000 description 2
- 101100484795 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) virE gene Proteins 0.000 description 2
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 101100018379 Shigella flexneri icsA gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101100476911 Yersinia enterocolitica yscW gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 2
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 2
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 2
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 2
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 101150027375 virA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150033532 virG gene Proteins 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000209072 Sorghum Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 101150047832 hpt gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007561 laser diffraction method Methods 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、粉体の存在下でアグロバクテリウム属細菌を植物材料に接種することを特徴とする方法に関する。
(1)アグロバクテリウム属細菌懸濁液と粉体を混合する工程;および、
(2)(1)の混合物を植物材料に接種する工程;
を含む、前記方法である。
(1)植物材料と粉体を混合する工程;および、
(2)(1)の混合物にアグロバクテリウム属細菌懸濁液を接種する工程;
を含む、前記方法である。
また、本発明は、前記遺伝子導入方法を使用した形質転換植物の製造方法をも提供する。
(1)粉体の存在下でアグロバクテリウム属細菌懸濁液を植物材料に接種し;
(2)形質転換された植物材料を選抜し;そして、
(3)選抜された形質転換体を再分化する;
を含むことを特徴とする方法に関する。
(i)アグロバクテリウム属細菌懸濁液と粉体を混合し;そして、
(ii)(i)の混合物を植物材料に接種する;
ことにより達成される。
(i)植物材料と粉体を混合し;そして、
(ii)(i)の混合物にアグロバクテリウム属細菌懸濁液を接種する;
ことにより達成される。
アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入は、一般的には以下の工程を含む:
(a)植物材料を調製する工程;
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を調製する工程;
(c)工程(a)で調製した植物材料を(b)で調製したアグロバクテリウム属細菌に感染させる工程。
(d)形質転換細胞を選抜する工程;および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
を施してもよい。
本明細書において、遺伝子導入に供される「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。本発明の方法に供される単子葉植物には、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、アスパラガス、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法に供される双子葉植物にはタバコ、ダイズ、ミヤコグサ、ジャガイモ、ワタ、ヒマワリ、その他が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法に供される好ましい植物は、単子葉植物であり、最も好ましくはイネまたはトウモロコシである。
土壌細菌アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)が多くの双子葉植物に根頭癌腫病(crown gall disease)を引き起こすことは古くから知られており、1970年代には、Tiプラスミドが病原性に関与すること、さらにTiプラスミドの一部であるT−DNAが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このT−DNAには癌腫の誘発に必要なホルモン(サイトカイニンとオーキシン)の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。T−DNAの切り出しと植物への伝達にはTiプラスミド上のヴィルレンス領域(vir領域)に存在する遺伝子群が必要であり、またT−DNAが切り出されるためにはT−DNAの両端に存在するボーダー配列が必要である。他のアグロバクテリウム属細菌であるAgrobacterium rhizogenesもRiプラスミドによる同様なシステムを有している(例えば、特開2000−342256の図3および図4)。
アグロバクテリウム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、植物材料をアグロバクテリウム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、106〜1011cfu/ml程度の細胞濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植物材料を3〜10分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。
さらに所望により、形質転換体を得るためには、上記工程(c)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程;および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
が必要である。即ち、一般に植物の形質転換を行うためには、植物細胞に外来遺伝子を導入した後に、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれた植物細胞を選抜することが必要である。
(a)植物材料を調製する工程;
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を調製する工程;および
(c)粉体の存在下で、工程(a)で調製した植物材料を(b)で調製したアグロバクテリウム属細菌に感染させる工程;
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程(c)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程;および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程;
を含む、前記方法である。
(a)植物材料を調製する工程;
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を調製する工程;
(c−1)(b)で調製したアグロバクテリウム属細菌の懸濁液と粉体を混合する工程;および
(c−2)(c−1)の混合物を(a)で調製した植物材料に接種することにより、植物材料をアグロバクテリウム属細菌に感染させる工程;
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程(c−2)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程;および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程;
を含む、前記方法である。
(a)植物材料を調製する工程;
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を調製する工程;
(c−1)(a)で調製した植物材料と粉体を混合する工程;および
(c−2)(c−1)の混合物に(b)で調製したアグロバクテリウム属細菌の懸濁液を接種することにより、植物材料をアグロバクテリウム属細菌に感染させる工程;
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程(c−2)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程;および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程;
を含む、前記方法である。
(a)植物材料を調製する工程;
(b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を調製する工程;および
(c)(a)で調製した植物材料、(b)で調製したアグロバクテリウム属細菌の懸濁液、および粉体を同時に混合することにより、植物材料をアグロバクテリウム属細菌に感染させる工程;
を含み、所望により、形質転換体を得るために、上記工程(c)に次いで
(d)形質転換細胞を選抜する工程;および
(e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程;
を含む、前記方法である。
材料および方法
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB134)を用いた。LBA4404(pSB134)は以下のように作成した。pIG221(Ohta, S., et al., (1990) Plant Cell Physiol., 31: 805-813)由来のGUS発現ユニットをpKY205(Kuraya, Y., et al., (2004) Mol. Breed., 14: 309-320)のトウモロコシユビキチンプロモーターで制御されたHPT遺伝子の上流のHindIII制限部位に挿入した。このプラスミドをLBA4404(pSB1)(Komari, T., et al., (1996) Plant J., 10: 165-174)に導入し、LBA4404(pSB134)を得た。
供試品種として、日本稲品種ゆきひかりを用いた。開花後8〜14日目の未熟種子の穎を除去し、70%エタノールで数秒、ツイーン20(和光純薬工業株式会社)を含む1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ1.5〜2mmの未熟胚を摘出し供試組織とした。
粉体としてハイドロキシアパタイト(Bio-Rad)およびシリカゲル(ICN Pharmaceuticals)を供試した。80〜100mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。AB培地 (Chilton, M-D, et al., (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672-3676) 上で3〜5日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかき取り、修正AA培地(AA主要無機塩類、AAアミノ酸およびAAビタミン類 (Toriyama K., et al., (1985) Plant Sci., 41: 179-183) 、MS微量塩類 (Murashige, T. and Skoog, F., (1962) Physiol. Plant, 15: 473-497) 、1.0g/lカザミノ酸、100μMアセトシリンゴン、0.2Mショ糖、0.2Mグルコース)に1x108〜1x109cfu/mlの濃度で懸濁した。粉体を入れたチューブに1mlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、接種源とした。
無菌的に摘出した未熟胚を2N6−AS培地に置床した。粉体が細菌懸濁液に均等に分散するようにボルテックスミキサーで数秒間撹拌した後、1未熟胚につき、5μlの懸濁液を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の場所に移動した。培養容器をシールした後、25℃、暗黒下で7日間共存培養を行った。一部の未熟胚についてX−Glucを処理することによるGUS発現を調査した(Hiei et al., 1994)。すなわち、共存培養処理直後、組織を0.1% Triton X-100を含む0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.8) に浸漬し、37℃で1時間静置した。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを除去した後、1.0mM 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−グルクロン酸(X−Gluc)および20%メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。37℃で24時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察した。
共存培養後の未熟胚をメスで4〜6分割し、nN6CC培地(N6無機塩、N6ビタミン、0.5g/l カザミノ酸、0.5g/l L−プロリン、1mg/l 2,4−D、0.5mg/l NAA、0.1mg/l 6BA、20g/l シュークロース、55g/l ソルビトール、250mg/l セフォタキシム、250mg/l カルベニシリン、5g/l ゲルライト、pH5.8)あるいはNBK4CC(NBK4主要無機塩、B5微量無機塩、B5ビタミン、AAアミノ酸、0.5g/l カザミノ酸、0.5g/l L−プロリン、1mg/l 2,4−D、0.5mg/l NAA、0.1mg/l 6BA、20g/l マルトース、55g/l ソルビトール、250mg/l セフォタキシム、250mg/l カルベニシリン、5g/l ゲルライト、pH5.8)に置床した。照明下28℃で1週間培養後、カルスを5分割し、ハイグロマイシン50mg/lを含むnN6CC培地あるいはNBK4CC培地に置床し、同条件で10日間培養した。増殖した細胞塊をハイグロマイシン50mg/lを含む再分化培地(N6無機塩、N6ビタミン、AAアミノ酸、1g/l カザミノ酸、0.5mg/l カイネチン、20g/l シュークロース、30g/l ソルビトール、4g/l ゲルライト、pH 5.8)あるいは(NBK4主要無機塩、B5微量無機塩、B5ビタミン、AAアミノ酸、1g/l カザミノ酸、2mg/l カイネチン、20g/l マルトース、30g/l ソルビトール、5g/l ゲルライト、pH 5.8)に置床し、同条件で約2週間培養した。
アグロバクテリウムを接種したイネ未熟胚では、胚盤の広い範囲でGUS遺伝子のトランジェント発現を示すスポットが観察される。1つの胚盤でも離れた部位で観察されるスポットは個々に遺伝子導入のなされた独立の形質転換細胞に由来するものであると考えられる。共存培養後およびレスティング培養後に増殖した未熟胚を4から6の塊に分割した場合、由来は1つの未熟胚であっても分割して得られた20〜30の細胞塊からハイグロマイシン存在下で増殖してきたカルスおよびその再分化植物はそれぞれ独立の形質転換体であると考えられる。
(7)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。いずれの未熟胚でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、接種源に粉体を添加し、接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べ青色を呈する部位が広範にみられ、粉体の添加により遺伝子導入が促進されていることが示された。
共存培養後の未熟胚をハイグロマイシンを含む培地で培養し、得られたカルスをハイグロマイシンを含む再分化培地に置床し培養した。ハイグロマイシン抵抗性再分化植物はいずれの未熟胚からも得られたが、接種源に粉体を添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べハイグロマイシン抵抗性再分化植物の数は多く、粉体の添加により形質転換効率の向上がみられた(図1)。
材料および方法
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB131)(Ishida, Y., et al., (1996) Nature Biotechnology, 14: 745-750)を用いた。
供試品種として、トウモロコシインブレッドA188を用いた。交配後8〜14日目の雌穂から大きさ1.0〜1.2mmの未熟胚を無菌的に取り出し、供試組織とした。
粉体としてハイドロキシアパタイト(Bio-Rad)、シリカゲル(ICN Pharmaceuticals)および乳鉢で磨砕したグラスウールを供試した。80〜100mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。YP培地(5g/l 酵母エキス、10g/l ペプトン、5g/l NaCl、pH6.8)上で3〜5日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかき取り、LS−inf培地(Ishida, Y., et al., (1996) Nature Biotechnology, 14: 745-750)に1x108〜1x109cfu/mlの濃度で懸濁した。粉体を入れたチューブに1mlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、接種源とした。
接種は通常接種と滴下接種の2種類の方法で行った。
未熟胚を5mg/l フォスフィノスライシン(PPT)を含む改良LSD1.5培地 (Ishida, Y., et al., (2003) Plant Biotechnology, 20: 57-66)に置床した。暗黒下25℃で10〜14日間培養後、10mg/l PPTを含む改良LSD1.5培地で培養した。増殖した細胞塊を5mg/l PPTおよび10μM CuSO4を含むLSZ再分化培地(Ishida, Y., et al., (1996) Nature Biotechnology, 14: 745-750)に置床し、照明下25℃で約2週間培養した。再分化した植物の葉の一部を切り取り、X−Glucを処理することによるGUS発現を調査した。
(6)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。いずれの未熟胚でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、通常接種、滴下接種ともに、接種源に粉体を添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べ青色を呈する部位が広範にみられ、粉体の添加により遺伝子導入が促進されていることが示された。
共存培養後の未熟胚をPPTを含む培地で培養し、得られたカルスをPPTを含む再分化培地に置床し培養した。再分化のみられたPPT抵抗性植物についてGUS分析を行った。GUS陽性植物はいずれの未熟胚からも得られたが、通常接種、滴下接種ともに、接種源に粉体を添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べGUS陽性植物の数は多く、粉体の添加により形質転換効率の向上することが明らかとなった(表1)。粉体の添加による形質転換効率の向上は、未熟胚をアグロバクテリウムおよび粉体と共存下で撹拌した後、共存培地に置床した場合(通常接種)だけでなく、粉体とアグロバクテリウムの混合液を未熟胚上に滴下した場合(滴下接種)にも見られた。このことは、形質転換効率の向上は粉体による植物組織の付傷によるものではないことを示す。
材料および方法
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB134)を用いた。
供試品種として、日本稲品種ゆきひかりを用いた。開花後8〜14日目の未熟種子の穎を除去し、70%エタノールで数秒、ツイーン20を含む1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ1.5〜2mmの未熟胚を摘出し供試組織とした。
粉体として異なる粒径のシリカゲル5種(粒径:5〜20μm、20〜40μm、45〜75μm、75〜150μm、150〜425μmのもの;和光純薬工業株式会社)を供試した。120mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。AB培地(Chilton, M-D., et al., (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672-3676)上で3〜5日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかき取り、修正AA培地(AA主要無機塩類、AAアミノ酸およびAAビタミン類(Toriyama, K., et al., (1985) Plant Sci., 41: 179-183)、MS微量塩類(Murashige, T. and Skoog, F., (1962) Physiol. Plant, 15: 473-497)、1.0g/l カザミノ酸、100μM アセトシリンゴン、0.2M ショ糖、0.2M グルコース)に1x108〜1x109cfu/mlの濃度で懸濁した。粉体を入れたチューブに1mlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、接種源とした。
接種、共存培養、選抜、再分化および形質転換効率の算出は実施例1の方法に従って行った。
(5)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いずれの処理区でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、粒径150μm以下のシリカゲルを接種源に添加し接種した未熟胚では、粉体無添加の対照および150μm以上の粉体を接種源に添加し接種した未熟胚に比べ、青色を呈する部位が広範にみられ、粉体の粒径により遺伝子導入を促進する程度の異なることが示された
(6)形質転換効率
共存培養後の未熟胚をハイグロマイシンを含む培地で培養し、得られたカルスをハイグロマイシンを含む再分化培地に置床し培養した。ハイグロマイシン抵抗性再分化植物はいずれの未熟胚からも得られたが、粒径150μm以下のシリカゲルを接種源に添加し接種した未熟胚では粉体無添加の対照の未熟胚に比べハイグロマイシン抵抗性再分化植物の数は多く、形質転換効率の向上がみられた(図2)。
材料および方法
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB134)を用いた。
供試品種として、日本稲品種ゆきひかりを用いた。開花後8〜14日目の未熟種子の穎を除去し、70%エタノールで数秒、ツイーン20を含む1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ1.5〜2mmの未熟胚を摘出し供試組織とした。
粉体として活性炭およびシリカゲル(和光純薬工業株式会社)を供試した。0〜240mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。AB培地(Chilton, M-D., et al., (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672-3676)上で3〜5日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかき取り、修正AA培地(AA主要無機塩類、AAアミノ酸およびAAビタミン類(Toriyama, K., et al., (1985) Plant Sci., 41: 179-183)、MS微量塩類(Murashige, T. and Skoog, F., (1962) Physiol. Plant, 15: 473-497)、1.0g/lカザミノ酸、100μM アセトシリンゴン、0.2M ショ糖、0.2M グルコース)に1x108〜1x109cfu/mlの濃度で懸濁した。粉体を入れたチューブに1mlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、接種源とした。
接種、共存培養、選抜、再分化および形質転換効率の算出は実施例1の方法に従って行った。
(5)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いずれの処理区でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、接種源1ml当たり60mg以上の活性炭を接種源に添加し接種した未熟胚では、粉体無添加の対照および30mg以下の粉体を接種源に添加し接種した未熟胚に比べ、青色を呈する部位が広範にみられ、接種源に添加する粉体の量により遺伝子導入を促進する程度の異なることが示された(図3)。
共存培養後の未熟胚をハイグロマイシンを含む培地で培養し、得られたカルスをハイグロマイシンを含む再分化培地に置床し培養した。ハイグロマイシン抵抗性再分化植物はいずれの未熟胚からも得られたが、30mg以上のシリカゲルを接種源に添加し接種した未熟胚では、粉体無添加の対照の未熟胚に比べ、ハイグロマイシン抵抗性再分化植物の数は多く、形質転換効率の向上がみられた(図4)。
材料および方法
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB131)を用いた。
供試品種として、トウモロコシインブレッドA188を用いた。交配後8〜14日目の雌穂から大きさ1.0〜1.2mmの未熟胚を無菌的に取り出し、供試組織とした。
粉体として2種の粒径のゼオライト(5μm、75μm;和光純薬工業株式会社)を供試した。粉体の滅菌および接種源の調製は実施例2に記載の方法に従って行った。
接種は実施例2に記載の滴下接種方法で行った。共存培養後の未熟胚でのGUS未熟胚での調査は実施例2に記載の方法により行った。
(5)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。いずれの未熟胚でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、ゼオライトを接種源に添加し、接種した未熟胚では対照の未熟胚に比べGUS遺伝子の発現部位が広範囲でみられた。粒径5μmのゼオライトに比べ75μmのゼオライトではより広い範囲でのGUS遺伝子の発現が観察された(図5)。
材料および方法
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB134)を用いた。
供試品種として、日本稲品種ゆきひかりを用いた。供試組織の調製は実施例4に記載の方法に従って行った。
粉体としてシリカゲル、ハイドロキシアパタイトおよび磨砕グラスウールを供試した。総量120mgの粉体をチューブに入れ、オートクレーブにより滅菌処理を行った。2種の粉体を混合した時は各粉体を約60mgずつ、3種の粉体を混合した時は各粉体を約40mgずつチューブに入れ滅菌した。アグロバクテリウム懸濁液の調製は実施例4に記載の方法に従って行った。粉体を入れたチューブに1mlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、接種源とした。
接種、共存培養方法およびGUS発現の調査は実施例1に記載の方法に従って行った。
(5)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いずれの処理区でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、粉体を接種源に添加し接種した未熟胚では、粉体未添加の対照に比べ青色を呈する部位が広範に見られた。1種類の粉体と2種類または3種類の混合粉体の間では遺伝子導入を促進する程度に大きな差は見られなかった(図6)。
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pSB134)を用いた。
供試品種として、日本稲品種ゆきひかりを用いた。開花後8〜14日目の未熟種子の穎を除去し、70%エタノールで数秒、ツイーン20を含む1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で15分間滅菌処理を行った。滅菌水で数回洗浄後、長さ1.5〜2mmの未熟胚を摘出し2N6−AS培地に置床した。暗黒下、25℃で1週間培養し、カルスの増殖した未熟胚を供試材料とした。
粉体としてハイドロキシアパタイト(Bio-Rad)を供試した。接種源の調製は実施例1の方法に従って行った。
接種および共存培養
導入遺伝子のトランジェント発現を確認するために、カルスを2N6−AS培地に置床した。粉体が細菌懸濁液に均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した後、1カルスにつき、10μlの懸濁液をカルス上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、カルスを同培地上の別の場所に移動した。共存培養方法およびGUS発現の調査は実施例4に記載の方法に従って行った。
形質転換効率を確認するために、カルスに対する接種、共存培養、選抜、再分化および形質転換効率の算出を、実施例1の方法に従って行った。細菌懸濁液の滴下量は10μlとした。
(5)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。粉体無添加の接種源を接種したカルスに比べ、接種源にハイドロキシアパタイトを添加し、接種したカルスでは青色を呈する部位が広範にみられ、カルスを材料とした時にも接種源への粉体の添加により遺伝子導入が促進されることが示された(図7)。
共存培養後のカルスをハイグロマイシンを含む培地で培養し、増殖したカルスをハイグロマイシンを含む再分化培地に置床し培養した。粉体無添加の接種源を接種したカルスに比べ、接種源にハイドロキシアパタイトを添加し、接種したカルスからは、より多くのハイグロマイシン抵抗性植物の再分化がみられ、形質転換効率の向上が認められた(図8)。
(1)アグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
アグロバクテリウムおよびそのベクターには、LBA4404(pIG121Hm)(Hiei, et al., 1994, The Plant Journal, 6: 271-282) を用いた。LBA4404(pIG121Hm)はスーパーバイナリーベクターの有する強病原性菌株のvir遺伝子の一部を持たないノーマルバイナリーベクターである。
供試品種として、日本稲品種ゆきひかりを用いた。供試組織の調製は実施例4に記載の方法に従って行った。
粉体として磨砕したグラスウールおよびハイドロキシアパタイトを供試した。接種源の調製は実施例1の方法に従って行った。
接種、共存培養方法およびGUS発現の調査は実施例4に記載の方法に従って行った。
(5)導入遺伝子のトランジェント発現
共存培養後の未熟胚をX−Glucにより処理した。粉体無添加の対照を含め、いずれの処理区でもGUS遺伝子のトランジェントな発現を示す青色のスポットがみられたが、紛体無添加の未熟胚に比べ、磨砕グラスウールおよびハイドロキシアパタイトを接種源に添加し接種した未熟胚では青色を呈する部位が広範にみられ、ノーマルバイナリーベクターを接種する場合も、接種源に粉体を添加することにより遺伝子導入が促進されることが示された(図9)。
実施例9:サザン分析
実施例1で得られた形質転換植物および接種源に磨砕グラスウールあるいは活性炭を添加して実施例1と同様の方法で得られた形質転換植物から小鞠らの方法(Komari, et al., 1989; Theor. Appl. Genet., 77: 547-552)に従いDNAを抽出し、抽出したDNAに制限酵素XbaIを処理し、GUS遺伝子をプローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行った。サザン法はMolecular Cloning (Sambrook, et al., 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載の方法に従って行った。その結果、ハイブリダイズするバンドはいすれも異なった位置にみられ、導入遺伝子がイネゲノム中にランダムに挿入されていることが証明された。導入遺伝子のコピー数は1から4であった(表2)。
実施例1で得られた形質転換植物および接種源に磨砕グラスウールを添加して実施例1と同様の方法で得られた形質転換植物を自殖し、得られたT1種子を播種した。播種後10日目の幼苗から葉の一部を切り取り、実施例1の方法に従い、GUS遺伝子の発現を調査した。
Claims (13)
- アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、以下:
(1)アグロバクテリウム属細菌懸濁液と粉体を混合し;そして
(2)(1)の混合物を植物材料に滴下接種する;
ことを含む工程により、粉体の存在下でアグロバクテリウム属細菌を植物材料に接種することを特徴とし、ここで当該粉体は、1〜150μmの粒径を有し、生体組織に対し悪影響を及ぼさず、かつ、水に不溶性である、前記方法。 - 粉体が、さらに以下の特性:生体組織に対する親和性を有する;吸着特性を有する;および表面極性を有する;からなる群より選択される1またそれより多くの特性を有する粉体である、請求項1に記載の方法。
- 粉体が、多孔質の粉体である、請求項1または2に記載の方法。
- 多孔質の粉体が、多孔性セラミックスの粉体である、請求項3に記載の方法。
- 粉体が、ハイドロキシアパタイト、シリカゲル、ゼオライト、その他の多孔性セラミックス、グラスウールおよび活性炭、ならびにそれらの混合物、からなる群より選択される粉体である、請求項1に記載の方法。
- 粉体が5〜75μmの粒径を有する、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 植物材料が、植物細胞、葉、根、茎、芽、花(雄蕊、雌蕊等含む)、実、種子、発芽種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、外植片、成長点、未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織、または完全な植物体からなる群より選択される、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 植物が単子葉植物である、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 単子葉植物が、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、アスパラガス、サトウキビおよびソルガムからなる群より選択される植物である、請求項8に記載の方法。
- 植物が双子葉植物である、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- 双子葉植物が、タバコ、ダイズ、ミヤコグサ、ジャガイモ、ワタ、およびヒマワリからなる群より選択される植物である、請求項10に記載の方法。
- 以下の工程:
(1)アグロバクテリウム属細菌懸濁液と粉体を混合する工程;および、
(2)(1)の混合物を植物材料に滴下接種する工程;
を含む、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、
ここで、該粉体は、ハイドロキシアパタイト、シリカゲル、ゼオライト、その他の多孔性セラミックス、グラスウールおよび活性炭、ならびにそれらの混合物、からなる群より選択される粉体であって、粒径が1〜150μmの粉体である、
前記方法。 - アグロバクテリウム属細菌を介した植物材料の形質転換による形質転換植物の製造方法であって、以下の工程:
(1)(i)アグロバクテリウム属細菌懸濁液と粉体を混合し;そして(ii)(i)の混合物を植物材料に滴下接種する;ことにより粉体の存在下でアグロバクテリウム属細菌懸濁液を植物材料に接種し;
(2)形質転換された植物材料を選抜し;そして、
(3)選抜された形質転換体を再分化する;
を含むことを特徴とし、ここで当該粉体は1〜150μmの粒径を有する、前記方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007550198A JP5260963B2 (ja) | 2005-12-13 | 2006-12-13 | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JPPCT/JP2005/022863 | 2005-12-13 | ||
PCT/JP2005/022863 WO2007069301A1 (ja) | 2005-12-13 | 2005-12-13 | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
PCT/JP2006/324839 WO2007069643A1 (ja) | 2005-12-13 | 2006-12-13 | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
JP2007550198A JP5260963B2 (ja) | 2005-12-13 | 2006-12-13 | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007069643A1 JPWO2007069643A1 (ja) | 2009-05-21 |
JP5260963B2 true JP5260963B2 (ja) | 2013-08-14 |
Family
ID=49053071
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007550198A Active JP5260963B2 (ja) | 2005-12-13 | 2006-12-13 | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5260963B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5785378B2 (ja) * | 2010-01-08 | 2015-09-30 | 国立大学法人大阪大学 | 組織培養法 |
EP2418283A1 (en) * | 2010-08-07 | 2012-02-15 | Nomad Bioscience GmbH | Process of transfecting plants |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002528047A (ja) * | 1998-01-29 | 2002-09-03 | ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー | 植物細胞凝集体及び植物組織のホイスカー−媒介形質転換ならびにその植物の再生 |
JP2003274953A (ja) * | 2002-03-27 | 2003-09-30 | Niigata Prefecture | 植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置 |
-
2006
- 2006-12-13 JP JP2007550198A patent/JP5260963B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002528047A (ja) * | 1998-01-29 | 2002-09-03 | ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー | 植物細胞凝集体及び植物組織のホイスカー−媒介形質転換ならびにその植物の再生 |
JP2003274953A (ja) * | 2002-03-27 | 2003-09-30 | Niigata Prefecture | 植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN4006005716; Plant Cell Reports Vol. 16, 1996, 127-132 * |
JPN4006005717; Plant Cell Reports Vol. 14, 1995, 285-289 * |
JPN4006005718; Transgenic Res. Vol. 6, 1996, 329-336 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2007069643A1 (ja) | 2009-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1964919B1 (en) | Method for improving transformation efficiency using powder | |
WO2009122962A1 (ja) | アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 | |
AU2008221585B2 (en) | Method of elevating transformation efficiency in plant by adding copper ion | |
JP4532413B2 (ja) | 植物材料への遺伝子導入を行う方法 | |
CA2386125C (en) | Method of improving gene transfer efficiency into plant cells | |
JP5227303B2 (ja) | 3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法 | |
EP1306441B1 (en) | Method of improving gene transfer efficiency into plant cells | |
WO2012015039A1 (ja) | アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法 | |
JP5260963B2 (ja) | 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法 | |
JPWO2008105509A1 (ja) | 選抜工程を経ないアグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法 | |
JP4424784B2 (ja) | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 | |
JP4428757B2 (ja) | 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法 | |
JP2000023675A (ja) | 広範な品種に適応可能なアグロバクテリウムによるトウモロコシの形質転換方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090924 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120411 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130301 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20130312 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130329 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130426 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160502 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5260963 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |