JP5244130B2 - 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 - Google Patents
反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5244130B2 JP5244130B2 JP2009550069A JP2009550069A JP5244130B2 JP 5244130 B2 JP5244130 B2 JP 5244130B2 JP 2009550069 A JP2009550069 A JP 2009550069A JP 2009550069 A JP2009550069 A JP 2009550069A JP 5244130 B2 JP5244130 B2 JP 5244130B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- protruding
- solution
- magnetic beads
- droplets
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 148
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 44
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 title claims description 15
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 121
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 38
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 33
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 31
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 21
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 16
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 14
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 claims description 7
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 claims description 7
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 claims description 3
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 86
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 8
- 229910001172 neodymium magnet Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- -1 polyoxyethylene sulfate Polymers 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- ASHGTUMKRVIOLH-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[K+].OP([O-])([O-])=O ASHGTUMKRVIOLH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 102000000528 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010041520 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000005211 alkyl trimethyl ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007788 roughening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B08—CLEANING
- B08B—CLEANING IN GENERAL; PREVENTION OF FOULING IN GENERAL
- B08B3/00—Cleaning by methods involving the use or presence of liquid or steam
- B08B3/04—Cleaning involving contact with liquid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
Description
(1)基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有し、
かつ
前記基板表面の少なくとも前記液滴を保持する面は、純水に対する接触角が90〜150°の範囲である
ことを特徴とする反応治具。
(2)前記複数の突起状囲いは、少なくとも一部または全部が、縦横に整列して設けられている(1)に記載の反応治具。
(3)前記突起状囲いの液滴保持用空間は、0.5μl〜200μlの範囲の量の液滴を保持できる(1)または(2)に記載の反応治具。
(4)突起状囲いは、2つまたは3つの切欠き部を有し、前記切欠き部の開口の間隔は0.5〜10mmの範囲である(1)〜(3)のいずれかに記載の反応治具。
(5)前記基板表面は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなる(1)〜(4)のいずれかに記載の反応治具。
(6)前記基板は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなるコーティング層を有する(1)〜(4)のいずれかに記載の反応治具。
(7)各突起状囲いの液滴保持用空間には、同一または異なる種類の溶液の液滴が、他の突起状囲いの液滴保持用空間部分に置かれた液滴と混ざることなく、保持されるように用いられる(1)〜(6)のいずれかに記載の反応治具。
(8)同一の横列に属する突起状囲いの液滴保持用空間には、同一の種類の溶液の液滴が保持されるように用いられる(1)〜(7)のいずれかに記載の反応治具。
(9)前記溶液が、表面張力低下試薬を含有する反応液または洗浄液である(7)または(8)に記載の反応治具。
(10)前記突起状囲いを有する表面をカバーする覆い部材をさらに有し、かつ前記覆い部材が覆われた空間に湿気を供給する保湿部材をさらに有する(1)〜(9)のいずれかに記載の反応治具。
(11)(1)〜(10)のいずれかに記載の反応治具を用い、
磁気ビーズに固定化した物質を、上記突起状囲いの液滴保持用空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中で、前記基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させることにより、反応及び/または洗浄を行うことを含む、反応方法。
(12)(1)〜(10)のいずれかに記載の反応治具であって、1つの縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及びcDNA合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、
磁気ビーズに固定化したcDNAを得ることを含む、cDNAの合成方法。
(13)複数の縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
各横列の突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液は、同一種類の溶液であり、
縦列を移動させる磁気ビーズに固定化したmRNAは、異なる種類のmRNAであり、
複数の異なる種類のcDNAを、磁気ビーズに固定化したcDNAとして得る、(12)に記載の方法。
(14)前記反応治具は、1つの縦列に、少なくとも4つの突起状囲いが設けられ、
前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間には、細胞溶解用溶液、mRNA洗浄用溶液、cDNA合成用溶液及びcDNA洗浄用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次移動させる、(12)または(13)に記載の方法。
(15)前記反応治具は、突起状囲いを有する表面を下向きにして用いられる、(11)〜(14)のいずれかに記載の方法。
本発明は、基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有する反応治具に関する。
(1)陰イオン系界面活性剤:脂肪酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩
(2)陽イオン系界面活性剤:アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩
(3)両性界面活性剤:アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、
(4)非イオン性界面活性剤:ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル
陰イオン系界面活性剤の代表例として、ドデシル硫酸リチウムをあげることができ、非イオン性界面活性剤の代表例として、TritonX100をあげることができる。
本発明は、上記本発明の反応治具を用いる反応方法を包含する。本発明の反応方法は、磁気ビーズに固定化した物質を突起状囲い(例えば、上記ハの字型突起)の空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中を、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させて、反応及び洗浄を行うことを含む。反応及び洗浄を行う温度は、反応及び洗浄に適した温度を考慮して適宜決定でき、工程ごとに、温度を上下させて調整することもできる。その場合、必要により、例えば、前記覆い部材50および/または60の外側あるいは内部、および/または薄層ガラス板(10)と樹脂フィルム(11)の間または基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面に、加熱および/または冷却装置を設けることもできる。
本発明のcDNAの合成方法は、上記本発明の反応治具であって、1つの縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用いる。前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及び表面張力低下試薬を含有するcDNA合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、磁気ビーズに固定化したcDNAを得ることを含む。
第1のハの字型突起の空間に保持される細胞溶解用溶液は、例えば、100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitolを含む全量3μlの溶液であることができる。
第2のハの字型突起の空間に保持されるmRNA洗浄用溶液は、10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% ドデシル硫酸リチウムを含む全量3μlの溶液であることができる。
第3のハの字型突起の空間に保持される逆転写反応用洗浄溶液は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitorを含む全量3μlの溶液であることができる。
第4のハの字型突起の空間に保持される逆転写反応溶液は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 8 unit SuperScript III Reverse transcriptaseを含む全量3μlの溶液であることができる。
但し、これらは例示であって、これらの溶液に限定される意図ではない。
測定は以下のように行った。純水3μlを各種材料表面に静置し5分後の液滴の状態を顕微鏡にて観察した。液滴の高さA及び材料表面と接触している辺の長さBを測定し、水の接触角θを以下の計算式により求めた。
5'-RACE用cDNA作成
以下に記載するプロトコルに従って5'-RACE用cDNAを作成した。
mRNA結合性磁気ビーズ(25μg)を含む細胞溶解液3μlにBリンパ球1から100個を加え溶解させ、細胞から放出されたmRNAをmRNA結合性磁気ビーズ上に捕捉する。
A行のチューリップ型突起の中心部に上記溶液2〜3μlをスポットする(細胞溶解液滴)。
B行のチューリップ型突起の中心部に、mRNA洗浄用溶液2〜3μlをスポットする(細胞洗浄液滴)。
C行のチューリップ型突起の中心部に、逆転写反応用洗浄液2〜3μlをスポットする(逆転写反応用洗浄液滴)。
D行のチューリップ型突起の中心部に、逆転写反応液2〜3μlをスポットする(逆転写反応用液滴)。
E行のチューリップ型突起の中心部に、3'-テーリング反応用洗浄液2〜3μlをスポットする(3'-テーリング反応用洗浄液滴)。
F行のチューリップ型突起の中心部に、3'-テーリング反応液2〜3μlをスポットする(3'-テーリング反応用液滴)。
G行に反応停止液2〜3μlをスポットする。
H行にPCR反応溶液2〜3μlをスポットする。
プレート底面の薄層ガラス板上からA行の細胞溶解液滴の中心部に向け、小型ネオジム磁石を設置し1秒静置させる。
A行の細胞溶解液滴からB行のmRNA洗浄用液滴へ向け、小型ネオジム磁石を2秒程度かけてゆっくりスライドさせる。このときmRNAを結合した磁気ビーズ集団は数十ナノリットルの水滴として、A行の細胞溶解液滴から離れ、B行のmRNA洗浄用液滴へ移動する。
磁気ビーズが液滴底部に落下した後、上記の操作と同様に小型ネオジム磁石をB行のmRNA洗浄用液滴の中心部に1秒間静置させ、次にC行の逆転写反応用洗浄液滴へ移動させる。
逆転写反応
D行の逆転写反応用液滴に磁気ビーズを移動させた後、プレートは反転させたまま、37〜50℃の保温装置に入れ1時間保温する。この間10分ごとにプレートを反転または前後左右に傾け磁気ビーズを液滴中で撹拌させ十分な酵素反応を行わせる。
磁気ビーズの洗浄を行う。
3'-テーリング反応 プレートを反転させ37℃にて1時間保温する。逆転写反応と同様磁気ビーズの撹拌を行う。
H行に移動させた液はそのまま、5'-RACE法によるDNAの増幅に用いることができる。
RNAウイルス、レトロウイルス含有試料からのcDNA合成法
成人ヒトT細胞白血病ウイルスー1型(HTLV-I)は一本鎖RNAをゲノムとして有するヒトレトロウイルスである。細胞上澄中に分泌されたレトロウイルスを、本発明を用いて検出するため、HTLV-Iを産生する細胞株(MT2)1万個を、1mlのRPMI-10%牛胎児血清培地を用いて24well細胞培養皿にて24時間培養した。まず、本細胞培養液にDNase Iを加え37℃、15分間処理することで、混入した細胞由来のゲノムDNAを分解した。本溶液1μlを、細胞溶解用溶液(100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitol)でそれぞれ10倍から1000万倍に10倍きざみで希釈して7種類の希釈サンプルを調製した。各希釈サンプル1μlを、Oligo-dT磁気ビーズを濃度10mg/mlになるように懸濁した細胞溶解用溶液(100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% ドデシル硫酸リチウム 5mM dithiothreitol)2μlに加え、実施例1と同様の方法でE行の逆転写反応までを7サンプル並行して行った。さらに、希釈サンプルを含まない細胞溶解用溶液もネガティブコントロールとしてE行の逆転写反応までを7サンプルに並行して行った。
B行は、10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% ドデシル硫酸リチウムを含む全量3μlの溶液である。
C行は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitorを含む全量3μlの溶液である。
D行は、50mM Tris HCl (pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase inhibitor, 8 unit SuperScript III Reverse transcriptaseを含む全量3μlの溶液である。
E行は、10mM Tris HCl (pH 7.5), 0.1% Triton X-100, 0.1mM EDTAを含む全量3μlの溶液である。
牛血清アルブミンを含む液滴からの磁気ビーズ移動
A行にそれぞれ、磁気ビーズ(粒径2.8μmのDyanabeads)25μgを含むPBS(10mM phosphate buffer, 120mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.6)を3μl、もしくは磁気ビーズ(粒径2.8μmのDyanabeads)25μgを含む1%牛血清アルブミン-PBS 3μlをスポットした。B行には1%牛血清アルブミン-PBSをスポットした。これを図2に示す反応治具にて37℃で30分加温し、加温により生じる水蒸気が基板表面上で凝結して微小な液滴が形成されることを促進した。尚室温は20℃であった。その後室温にて5分間放置し、小型磁石を用いてA行液滴内の磁気ビーズのB行への移動を試みた。移動後の反応治具の写真を図7に示す。この結果、牛血清アルブミンを含有する液滴においては磁気ビーズの移動が認められたが、牛血清アルブミンを含有しない液滴においては磁気ビーズの移動が認められなかった。
Claims (15)
- 基板の一方の表面に複数の突起状囲いが、整列して設けられており、前記突起状囲いは、少なくとも1つの切欠き部を有し、かつ内部には液滴を保持できる空間を有し、
かつ
前記基板表面の少なくとも前記液滴を保持する面は、純水に対する接触角が90〜150°の範囲である
ことを特徴とする反応治具。 - 前記複数の突起状囲いは、少なくとも一部または全部が、縦横に整列して設けられている請求項1に記載の反応治具。
- 前記突起状囲いの液滴保持用空間は、0.5μL〜200μLの範囲の量の液滴を保持できる請求項1または2に記載の反応治具。
- 突起状囲いは、2つまたは3つの切欠き部を有し、前記切欠き部の開口の間隔は0.5〜10mmの範囲である請求項1〜3のいずれかに記載の反応治具。
- 前記基板表面は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなる請求項1〜4のいずれかに記載の反応治具。
- 前記基板は、パラフィン樹脂、テフロン樹脂またはシリコン樹脂からなるコーティング層を有する請求項1〜4のいずれかに記載の反応治具。
- 各突起状囲いの液滴保持用空間には、同一または異なる種類の溶液の液滴が、他の突起状囲いの液滴保持用空間部分に置かれた液滴と混ざることなく、保持されるように用いられる請求項1〜6のいずれかに記載の反応治具。
- 同一の横列に属する突起状囲いの液滴保持用空間には、同一の種類の溶液の液滴が保持されるように用いられる請求項1〜7のいずれかに記載の反応治具。
- 前記溶液が、表面張力低下試薬を含有する反応液または洗浄液である請求項7または8に記載の反応治具。
- 前記突起状囲いを有する表面をカバーする覆い部材をさらに有し、かつ前記覆い部材が覆われた空間に湿気を供給する保湿部材をさらに有する請求項1〜9のいずれかに記載の反応治具。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の反応治具を用い、
磁気ビーズに固定化した物質を、上記突起状囲いの液滴保持用空間に保持された表面張力低下試薬を含有する溶液の液滴中で、前記基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、順次移動させることにより、反応及び/または洗浄を行うことを含む、反応方法。 - 請求項1〜10のいずれかに記載の反応治具であって、1つの縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間には、表面張力低下試薬を含有する細胞溶解用溶液、及びcDNA合成用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記2つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次、基板の突起状囲いを有する表面とは反対側の表面から磁石を用いて、移動させ、
磁気ビーズに固定化したcDNAを得ることを含む、cDNAの合成方法。 - 複数の縦列に、少なくとも2つの突起状囲いが設けられた反応治具を用い、
各横列の突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液は、同一種類の溶液であり、
縦列を移動させる磁気ビーズに固定化したmRNAは、異なる種類のmRNAであり、
複数の異なる種類のcDNAを、磁気ビーズに固定化したcDNAとして得る、請求項12に記載の方法。 - 前記反応治具は、1つの縦列に、少なくとも4つの突起状囲いが設けられ、
前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間には、細胞溶解用溶液、mRNA洗浄用溶液、cDNA合成用溶液及びcDNA洗浄用溶液の液滴をこの順にそれぞれ保持し、
磁気ビーズに固定化したmRNAを、前記4つの突起状囲いの液滴保持用空間に保持された溶液に、順次移動させる、請求項12または13に記載の方法。 - 前記反応治具は、突起状囲いを有する表面を下向きにして用いられる、請求項11〜14のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009550069A JP5244130B2 (ja) | 2008-01-18 | 2009-01-16 | 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008008767 | 2008-01-18 | ||
JP2008008767 | 2008-01-18 | ||
JP2009550069A JP5244130B2 (ja) | 2008-01-18 | 2009-01-16 | 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 |
PCT/JP2009/050585 WO2009091048A1 (ja) | 2008-01-18 | 2009-01-16 | 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009091048A1 JPWO2009091048A1 (ja) | 2011-05-26 |
JP5244130B2 true JP5244130B2 (ja) | 2013-07-24 |
Family
ID=40885430
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009550069A Active JP5244130B2 (ja) | 2008-01-18 | 2009-01-16 | 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8993241B2 (ja) |
EP (1) | EP2246425B1 (ja) |
JP (1) | JP5244130B2 (ja) |
KR (1) | KR101530408B1 (ja) |
CN (1) | CN101939427B (ja) |
AU (1) | AU2009205104B2 (ja) |
CA (1) | CA2712572C (ja) |
WO (1) | WO2009091048A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102009028338A1 (de) | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Wacker Chemie Ag | Bioreaktor mit Siliconbeschichtung |
DE102009028339A1 (de) | 2009-08-07 | 2011-02-24 | Wacker Chemie Ag | Bioreaktor aus Siliconmaterialien |
EP2703485B1 (en) | 2011-03-30 | 2018-12-26 | National University Corporation University Of Toyama | Method for selecting plasma cells and plasmablasts, and method for producing target antigen-specific antibody |
JP5896550B2 (ja) * | 2011-09-21 | 2016-03-30 | 株式会社 清原光学 | 結晶化プレート |
KR20160062009A (ko) | 2013-09-30 | 2016-06-01 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 항―lps 011 항체 |
IL290959B2 (en) | 2015-06-29 | 2023-04-01 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Preparations containing antibody-drug conjugates and methods for their production |
WO2017026532A1 (ja) | 2015-08-10 | 2017-02-16 | 国立大学法人富山大学 | 抗原特異的モノクローナル抗体作製方法 |
CN105349272B (zh) * | 2015-11-17 | 2018-09-07 | 港龙生物技术(深圳)有限公司 | 一种用于微量移液针的清洗剂及其配制方法和使用方法 |
JP2018057333A (ja) * | 2016-10-06 | 2018-04-12 | 株式会社リコー | 処理キット、処理方法、cDNAの合成方法及び処理装置 |
JP6881801B2 (ja) | 2019-02-18 | 2021-06-02 | 株式会社エヌビィー健康研究所 | 細胞の選抜方法、核酸の製造方法、組換え細胞の製造方法、目的物質の製造方法、医薬組成物の製造方法、及び試薬 |
WO2021020282A1 (ja) | 2019-07-26 | 2021-02-04 | 学校法人埼玉医科大学 | Alk2/acvr1の細胞外領域を認識する抗体 |
JP7209980B2 (ja) | 2020-12-11 | 2023-01-23 | 東洋紡株式会社 | Dnaポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006105705A (ja) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | National Institute For Materials Science | 試料作製用基板と液状試料盛付方法及び試料の製造方法 |
JP2007512507A (ja) * | 2003-10-31 | 2007-05-17 | コミッサリア ア レネルジー アトミーク | 縁取りされた作用区域を備える作用装置、オンチップラボ及びマイクロシステム |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04110579A (ja) * | 1990-08-31 | 1992-04-13 | Toshiba Corp | 製氷装置 |
JP2003315346A (ja) * | 2002-04-19 | 2003-11-06 | Hideyuki Suzuki | マイクロウェルアレイと同マイクロウェルアレイを用いた液体の取り出し方法 |
EP2359689B1 (en) * | 2002-09-27 | 2015-08-26 | The General Hospital Corporation | Microfluidic device for cell separation and use thereof |
CN2575676Y (zh) * | 2002-11-04 | 2003-09-24 | 成都夸常科技有限公司 | 一种多面生物芯片 |
JP2006519384A (ja) | 2003-03-04 | 2006-08-24 | チョンドークァチャンイシュエゴォンイェユーシェンゴォンスー | 極小の高さのリアクターを持つ高集積解析チップとその応用 |
CN1208622C (zh) * | 2003-03-04 | 2005-06-29 | 成都夸常科技有限公司 | 一种反应器隔离结构高度最小化的生物芯片及制备方法 |
NZ545469A (en) | 2003-09-12 | 2009-11-27 | Biocontrol Systems Inc | Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms without a separate DNA extraction step |
JP4769026B2 (ja) * | 2005-06-17 | 2011-09-07 | 凸版印刷株式会社 | 反応容器及びこれを用いた物質の検出方法 |
US8261598B2 (en) * | 2006-03-09 | 2012-09-11 | Agency For Science, Technology And Research | Apparatus for performing a reaction in a droplet and method of using the same |
-
2009
- 2009-01-16 EP EP09703047.2A patent/EP2246425B1/en active Active
- 2009-01-16 CN CN200980102879.8A patent/CN101939427B/zh active Active
- 2009-01-16 CA CA2712572A patent/CA2712572C/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-01-16 JP JP2009550069A patent/JP5244130B2/ja active Active
- 2009-01-16 WO PCT/JP2009/050585 patent/WO2009091048A1/ja active Application Filing
- 2009-01-16 KR KR1020107017949A patent/KR101530408B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2009-01-16 AU AU2009205104A patent/AU2009205104B2/en not_active Ceased
- 2009-01-16 US US12/863,185 patent/US8993241B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007512507A (ja) * | 2003-10-31 | 2007-05-17 | コミッサリア ア レネルジー アトミーク | 縁取りされた作用区域を備える作用装置、オンチップラボ及びマイクロシステム |
JP2006105705A (ja) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | National Institute For Materials Science | 試料作製用基板と液状試料盛付方法及び試料の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6009011638; Pipper J. et al: 'Catching bird flu in a droplet' Nature Medicine vol.13, 2007, p.1259-1263 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101939427B (zh) | 2014-08-13 |
WO2009091048A1 (ja) | 2009-07-23 |
EP2246425A4 (en) | 2012-05-23 |
CA2712572A1 (en) | 2009-07-23 |
AU2009205104A1 (en) | 2009-07-23 |
EP2246425B1 (en) | 2013-07-10 |
KR101530408B1 (ko) | 2015-06-19 |
AU2009205104B2 (en) | 2013-11-21 |
JPWO2009091048A1 (ja) | 2011-05-26 |
EP2246425A1 (en) | 2010-11-03 |
US8993241B2 (en) | 2015-03-31 |
KR20100112163A (ko) | 2010-10-18 |
US20110020879A1 (en) | 2011-01-27 |
CA2712572C (en) | 2016-09-13 |
CN101939427A (zh) | 2011-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5244130B2 (ja) | 反応治具及び反応方法、並びにcDNAの合成方法 | |
US10809257B2 (en) | Method for detecting target molecule | |
US9581527B2 (en) | Apparatus for processing a sample in a liquid droplet and method of using the same | |
AU2021345133A1 (en) | Methods of determining the location of an analyte in a biological sample using a plurality of wells | |
US7931868B2 (en) | Device for the manipulation of limited quantities of liquids | |
JP5719313B2 (ja) | 免疫蛍光計測のための官能化マイクロ流体デバイス | |
Cleveland et al. | Nanoliter dispensing for uHTS using pin tools | |
De Bruyker et al. | Rapid mixing of sub-microlitre drops by magnetic micro-stirring | |
US20130102501A1 (en) | Device for recovery and isolation of biomolecules | |
US20050003521A1 (en) | Addressable microarray device, methods of making, and uses thereof | |
JP2006519384A (ja) | 極小の高さのリアクターを持つ高集積解析チップとその応用 | |
Kudalkar et al. | Coverslip cleaning and functionalization for total internal reflection fluorescence microscopy | |
JP2006519384A5 (ja) | ||
JP2018072134A (ja) | 検出方法及びデバイス |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130326 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130405 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160412 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5244130 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |