JP5219513B2 - 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物 - Google Patents

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Description

本出願は、米国仮出願番号第６０／６１２，４８８号（２００４年９月２３日出願）の出願日の利益を主張し、その全開示を本明細書に援用する。
血管形成、すなわち予め存在している脈管構造の内皮からの新血管の発生は、ホスト内での充実性腫瘍の増殖、プログレッション、及び転移において重要なプロセスである。生理学的に正常な血管形成の間は、血管内皮とその周囲の間質成分とのオートクリン、パラクリン、及びアンフィクリン相互作用は、空間的及び時間的に緊密に調整される。更に、血管新生促進及び血管新生阻害サイトカイン並びに増殖因子のレベル及び活性はバランスが保たれている。反対に、活発な腫瘍増殖に必要な病理学上の血管形成は保持されて持続し、正常な血管形成システムの調節不全を示す。充実性腫瘍及び造血腫瘍種は高レベルの異常な血管形成に特に関係する。
一般的に腫瘍の発生は、急成長する潜在能力を有する自律性クローンの発生を引き起こす連続的で且つ相関性のあるステップから構成されると考えられる。これらのステップは持続的な成長及び制限のない自己複製を含む。腫瘍中の細胞母集団は、一般的に成長シグナルの自給自足、成長抑制シグナルへの低い感応性、及び耐アポトーシス性に特徴付けられる。異常な成長を開始する遺伝子的又は細胞遺伝学的事象は、アポトーシスを防止することにより細胞を長期の「準備」状態に維持する。
本発明は、血管形成及び腫瘍増殖阻害用の薬剤及び治療的処置を提供することを目的とする。
本発明の概要
ある観点において、本発明はEphB4又はエフリンB2で仲介される機能を阻害するポリペプチド薬であり、EphB4及びエフリンB2蛋白質のモノマー性リガンド結合部を含むものを提供する。本明細書において示すように、EphB4及びエフリンB2は癌及び望ましくない又は過度の血管形成に関連した病気を含む種々の病状に関与する。従って、本発明の特定のポリペプチド薬は、これらの病気を治療するために使用できる。更なる観点において、本発明はEphB4及び／又はエフリンB2が、しばしば高レベルで、種々の腫瘍中で発現されるという発見に基づく。従って、EphB4又はエフリンB2機能をダウンレギュレートするポリペプチド薬は、腫瘍細胞への直接的効果及び腫瘍が採用する血管形成プロセスへの間接的効果により腫瘍へ影響を与える。ある実施形態において、本発明はEphB4又はエフリンB2の機能をダウンレギュレートする薬剤を用いた治療に特に適した腫瘍種を特定する。好ましい実施形態において、本明細書に開示するポリペプチドは生体内での血清中半減期が長くなるように修飾される。
ある観点において、本発明はEphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性EphB4ポリペプチドを提供する。この可溶性EphB4ポリペプチドは特異的にエフリンB2ポリペプチドへ結合する。用語「可溶性」は単に、これらのポリペプチドが膜貫通領域を含有しないか、又は生理食塩水中のポリペプチドの溶解度を損なうのに充分な膜貫通領域部分を含有しないことを表すために使用される。可溶性ポリペプチドは単量体として調製されるのが好ましく、エフリンB2等のリガンドへ結合するEphB4と競合し、EphB4の活性化で引き起こされるシグナルを阻害する。随意的に、可溶性ポリペプチドは、例えばFc融合蛋白質として発現することにより、又は別の多量体形成領域と融合することにより、多量体の形態で調製してもよい。これら多量体の形態は、文脈に応じてアゴニスト的又はアンタゴニスト的効果を有する複合的活性を有する。ある実施形態においては、可溶性EphB4ポリペプチドはEphB4蛋白質の球状領域を含有する。可溶性EphB4ポリペプチドは、図６５（SEQ ID NO:10）により特定されるアミノ酸配列の残基１〜５２２と少なくとも９０％は同一の配列を含有し得る。可溶性EphB4ポリペプチドは、図６５（SEQ ID NO:10）により特定されるアミノ酸配列の残基１〜４１２と少なくとも９０％は同一の配列を含有し得る。可溶性EphB4ポリペプチドは、図６５（SEQ ID NO:10）により特定されるアミノ酸配列の残基１〜３１２と少なくとも９０％は同一の配列を含有し得る。可溶性EphB4ポリペプチドは球状(G)領域(図６５のアミノ酸29-197, SEQ ID NO:10)を包含する配列を含有することができ、随意的に追加的領域、例えばシステインリッチな領域(図６５のアミノ酸239-321, SEQ ID NO:10)、第一のフィブロネクチンタイプ３領域(図６５のアミノ酸324-429, SEQ ID NO:10)及び第二のフィブロネクチンタイプ３領域(図６５のアミノ酸434-526, SEQ ID NO:10)を含有することができる。本明細書に記載され、リガンド結合活性をもつとして示された好ましいポリペプチとしては図６５(SEQ ID NO: 10)に示すアミノ酸配列の1-537, 1-427及び1-326それぞれに対応するポリペプチドが挙げられる。可溶性EphB4ポリペプチドは図１又は２(SEQ ID Nos. 1又は2)に記載の配列を含有することができる。斯界で周知のように、HEK293T細胞系といった適切な細胞内で該EphB4ポリペプチドが発現するとリーダーペプチドが切断される。該切断は常に完全であるわけでも、単一部位での完璧な一貫性があるわけでもないが、EphB4は図６５(SEQ ID NO:10)に示される配列の最初の１５個のアミノ酸を除去するように切断される傾向にあることが知られている。従って、具体例として、本発明はエフリンB2に結合し、そして次の群（番号は図６５のSEQ ID NO:10に対応）：1-197, 29-197, 1-312, 29-132, 1-321, 29-321, 1-326, 29-326, 1-412, 29-412, 1-427, 29-427, 1-429, 29-429, 1-526, 29-526, 1-537及び29-537から選択されるアミノ酸配列を含有するプロセシングを受けていない可溶性EphB4ポリペプチドを提供する。更に、異種のリーダーペプチドが内発的リーダー配列に取って代わることもできる。ポリペプチドは次の群（番号は図６５のSEQ ID NO:10に対応）：16-197, 16-312, 16-321, 16-326, 16-412, 16-427, 16-429, 16-526及び16-537から選択される予測アミノ酸配列を有するプロセシングを受けた形態で使用してもよい。更に、可溶性EphB4ポリペプチドは、エフリンB2結合活性を保持しつつ、先行するアミノ酸配列の何れかに少なくとも９０％（随意に９５％又は９９％）は同一であるアミノ酸配列を含有するものとすることができる。好ましくは、図６５（SEQ ID NO:10）に示される配列からのアミノ酸配列の変異は何れも１，２，３，４又は５個以下のアミノ酸の保存的変化又は欠失であり、とりわけ表面ループ部位での変異である。ある実施形態においては、可溶性EphB4ポリペプチドは、エフリンB2とEphB4の間の相互作用を阻害し得る。可溶性EphB4ポリペプチドは、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害し得る。エフリンB2又はEphB4のリン酸化は一般的にこれらの蛋白質により調節される細胞内シグナル経路を刺激する初期事象の一つであると考えられる。上述したように、可溶性EphB4ポリペプチドは単量体又は多量体融合蛋白質として調製し得る。可溶性ポリペプチドは１以上の修飾アミノ酸を含有してもよい。これらアミノ酸はプロテアーゼ消化耐性の増加等の望ましい性質に寄与し得る。
本発明はエフリンB2結合活性を保持しつつ、血清中半減期を長くする追加的成分を有する可溶性EphB4ポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、可溶性EphB4ポリペプチドは単量体であり、１又は２以上のポリオキシアルキレン基（例：ポリエチレン、ポリプロピレン）、好ましくはポリエチレングリコール（PEG）基に共有結合する。従って、本発明は一観点において、修飾がポリペプチドに共有結合した単一のポリエチレングリコール基を含む修飾EphB4ポリペプチドを提供する。別の観点においては、本発明は１、２、３又は４以上のポリエチレングリコール基に共有結合した修飾EphB4ポリペプチドを提供する。
１又は２以上のＰＥＧは約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、好ましくは約１０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ又は約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有し得る。ＰＥＧ基は直鎖状ＰＥＧ及び分枝鎖状ＰＥＧであってよい。好ましい実施形態においては、可溶性で単量体のEphB4共役体は約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ又は約１５ｋＤａ〜３０ｋＤａのＰＥＧ基に、好ましくはEphB4リジンのε−アミノ基又はＮ末端アミノ基を介して、共有結合した１つのEphB4ポリペプチド（モノＰＥＧ化EphB4）を含む。最も好ましくは、EphB4はEphB4リジンのε−アミノ基及びＮ末端アミノ基からなる群からの１つのアミノ基のところでランダムにＰＥＧ化される。
一実施形態において、本発明により提供されるＰＥＧ化ポリペプチドは生体内における血清中半減期が非修飾EphB4ポリペプチドよりも少なくとも５０％、７５％、１００％、１５０％又は２００％長い。別の一実施形態において、本発明により提供されるＰＥＧ化ポリペプチドはエフリンB2の活性を阻害する。特定の実施形態において、本発明により提供されるＰＥＧ化ポリペプチドはエフリンB2受容体のクラスター化、エフリンB2のリン酸化及び／又はエフリンB2キナーゼ活性を阻害する。
驚くべきことに、本発明に係るモノＰＥＧ化EphB4は非修飾の可溶性EphB4ポリペプチド及びポリＰＥＧ化EphB4よりも治療上の利用性に対して優れた特性をもつことを見出した。但し、本発明ではＰＥＧを２箇所以上有するポリＰＥＧ化EphB4も提供する。そのようなポリＰＥＧ化した形態も非修飾の形態よりは血清中半減期が向上する。
ある実施形態において、可溶性EphB4ポリペプチドはEphrinB2結合性を実質的に減ずることなく半減期を向上させる第二の安定化ポリペプチドに安定的に結合する。安定化ポリペプチドは好ましくはヒト患者（又は獣医学的使用が企図される場合には動物患者）と免疫適合性のあるものであり、有意な生物学的活性がほとんど又は全くないものである。
好ましい実施形態においては、安定化ポリペプチドはヒト血清アルブミン又はその一部である。ヒト血清アルブミンはEphB4ポリペプチドと安定的に共有結合又は非共有結合する。共有結合はヒト血清アルブミンとの同時翻訳融合体としてEphB4ポリペプチドが発現することで達成され得る。アルブミンの配列は可溶性EphB4ポリペプチドにおけるＮ末端、Ｃ末端又は非破壊的な内部位置で融合することができる。EphB4の露出したループはアルブミンの配列を挿入するのに適切な位置であろう。アルブミンは、例えば化学的架橋によって、EphB4ポリペプチドの翻訳後に結合してもよい。また、EphB4ポリペプチドは２以上のアルブミンポリペプチドと安定的に結合することもできる。ある実施形態においては、アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）よりなる群から選択される。他の実施形態においては、アルブミンは自然に生じる変異体である。好ましい実施形態においては、EphB4−ＨＳＡ融合体はエフリンB2及びEphB4の間の相互作用、エフリンB2又はEphB4のクラスター化、エフリンB2又はEphB4のリン酸化、或いはこれらの組合せを阻害する。別の一実施形態においては、EphB4−HSA融合体は非修飾野生型ポリペプチドよりも生体内での安定性が高い。
ある観点において、本発明はエフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性エフリンB2ポリペプチドを提供する。該可溶性エフリンB2ポリペプチドはEphB4ポリペプチドに特異的に結合する。用語「可溶性」は単に、これらのポリペプチドが膜貫通領域を含有しないか、又は生理食塩水中のポリペプチドの溶解度を損なうのに充分な膜貫通領域の部分を含有しないことを表すために使用される。可溶性ポリペプチドは単量体として調製されるのが好ましく、EphB4等のリガンドへ結合するエフリンB2と競合し、エフリンB2の活性化で引き起こされるシグナルを阻害する。随意的に、可溶性ポリペプチドは、例えばFc融合蛋白質として発現することにより、又は別の多量体形成領域と融合することにより、多量体の形態で調製してもよい。これら多量体の形態は、文脈に応じてアゴニスト的又はアンタゴニスト的効果を有する複合的活性を有する。可溶性エフリンB2ポリペプチドは図６６（SEQ ID NO:11）により特定されるアミノ酸配列の残基１〜２２５を有し得る。可溶性エフリンB2ポリペプチドは図３によって特定される配列を有し得る。斯界で周知のように、ＨＥＫ２９３Ｔのような適切な細胞内で該エフリンB2ポリペプチドを発現するとリーダーペプチドを切断することになる。該切断は常に完全というわけでも、単一部位のところで完璧に一致するわけでもないが、エフリンB2は図６６（SEQ ID NO:11）に示す配列の最初の２６個のアミノ酸を除去するように切断される傾向があることが知られている。従って、具体例として、本発明はEphB4に結合し、図６６（SEQ ID NO:11）のアミノ酸１−２２５に対応するアミノ酸配列を含有するプロセシングを受けていない可溶性エフリンB2ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは次の群（番号は図６６のSEQ ID NO:11に対応）：２６−２２５から選択される予測アミノ酸配列を有するプロセシングを受けた形態で使用してもよい。ある実施形態においては、可溶性エフリンB2ポリペプチドは、エフリンB2とEphB4の間の相互作用を阻害し得る。可溶性エフリンB2ポリペプチドは、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害し得る。上述したように、可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体又は多量体融合蛋白質として調製し得る。可溶性ポリペプチドは１以上の修飾アミノ酸を含有してもよい。これらアミノ酸はプロテアーゼ消化耐性の増加等の望ましい性質に寄与し得る。
ある観点において、本発明はポリペプチド薬及び製薬上許容し得る担体を含有する医薬処方物を提供する。ポリペプチド薬は、例えば可溶性EphB4又はエフリンB2ポリペプチドを含めて、本明細書に記載の何れともすることができる。更なる処方物としては化粧組成物及び診断用キットが挙げられる。
ある観点において、本発明は、細胞内でエフリンB2／EphB4経路を通るシグナルの阻害方法を提供する。上記方法は、細胞を有効量のポリペプチド薬と接触させるステップを含む。ポリペプチド薬としては例えば（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であり、エフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する）；（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する）が挙げられる。
ある観点において、本発明は腫瘍の増殖速度を減少させるのに充分な量のポリペプチド薬を投与することを含む腫瘍の増殖速度を減少させる方法である。ポリペプチド薬は：
（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する。随意的に、上記EphB4ポリペプチドは血清中半減期を長くするためのＰＥＧ化、血清アルブミン又はその両方といった追加的修飾を含有する。）；
（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する。）；
よりなる群から選択することができる。
随意的に、腫瘍は同等組織の非癌化細胞よりも高いレベルでエフリンB2及び／又はEphB4を発現する細胞を含む。
ある観点において、本発明は癌患者を治療する方法を提供する。上記方法はポリペプチド薬を患者へ投与することを含む。ポリペプチド薬は：
（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する。随意的に、上記EphB4ポリペプチドは血清中半減期を長くするためのＰＥＧ化、血清アルブミン又はその両方といった追加的修飾を含有する。）；
（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する。）；
よりなる群から選択することができる。
随意的に、癌は同等組織の非癌化細胞よりも高いレベルでエフリンB2及び／又はEphB4を発現する癌細胞を含む。癌は転移性癌でもよい。癌は結腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺腫瘍、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫及び白血病よりなる群から選択され得る。随意的に、上記癌は血管形成に依存する癌又は血管形成に依存しない癌である。本発明で使用されるポリペプチド薬は、エフリンB2又はEphB4のクラスター化又はリン酸化を阻害し得る。ポリペプチド薬は、ポリペプチド薬と付加的又は相乗的に癌細胞を抑制する１種以上の追加的抗癌化学療法薬と共投与してもよい。
ある観点において、本発明は血管形成阻害方法を提供する。上記方法は血管形成の阻害に充分な量のポリペプチド薬と細胞を接触させるステップを含む。ポリペプチド薬は：
（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する。随意的に、上記EphB4ポリペプチドは血清中半減期を長くするためのＰＥＧ化、血清アルブミン又はその両方といった追加的修飾を含有する。）；
（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する。）；
よりなる群から選択することができる。
ある観点において、本発明はポリペプチド薬を患者へ投与するステップを含む血管形成関連疾患の患者を治療する方法を提供する。ポリペプチド薬は：
（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する。随意的に、上記EphB4ポリペプチドは血清中半減期を長くするためのＰＥＧ化、血清アルブミン又はその両方といった追加的修飾を含有する。）；
（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する。）；
よりなる群から選択することができる。可溶性ポリペプチドは製薬上許容し得る担体と共に処方することができる。血管形成関連疾患又は望ましくない血管形成関連プロセスは血管形成依存性癌、良性腫瘍、炎症性障害、慢性関節リューマチ及び乾癬、眼性血管形成病、オスラーウェバー症候群、心筋性血管形成、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、繊維血管腫、毛細血管拡張乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新生血管形成及び脈管形成よりなる群から選択され得る。ポリペプチド薬は可溶性ポリペプチドと追加的又は相乗的に血管形成を抑制する少なくとも１種の追加的抗血管形成薬と共投与してもよい。
ある観点においては、本発明は癌又は血管形成関連障害の治療薬の製造におけるポリペプチド薬の使用を提供する。ポリペプチド薬は：
（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する。随意的に、上記EphB4ポリペプチドは血清中半減期を長くするためのＰＥＧ化、血清アルブミン又はその両方といった追加的修飾を含有する。）；
（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する。）；
よりなる群から選択することができる。
ある観点においては、本発明は下記：
（ａ）患者中のEphB4及び／又はエフリンB2を発現する複数の癌細胞を有する腫瘍を特定するステップ；並びに
（ｂ）ポリペプチド薬を患者へ投与するステップ；
を含有する。
ポリペプチド薬は：
（ａ）EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記EphB4ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドへ特異的に結合する。随意的に、上記EphB4ポリペプチドは血清中半減期を長くするためのＰＥＧ化、血清アルブミン又はその両方といった追加的修飾を含有する。）；
（ｂ）エフリンB2蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有する可溶性ポリペプチド（但し、上記可溶性エフリンB2ポリペプチドは単量体であり、EphB4ポリペプチドへ高親和性で結合する。）；
よりなる群から選択することができる。
ある観点においては、本発明はエフリンB2又はEphB4アンタゴニストでの治療が適切である腫瘍を特定する方法を提供する。上記方法は、腫瘍細胞中に１以上の下記特徴を検出する方法を含有してもよい：（ａ）EphB4蛋白質及び／又はｍＲＮＡの発現；（ｂ）エフリンB2蛋白質及び／又はｍＲＮＡの発現；（ｃ）EphB4遺伝子の遺伝子増幅（例：遺伝子複製数の増加）；又は（ｄ）エフリンB2遺伝子の遺伝子増幅。上記特徴（ａ）〜（ｄ）の１以上を有する腫瘍細胞は、本発明のポリペプチド薬等の、エフリンB2又はEphB4アンタゴニストでの治療が適切であろう。
驚くべきことに、本発明者は球状領域を欠失したEphB4ポリペプチドが異種移植モデル内の腫瘍増殖を実際に阻害し、血管内皮細胞の管形成を阻害し、及びエフリンB2によって活性化されるEphB4の自己リン酸化蛋白質（autokinase）活性を阻害することができることを見出した。如何なる作用機構にも拘束されることを望まないが、該ポリペプチドはEphB4の凝集を予防するか又は原形質膜からのEphB4の排除を（例：エンドサイトーシスにより）刺激すると予測される。しかして、本発明はEphB4蛋白質のフィブロネクチンタイプ３領域のアミノ酸配列を含有する単離された可溶性ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは好ましくはEphB4又はエフリンB2蛋白質の活性（例：凝集やキナーゼ活性）を阻害するような、とりわけヒト又は癌のマウス異種移植モデル中の腫瘍増殖を阻害するような生物学的活性を有する。該ポリペプチドは生体内又は細胞ベースのアッセイ系で脈管形成を阻害することもできる。該ポリペプチドはエフリンB2には結合せずに、EphB4蛋白質の球状領域の全て又は機能性（例：エフリンB2結合性）部分を特異的に排除する場合がある。該ポリペプチドは好ましくは図６５（SEQ ID NO:10）の配列のアミノ酸３２４−４２９及び／又は４３４−５２６に対応するアミノ酸、或いはこれと少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％は同一の配列を含有する。該ポリペプチドの一例をSEQ ID NO:15に示す。該ポリペプチドは本明細書に記載の任意の方法で修飾してもよく、単量体として又は２以上のポリペプチドを含有する二量体若しくは多量体（例えばＦｃ融合コンストラクト）として製造してもよい。二量体又は多量体が該ポリペプチドの効果を高めるのに望ましいであろう。該ポリペプチドを製造及び使用するための方法の全てはその他のEphB4ポリペプチドに関して本明細書で記載する方法と同様である。
Ｉ．概説
本発明の一部は、エフリン／エフリンレセプター（エフリン/eph）経路を経由するシグナルが腫瘍生成に貢献することを発見したことに基づいている。発明者らは、腫瘍組織中のエフリンB2及びEphB4の発現を検出し、エフリン／エフリンレセプターを経由するシグナルをブロックする抗腫瘍治療薬を開発した。更に、本発明は、EphB4及び／又はエフリンB2のポリペプチド-ベースの機能阻害のためのポリペプチド治療薬及び方法を提供する。従って、本発明はある観点において、癌並びに血管形成関連障害及び望ましくない血管形成関連プロセスを治療するために使用できる数多くのポリペプチド化合物（薬）を提供する。本発明者は修飾された形態のエフリンB2及びEphB4ポリペプチドを作り出し、該修飾形態が薬物動態学を顕著に向上させることを実証した。従って、本発明はある観点において、癌並びに血管形成関連障害及び望ましくない血管形成関連プロセスを治療するために使用できる数多くのポリペプチド化合物（薬）を提供する。
ここで使用される用語「エフリン」及び「Eph」は、それぞれリガンド及びレセプターを指すものとして使用される。それらは種々の動物（例えば、ほ乳類／非ほ乳類、脊椎動物／非脊椎動物、ヒト等）のいずれかからでも得られる。この分野の命名法は急速に変化しており、ここで使用される用語法は、Eph命名法委員会による作業の結果として提案されたものであり、以前使用されていた名前と共にウェッブサイトhttp://www.eph-nomenclature.com.でアクセスできる。
本発明の研究は、とりわけ実施例中では、エフリンB2及びEphB4に関する。しかし、本発明は、腫瘍中で発現されるそれぞれのファミリー中のエフリンリガンド及び／又はEphレセプターのいずれかを意図する。エフリン（リガンド）は２種の構造的タイプからなり、それは配列関係を基礎として、及び機能的にはそれらが２種の対応するレセプターサブグループを示す選択的結合を基礎として更に分けられる。構造的に、２種のエフリンが存在する。即ち、グリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンケージにより膜結合するものと、膜貫通領域を通して結合するものである。従来リガンドは、選択的にEphＡレセプターへ結合するＧＰＩ-結合された蛋白質であるエフリン-Ａサブクラス、及び一般的に選択的にEphＢレセプターへ結合する膜貫通蛋白質であるエフリン-Ｂサブクラスへ分割されている。
Ephファミリーレセプターは、レセプター蛋白質-チロシンキナーゼのファミリーであり、それはエリスロポエチン-生産ヒト肝細胞性癌細胞系中でのその発現のために命名されたEphに関係する。それらはそれらの細胞外領域配列の関連性及びそれらのエフリン-Ａ蛋白質又はエフリン-Ｂ蛋白質へ選択的に結合する能力を基礎として２個のサブグループへ分離される。エフリン-Ａ蛋白質と選択的に相互作用するレセプターは、EphＡレセプターであり、エフリン-Ｂ蛋白質と選択的に相互作用するものはEphＢレセプターである。
Ephレセプターは、リガンド結合球状領域、その次に一対のフィブロネクチンタイプIIIリピートが続くシステインリッチ領域から構成される細胞外領域を有する（例えば、図１６参照）。細胞質領域は、２種の蛋白質チロシンキナーゼ領域、即ち無菌性α-モチーフ（ＳＡＭ）及びＰＤＺ-領域結合モチーフの保存されたチロシン残基を含有する膜近傍（juxtamembrane）領域から構成される。EphB4は膜結合性リガンドエフリンB2に対して特異的である（Sakano、S.ら1996;Brambilla R.ら1995）。エフリンB2は、膜貫通領域及び５個の保存されたチロシン残基及びＰＤＺ領域を有する細胞質領域を有するEphリガンドの種類に属する。Ephレセプターは、クラスター化され、膜へ結合したエフリンの結合により活性化され（Davis S.ら、1994）、レセプターを発現している細胞及びリガンドを発現している細胞間を接触することがEph活性化に要求されることを示す。
リガンド結合において、Ephレセプターは二量体化し、自己リン酸化して膜近傍チロシン残基を完全活性化させる（Kalo MSら、1999、BinnsKS、2000）。更にEphレセプターを経由するシグナルに加えて、リバースシグナルがエフリンＢｓを経由して発生できる。エフリンのEph結合（engagement）は、保存された細胞内チロシンの急速なリン酸化を生じ（Bruckner K、1997）、ＰＤＺ結合蛋白質のレクルートメントをいくらか遅延させる（Palmer A 2002）。近年、いくつかの研究でEph／エフリンの高い発現は腫瘍増殖、腫瘍原性、及び転移の可能性の増大に関係することが示された（Easty DJ、1999;Kiyokawa E、1994;Tang XX、1999;Vogt T、1998;Liu W、2002;Stephenson SA、2001;Steube KG 1999;Berclaz G、1996）。
ある実施形態において、本発明はエフリンB2、EphB4、又は両方の活性を阻害するポリペプチド治療薬を提供する。ここで使用される用語「ポリペプチド治療薬」又は「ポリペプチド薬」は、エフリンB2／EphB4経路を経由するシグナルをブロックするいずれのポリペプチドをも含む総称名である。本発明の好ましいポリペプチド治療薬は、エフリンB2又はEphB4の可溶性ポリペプチドである。本発明の別の好ましいポリペプチド治療薬は、エフリンB2又はEphB4へ結合するアンタゴニスト抗体である。例えば、これらポリペプチド治療薬は、エフリンB2又はEphB4の機能を阻害でき、エフリンB2及びEphB4間の相互作用を阻害でき、エフリンB2又はEphB4のリン酸化を阻害でき、又はエフリンB2のEphB4への結合に対する下流シグナルイベントのいずれかを阻害できる。そのようなポリペプチドには、例えばPEG化により又は血清アルブミン蛋白質と安定に結合することにより、血清中半減期を改善するように修飾されているEphB4又はエフリンB2を挙げることができる。
II．可溶性ポリペプチド
ある観点において、本発明はエフリンB2蛋白質の細胞外領域を含有する可溶性ポリペプチド（ここでエフリンB2可溶性ポリペプチドと言う）又はEphB4蛋白質の細胞外領域を含有する可溶性ポリペプチド（ここでEphB4可溶性ポリペプチドと言う）に関する。好ましくは、本発明の可溶性ポリペプチドは単量体であり、高親和でエフリンB2又はEphB4へ結合できる。特に、本発明のEphB4可溶性ポリペプチドは、EphB4蛋白質の球状領域を含有する。一例としてEphB4可溶性ポリペプチドを図１、２及び１５に示す。エフリンB2可溶性ポリペプチドの一例は図３及び１４に示す。
ここで使用される本発明の可溶性ポリペプチドは、EphB4可溶性ポリペプチド又はエフリンB2可溶性ポリペプチドのフラグメント、機能的変異体及び修飾体を含む。これらの本発明の可溶性ポリペプチドのフラグメント、機能的変異体及び修飾体は、EphB4、エフリンB2又は両方の機能をアンタゴナイズする。
ある実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドの単離されたフラグメントは、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドをエンコードする核酸の対応するフラグメントから組み換え的に生産されるポリペプチドのスクリーニングにより得ることができる。更に、フラグメントは、従来のMerrifield固体相（合成法）ｆ-Ｍｏｃ又はｔ-Ｂｏｃ化学等の公知の技術を使用して化学的に合成できる。フラグメントは（組み換え的に又は化学合成により）生産され、EphB4又はエフリンB2の機能を阻害するように働くことのできるそれらのペプチジルフラグメントを特定するために、例えば血管形成又は腫瘍増殖を阻害するフラグメントの能力の試験により試験されてもよい。
ある実施形態において、EphB4可溶性ポリペプチドの機能的変異体は、図６５（SEQ ID NO:10）によって特定されるアミノ酸配列の残基1-197, 29-197, 1-312, 29-132, 1-321, 29-321, 1-326, 29-326, 1-412, 29-412, 1- 427, 29-427, 1-429, 29-429, 1-526, 29-526, 1-537及び29-537に少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。該ポリペプチドはプロセシングを受けた形態であってもよく、従って、ある実施形態においては、EphB4可溶性ポリペプチドは図６５（SEQ ID NO:10）によって特定されるアミノ酸配列の残基16-197, 16-312, 16-321, 16-326, 16-412, 16-427, 16-429, 16-526及び16-537に少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含有する。
別の実施形態においては、エフリンB2可溶性ポリペプチドの機能的変異体は、図６６（SEQ ID NO:11）によって特定されるアミノ酸配列の残基1-225に少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一である配列を含有するか、或いは、図６６（SEQ ID NO:11）によって特定されるアミノ酸配列の残基26-225に少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含有するようなプロセシングを受けた形態である。
ある実施形態において、本発明は治療用若しくは予防的効能、又は安定性（例えば、ex vivoでの貯蔵寿命及びin vivoでの耐蛋白質分解性変質（degradation））の強化を目的として、本発明の可溶性ポリペプチドの構造を改質することによる機能的変異体の製造も意図する。これら改質可溶性ポリペプチドは天然EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドの機能的均等物と考えられる。改質可溶性ポリペプチドは、例えばアミノ酸の置換、欠失又は添加により生産できる。本発明では、例えばロイシンをイソロイシン又はバリンと、アスパルテートをグルタメートと、スレオニンをセリンとの単離された置換、又はそのアミノ酸と構造的に関係するアミノ酸との同様な置換（例えば、保存的突然変異）は分子を生じる生物学的活性へ大きな影響を及ぼさないと理解することは当然である。保存的置換とは、それらの側鎖に関係するアミノ酸のファミリー内で置換することである。
本発明は更に、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドの一連の組み合わせ突然変異体の製造方法、並びに突然変異体のトランケーション方法、機能的変異体配列の特定に特に有用である方法を意図する。組み合わせライブラリー等のスクリーニングの目的は、例えば、EphB4、EphB2又は両方のアンタゴニストとして作用する可溶性ポリペプチド変異体の製造にもある。それは、組み合わせ由来の変異体が天然可溶性ポリペプチドに関する選択的能力を有するように生成できる。これら変異体蛋白質は、組み換え型ＤＮＡ構築物から発現された場合、遺伝子治療法プロトコル中に使用できる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型可溶性ポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生み出すことが出来る。例えば、変異した蛋白質は、蛋白質分解性変質又は本発明の蛋白質（例えば、可溶性ポリペプチド）の分解さもなければ活性化を生じる他の細胞性プロセスに対してより安定又はより不安定のいずれにも設定できる。これら変異体、及びそれらをエンコードする遺伝子は、それらの半減期の調整により本発明の可溶性ポリペプチドレベルを変えるために使用できる。例えば、短い半減期は、より一時的な生物学的効果を生じ、誘導可能な発現システムの一部である場合には、細胞中の組み換え型可溶性ポリペプチドレベルのより精密なコントロールを可能にする。上記のように、これら蛋白質、及び好ましくはそれらの組み換え型核酸構築物は、遺伝子治療プロトコル中で使用できる。
能力のある（potential）ホモログのライブラリーが縮重（degenerate）オリゴヌクレオチド配列からの生成可能である方法が多く知られている。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機中で実施でき、及び合成遺伝子は次に発現用の適切な遺伝子へライゲートされる。遺伝子の縮重セットの目的は、１の混合物中に能力のある可溶性ポリペプチド配列の目的とするセットをエンコードする全ての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は当分野で公知である（例えば、Narang、SA（1983）tetrahedron 39:3;Itakuraら、（1981）組み換え型DNA、Proc.第3回クリーブランドシンポジウム、Macromolecules、A G Walton編、アムステルダム:Elsevier pp273-289;Itakuraら、（1984）Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakuraら、（1984）Science198: 1056;Ikeら、（1983）「核酸」Res. 11:477参照）。これら技術は、他の蛋白質の直接的発展に使用されてきた（例えば、Scottら、（1990）Science、249:386-390;Robertsら、（1992）PNAS USA89:2429-2433;Devlinら、（1990）Science、249:404-406;Cwirlaら、（1990）PNAS USA87:6378-6382;並びに米国特許番号第５２２３４０９号、５１９８３４６号、及び５０９６８１５号参照）。
又、他の突然変異誘発の形も、組み合わせライブラリーを生成するために使用出来る。例えば、可溶性ポリペプチド変異体（例えば、アンタゴニスト体）は、合成してライブラリーから下記方法により単離できる：例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発等を使用したスクリーニング（Rufら、（1994）Biochemistry33: 1565-1572;Wangら、（1994）J.Biol.Chem.269:3095-3099;Balintら、（1993）Gene 137: 109-118;Grodbergら、（1993）Eur.J.Biochem.218:597-601;Nagashimaら、（1993）J.Biol.Chem.268:2888-2892;Lowmanら、（1991）Biochemistry30:10832-10838;及びCunninghamら、（1989）Science244:1081-1085）;リンカースキャニング突然変異誘発（Gustinら、（1993）Virology193:653-660;Brownら、（1992）Mol.Cell Biol.12:2644-2652;McKnightら、（1982）Science232:316）;飽和突然変異誘発（Meyersら、（1986）Science232:613）;PCR突然変異誘発（Leungら、（1989）Method Cell Mol Biol 1:11-19）;又は化学突然変異誘発等のランダム突然変異誘発（Millerら、（1992）「細菌遺伝子学短期コース」CSHL出版、コールドスプリングハーバー、NY;及びGreenerら、（1994）Strategies in Mol Biol 7:32-34）合成できる。リンカースキャニング突然変異誘発は、好ましくは組み合わせ的設定で、本発明の可溶性ポリペプチドの短縮された（生物活性な）形を特定するために魅力的な方法である。
点突然変異及びトランケーションにより構築された（遺伝子）組み合わせライブラリーの遺伝子生成物のスクリーニング、詳しくは所定の性質を有する遺伝子生成物用のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用には広い範囲の技術が当分野で公知である。これら技術は、本発明の可溶性ポリペプチドの組み合わせ突然変異誘発により作成された遺伝子ライブラリーの素早いスクリーニングに一般的に適用できる。最も広く使用されている巨大遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術として一般的には、遺伝子ライブラリーの複製可能な発現ベクターへのクローニング、ベクターのライブラリーを生じる適切な細胞の形質変換、及び、目的とする活性の検出がその生成物が検出される遺伝子をエンコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下での組み合わせ的遺伝子の発現が挙げられる。組み合わせ突然変異誘発技術により作成された大量の縮重配列をスクリーンするために必要な、それぞれの下記例示的アッセイが、高スループット分析に適している
ある実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドは、ペプチド及びペプチドミメティック等の小分子を含む。ここで使用される用語「ペプチドミメティック」は、化学的に改質ペプチド及び非天然アミノ酸、ペプトイド等を含むペプチド様分子を包含する。ペプチドミメティックは、元のペプチドへ被験者へ投与された際に強化された安定性を含む種々の利点を与える。ペプチドミメティックの特定方法は当分野で公知であり、能力のあるペプチドミメティックのライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。例えば、ケンブリッジ構造データベースは、公知の結晶構造を有する３０００００を超える化合物のコレクションを含む（Allenら、Acta Crystallogr.セクションB、35:2331（1979））。ターゲット分子の非結晶構造が可能な場合、ある構造は例えばプログラムCONCORD（商標）（Rusinkoら、J.Chem.Inf.Comput.Sci.29:251（1989））を使用して製造できる。別のデータベース、「Available Chemicals Directory」（Molecular Design Limited社製、情報システム；サンレアンドロ カリフォルニア）は、市販されている約１０００００の化合物を含有し、それらも又、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドの能力のあるペプチドミメティックを特定できる。
ある実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドは、更に翻訳後修飾を含有してもよい。翻訳後の蛋白質修飾の例にはリン酸化、アセチル化、メチル化、ADP-リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、SUMO化、ビオチニル化、又はポリペプチド側鎖若しくは疎水性基の付加が挙げられる。その結果、修飾された可溶性ポリペプチドは脂質、多糖若しくは単糖、及びリン酸等の非アミノ酸要素を含有してもよい。これら非アミノ酸要素が可溶性ポリペプチドの機能に与える効果については、EphB4又はエフリンB2機能でのそのアンタゴナイズ的性質、例えばそれが阻害的に血管形成又は腫瘍増殖に影響するか、を試験することができる。
本発明の一具体例において、主題の可溶性ポリペプチドの修飾形態は主題の可溶性ポリペプチドに結合した非蛋白質性ポリマーを含有する。一具体例においては、該ポリマーは米国特許第4,640,835号; 同第4,496,689号; 同第4,301,144号; 同第4,670,417号; 同第4,791,192号又は同第4,179,337号に記載のような、ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンである。本発明の修飾ポリペプチドの例にはＥＰＧ化された可溶性エフリンB2及びＰＥＧ化された可溶性EphB4が挙げられる。
ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであって、商業的に入手可能であり又は斯界に周知の方法（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）によってエチレングリコールの開環重合により調製可能である。用語“ＰＥＧ”は、ＰＥＧの末端における大きさや修飾に関係なく、任意のポリプロピレングリコール分子を包含するように広く使用され、次式：
X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH （１）（式中、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨ又は末端修飾（例：Ｃ1-4アルキル）である。一実施形態において、本発明のＰＥＧは一端がヒドロキシ若しくはメトキシ、すなわち、Ｈ又はＣＨ3（“メトキシ”ＰＥＧ）で終了する。ＰＥＧは結合反応に必要な化学基（分子の化学合成によるもの又は分子の部分に最適距離を与えるためのスペーサー）を更に含有することができる。加えて、ＰＥＧは相互に結合した１又は２以上のＰＥＧ側鎖から構成されることができる。分枝状ＰＥＧは例えばポリエチレンオキシドを種々のポリオール、例えばグリセロール、ペンタエリスリトール及びソルビトールに付加することで調製可能である。分枝状ＰＥＧは例えばEP-A 0 473 084及び米国特許第5,932,462号に記載されている。ＰＥＧの一形態としては、二つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）がリジンの第１級アミノ基を介して結合しているものが挙げられる（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。
ペプチド又は蛋白質へのＰＥＧ共役は一般にＰＥＧの活性化と、活性化されたＰＥＧ中間体の目標となる蛋白質／ペプチドへの直接的な連結又はリンカー（リンカーはその後活性化されて目標となる蛋白質／ペプチドへ連結する）への連結を伴う（Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977) and J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky, et al., and Harris et. al., in: Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22参照）。ＰＥＧ含有EphB4は共役蛋白質としても知られているが、結合ＰＥＧ分子を欠いている蛋白質は非共役と呼ぶことができるに注意されたい。
任意の分子量のＰＥＧを実用上望ましいように使用することができ、例えば約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは２０〜２３００）として、可溶性EphB4又はエフリンB2ペプチドに共役させることができる。ＰＥＧ中の反復単位“ｎ”はダルトンで表された分子量に対する近似である。活性化されたリンカー上のＰＥＧの連結分子量は医薬用途に適している。従って、一実施形態においては、ＰＥＧ分子の分子量は１００，０００Ｄａを超えない。例えば、リンカーにＰＥＧ分子が三つ結合しているとき、各ＰＥＧ分子の分子量が同じ１２，０００Ｄａ（各ｎは約２７０）である場合は、リンカー上のＰＥＧの全分子量は約３６，０００Ｄａ（ｎの合計は約８２０）である。リンカーに結合したＰＥＧの分子量は異なる可能性もあり、例えば、リンカー上の三分子のうち、二つのＰＥＧ分子がそれぞれ５，０００Ｄａ（各ｎは約１１０）で、一つのＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａ（ｎは約２７０）となり得る。
本発明の具体例では、EphB4ポリペプチドは次式：−CO−(CH2)X−(OCH2CH2)m−OＲで表される一つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合し、ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（カルボニル）はEphB４のアミノ基の一つとアミド結合を形成する。ここで、Ｒは低級アルキルであり、ｘは２又は３であり、ｍは約４５０〜約９５０であり、ｎ及びｍは共役体の分子量からEphB4蛋白質の分子量を引いた値が約１０〜４０ｋＤａとなるように選択される。一実施形態においては、EphB4におけるリジンのε-アミノ基が利用可能な（遊離）アミノ基である。
上記共役体はより具体的には次式（II）：P−NHCO−(CH2)X−(OCH2CH2)m−OR (II)で表すことができる。式中、Ｐは本明細書に記載のEphB4蛋白質（すなわち、式（II）に示すカルボニルとアミド結合を形成する１又は２以上のアミノ基が存在しないもの）の基であり、Ｒは低級アルキルであり、ｘは２又は３であり、ｍは約４５０〜約９５０であって、共役体の分子量からEphB4蛋白質の分子量を引いた値が約１０〜４０ｋＤａとなるように選択される。本明細書においては、所与の範囲の“ｍ”は配向性に関する意味を有する。“ｍ”の範囲は何れの場合もＰＥＧ基の分子量によって正確に測定される。
ＰＥＧ化したEphB4をどのように治療上使用するのか、望まれる投薬量、循環時間、タンパク質加水分解に対する耐性、免疫原性及びその他の考慮事項に基づき、当業者であればＰＥＧの適切な分子量を選択することができる。ＰＥＧについての議論及び蛋白質の特性を高めるためのＥＰＧの使用に関しては、「N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993)」を参照されたい。
本発明の一実施形態においては、ＰＥＧ分子は活性化されてEphB4上のアミノ基、例えばリジンと反応することができる（Bencham C. O. et al., Anal. Biochem., 131, 25 (1983); Veronese, F. M. et al., Appl. Biochem., 11, 141 (1985).; Zalipsky, S. et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999); Zalipsky, S. et al., Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgado, C. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990)）。
一具体例では、ＰＥＧの炭酸エステルを使用してＰＥＧ−EphB4蛋白質の共役体を形成することができる。ＰＥＧとの反応にＮ，Ｎ’−ジスクシンンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を使用して活性なＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート混合物を形成し、次いでリンカーの求核性基又はEphB4のアミノ基と反応させることができる（米国特許第5,281,698号及び米国特許第5,932,462号）。類似の反応において、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネート及びジ（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させてＰＥＧ−ベンゾトリアゾリル及びＰＥＧ−ピリジルが混合したカーボネートを形成することができる（米国特許第5,382,657）。
一実施形態においては、１又は２以上のリジン残基を導入する部位特異的突然変異誘発の導入によって、ＰＥＧ化のための追加部位が導入される。例えば、１又は２以上のアルギニン残基をリジン残基に突然変異させてもよい。別の一実施形態においては、EphB4上のアミノ酸を修飾することによって追加的なＰＥＧ化部位を化学的に導入する。一具体例では、EphB4内のカルボキシル基をジアミノブタンと共役させ、カルボキシルをアミド化する（Li et al., Anal Biochem. 2004;330(2):264-71）。この反応は水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが触媒することができる。その後、得られるアミドをＰＥＧと共役させることができる。
EphB4のＰＥＧ化は公知の方法に従って、例えばEphB4と親電子的活性ＰＥＧ（供給元：Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com）の反応により、行うことができる。本発明の好ましいＰＥＧ試薬は例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノアート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート又は分枝状Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）である。該方法を使用することで、EphB4のリジンのεアミノ基又はEphB4のＮ末端アミノ基のところでＰＥＧ化することができる。
別の一実施形態においては、ＰＥＧ分子はEphB4上のスルフヒドリル基に結合し得る（Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343; U.S. Patent No. 5,766,897）。米国特許第6,610,281号及び同第5,766,897号はスルフヒドリル基に結合可能な反応性ＰＥＧ類の例を記載している。
ＰＥＧ分子がEphB4上のシステイン残基に共役する場合、ある実施形態においてはシステイン残基はEphB4に元々存在する一方で、他の実施形態においては、１又は２以上のシステイン残基がEphB4内に構築される。EphB4をコードする配列内に突然変異を導入することによってシステイン残基を生じさせてもよい。例えば、１又は２以上のアミノ酸残基をシステインに突然変異させることによって達成され得る。システイン残基に突然変異させるのに好ましいアミノ酸としてはセリン、スレオニン、アラニン及びその他の親水性残基が挙げられる。好ましくは、システインに突然変異されるべき残基は表面に露出した残基である。蛋白質の一次配列に基づいて残基の表面アクセス性を予測するためのアルゴリズムは斯界で周知である。或いは、表面残基はEphB4及びEphB２のアミノ酸配列を比較することによって予測することができる。EphB２の結晶構造は解明されており（Himanen et al., Nature. (2001) 20-27;414(6866):933-8）、表面露出残基が特定されたためである。一実施形態においては、システイン残基をＮ−及び／又はＣ−末端のところ若しくはその近傍で、又はループ領域中でEphB4内に導入する。ループ領域はEphB4とEphB２の配列を比較することで特定することができる。
ある実施形態においては、PEG化したEphB4はN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合したPEG分子を含有する。部位特異的なN末端還元的アミノ化が「Pepinsky et al., (2001) JPET, 297,1059」及び米国特許第5,824,784号に記載されている。他の利用可能な求核性アミノ基を利用した蛋白質の還元的アミノ化のためのPEG-アルデヒドの使用が米国特許第4,002,531号, 「Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579」及び「Chamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133」に記載されている。
別の一実施形態においては、PEG化したEphB4では、１又は２以上のPEG分子がリンカーに共有結合しており、リンカーはEphB4のN末端のところでアミノ酸残基のαアミノ基に結合している。該方法が米国特許出願公開第2002/0044921号及びWO94/01451に開示されている。
一実施形態においては、EphB4はC末端のところでPEG化される。一具体例では、C末端アジド−メチオニンの導入及びその後のシュタウディンガー反応を介したメチル−PEG−トリアリールホスフィン化合物の共役により蛋白質がC末端のところでPEG化される。このC末端共役法は「Cazalis et al., C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004;15(5):1005-1009」に記載されている。
EphB4のモノＰＥＧ化はWO94/01451に記載の一般的方法に従って行うことができる。WO94/01451は修飾された末端アミノ酸のα炭素の反応性基をもつ組み換えポリペプチドを調製する方法を記載している。該方法は、組み換えポリペプチドを形成し、これをN末端αアミン及びC末端αカルボキシルのところで生物学的に付加された１又は２以上の保護基により保護する工程を含む。次いで、該ポリペプチドを化学的保護剤と反応させることで選択的に反応性側鎖基を保護し、これによって側鎖基が修飾されるのを防止する。次いで、該ポリペプチドを生物学的保護基に特異的な切断試薬を用いて切断し、保護されていない末端アミノ酸のα炭素の反応性基を形成する。この保護されていない末端アミノ酸のα炭素の反応性基を化学的修飾剤で修飾する。この保護された側鎖をもつ修飾された単一コピーポリペプチドを側鎖基のところで脱保護し、末端修飾された組み換え型の単一コピーポリペプチドを形成する。該方法における工程の数及び順序を変更し、ポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端アミノ酸のところで選択的な修飾を行うことができる。
共役反応において、活性化されたPEGに対するEphB4（又はエフリンB2）の比率は約１：０．５〜１：５０、約１：１〜１：３０又は約１：５〜１：１５とすることができる。本方法においてはEphB4へのｐEGの共有付加を触媒するために種々の水性緩衝剤を使用することができる。一実施形態においては、使用する緩衝剤のpHは約７．０〜９．０である。別の一実施形態では、pHは僅かに塩基性であり、例えば約７．５〜８．５である。中性のpHに近いｐKaをもつ緩衝剤を使用してもよい（例：リン酸塩緩衝剤）。
一実施形態においては、モノ−PEG−EphB4を調製するための温度範囲は約４℃〜４０℃、約１８℃〜２５℃である。別の一実施形態では、温度は室温である。
PEG化反応は３〜４８時間、又は１０〜２４時間続けることができる。反応はEphB4、モノ−PEG-EphB4及びポリ−PEG-EphB4を区別するためにSE-HPLCを使用してモニタリングするモノ−PEG-EphB4はジ−PEG-EphB4の前に形成されることに注意すべきである。モノ−PEG-EphB4濃度が横ばい状態に達したとき、未反応のPEGと反応する冷却剤を添加することにより反応を終了させることができる。ある実施形態では、冷却剤はグリシン、システイン又はリジンのような遊離アミノ酸である。
斯界に公知の慣例的な分離及び精製技術、例えばサイズ排除（例：ゲル濾過）及びイオン交換クロマトグラフィを使用することでPEG化されたEphB4又はエフフィンB2生成物を精製することができる。生成物はSDS-PAGEを用いて分離してもよい。分離され得る生成物にはモノ−、ジ−、トリ−、ポリ−、及び未−PEG化EphB4、並びに遊離PEGが含まれる。モノ−PEG共役体の約９０％は収率と活性の良好なバランスを示す。例えば共役体の少なくとも９２％又は少なくとも９６％モノ−PEG種である組成物が望ましいであろう。本発明の一実施形態においては、モノ−PEG共役体のパーセンテージは９０〜９６％である。
一実施形態においては、本発明のPEG化されたEphB4蛋白質は１、２又は３以上のPEG部分を含有する。一実施形態においては、PEG部分は蛋白質の表面上にある及び/又はエフフィンB2に接触する表面から離れているアミノ酸残基に結合する。一実施形態においては、PEG-EphB4内にあるPEGの合算又は全体分子量は約３，０００Da〜６０，０００Daであり、随意的に約１０，０００Da〜３６，０００Daである。一実施形態においては、PEG化されたEphB4内にあるPEGは実質的に線状で直鎖のPEGである。
本発明の一実施形態においては、ＰＥＧ化されたEphB4又はエフリンB2内のPEGは、ヒドロキシアミンでアッセイ（例えば、４５０ｍＭのヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）で８〜１６時間室温）しても、ＰＥＧ化したアミノ酸残基から加水分解せず、安定である。一実施形態においては、組成物の８０％超、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が安定なモノ−ＰＥＧ−EphB4である。
別の一実施形態においては、本発明のＰＥＧ化したEphB4蛋白質は非修飾の蛋白質nに対して好ましくは少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の生物学的活性を保持することとなるだろう。一実施形態においては、生物学的活性とはエフリンB2に結合する能力を指す。一具体例では、PEG化したEphB4蛋白質はPEG化していないEphB4蛋白質に対してエフリンB2への結合性が上昇する。
好ましい実施形態においては、PEG-EphB4は非修飾蛋白質に対して半減期（ｔ1/2）が長くなる。好ましくは、PEG-EphB4の半減期は少なくとも10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% 又は500%, 又は更には1000%向上する。ある実施形態においては、蛋白質の半減期は緩衝塩溶液又は血清中のようなin vitroで決定される。他の実施形態においては、蛋白質の半減期は、動物の血清又はその他の体液中での蛋白質の半減期のような、生体内での半減期である。
ある観点において、主題の可溶性ポリペプチドの機能的変異体又は修飾形態には、可溶性ポリペプチドの少なくとも一部及び１又は２以上の融合領域の部分を有する融合蛋白質が含まれる。融合領域の周知例には、限定的ではないが、ポリヒスチジン、Glu-Glu、グルタチオンＳ転移酵素（GST）、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、及び免疫グロブリン重鎖定常領域（Fc）、マルトース結合蛋白質（MBP）が挙げられ、これらは親和性クロマトグラフィによる融合蛋白質の単離に特に有用である。アフィニティー精製のために、親和性クロマトグラフィ用の関連するマトリックス、例えばグルタチオン−、アミラーゼ−、及びニッケル−又はコバルト−共役樹脂が使用される。斯界で周知のその他の融合領域は緑色蛍光蛋白質（GFP）である。また、融合領域は特定の抗体が利用できる短いペプチド配列である“エピトープ標識”を含有する。特定のモノクローナル抗体が容易に利用できる周知のエピトープ標識にはＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、及びｃ-myc標識が挙げられる。あるケースでは、融合領域はファクターXaやトロンビンといったプロテアーゼ切断部位を有し、これによって関連するプロテアーゼは融合蛋白質を部分的に消化することが可能となり、組み換え蛋白質をそこから遊離する。その後、遊離された蛋白質はクロマトグラフ分離により融合領域から単離することができる。
ある実施形態においては、本発明の可溶性ポリペプチドは可溶性ポリペプチドを安定化することが可能な１又は２以上の修飾を含有する。例えば、該修飾によって可溶性ポリペプチドのin vitroでの半減期が向上し、可溶性ポリペプチドの循環系半減期が向上し、又は可溶性ポリペプチドの蛋白分解劣化が減少する。
更なる実施形態においては、本発明の可溶性ポリペプチドは細胞毒性薬に融合する。この方法では、融合体は細胞毒性薬が特定の組織又は細胞（例：腫瘍組織又は細胞）を標的とするように作用し、罹患細胞の数を減少させる。斯かる方法により癌及び血管形成関連障害に伴う症状を減少することができる。細胞毒性薬には、限定的ではないが、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン等、及び放射性化学物質が挙げられる。
ある実施形態においては、本発明の可溶性ポリペプチドはその他の治療用蛋白質に融合してもよく、又は薬物動態学的目的のためにＦｃ若しくは血清アルブミンのような別の蛋白質に融合してもよい。例えば、米国特許第5,766,883号及び同第5,876,969号を参照のこと（これら両方を本明細書に援用する。）。ある実施形態においては、本発明の可溶性ポリペプチドＦｃ変異体に融合する。一具体例においては、可溶性ポリペプチドは同質二量体化しないＦｃ（例えば他のＦｃ鎖とシステイン結合を形成するシステイン残基が欠失したもの）に融合する。
ある実施形態においては、本発明の修飾されたポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ領域をもつ融合蛋白質を含有する。知られていることだが、各免疫グロブリンの重鎖不変領域は４又は５つのドメインを有する。該ドメインは順に、ＣＨｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）と名付けられている。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は免疫グロブリンのクラス間で交差相同性を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインはＩｇＡ及びＩｇＤのＣＨ２ドメインと、そしてＩｇＭ及びＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同性がある。本明細書では、用語“免疫グロブリンＦｃ領域”とは、免疫グロブリン鎖不変領域のカルボキシル末端部分、好ましくは免疫グロブリン重鎖不変領域、又はその一部を意味するものとして理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、又は５）２以上のドメインの組合せ及び免疫グロブリンヒンジ領域を含有し得る。好ましい実施形態においては、免疫グロブリンＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを少なくとも含有し、好ましくはＣＨ１ドメインを欠くものである。
一実施形態においては、重鎖不変領域が誘導される免疫グロブリンのクラスはＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１，２，３又は４）である。ヒトＦｃガンマ−１のヌクレオチド及びアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：５及び６に記載されている。マウスＦｃガンマ−２ａのヌクレオチド及びアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：７及び８に記載されている。免疫グロブリンのその他のクラスであるＩｇＡ （Ｉｇα）， ＩｇＤ （Ｉｇδ）， ＩｇＥ （Ｉｇｅ）及びＩｇＭ （Ｉｇμ)を使用してもよい。適切な免疫グロブリン重鎖不変領域の選択について、詳細が米国特許第5,541,087号及び同第5,726,044号に記載されている。特定の結果を達成するために幾つかの免疫グロブリンのクラス及びサブクラスから特定の免疫グロブリン重鎖不変領域を選択することは当業者であれば可能であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコード化するＤＮＡコンストラクトの部分は好ましくはヒンジ領域の少なくとも一部を含有し、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭの何れかのＦｃγのＣＨ３ドメイン又はその相同性ドメインの少なくとも一部を含有する。
更に、免疫グロブリン重鎖不変領域内にあるアミノ酸が置換又は欠失すると本発明の実施に有益であると考えられる。一例は上部ＣＨ２領域内でアミノ酸を置換してＦｃ受容体に対する親和性の低いＦｃ変異体を作り出すことであろう（Cole et al. (1997) J. IMMUNOL. 159:3613）。当業者であれば周知の分子生物学に関する技術を使用することで斯かるコンストラクトを調製することができる。
本発明の一具体例においては、主題の可溶性ポリペプチドの修飾された形態は、可溶性ポリペプチド（例：エフリンB2又はEphB4の細胞外ドメイン）の少なくとも一部及びアルブミンのような安定化ドメインを有する融合蛋白質である。本明細書において、“アルブミン”とはアルブミンの蛋白質若しくはアミノ酸配列か、或いはアルブミンの１又は２以上の機能的活性を示すアルブミンの断片若しくは変異体を集合的に指す。とりわけ、“アルブミン”とはヒトのアルブミン又はその断片（EP 201 239, EP 322 094， WO 97/24445, WO95/23857を参照）、特にヒトの成熟型アルブミン、又は他の脊椎動物のアルブミン若しくはその断片、又は上記分子若しくはその断片の類似体若しくは変異体を指す。
本発明では該融合蛋白質は対応する野生型可溶性蛋白質に比べて安定であることを記述する。例えば、主題の可溶性ポリペプチド（例：エフフィンB2又はEphB4の細胞外ドメイン）がヒト血清アルブミン（HSA）、ウシ血清アルブミン（BSA）、又は安定化活性をもつアルブミン蛋白質の任意の断片と融合することができる。そのような安定化ドメインにはヒト血清アルブミン（HSA）及びウシ血清アルブミン（BSA）が挙げられる。
とりわけ、本発明のアルブミン融合蛋白質にはヒトアルブミンの自然界で生じる多型性変異体及びヒトアルブミンの断片が挙げられ（WO95/23857）、例えばEP 322 094に記載の断片(すなわちHA(Pn)、nは369〜419)が挙げられる。アルブミンは任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ又はブタ由来のものとしてよい。非哺乳動物のアルブミンとしては、限定的ではないが、メンドリ及びサケが挙げられる。アルブミン融合蛋白質のアルブミン部分はEphB4と異なる動物由来であってよい。
ある実施形態においては、アルブミン融合蛋白質のアルブミン蛋白質部分は血清アルブミンの断片に相当する。血清アルブミンポリペプチドの断としては、１又は２以上の残基がアミノ末端又はC末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。一般に、HA断片又は変異体は少なくとも１００のアミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸長であろう。HA変異体はHAの少なくとも一つの全体ドメインから成るか又はこれを含む。米国特許出願公開2004/0171123に記載のSEQ ID NOS：１８に対するドメインは：ドメイン1 (アミノ酸1-194), ドメイン2 (アミノ酸195-387), ドメイン3 (アミノ酸388-585), 1+2 (1-387), 2+3 (195- 585) 又は1+3 (アミノ酸1-194 +アミノ酸388-585)である。各ドメインそれ自体は、Lys l06〜Glu 119, Glu 292〜Val 315及びGlu 492〜Ala 511を有する柔軟性のあるサブドメイン間リンカー領域をもつ、相同性のある二つのサブドメイン、すなわち1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491及び512- 585で構成されている。
一実施形態においては、EphB4−HSA融合体は一つのHSA分子に連結した一つのEphB4可溶性ポリペプチドを有するが、その他の形態も本発明の範囲内である。例えば、EphB4−HSA融合蛋白質は：R1-L-R2;R2-L-R1;R1-L-R2-L-R1;又はR2-L-Rl-L-R2; R1-R2; R2-R1; R1-R2-R1;又はR2-R1-R2の何れを有することもできる。ここで、R1は可溶性ポリペプチドの配列であり、R2はHSAであり、Lはペプチドリンカーの配列である。
一具体例では、EphB4及びHSAのドメインは、好ましくはリンカー配列を介して、互いに連結している。リンカー配列はEphB4及びHSAのドメインを、各ドメインが適切に折りたたまれて２次及び３次構造を確実に形成するのに充分な距離だけ、分離する。好ましいリンカー配列は（１）柔軟な伸長構造を有するべきであり、（２）機能的なEphB4及びHSAのドメインと相互作用し得る秩序だった二次構造を発達させる傾向を示さないべきであり、（３）機能的蛋白質のドメインとの相互作用を促進し得る疎水性又は荷電性は最小限とすべきである。柔軟な蛋白質領域内の典型的な表面アミノ酸としてはGly、Asn及びSerが挙げられる。Gly、Asn及びSerを含有するアミノ酸配列の順列はリンカー配列に対する上記基準を満足することが期待される。Thr及びAlaといったその他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列内に使用することができる。
一具体例では、機能性蛋白質のドメイン間に適度な分離を与えるためにリンカー配列の長さが約２０であるアミノ酸を使用することができる。但し、より長い又は短いリンカー配列も使用可能である。EphB4及びHASを分離するリンカー配列の長さはアミノ酸長５〜５００、好ましくはアミノ酸長５〜１００とすることができる。好ましくは、リンカー配列はアミノ酸長が約５〜３０である。好ましい実施形態では、リンカー配列はアミノ酸長が約５〜約２０であり、有利にはアミノ酸長が約１０〜約２０である。EphB4及びHASのリンカーとして有用なアミノ酸配列には、限定的ではないが、（ＳｅｒＧｌｙ4）ｙ（式中、ｙは８以上）又はＧｌｙ4ＳｅｒＧｌｙ5Ｓｅｒが挙げられる。好ましいリンカー配列は(ＳｅｒＧｌｙ4）4の式を有する。別の好ましいリンカーは（（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）3−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）の配列を有する。
一実施形態においては、本発明のポリペプチド及びHSA蛋白質はリンカー配列なしで直接融合する。好ましい実施形態では、可溶性EphB4ポリペプチドのＣ末端はHSAのN末端に直接融合することができ、又はHSAのＣ末端は可溶性EphB4のN末端に直接融合することができる。
ある実施形態においては、米国特許出願公開2003/0166877に記載のように、融合蛋白質をつなぐ接合領域内のT細胞エピトープの候補を特定し、接合領域内にあるアミノ酸を変化させることによって、HAS及びEphB4間の融合接合部の免疫原性を減少させることができる。
ある実施形態においては、本発明の（未改質又は改質）可溶性ポリペプチドは、当分野の種々の公知技術により製造できる。例えば、これら可溶性ポリペプチドは、Bodansky、M.「ペプチド合成原則」Springer Verlag、ベルリン（1993）及びGrant G.A.編「合成ペプチド」:「使用者ガイド」W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1992）等に記載された標準的な蛋白質化学技術を使用して合成できる。更に、自動化ペプチド合成機は市販されている（例えば、Advanced Chem Techモデル396;Milligen/Biosearch社9600）。又、可溶性ポリペプチド、フラグメント又はそれらの変異体は、公知の種々の発現系を使用して組み換え的に生産してもよい（同様に下記参照）。
III．可溶性ポリペプチドをエンコードする核酸
ある観点においては、本発明はEphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドをエンコードする単離された及び／又は組み換え型核酸に関する。本発明の核酸は、単鎖又は二重鎖、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は治療薬として有用である。例えば、これらの核酸は、治療用として細胞又は患者へ投与された組み換え型可溶性ポリペプチドの製造に有用である。又、これら核酸は、遺伝子治療法等の治療用として細胞又は患者へ直接に投与できる。
ある実施形態において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ番号６−９に示されたヌクレオチド配列の領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である単離型又は組み換え型核酸配列を提供する。当業者は、本発明の核酸と相補的な核酸配列及び本発明の核酸の変異体も又本発明の範囲内であることを理解できる。更に、本発明の核酸配列は、単離され、組み換えられ、及び／又は非相同のヌクレオチド配列と融合されてもよく、ＤＮＡライブラリ中のものでもよい。
他の実施形態において、本発明の核酸は又、高い緊縮条件下で図６−９中に示されたヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。上記のように、当業者はＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な緊縮条件は変化できることが容易に理解できる。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）約４５℃でハイブリダイゼーションを行い、次に２．０×ＳＳＣで５０℃で洗浄してもよい。例えば、洗浄ステップ中の塩濃度は約２．０×ＳＳＣで５０℃の低い緊縮から約０．２×ＳＳＣの５０℃での高い緊縮まで選択出来る。更に、洗浄ステップ中の温度は、室温（約２２℃）での低い緊縮条件から、約６５℃での高い緊縮条件へ増加できる。温度及び塩の両方は変化してもよく、又温度若しくは塩濃度は他の変更可能な因子が変化する間一定に保持されてもよい。例えば、本発明は６×ＳＳＣ室温での低い緊縮条件下でハイブリダイズされ、次に２×ＳＳＣ室温で洗浄される核酸も提供する。
遺伝暗号中の縮重を原因とする目的の核酸とは異なる単離された核酸も又本発明の範囲内である。例えば、多くのアミノ酸が１を超えるトリプレットにより指定される。同一のアミノ酸を特定するコドン又はそのシノニム（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣはヒスチジンに対するシノニムである）は、蛋白質のアミノ酸配列に作用しない「沈黙」突然変異を生じる。しかし、本発明の蛋白質のアミノ酸配列中の変化へ導くＤＮＡ配列多型性はほ乳類細胞間に存在することが予測されている。当業者は、特別な蛋白質をエンコードする核酸の１以上のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）中のこれらの変異は、天然対立遺伝子的変異により所定の種の被験体間に存在することを理解できる。これらヌクレオチド変異及び得られるアミノ酸多型性のいずれか及び全ては本発明の範囲内である。
ある実施形態において、本発明の組み換え型核酸は、発現構築物中の１以上の調節ヌクレオチド配列へ作動可能なように結合されてもよい。調節ヌクレオチド配列は、発現に使用されるホスト細胞として一般的に適切である。数多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が、種々のホスト細胞用に当分野で公知である。通常、上記１以上の調節ヌクレオチド配列として、本発明を限定するものではないが、プロモーター配列、リーダー配列又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又は活性化配列が挙げられる。
当分野で公知の構成成分となる又は誘導可能なプロモーターも本発明では意図される。プロモーターは、天然プロモーター又は１を超えるプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれでもよい。発現構築物はプラスミド等のエピソーム上の細胞中に存在しても良く、発現構築物は染色体中に挿入されてもよい。好ましくは、発現ベクターは形質変換されたホスト細胞の選択を可能とするため選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は当分野で公知であり、使用されるホスト細胞に応じて変化できる。
本発明のある観点において、核酸は、EphB4又はエフリンB2可溶性ポリペプチドをエンコードし、作動可能なように少なくとも１の調節配列へ結合されたヌクレオチド配列を含有する発現ベクター中に提供される。調節配列は当分野で認識され、可溶性ポリペプチドの直接的発現のために選択される。従って、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節要素を含有する。例示的調節配列は、Goeddel「遺伝子発現技術：酵素学的方法」Academic Press、サンディエゴ、ＣＡ（１９９０）」に記載されている。例えば、動作可能なように結合された場合にＤＮＡ配列の発現を調節する広い範囲の種々の発現調節配列のいずれでも、可溶性ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を発現するためにこれらのベクター中に使用できる。これら有用な発現調節配列として例えば、ＳＶ４０の上流（early）及び下流（late）プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウィルス又はサイトメガロウィルス直前プロモーター、lａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、その発現はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより誘導されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ被覆蛋白質用調節領域、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素用プロモーター、Ｐｈｏ５等の酸ホスファターゼのプロモーター、酵母α-接合因子のプロモーター、バキュロウィルスシステムの多面体プロモーター及び原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウィルスの遺伝子の発現を調節することが知られている他の配列、並びにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質変換されるホスト細胞、及び／又は発現されることを目的とする蛋白質の種類等の選択の因子に依存すると考えられる。更に、ベクターのコピー数、コピー数調節能力及び抗生物質マーカー等のベクターによりエンコードされる他の蛋白質の発現を調節する能力も又考慮される必要がある。
本発明は又、１以上の本発明の可溶性ポリペプチドのためのコーディング配列を含有する組み換え型遺伝子でトランスフェクトされたホスト細胞に関する。ホスト細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。例えば、本発明の可溶性ポリペプチドは、E．coli等の細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウィルス発現系を使用）、酵母、又はほ乳類細胞中で発現される。他の適切なホスト細胞も当業者に公知である。
又、本発明は更に本発明の可溶性ポリペプチドの製造方法に関する。例えば、EphB4可溶性ポリペプチドをエンコードする発現ベクターでトランスフェクトされたホスト細胞は、適切な条件下で培養され、EphB4可溶性ポリペプチドの発現を行うことができる。EphB4可溶性ポリペプチドは、細胞及び可溶性ポリペプチドを含有する培地の混合物から分泌されて単離される。可溶性ポリペプチドは細胞質中又は膜フラクション中に保持され、細胞が採取され、溶解され蛋白質が単離される。細胞培養物はホスト細胞、培地及び他の副成物を含む。細胞培養物用の適切な培地は当分野で公知である。可溶性ポリペプチドは、蛋白質精製用の公知技術を使用して、細胞培養培地、ホスト細胞又はそれら両方から単離できる。その技術としてイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、超ろ過、電気泳動、及び可溶性ポリペプチドの特別なエピトープに特異的な抗体との免疫親和性精製等が挙げられる。好ましくは、可溶性ポリペプチドは、その精製を容易にする領域を含有する融合蛋白質である。
本発明の組み換え型核酸は、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫又はほ乳類）又はそれら両方のいずれか中で発現に適切なベクター中にクローンされた遺伝子又はそれらの一部をライゲートすることにより生産できる。組み換え型可溶性ポリペプチドの作成用の発現ビヒクルとして、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとして下記種類のプラスミドが挙げられる：E．coli等の原核細胞中の発現用の、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミド。
好ましいほ乳類発現ベクターは、細菌中のベクターの増殖を促進する原核配列及び真核細胞中で発現された１以上の真核転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２-ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ-ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切なほ乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかはｐＢＲ３２２等の細菌性プラスミドからの配列で改質されて、原核及び真核細胞の両方での複製及び耐薬品性選択を促進してもよい。又、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ-１）、又はエプスタイン-バーウィルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５由来）等のウィルス誘導体は、真核細胞中の蛋白質の一時的発現に使用出来る。他のウィルス性（レトロウィルスを含む）発現システムの例は、下記遺伝子治療デリバリーシステムの記載中に示す。プラスミドの作成及びホスト有機体の形質転換で使用される種々の方法は、当分野で公知である。原核及び真核細胞の両方について、他の適切な発現システム並びに一般的組み換え型手順は、分子クローニング「実験マニュアル」第２版、Sambrook、Fritsch及びManiatis編（コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８９）１６及び１７章が参照できる。例えば、バキュロウィルス発現システムの使用により組み換え型ＳＬＣ５Ａ８ポリペプチドを発現することも好ましい。これらバキュロウィルス発現システムの例として、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１等）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１等）、並びにｐＢlｕｅＢａｃ由来ベクター（ｐＢlｕｅＢａｃ III含有β-ｇａl等）が挙げられる。
融合遺伝子作成技術は公知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの結合は、従来技術に従い行うことができ、例えばライゲーション用のブラントエンド末端又は相補末端（ｓｔａｇｇｅｒ-ｅｎｄｅｄ）の採用、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な付着末端の補完、目的外の結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションが挙げられる。又、融合遺伝子は自動化ＤＮＡ合成機等の従来の技術により合成できる。又、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２個の連続する遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施でき、それは次にキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールできる（例えば、「分子生物学の現在のプロトコル」Ausubelら編、John Wiley&Sons:1992）。
IV. ドラッグスクリーニングアッセイ
ポリペプチド治療薬を、EphB4、エフリンB2又は両方のアンタゴニストとしてスクリーニングする数多くのアプローチがある。例えば、化合物又は分子の高スループットスクリーニングが、血管形成を阻害するか腫瘍増殖を阻害する試薬又はドラッグを特定するために実施できる。試験試薬は、（化学）合成的に製造され、組み換え型技術により製造され、又は天然原料から単離されたいずれの化学製品（元素、分子、化合物、ドラッグ）でもよい。例えば、試験試薬はペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、糖類、ホルモン類、又は核酸分子でもよい。更に、試験試薬は、小分子又は化学的組み合わせにより、例えばライブラリへ組み込まれて製造されたより大きい複合体でもよい。これらのライブラリーとして、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル及び他の有機的化合物種が挙げられる。試験試薬も又、溶解産物又は細胞の増殖培地（細菌性、動物又は植物性）から単離された天然物若しくは遺伝子的に設計された製品、又は細胞溶解産物若しくは増殖培地自身でもよい。試験系への試験化合物の形態は、単離体又は、特に初期スクリーニングステップ中では、化合物の混合物のいずれでもよい。
例えば、アッセイは、エフリンB2（リガンド）のEphB4（レセプター）への結合又はその反対の結合を特異的に阻害する化合物のスクリーンを、例えば、標識化リガンド-又はレセプター-Fc融合蛋白質の不死化細胞への結合の阻害により実施できる。このスクリーニングで特定された化合物は次に、それらのin vivoでの抗血管形成又は抗腫瘍活性を評価するために動物中で試験される。
２個の細胞表面分子（例えば、エフリンB2及びEphB4）の相互作用を妨害する物質を特定するアッセイの一具体例として、ある種の細胞表面分子を発現する細胞のサンプル（例えば、EphB4）は、標識化リガンド（例えば、エフリンB2若しくはその可溶性部分、又は細胞外領域及びIgGのＦｃ領域の融合等の融合蛋白質）又は標識化リガンドプラス試験化合物（若しくは試験化合物群）のいずれかと接触させる。細胞へ結合した標識化リガンドの量が測定される。（標識が例えば、放射性同位体、蛍光性又は比色分析用標識の場合）試験化合物と接触したサンプル中の標識量がより少なくても、試験化合物が結合を阻害することが示される。リガンド（例えば、エフリンB2リガンド又はその可溶体）を発現する細胞を使用した相互アッセイは、Ephレセプター又はその可溶性部分の結合に影響する物質を試験するために使用できる。
Ephレセプター及びエフリン間の相互作用に影響する物質を特定するアッセイは、試験化合物と競合しない成分（例えば、細胞、融合蛋白質及び結合活性部位を含む精製蛋白質）を使用して、固体担持体へ結合されて行うことが出来る。固体担持体は、いずれの適切な固体相又はマトリックスでもよく、例えばビーズ、プレート壁又は他の適切な表面等（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）、カラム多孔質ガラス（ＣＰＧ）又はウェルの溶液中に浸漬されるピンが挙げられる。細胞又は精製蛋白質の固体担持体への結合は、直接的でも１以上のリンカー分子を介してでもよい。
一実施形態において、単離され又は精製された蛋白質（例えば、Ephレセプター又はエフリン）は、化学架橋の標準技術により、又は単離され又は精製された蛋白質に対して生じる抗体を介して、適切な親和性マトリックス上に固定化され、固体担持体へ結合されてもよい。マトリックスはカラム又は他の適切な容器中に充填され、１以上の試験用化合物（例えば、混合物）とその化合物の蛋白質への結合に適切な条件下で接触させられる。例えば、化合物含有溶液はマトリックスを通過するようにも調製できる。マトリックスは、結合していない化合物、非特異的に結合した化合物を除去するために、適切な洗浄バッファで洗浄されてもよい。結合を保持する化合物は、適切な溶離バッファにより溶離される。例えば、溶離バッファのイオン強度又はｐＨの変化は化合物の溶離を引き起こす。又、溶離バッファは、溶離成分又は化合物の結合を切断するように設計された成分（例えば、１以上のリガンド若しくはレセプター、適切な場合にはそれらのアナログであって、結合を切断できるか、試験化合物の蛋白質への結合を競合的に阻害できるもの）を含有してもよい。
その性質上、その蛋白質中で発生しない第二成分へ結合された蛋白質（例えば、Ephレセプター又はエフリン）の全て又は一部を含有する融合蛋白質も、本発明の方法で使用するために作成できる。この目的のために適切な融合蛋白質は、第二成分が親和性リガンド（例えば、酵素、抗原、エピトープ）を含有するようなものを含む。融合蛋白質は、蛋白質（例えば、Ephレセプター又はエフリン）又はその一部を、親和性リガンドをエンコードする適切な発現ベクター中へ挿入することにより作成できる。発現ベクターは、適切な発現用ホスト細胞中へ導入できる。ホスト細胞は破壊され、融合蛋白質を含有する細胞材料は、融合蛋白質の親和性リガンド部位が親和性マトリックスへ結合するのに適切な条件下で、細胞材料を親和性マトリックスと接触させることにより、適切な親和性マトリックスへ結合できる。
本実施形態の一観点では、融合蛋白質は融合蛋白質の親和性リガンド部位がマトリックスへ結合するのに適切な条件下で適切な親和性マトリックス上に固定化され、その化合物が結合された融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位へ結合するために適切な条件下で１以上の試験用化合物（例えば混合物）と接触させられる。次に、結合された融合蛋白質を有する親和性マトリックスは、適切な洗浄バッファで洗浄され、特異的に結合された化合物の結合を非常に破壊せずに、結合していない化合物及び非特異的に結合された化合物を除去してもよい。結合を保持する化合物は、それへ結合している融合蛋白質を有する親和性マトリックスを適切な溶離バッファ（化合物溶離バッファ）へ接触させることにより溶離出来る。この見地から、化合物溶離バッファは親和性マトリックスによる融合蛋白質の保持を可能とするようにも配合できるが、試験する化合物の、融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位への結合を阻害するように配合してもよい。例えば、溶離バッファのイオン強度又はｐＨの変化は化合物の溶離を引き起こしてもよく、溶離バッファは溶離成分又は化合物の融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位への結合を破壊するために設計された成分（例えば、化合物の融合蛋白質のレセプター又はリガンド蛋白質部位への結合を破壊できる、１以上のリガンド又はレセプター又はそれらのアナログ）を含有してもよい。固定化は、融合蛋白質を化合物と接触させる前、同時、又は後に随時行っても良い。本発明の方法は、試験される化合物、選択された親和性マトリックス、及び溶離バッファ配合等の因子に依存して、種々の順序の変更が可能である。例えば、洗浄ステップ後、それに結合した化合物を有する融合蛋白質は、親和性マトリックスから適切な溶離バッファ（マトリックス溶離バッファ）により溶離されてもよい。融合蛋白質がトロンビン切断部位等の開裂可能なリンカーを含有する場合、親和性リガンドからの開裂はそれへ結合した化合物との融合物の一部を溶離できる。結合された化合物は、次に融合蛋白質又はその開裂生成物から抽出等の適切な方法により溶離できる。
Ｖ．治療方法
ある実施形態において、本発明は血管形成阻害方法及び血管形成関連障害治療方法を提供する。又、例えば、本発明は腫瘍増殖阻害又は減少方法及び癌患者治療方法を提供する。これらの方法は、治療的有効量の１以上の上記ポリペプチド治療薬を患者への投与を含む。これらの方法は好ましくは動物、更に好ましくはヒトの治療用及び予防的処置を目的とする。
ここで示される血管形成関連障害は、本発明を限定するものではないが、下記が挙げられる；充実性腫瘍等の血管形成依存性癌、白血病等の血液性腫瘍、及び腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫；免疫及び非免疫性炎症等の炎症性障害；慢性間接リューマチ及び乾癬；眼性血管形成病、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑改質、角膜移植拒絶、新血管の緑内症、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス；オスラーウェバー症候群；心筋性血管形成；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；繊維血管腫；毛細血管拡張乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新生血管形成、脈管形成、血液新生。
本発明の方法及び組成物は又、いずれの血管形成独立性癌（腫瘍）を治療するためにも有用である。ここで使用される用語「血管形成独立性癌」とは、腫瘍組織中に新生血管形成がないかほんの僅かである癌（腫瘍）を言う。
特に、本発明のポリペプチド治療薬は癌（腫瘍）の治療又は防止に有用であり、その例として本発明を限定するものではないが、腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、頭部癌及び頚部癌等の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、カポジ肉腫、及び白血病が挙げられる。
該方法のある実施形態においては、１以上のポリペプチド治療薬は、一緒（同時）に又は異なる時（逐次的）に投与できる。更に、本発明のポリペプチド治療薬は、別の種類の癌治療用又は血管形成阻害用化合物とともに投与できる。
ある実施形態において、本発明の方法は単独で実施できる。又、本発明の方法は、増殖性障害（例えば、腫瘍）の治療又は防止を目的とする他の従来の抗癌治療用アプローチと組み合わせても使用できる。例えば、これら方法は、予防的癌防止、外科手術後の癌再発及び癌転移の防止、及び他の従来の癌治療法の補強剤（adjuvant）として使用できる。本発明では従来の癌治療法（例えば、化学療法、放射線治療法、光線療法、免疫療法、及び外科的治療）の有効性が本発明のポリペプチド治療薬の使用により強化されることを認識できる。
広い範囲の従来の化合物が抗新生物性活性を有することが示された。これらの化合物は、化学療法中で充実性腫瘍を縮小させ、転移及び更なる増殖を防止し、又は白血病又は骨髄悪性腫瘍での悪性細胞数を減少させるための医薬的試薬として使用されてきている。化学療法は種々の悪性疾患種の治療に効果的ではあるが、多くの抗新生物性化合物は望ましくない副次的効果を誘起する。２以上の異なる治療が組み合わされた場合に、それらの治療は相乗的に作用してそれぞれの治療の投薬量を減少させることを可能とすることが示され、その結果より高い投薬量ではそれぞれの化合物が発生させる有害な副作用効果を減少させる。又例えば、治療困難な悪性疾患でも２以上の異なる治療の併合治療法が効果を示す場合がある。
本発明のポリペプチド治療薬が別の従来の抗新生物性試薬と組み合わせて、併合して又は逐次的に投与される場合、これら治療薬は、抗新生物性試薬の治療的効果を強化するかこれら抗新生物性試薬への細胞の耐性を克服することを示す。これは抗新生物性試薬の投薬の減少を可能とし、その結果目的としない副次的効果を減少させ、耐性細胞中の抗新生物性試薬の効果を回復する。
組み合わせ的抗腫瘍治療法に使用できる医薬的化合物として、単に例示のためであるが下記が挙げられる：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン（campothecin）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオロキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン（ironotecan）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトーテン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツヅマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン。
これらの化学療法の抗腫瘍化合物は、それらの作用機構により、例えば下記グループに分類できる：ピリミジンアナログ（５-フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）及びプリンアナログ、葉酸アンタゴニスト並びに関連する抑制剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２-クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））等の代謝拮抗物質／抗癌試薬；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン）等の天然生成物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン等の微少管破壊剤、エピジ（epidi）ポドフィロトキシン系（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アンスラサイクリン系、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、merchlorehtamine、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド（ＶＰ１６））等の抗増殖性／細胞***抑制剤；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アンスラサイクリン系、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン等の抗生物質；酵素（Ｌ-アスパラギンを全身的に新陳代謝させ、それら自身アスパラギンの合成能力を有さない細胞を除去するＬ-アスパラギナーゼ）；抗血小板試薬；窒素マスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及びアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン類及びメチルメラミン類（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネート-ブスルファン、ニトロソウレア類（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼン-ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）等の抗増殖性／細胞***抑制アルキル化試薬；葉酸アナログ（メトトレキサート）等の抗増殖性／細胞***抑制代謝拮抗物質；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトーテン、アミノグルテチミド；ホルモン類、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビン阻害薬）；フィブリン溶解性試薬（組織プラスミノゲン活性化剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ等）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走性試薬；抗分泌性試薬（breveldin）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ-５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノレート・モフェチル）；抗血管形成化合物（ＴＮＰ-４７０、ゲニステイン）及び増殖因子抑制剤（血管の内皮性増殖因子（ＶＥＧＦ）抑制剤、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）抑制剤）；アンギオテンシンレセプターブロッカー；一酸化窒素ドナー類；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツヅマブ）；細胞周期停止剤及び分化誘起剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド類（コーチゾン、デキサメタゾン、ハイドロコーチゾン、メチルペドニソロン、プレドニゾン及びプレニソロン）；増殖因子シグナル変換キナーゼ抑制剤；ミトコンドリア性機能障害誘起剤及びカスパーゼ活性化剤；及びクロマチンかく乱剤。
ある実施形態においては、組み合わせ抗血管形成治療法に使用できる医薬的化合物として下記が挙げられる。（１）ｂＦＧＦ（基本的繊維芽細胞増殖因子）等の「血管形成分子」の放出抑制剤；（２）抗βｂＦＧＦ抗体等の血管形成分子中和剤；並びに（３）コラゲナーゼ阻害剤、基底膜代謝回転抑制剤、血管新生阻害ステロイド、菌由来血管形成抑制剤、血小板因子４、トロンボスポンジン、Ｄ-ペニシルアミン及びチオリンゴ酸金塩等の関節炎薬、ビタミンＤ3アナログ、α-インターフェロン等の血管形成刺激への内皮細胞応答抑制剤。更に血管形成抑制剤として、Bloodら、Bioch.Biophys.Acta、1032:89-118（1990）、Mosesら、Science、248:1408-1410（1990）、Ingberら、Lab.Invest.59:44-51（1988）、及び米国特許番号第５０９２８８５号、５１１２９４６号、５１９２７４４号、５２０２３５２号、及び６５７３２５６号に記載されているものが挙げられる。更に、血管形成を阻害するために使用できる広い範囲の化合物があり、下記に例示される：ＶＥＧＦ-仲介された血管形成経路をブロックするペプチド又は試薬、エンドスタチン蛋白質又は誘導体、アンギオスタチンのリシン結合フラグメント、メラニン又はメラニン-促進化合物、プラスミノゲンフラグメント（例えばプラスミノゲンのクリングル１〜３）、トロポイン（tropoin）サブユニット、ビトロネクチンαvβ3のアンタゴニスト、サポシンＢ由来ペプチド、抗生物質又はアナログ（例えば、テトラサイクリン又はネオマイシン）、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドへ連結されたＭｅｔＡＰ-２阻害コアを含有する化合物、化合物ＥＭ-１３８、カルコン及びそのアナログ、並びにｎａａｌａｄａｓｅ抑制剤。例えば、米国特許番号第６３９５７１８号、６４６２０７５号、６４６５４３１号、６４７５７８４号、６４８２８０２号、６４８２８１０号、６５００４３１号、６５００９２４号、６５１８２９８号、６５２１４３９号、６５２５０１９号、６５３８１０３号、６５４４７５８号、６５４４９４７号、６５４８４７７号、６５５９１２６号、及び６５６９８４５号参照。
組み合わせ治療法の性質に応じて、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、他の治療法の実施中及び／又はその後に続けられてもよい。このポリペプチド治療薬の投与は、単回投与でも複数回投与でもよい。例えば、本発明のポリペプチド治療薬の投与は、従来の治療法の少なくとも数日前に開始されてもよく、又その投与は従来の治療法の直前又はその投与時のいずれかで開始されてもよい。
VI.投与方法及び医薬的組成物
ある実施形態において、本発明のポリペプチド治療薬（例えば、可溶性ポリペプチド又は抗体）は、医薬的に適用可能なキャリアと共に配合できる。これら治療薬は、単体として又は医薬的配合物（組成物）の成分として投与できる。化合物は、ヒトへの使用又は動物用医薬に適した方法で投与するために配合できる。ドデシル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等の、湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤及び香料、保存薬及び抗酸化剤も又本発明の組成物中に存在できる。
本発明のポリペプチド治療薬の配合物には、経口／経鼻、局所的、非経口（腸管外）、直腸内、及び／又は膣内投与へ適切なものが含まれる。配合物は単位剤形の形で便利に提供でき、製薬分野で公知の方法により調製できる。単一剤形を生産するためにキャリア材料へ組み合わせできる活性成分量は、治療されるホスト、特別な投与モードに応じて変化できる。単一剤形を生産するためにキャリア材料へ組み合わせできる活性成分量は、一般的に治療的効果を得られる化合物量である。
例えば、本発明の配合物又は組成物の調製方法として、異なる種類の抗腫瘍薬又は抗血管形成治療薬及びキャリア、任意で１以上の補助成分を組み合わせてもよい。一般的に、配合物は液体キャリア、又は微細粉砕固体キャリア、又は両方と共に調製し、次に必要な場合には成形して製品化してもよい。
経口投与用配合物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ（香料ベース、通常スクロース及びアカシア又はトラガカントを使用）、粉剤、粒剤の形状でもよく、水性若しくは非水性液体の溶液若しくは懸濁液、水中油型若しくは油中水型の液体エマルジョン、エリキシル剤若しくはシロップ、又は香錠（ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア等の不活性基材を使用）及び／又は口内洗浄剤等の形状としてもよく、それぞれ活性成分として所定量の本発明のポリペプチド治療薬を含有する。
経口投与用固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉剤、粒剤等）として、本発明の１以上のポリペプチド治療薬は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム等の１以上の医薬的に適用可能なキャリア及び／又は下記いずれかと混合してもよい：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸等の充填剤又は増量剤；（２）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア等の結合剤；（３）グリセロール等の湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ポテト又はタピオカデンプン、アルギン酸、所定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤；（５）パラフィン等の溶解遅延剤；（６）第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤；（７）セチルアルコール、グリセロールモノステアラート等の湿潤剤；（８）カオリン及びベントナイトクレイ等の吸着担体；
（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチルグリコール、ドデシル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物等の吸収剤；並びに（１０）着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、本発明の医薬的組成物は又、緩衝剤を含有してもよい。類似種の固体組成物も又、ラクトース又は乳糖類、並びに高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用した、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用できる。
経口投与用液体剤形として、医薬学的に適用可能なエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当分野で通常使用される不活性希釈剤を含有してもよく、その例として、水又は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾアート、プロピレングリコール、１，３-ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、ピーナッツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物等の他の溶剤、可溶化剤及び乳化剤が挙げられる。一方、不活性希釈剤、経口組成物も又湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、矯味剤、着色剤、香料及び保存薬等の添加剤を含有してもよい。
懸濁液は活性化合物に加え、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタハイドロオキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント並びにそれらの混合物等の懸濁剤を含有してもよい。
特に、本発明の方法は、局所的に、（子宮）頸部及び膣上の皮膚又は粘膜のいずれか上にも投与できる。これは、腫瘍へ直接的に投薬する最も大きな機会であり、かつ副次的効果を誘導する最も低い機会を与える。この局部用配合物は、皮膚に効果的であり、角質層浸透強化剤として公知の、１以上の種々の試薬を更に含有してもよい。これらの例として、２-ピロリドン、Ｎ-メチル-２-ピロリドン、ジメチルアセトタミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコール又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド及びアゾン（azone）が挙げられる。追加的試薬は、配合物を化粧品として適用可能とするためにも更に含有できる。これらの例として、脂肪、ワックス、オイル、染料、香料、保存薬、安定剤及び表面活発な試薬が挙げられる。当分野で公知の角質溶解剤も又含有できる。その例示としてサリチル酸及びイオウが挙げられる。
局所的又は経皮的投与用の剤形として、粉剤、スプレー、軟膏、ペースト、スプレー、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が挙げられる。本発明のポリペプチド治療薬は、無菌性条件下で医薬的に適用可能なキャリアと、及び必要ないずれかの保存薬、バッファ又は噴射剤と混合されてもよい。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明のポリペプチド薬へ加え更に、動物性及び植物性脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン樹脂、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はそれらの混合物等の賦形剤を含有してもよい。
粉剤及びスプレーは、本発明のポリペプチド治療薬に加え更に、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉、又はこれらの物質の混合物等の賦形剤を含有してもよい。スプレーは更にクロロフルオロ炭化水素並びにブタン及びプロパン等の揮発性非置換炭化水素等の通常の噴射剤を含有できる。
非経口（腸管外）投与用に適切な医薬的組成物は、１以上の医薬学的に適用可能な無菌性等張水又は非水性溶液、分散体、懸濁液若しくはエマルジョン、又は使用直前に無菌性注射用溶液又は分散体内で再構成される無菌性粉剤と組み合わせた１以上のポリペプチド治療薬を含有してもよく、それは抗酸化剤、バッファ、静菌薬、対象とするレシピエントの血液と等張な配合物とする溶質、又は懸濁剤若しくは増粘剤を含有してもよい。本発明の医薬的組成物で使用できる適切な水性及び非水性キャリアの例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物、オリーブオイル等の植物性オイル、並びに、エチルオレアート等の注射用有機的エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用、分散体の場合必要な粒子径の維持及び界面活性剤の使用を行うことにより維持できる。
本発明の組成物は又、保存薬、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等の添加剤を含有してもよい。微生物の活動防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の種々の抗細菌性及び抗真菌剤の含有により確保できる。糖類、塩化ナトリウム等の等張性試薬を本発明の組成物中に含有させることも又好ましい。更に、注射可能な医薬形態の長期間吸収は、アルミニウムモノステアレート及びゼラチン等の吸収遅延剤の包含により達成できる。
注射可能な貯蔵体は、ポリラクチド-ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中の１以上のポリペプチド治療薬のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造できる。薬のポリマーに対する割合及び使用される所定のポリマーの性質に依存して、薬放出速度が制御できる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルソエステル）及びポリ（アンハイドライド）が挙げられる。注射可能な配合貯蔵体は又、リポソーム中又は体組織適合性のあるミクロエマルジョン中にドラッグを捕捉することにより調製できる。
膣内又は直腸内投与用配合物は、１以上の本発明の化合物を１以上の適切な非刺激性賦形剤又はキャリアと混合して製造される座薬として提供できる。上記賦形剤等として例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックス又はサリチラートが挙げられ、それらは室温で固体であるが体温で液体であるため、直腸内又は膣腔内で溶解して活性化合物を放出する。
他の実施形態において、本発明のポリペプチド治療薬は、真核プロモーターから細胞内で発現できる。例えば、EphB4又はエフリンB2の可溶性ポリペプチドは、適切なベクターから真核細胞中で発現できる。ベクターは好ましくはＤＮＡプラスミド又はウィルス性ベクターである。ウィルス性ベクターは本発明を限定するものではないが、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はアルファウィルスをベースとして構成できる。好ましくは、ベクターは確実にターゲット細胞中に導入されその中で存続する。又、ウィルス性ベクターは一時的発現を起こすためにも使用できる。これらのベクターは必要に応じて繰り返して投与できる。本発明のポリペプチド治療薬をエンコードするベクターのデリバリーは、静脈内又は筋肉内投与により全身的に行える。それは、患者から外植されたターゲット細胞内へ導入してから患者中へ再投入することにより、又は目的とするターゲット細胞を導入することを可能とする他の手段により行える（Coutureら、1996、TIG、12、510参照）。
本発明を上記概説したが、下記実施例により更に容易に理解できる。下記実施例は単に本発明の例示を目的として記載されており、本発明を限定するものではない。
実施例１（ヒトエフリンB2及びEphB4蛋白質の細胞外領域の可溶性誘導体）
ヒトエフリンB2及びEphB4蛋白質の細胞外領域の可溶性誘導体は、予測される短縮された完全長のエフリンB2（Ｂ４ＥＣｖ３、Ｂ２ＥＣ）の細胞外領域、又はその領域とＢ２ＥＣ-ＦＣ、Ｂ４ＥＣｖ２-ＦＣ及びＢ４ＥＣｖ３-ＦＣ等のヒト免疫グロブリンの定常領域（IgGl Ｆｃフラグメント）との翻訳上の（translational）融合のいずれかを表す。代表的ヒトエフリンB2構築物及びヒトEphB4構築物を図１４及び図１５に示す。
これらの組み換え型蛋白質をエンコードするｃＤＮＡフラグメントは、材料及び方法段落に詳細に記載されるように（下記参照）、ほ乳類発現ベクターへサブクローンされ、一時的に発現するか、ほ乳類細胞系を確実にトランスフェクトして、精製されて均質となった。蛋白質の推定アミノ酸配列を図１〜図５に示す。高純度の単離された蛋白質及びそれらの認識を、対応する抗エフリンB2及び抗EphB4モノクローナル又はポリクローナル抗体により確認した。組み換え型蛋白質は、予測される高親和性結合、結合競合及びそれらの対応する結合パートナーとの特異性性質を示し、それらは生物化学的アッセイにより確認された（例えば図６〜８参照）。
これら可溶性誘導体蛋白質ヒトエフリンB2及びEphB4は、数個の細胞-ベースアッセイ及び血管形成又は抗癌活性を測定するin vivoアッセイによる生物学的活性の能力を示し、従ってそれは抗血管形成及び抗癌治療用の将来性のあるドラッグ候補である。Ｂ４ＥＣｖ３並びにＢ２ＥＣ及びＢ２ＥＣ-ＦＣ蛋白質は、ヒト内皮細胞の走化性をブロックし（へその緒及び肝臓性ＡＥＣ又はＶＥＣで試験した）、細胞外マトリックス（マトリゲル、商標）の変質の減少及び増殖因子刺激に対する応答における移動を減少させた（図９〜１１）。Ｂ４ＥＣｖ３及びＢ２ＥＣ-ＦＣ蛋白質はそれらの内皮細胞管形成阻害により示される抗血管形成効果の能力を有する（図１２〜１３）。
本実施例についての材料及び方法の詳細な説明は米国特許出願公開第20050084873号に見出すことができる。
球状領域＋Cysリッチ領域（B4EC-GC）、前駆蛋白質の配列は(SEQ ID NO:12)：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDE EQHSVRTYEVCEVQRAPGQ AHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAG RSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKV NVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRE LVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCR ACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPS AHHHHHH
である。
治療用途を含む多くの用途に対して、リーダー配列（最初の１５アミノ酸、プロセシングを受けた形ではLeu-Glu-Gluで始まるように）及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを除去又は省略することができる。
GCF前駆蛋白質の配列（SEQ ID NO:13）：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDE EQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAG RSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKV NVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRE LVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFAEGNTKCRAC AQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPR SVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPR DLVEPWVVVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVHHHHHH
治療用途を含む多くの用途に対して、リーダー配列（最初の１５アミノ酸、プロセシングを受けた形ではLeu-Glu-Gluで始まるように）及びC末端ヘキサヒスチジンタグを除去又は省略することができる。
コード化されたFL-hB4EC前駆体のアミノ酸配列（Hisタグ有り）（SEQ ID:14）：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDE EQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAG RSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKV NVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRE LVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCR ACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPS APRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDP GPRDLVEPWVVVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAV SDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAE LRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQGSKRAILQIEG KPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH
治療用途を含む多くの用途に対して、リーダー配列（最初の１５アミノ酸、プロセシングを受けた形ではLeu-Glu-Gluで始まるように）及びC末端ヘキサヒスチジンタグを除去又は省略することができる。
EphB4 CF2蛋白質、先駆体（SEQ ID NO:15）：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGS CVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFK PLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRL NGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPW VVVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSP SSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGAS YLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQGGRSSLEGPRFEGKPIPNPLL GLDSTRTGHHHHHH
好ましいGCF2蛋白質（GCF2Fともいう）の前駆配列は（SEQ ID NO:16）：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHS VRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCK ETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKT LRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPV AGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQG TFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVV SRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLV EPWVVVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVT RSSPSSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKR GASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQ
プロセシングを受けた配列は（SEQ ID NO:17）：
LEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCEVQR APGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESD ADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGF YLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVVDAVP APGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGS CQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSWSRLNGSSLHL EWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVVVRGL RPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLA WAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQV RARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQ
生物化学的アッセイ；
Ａ．結合アッセイ：
１０μｌのＮｉ-ＮＴＡ-アガロースをマイクロ遠心機用試験管中で、結合バッファＢＢ（２０ｍＭ Tris-HCl、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミンｐＨ８）中で稀釈した５０μｌ表示量のＢ４ＥＣｖ３を使用してインキュベートした。振とう台上でのインキュベーション３０分後、Ｎｉ-ＮＴＡビーズを１．４mlのＢＢで２回洗浄し、次に５０μｌのＢ２-ＡＰを使用して最終濃度５０ｎＭとした。結合を３０分間振とう台上で行い、次に試験管を遠心分離し、１．４mlのＢＢで１回洗浄した。沈降したＡＰ量をＰＮＰＰ処理後に比色分析で測定した。
Ｂ．阻害アッセイ；
（溶液中の阻害）
５０μｌのＢＢ中に稀釈された異なる量のＢ４ＥＣｖ３を、５０μｌの５ｎＭ Ｂ２ＥＣ-ＡＰ試薬で予備インキュベートした（エフリンB2外部ドメインの胎盤性アルカリホスファターゼとの蛋白質融合）。１時間インキュベーション後、結合していないＢ２ＥＣ-ＡＰを膜結合した完全長EphB4を発現するＨＥＫ２９３細胞５０００と共に２０分間沈降させた。結合反応を１．２mlのＢＢで希釈して停止し、次に１０分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、採取された細胞に関するアルカリホスファターゼ活性をパラ-ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）基質を添加して測定した。
（細胞ベースの阻害）
Ｂ４ＥＣｖ３を２０ｍＭ Tris-HCl、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ８中で順に稀釈し、膜結合した完全長エフリンB2を発現するＨＥＫ２９３細胞５０００と混合した。インキュベーション１時間後、５０μｌの５ｎＭ Ｂ４ＥＣ-ＡＰ試薬（EphB4外部ドメインと胎盤性アルカリホスファターゼとの蛋白質融合）をそれぞれの試験管中へ３０分間添加し、未結合のエフリンB2結合部位を検出した。結合反応を１．２mlのＢＢでの希釈により停止し、遠心分離した。細胞-沈降したＡＰの比色分析的反応をＰＮＰＰ基質で展開した。
Ｃ．Ｂ４ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ；
（プロテインＡ-アガロースベースアッセイ）１０μｌのプロテインＡ-アガロースをエッペンドルフ型試験管中で、結合バッファＢＢ（２０ｍＭ Tris-HCl、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ８）中に稀釈した５０μｌの表示量のＢ４ＥＣ-ＦＣと共にインキュベートした。振とう台上でインキュベーション３０分間後、プロテインＡアガロースビーズを１．４mlのＢＢで２回洗浄し、次に５０μlのＢ２ＥＣＡＰ試薬を適用して最終濃度５０ｎＭとした。結合を３０分間振とう台上で行い、次に試験管を遠心分離し、１．４mlのＢＢで１回洗浄した。沈降したＡＰの比色分析的反応をＰＮＰＰの適用後に測定した（図６）。
（ニトロセルロースベースのアッセイ）Ｂ４ＥＣ-ＦＣを順に２０ｍＭ Tris-HCl、０．１５ＭＮａＣｌ、５０μｇ／mlＢＳＡ、ｐＨ８中に稀釈した。２μｌのそれぞれのフラクションをニトロセルロースストリップ上に適用し、スポットを３分間乾燥させた。ニトロセルロースストリップを５％無脂肪乳で３０分間ブロックし、次に５ｎＭ Ｂ２ＥＣ-ＡＰ試薬でインキュベーションした。結合用インキュベーション４５分後、ニトロセルロースを２０ｍＭ Tris-HCl、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０μｇ／ml ＢＳＡ、ｐＨ８で２回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質シグマＦａｓｔ（シグマ社製）を適用して色を展開した。
Ｄ．Ｂ４ＥＣ-ＦＣ阻害アッセイ；
（溶液中阻害）Ｂ４ＥＣｖ３について記載した上記参照。結果を図７に示す。
（細胞ベースの阻害）Ｂ４ＥＣｖ３について記載した上記参照。
Ｅ．Ｂ２ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ；
（プロテインＡ-アガロースベースアッセイ）Ｂ４ＥＣ-ＦＣについて記載した上記参照。結果を図８に示す。
（ニトロセルロースベースのアッセイ）Ｂ４ＥＣ-ＦＣについて記載した上記参照。
６）細胞-ベースのアッセイ；
Ａ．増殖阻害アッセイ：
ヒトへその緒静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（１．５×１０3）を１００μｌのＥＢＭ-２（Clonetic社製、番号ＣＣ３１６２）を含む９６-ウェルプレート中にプレートする。２４時間後（第０日）、試験用組み換え型蛋白質（１００μｌ）をそれぞれのウェルへＥＢＭ-２培地中に２×目的濃度（５〜７濃度レベル）で添加する。第０日に、１のプレートを２０％メタノール中０．５％クリスタルバイオレットで１０分間染色し、水で洗浄し、空気乾燥する。残っているプレートを７２時間３７℃でインキュベートする。７２時間後、プレートを２０％メタノール中０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、空気乾燥する。染色は、エタノール：０．１Ｍクエン酸ナトリウム１：１溶液で溶離し（第０日プレートを含む）、吸光度５４０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Dynatechラボラトリーズ社製）を使用して測定する。第０日吸光度を７２時間プレート結果から減じ、データをコントロール増殖（ビヒクル処理した細胞）割合としてプロットする。ＩＣ50（５０％阻害を発生する薬剤濃度）をプロットしたデータから算出する。
Ｂ．コード形成アッセイ（内皮細胞管形成アッセイ）；
マトリゲル（商標）（６０μｌの１０ｍｇ／ml；Collaborative Lab社製、番号３５４２３）を氷冷９６-ウェルプレートのそれぞれのウェル中に配置した。プレートを室温で１５分間放置し、次に３７℃３０分間インキュベートし、マトリゲルをポリマー化した。その間に、ＨＵＶＥＣをＥＧＭ-２（Clonetic社製、番号ＣＣ３１６２）中に濃度２×１０5細胞／mlで調製する。試験化合物を２×目的濃度（５濃度レベル）で同一の培地中に調製する。細胞（５００μｌ）及び２×ドラッグ（５００μｌ）を混合し、２００μｌのこの懸濁液をポリマー化したマトリゲル上で複製配置する。インキュベーション２４時間後、三個の試験画像をBioquant画像分析システムを使用してそれぞれの濃度で得る。未処理のコントロールと比較した薬剤効果（ＩＣ50）を、形成されたコードの長さ及び結合数を測定して評価する。
Ｃ．細胞移動アッセイ；
移動を、４８-ウェルボイデンチャンバー（商標）及び８μｍ孔径のコラーゲン被覆された（１０μｇ／mlラット尾コラーゲン；Collaborative Lab社製）ポリカーボネートフィルター（Osmonics、Inc.）を使用して評価する。底部チャンバーウェルに２７〜２９μｌのＤＭＥＭ培地のみ（ベースライン）又は化学走性誘因物質含有培地（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ又はスイス３Ｔ３細胞条件付け培地）を配置する。上部チャンバーに試験化合物を含む又は含まないＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡ中で調製される４５μｌのＨＵＶＥＣ細胞懸濁液（１×１０6細胞／ml）を配する。３７℃で５時間インキュベーション後、膜をＰＢＳ中で洗浄し、Ｄｉｆｆ-Ｑｕｉｃｋ溶液中に固定化して染色する。フィルターをガラススライド上に、移動した細胞を下向きに配置し、上部の細胞をＫｉｍｗｉｐｅ（商標）を使用して除去する。試験は４〜６複製物及びそれぞれのウェルからの５視野を計測して行う。陰性無刺激コントロール値を刺激されたコントロール及びドラッグ処理した値から除き、データを平均移動細胞±S.D.としてプロットする。ＩＣ50をプロットしたデータから算出する。
実施例２（EphB4レセプターの細胞外領域フラグメントは、血管形成及び腫瘍増殖を阻害する。）
Ａ．EphB4の球状領域が内皮性管形成アッセイ中で、エフリンB2結合のために、及びEphB4由来の可溶性蛋白質活性を測定するために必要である。
レセプターの可溶性組み換え型誘導体の抗血管形成活性に必要十分なEphB4の異所性部位のサブドメインを特定するために、EphB4ＥＣの４種の組み換え型欠失変異体を生産し、試験した（図１６）。EphB4の細胞外部位は、EphＢ及びEphＡレセプターファミリーの他の構成員と同様に、Ｎ-末端リガンド結合球状領域、次にシステイン-リッチ領域及び２個のフィブロネクチン型IIIリピート（ＦＮIII）を含有する。EphB4の完全異所性部位を含有する組み換え型Ｂ４-ＧＣＦ２蛋白質に加え、球状領域及びＣｙｓ-リッチ領域（Ｂ４-ＧＣ）を含有するEphB4ＥＣの３個の欠失変異体を構築した；即ち、球状、Ｃｙｓ-リッチ及び第一のＦＮIII領域（ＧＣＦ１）並びに削除された球状領域（ＣＦ２）を有するＥＣＤ変異体。球状領域のみを含有する短縮されたEphB4ＥＣ蛋白質の数個のバージョンを生産するための試みは成功せず、その理由はこれら全ての構築物から発現した蛋白質の分泌の欠如、及び細胞内で発現された組み換え型蛋白質により結合されたリガンドの不存在であった。更に、Ｂ４-ＧＣＦ２の非標識化体（ＧＣＦ２-Ｆという）は、追加的に融合されたアミノ酸を有さないEphB4の完全な細胞外領域を含有するものであり、発現され、精製され、ここで記載される実験の幾つかで使用された。
４個全てのＣ末端６ｘＨｉｓ標識化組み換え型蛋白質を一時的にトランスフェクトされた培養ほ乳類細胞中で予備的に発現し、条件付けした増殖培地からＮｉ2+キレート樹脂上のクロマトグラフィーを使用して親和性精製して均質化した（図１７）。明らかにそれらのグリコシル化を原因として、この蛋白質は３４．７ｋＤａ（ＧＣ）、４１．５（ＣＦ２）、４５．６ｋＤａ（ＧＣＦ１）及び５７．８ｋＤａ（ＧＣＦ２）のそれらの予測分子量により示唆されるよりもいくらか高くＳＤＳ-ＰＡＡＧ上を移動する。ヒトEphB4の細胞外領域の配列は、Ｃｙｓ-リッチ領域中の、第一フィブロネクチン型IIIリピート中にあり第一及び第二フィブロネクチンリピート間に位置する、３個の予測Ｎ-グリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）を含有する。
エフリンB2へ結合される精製された組み換え型蛋白質の能力を確定するために、それらをin vitro結合アッセイで試験した。予測されるように、ＣＦ２ではなくＧＣ、ＧＣＦ１及びＧＣＦ２は同系のリガンドエフリンB2を結合し、それはエフリンB2-アルカリホスファターゼ（エフリンB2-ＡＰ）融合蛋白質とＮｉ2+樹脂又はニトロセルロース膜上に固定化されたＢ４蛋白質との相互作用により確認される（図１７）。
４個全ての蛋白質も又、それらの、リガンド-依存性二量体化、及びＰＣ３細胞中のEphB4レセプターキナーゼの活性化をブロックする能力も試験された。ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞系は、上昇したレベルのヒトEphB4を発現することは公知である。ＰＣ３細胞のエフリンB2IgG Fc融合蛋白質による刺激は、レセプターのチロシンリン酸化の急速な誘導を導く。しかし、リガンドのＣＦ２ではなくＧＣＦ２、ＧＣＦ１又はＧＣ蛋白質とのプレインキュベーションは、その次に続くEphB4自動リン酸化を抑制する。蛋白質単独のＰＣ３細胞への添加又は細胞の蛋白質とのプレインキュベーション及び次の培地交換及びリガンド添加は、EphB4リン酸化段階に作用しない。
更に、EphB4の球状領域は、内皮性管形成アッセイ中のEphB4由来の可溶性蛋白質の活性に必要であることが発見された。
Ｂ．ＨＵＶ／ＡＥＣの可溶性EphB4のin vitro効果；
可溶性EphB4が血管形成経路中の主要な３段階に作用したか否かを決定するために、初期実験を行った。これらは、ＨＵＶ／ＡＥＣによるin vitroの移動／侵潤、増殖及び細管形成への可溶性EphB4の効果を確定することにより実施した。可溶性EphB4への曝露は、投薬量依存性挙動でのボイデンチャンバー（商標）アッセイ中のｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ-両方の誘起移動を非常に阻害し、ｎＭでの重要性を確定した（図１８）。マトリゲル（商標）被覆されたウェル上の、ＨＵＶ／ＡＥＣＳによる細管形成は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの不存在及び存在のいずれでも可溶性EphB4により投薬量依存性挙動で非常に阻害された（図１９）。又in vitroで可溶性EphB4のｎＭはＨＵＶＥＣＳへ細胞毒性であったか否かを評価した。
ＭＴＳアッセイで評価したように、可溶性EphB4のこれらの投薬量では細胞毒性効果が検出されなかった（図２０）。
Ｃ．可溶性EphB4レセプターは、マトリゲル（商標）プラグのin vivo血管形成を抑制する；
可溶性EphB4がin vivo血管形成を直接に阻害することを示すために、ネズミマトリゲルプラグ実験を行った。ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを可溶性EphB4の存在又は非存在下で補充したマトリゲル（商標）をBalb/C nu/nuマウスへｓ．ｃ．注射し、半固体プラグを６日間で形成した。増殖因子無しのプラグは、６日後に実質的に血管形成又は脈管構造が生じなかった（図２１）。反対に、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを補充されたプラグは、プラグ全体に充分な血管形成及び脈管を生じた。μｇの可溶性EphB4で処理したマウスから取り出されたプラグでは、増殖因子なしのプラグと比較してプラグの血管形成が顕著に減少した（図２１）。更に、プラグの組織試験は脈管染色が減少したことを示した（図２１）。
μｇ／投薬量での治療は、コントロールと比較してマトリゲルプラグ中への湿潤を非常に阻害した（図２１）。可溶性EphB4-処理した細胞からの溶解産物及びリン酸（phosphor）-チロシンに対する抗体を使用してウェスタンブロット法分析を実施して、ＨＵＶＥＣ中のEphB4レセプターリン酸化を試験した。血清-飢餓状態にしたＨＵＶＥＣの可溶性EphB4処理は、エフリンB2Fc、EphB4リガンド二量体の存在下で、リン酸化EphB4のレベルの急速及び一時的な減少を刺激した。可溶性EphB4蛋白質なしのエフリンB2Fcは、EphB4レセプターのリン酸化を誘起した（図２２）。
Ｄ．腫瘍増殖に対する可溶性EphB4のin vitro効果；
可溶性EphB4はBalb/C Nu/Nuマウス中のＳＣＣ１５腫瘍の増殖を抑制することが発見された（図２３）。
Ｅ．可溶性EphB4は角膜新生血管形成を阻害した；
可溶性EphB4のin vivo抗血管形成活性を更に検討するために、ｂＦＧＦで誘起されたマウス角膜中の新生血管形成に対する可溶性EphB4投与の阻害的効果を試験した。角膜マイクロポケット中へ移植されたHydron（商標）ペレットは、通常の血管面積中の血管形成を増殖因子の存在下で誘起できる。マウス角膜中の血管形成応答は中程度であり、血管芽の発生は遅れ、新しい毛細血管はまばらでゆっくりとしか成長しなかった。コントロールグループと比べて、移植７日目に、ｂＦＧＦによりマウス角膜中で誘起された新生血管形成は、可溶性EphB4-処理したグループ中で顕著に阻害された（図２４）。
Ｆ．腫瘍増殖に対する可溶性EphB4のin vivo効果；
同一のモデルを、可溶性EphB4のin vivo効果を決定するために使用した。ＳＣＣ１５腫瘍をマトリゲルと共に増殖因子有り又は無しでプレインキュベートして皮下移植し、又ｓｃ単独で移植し、マウスを一日１〜５ｕｇの可溶性EphB4でｓｃ又はｉｐ処理して実験した。
コントロールグループ中の腫瘍は、処理期間中連続して着実に増殖し、最終腫瘍体積ｍｍ3に達した。しかし、可溶性EphB4を注射した動物では増殖速度が非常に（ｐ＜０．０／）減少し、最終腫瘍体積はたったｍｍ3であった（図２５）。類似の結果が更に２個のこれら腫瘍保持マウスの集団でも得られた。可溶性EphB4の投与は、動物の体重又は一般的健康に対する非常な効果を示さないでin vivoで耐薬物性に優れることが明らかになった（昏睡、断続的な背中の曲げ、震え又は不安定な呼吸パターンの不存在により決定された）。
Ｇ．腫瘍組織に対する可溶性EphB4の効果；
組織分析は、通常腫瘍細胞の生存縁部ｕｍ幅で囲まれている、全ＳＣＣ１５腫瘍中の壊死の中心面積の存在を明らかにした。中心壊死面積はしばしば大きく接触性（confluent）であり、細胞詳細部の喪失を示した。腫瘍断片面積の割合として評価した壊死は、可溶性EphB4-処理したグループで非常に（ｐ＜０．０２）多かった（コントロールに対する処理体の％壊死）。可溶性EphB4処理した腫瘍体積の減少はこの蛋白質の腫瘍血管供給に対する効果によるのか否かを決定するために、血管中の内皮細胞を、腫瘍断片中で抗血小板細胞付着分子（ＰＥＣＡＭ-１；ＣＤ３１）抗体を使用した免疫染色法を使用して特定し、微細血管の密度を評価した（図２６）。微細血管密度は、コントロール中及び可溶性EphB4-処理した腫瘍中の、腫瘍細胞の外側の生存縁部（よく区別される核を有する腫瘍の周辺部へ隣接する細胞の均一層）と類似した。微細血管密度は非常に内側にあり、コントロール腫瘍より可溶性EphB4-処理した壊死性中心面積に接触する腫瘍細胞の生存領域がより少なかった。マッソン社製トリクローム（商標）染色で特定されるように、繊維素沈着はコントロール腫瘍より、内側生存縁部中の血管中及び周囲並びに可溶性EphB4処理した中心壊死性コアで増加した。可溶性EphB4処理した腫瘍の生存縁部の外側では、脈管管腔は空腔を保持し、赤血細胞を含有するが、繊維素沈着は多くの脈管周囲で顕著であった。可溶性EphB4は、試験された正常組織（肺、肝臓及び腎臓）中の内皮に対してはこれらの効果が無いことが発見された。
Ｈ．材料及び方法；
本実施例の材料及び方法の詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
細胞-ベースのEphB4チロシンキナーゼアッセイ；
ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ３細胞を１０％半透膜ろ過したウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質混合物と共にＲＰＭＩ培地中で維持した。細胞を５％ＣＯ2／９５％空気湿生雰囲気下３７℃で保持した。通常、細胞を接触するまで６０ｍｍディッシュ中で増殖し、１０分間１μｇ／mlのＲＰＭＩ中でマウスエフリンB2-Fc融合で処理してEphB4レセプター活性化するか、コントロールとして単純（ｐlａｉｎ）培地で処理した。EphB4レセプター活性化に対する可溶性EphB4ＥＣＤ蛋白質の異なる誘導体の効果を試験するために、３セットの細胞を使用した。第一のセットで、細胞を種々の蛋白質（５蛋白質；ＧＣ、ＧＣＦ１、ＧＣＦ２、ＧＣＦ２-Ｆ、ＣＦ２）で５μｇ／ml ２０分間処理した。第二セットの細胞では、適用前に、蛋白質を１：５（EphB4蛋白質：B2-Fc）モル比でエフリンB2-Fcと予備混合し、２０分間インキュベートし、細胞上に１０分間適用した。第三セットの細胞では、細胞を最初に蛋白質と２０分間５μｇ／mlで処理し、培地を１μｇ／mlのエフリンB2-Fcを含有する新しい培地で置換し、更に１０分間インキュベートした。
刺激後、細胞を直ちに、２０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Triton X100（商標）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含有する蛋白質抽出バッファで採取した。蛋白質抽出物を、１４０００ｒｐｍ、２０分間４℃遠心分離で清澄化した。清澄化蛋白質サンプルを抗EphB4モノクローナル抗体予備コートされたプロテインＡ／Ｇ結合したアガロースビーズと共に一晩インキュベートした。ＩＰ複合体を同じ０．１％Triton X100（商標）を含有する抽出バッファで２回洗浄した。免疫沈降した蛋白質を１Ｘ ＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプルローディングバッファ中で可溶化し、１０％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離した。EphB4レセプター活性化試験のために、電気ブロッティングした膜を１：１０００希釈の抗ｐＴｙｒ特異的抗体４Ｇ１０、次に１：５０００希釈のプロテインＧ-ＨＲＰ複合体でプローブした。
内皮細胞管形成アッセイ；
マトリゲル（商標）（６０μｌの１０ｍｇ／ml；Collaborative Lab社製、カタログ番号３５４２３）を氷冷９６-ウェルプレートのそれぞれのウェル中に設置した。プレートを室温で１５分間放置し、次に３７℃で３０分間インキュベートしてマトリゲル（商標）をポリマー化した。その間に、ヒトへその緒の静脈内皮細胞を、ＥＧＭ-２（Clonetic社製、カタログ番号ＣＣ３１６２）中、濃度２×１０5細胞／mlで調製した。試験蛋白質を同じ培地中の２×目的濃度（５濃度レベル）で調製した。細胞（５００μｌ）及び２×蛋白質（５００μｌ）を混合し、２００μｌのこの懸濁液をポリマー化したマトリゲル（商標）の複製物中に加えた。インキュベーション２４時間後、三個の試験画像をそれぞれの濃度でBioquant（商標）画像分析システムを使用して取った。蛋白質添加効果（ＩＣ50）を形成されたコード長さ及び結合数を測定して、未処理のコントロールと比較して評価した。
細胞移動アッセイ；
ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦへの走化性を、modifiedボイデンチャンバー（商標、マトリゲルでコートしたトランスウェル膜フィルターインサート；２４ウェルプレート、６．５ｍｍ直径、８μｍ孔径、１０μｍ厚ポリカーボネート膜（BD Biosciences社製））を使用して評価した。２００μｌのＥＢＭ中のＨＵＶＥＣ細胞の懸濁液（２×１０5細胞／ml）を、上室チャンバーに接種し、可溶性EphB4蛋白質を刺激剤（ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ）と同時にチャンバーの下室へ添加し、１００ｎＭ〜１μＭ試験化合物の存在又は非存在下で１０〜２０ｎｇ／mlのＶＥＧＦに応答してポリカーボネートフィルターを通過するそれらの移動を測定した。３７℃で４〜２４時間インキュベーション後、フィルターの上部表面を綿棒でスクレープし、フィルターを固定してDiff Quick（商標）で染色した。２００×倍率で１０のランダム視野を計測し、結果を視野当りの平均数として示した。刺激されたコントロール及び蛋白質処理したサンプル値から陰性無刺激コントロール値を除き、データを平均移動した細胞±S.D.としてプロットした。ＩＣ50をプロットしたデータから算出した。
増殖阻害アッセイ；
ＨＵＶＥＣ（１．５×１０3細胞）を１００μｌのＥＢＭ-２（Clonetic社製、カタログ番号ＣＣ３１６２）を含む９６-ウェルプレート中にプレートした。２４時間後（第０日）、試験用組み換え型蛋白質（１００μｌ）をそれぞれのウェルへＥＢＭ-２培地中に２×目的濃度（５〜７濃度レベル）で添加した。第０日に、１のプレートを２０％メタノール中０．５％クリスタルバイオレットで１０分間染色し、水で洗浄し、空気乾燥した。残っているプレートを７２時間３７℃でインキュベートした。７２時間後、プレートを２０％メタノール中０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、空気乾燥した。染色は、エタノール：０．１Ｍクエン酸ナトリウム１：１溶液で溶離し（第０日プレートを含む）、吸光度５４０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Dynatechラボラトリーズ社製）を使用して測定した。第０日吸光度を７２時間プレート結果から減じ、データをコントロール増殖（ビヒクル処理した細胞）割合としてプロットした。ＩＣ50値をプロットしたデータから算出した。
ネズミマトリゲル（商標）プラグ血管形成アッセイ；
In vivo血管形成をマウス中の皮下組織からマトリゲルプラグ含有試験サンプル中への血管の成長としてアッセイした。マトリゲル（商標）は急速に体温で固体ゲルを形成し、因子をトラップして除放及び周囲の組織への長期間の曝露を可能とする。４℃で液状のマトリゲル（商標）（８．１３ｍｇ／ml、０．５ml）を内皮細胞成長補充物（ＥＣＧＳ）、試験蛋白質プラスＥＣＧＳ又はマトリゲル（商標）プラスビヒクル単独（ＰＢＳ含有０．２５％ＢＳＡ）と混合した。マトリゲル（商標）（０．５ml）をメスnu/nuマウス（６週齢）の腹部皮下組織へ腹膜中心線に沿って注射した。それぞれのグループに３マウスを使用した。動物は、慣習及びＮＩＨガイドラインに従って取り扱った。６日目に、マウスを犠牲にし、プラグを回収し、組織を処理した。通常表面の皮膚を除去し、ゲルをサポート用に腹膜ライニングを保持したまま取り出し、１０％緩衝ホルマリンのＰＢＳ溶液中で固定化してパラフィン中に包埋した。３μｍの断片に切断し、Ｈ＆Ｅ又はマッソン社製トリクローム（商標）染色で染色し、光学顕微鏡で試験した。
マウス角膜マイクロポケットアッセイ；
マウス角膜マイクロポケットアッセイをＫｅｎｙｏｎら、１９９６の詳細に従い行った。簡潔には、９０ｎｇのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ）又は１８０ｎｇのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、ミネアポリス、ＭＮ、米国）のいずれか及び４０μｇのスクロース硫酸アルミニウム（シグマ社製）を含有するhydronペレット（ポリヒドロキシエチルメタクリレート［ポリＨＥＭＡ］、Interferon Sciences社製、ニューブランズウィック、ＮＪ、米国）を作成した。手術用顕微鏡を使用して、間質性直線状角膜切開を外科用ブレード（商標、Bard-Parker社製、no.１５）を使用して麻酔した動物の外側直筋の挿入物と平行に行った。基質内のマイクロポケットを、改良フォングレーフェ刀（２’３０ｍｍ）を使用して切開した。１個のペレットを移植し、一時的（temporal）角膜輪部（ｂＦＧＦペレット用に０±７±１±０ｍｍ及びＶＥＧＦペレット用に０±５ｍｍ内）に対して進め、それぞれの増殖因子用のペレット位置内での相違は、このモデル内でＶＥＧＦの比較的弱い血管形成刺激を生じるために必要であるように決定された。次に抗生物質軟膏（エリスロマイシン）を手術した目へ適用し、感染を防止し表面不規則性を減少させた。次に角膜輪部脈管構造からペレットに向かって延びる血管の応答を測定した。ここで示される新生血管形成の隣接した外周部のデータ及び臨床性写真はペレット移植後６日目に得られ、その日は最大血管形成応答日であることが明らかになった。
In vitro侵潤アッセイ；
「マトリゲル（商標）」マトリックス被覆された９-ｍｍ細胞培養インサート（孔径８μｍ；ベクトンディッキンソン社製、フランクリンレイクス、ＮＪ）を２４-ウェルプレート中に配置した。ＨＵＶＥＣ細胞を密度５×１０3／ウェル細胞で培養インサートの上層中に接種し、２４時間EphB4ＥＣＤの存在下で血清フリーＥＢＭで培養した。コントロールグループを同じ培地中にEphB4無しに培養した。次に０．５mlのヒトＳＣＣ１５細胞系、条件付け培地を、培養インサートの下層中に化学走性誘因物質として充填した。細胞を２４時間インキュベートし、次に上層中に残っている細胞を綿棒でかきとり下層中の通過した細胞を５％グルタルアルデヒドで固定化し、Diff Quick（商標）で染色した。マトリゲル（商標）マトリックス及びそれぞれの８μｍ孔径の培養インサートを通過した細胞合計数を光学的顕微鏡を使用して測定し、侵潤インデックスとして規定した（細胞数／面積）。
マウス中のＳＣＣ１５腫瘍の成長；
対数的に増殖するＳＣＣ１５（頭部及び頚部扁平上皮細胞癌細胞系）を５×１０6細胞密度で、EphB4ＥＣＤの存在又は非存在下で、ヒトｂＦＧＦの存在又は非存在下で、胸腺欠損マウスBalb/cヌードマウス中に、マトリゲル（商標、BD Biosciences社製）合成基底膜（１：１ｖ／ｖ）と共に皮下注射し、２週間腫瘍を検査した。EphB4ＥＣＤグループ中の腫瘍体積は、ビヒクルグループ中のそれよりも移植後の増殖因子の存在及び不存在で３倍小さかった。グループ間に体重の違いはなかった。切除された腫瘍の横断面の免疫組織化学試験及びＴＵＮＥＬ-陽性アポトーシス又は壊死、ＣＤ３４免疫染色法、及びBrdU増殖速度試験を、脱パラフィン化後、再水和し、内因性ペルオキシダーゼ活性のためにクエンチし、プロテアーゼＫでの透過化処理で１０分後行った。血管密度の量的評価も又行った。局部的腫瘍内デリバリー又はEphB4ＥＣＤのＩＶデリバリーも又、週２回行った。
３０胸腺欠損ヌードマウス、ＢＡＬＢ／ｃ（nu/nu）へ、０．１mlマトリゲルと混合した０．１mlＰＢＳ中の１×１０6Ｂ１６黒色腫細胞をそれぞれ注射し、又は２００μｌのＤＭＥＭ血清フリー培地中に再懸濁した１．５×１０6ＳＣＣ１５細胞を０日目にマウスの右肩領域へ皮下注射した。蛋白質を、開始１日目にローディング投薬量４μｇ／ｍｇで腫瘍周囲に静脈内又は皮下注射し、２ｕｇ／ｍｇの注射を週間毎に行い（１０μｇ／ｇ、５０μｇ／ｋｇ／日）、接種後２週間検査した。マウスは１４日目に犠牲にされた。コントロールマウスはＰＢＳ５０μｌを毎日投与された。
ヌードマウス中の腫瘍形成；
全動物は動物愛護協会組織に承認されたプロトコルに従って取り扱った。癌細胞（５×１０6）をヌードマウスの背中皮膚に皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ3の大きさまで増殖した時に（通常１２日かかった）、ｓEphB4を腹膜内又は皮下に１回／日注射し、腫瘍発生を２週間監視した。腫瘍体積を式ａ2×ｂに従って算出した、但しａ及びｂはそれぞれ最小及び最大直径である。スチューデントｔ試験を腫瘍体積を比較するために使用し、Ｐ＜０．０５は優位であるとみなした。
微細血管密度の定量化；
腫瘍を４％ホルムアルデヒド中に固定化し、パラフィン中に包埋し、５μｍに断片化し、ヘマトキシリンエオシンで染色した。脈管密度をコンピュータベースの画像分析機を使用して半定量化した（それぞれのグループのマウス３頭からの断片当たり５視野）。
実施例３（EphB4は、アップレギュレートされて前立腺癌に成長促進を付与する。）
Ａ．前立腺癌細胞系中のEphB4の発現；
最初にウェスタンブロット法により種々の前立腺癌細胞系中でEphB4蛋白質の発現について試験した。前立腺癌細胞系は顕著な変異体を１２０ｋＤ EphB4中に豊富に示すことが見いだされた。レベルはＰＣ３中で比較的高く、ＰＣ３Ｍ（ＰＣ３の転移性クローン）でさえ高い。一方、正常前立腺由来の細胞系（ＭＬＣ）はEphB4の発現を僅か又は全く示さない（図２７Ａ）。次にＰＣ３細胞中のEphB4の活性化段階をリン酸化試験により確認した。正常培養条件下でさえ、EphB4はそのリガンド、エフリンB2により更に誘起されるにもかかわらず、ホスホリル化されることが明らかになった（図２７Ｂ）。
Ｂ．臨床性前立腺癌サンプル中のEphB4の発現；
EphB4が臨床性前立腺サンプル中で発現したか否かを決定するために、前立腺癌外科的標本からの腫瘍組織及び隣接した正常組織を試験した。前立腺標本中のEphB4の組織的分布を免疫組織化学法により決定した。明らかに、EphB4発現は新生物性上皮に限定され（図２８、左上）、間質性及び正常前立腺上皮では存在しない（図２８、右上）。前立腺組織アレイ中、試験された３２前立腺癌の２４が陽性であった。量的ＲＴ-ＰＣＲによりEphB4ｍＲＮＡは、臨床性サンプルの正常及び腫瘍組織の両方で発現したことが明らかになった。しかし、腫瘍EphB4ｍＲＮＡレベルは、このケースでは正常な場合よりも少なくとも３倍高かった（図２８、右下）。
Ｃ．ｐ５３及びＰＴＥＮはＰＣ３細胞中のEphB4の発現を阻害した；
ＰＣ３細胞は、ＰＴＥＮ発現（Davisら、1994、Science.266:816-819）及び野生型ｐ５３機能（Galeら、1997、Cell Tissue Res.290:227-241）を欠如することは当分野で公知である。EphB4の比較的高い発現はｐ５３及び／又はＰＴＥＮに関係するか否かを、野生型ｐ５３及び／又はＰＴＥＮのＰＣ３細胞の再導入により検討した。トランスフェクション効率及び希釈効果を補填するために、トランスフェクトされた細胞は共トランスフェクトされた短縮されたＣＤ４マーカーについて分類された。ＰＣ３細胞中のEphB4の発現は、野生型ｐ５３又はＰＴＥＮのいずれかの再導入により減少した。ｐ５３及びＰＴＥＮの共トランスフェクションは、EphB4の発現を更に阻害しなかった（図２９Ａ）。
Ｄ．レチノイドＸレセプター（ＲＸＲα）はEphB4の発現をレギュレートする；
発明者らは以前にＲＸＲαは前立腺癌細胞系中でダウンレギュレーションされることを発見したが（Ｚｈｏｎｇら、２００３、Cancer Biol Ther.2：179-184）、EphB4発現は、「正常」前立腺（ＭＬＣ）、前立腺癌（ＰＣ３）及び転移性前立腺癌（ＰＣ３Ｍ）を検討した時には逆の発現パターンを有することを今回発見し（図２７Ａ）、ＲＸＲαはEphB4の発現をレギュレートするのではないかと考えた。この関係を確認するために、EphB4の発現を構成的にＲＸＲαを発現するＣＷＲ２２Ｒ及びＣＷＲ２２Ｒ-ＲＸＲα間で比較した。ＲＸＲα過発現細胞系でのEphB4発現の適度な減少が発見された一方、ＦＧＦ８はEphB4発現に効果がなかった。初期結果に適合するように、EphB4は「正常」良性前立腺肥大性細胞系ＢＰＨ-１中に発見されなかった（図２９Ｂ）。
Ｅ．ＥＧＦＲ及びＩＧＦ-１Ｒの増殖因子シグナル経路はEphB4発現をレギュレートする；
ＥＧＦＲ及びＩＧＦ-１Ｒは両方共ＰＣ３細胞増殖に対するオートクリン及びパラクリン作用を有することを示した。EphB4発現はより悪性の細胞系ではより高いために、EphB4発現はこれらのｐｒｏ-生存増殖因子と相関関係を有することが予測された。独立してＥＧＦＲ及びＩＧＦ-１Ｒシグナルをブロッキングすることによりその関係を試験した。EphB4は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８を使用したＥＧＦＲシグナルのブロッキング後（図３０Ａ）又はＩＧＦ-１Ｒ中和抗体を使用したＩＧＦ-１Ｒシグナル経路のブロックにおいて（図３０Ｂ）ダウンレギュレーションされた。
Ｆ．EphB4 siRNA及びアンチセンスＯＤＮはＰＣ３細胞生存能力を阻害する；
前立腺癌モデル中のこのEphB4過発現の有意性を確定するために、比較的高いEphB4の発現を示すＰＣ３細胞に研究を集中した。EphB4発現を減少させる２つのアプローチは、siRNA及びＡＳ-ＯＤＮであった。EphB4コーディング領域の異なるセグメントを相補する多くの異なるホスホロチオアート-改質ＡＳ-ＯＤＮについて、EphB4阻害の特異性及び効率を試験した。完全長EphB4発現ベクターＡＳ-１０で一時的にトランスフェクトされた２９３細胞を使用すると、最も効果的であることが発見された（図３１Ｂ）。類似のアプローチを特異的siRNAの選択へ適用した。EphB4 siRNA４７２は、EphB4蛋白質発現を効果的にノックダウンした（図３１Ａ）。siRNA４７２及びアンチセンスＡＳ-１０ＯＤＮの両方は、投薬量依存性挙動でＰＣ３細胞の生存能力を減少した（図３１Ｃ、Ｄ）。関係のないsiRNA又はセンスオリゴヌクレオチドは生存能力に効果がなかった。
Ｇ．EphB4 siRNA及びアンチセンスＯＤＮはＰＣ３細胞の移動性を阻害する；
ＰＣ３細胞は、マウス内へ同所的に注射した場合に局部的に進行的に増殖し、リンパ節転移を形成できる。ＰＣ３細胞のIn vitro移動に対するEphB4の機能を検討するために創傷治癒アッセイを行った。創傷がＰＣ３細胞の単層中に導入された場合、次の２０時間のコースで、細胞はクリアな領域中へ進行的に移動した。しかし、細胞がsiRNA４７２でトランスフェクトされ、創傷が導入された場合、この移動は非常に阻害された（図３１Ｅ）。ＰＣ３細胞の１０μＭのEphB4 AS-１０による１２時間の予備処理は、同じ効果を生じた（図３１Ｆ）。更に、siRNA４７２を有するＰＣ３細胞中EphB4発現のノックダウンは、コントロールsiRNAと比べてこれらの細胞のマトリゲル（商標）侵入能力を激しく減少させたことがダブル-チャンバー侵潤アッセイにより評価された（図３１Ｇ）。
Ｈ．EphB4 siRNAは、ＰＣ３細胞中で細胞周期停止及びアポトーシスを誘起する；
EphB4のノックダウンは細胞生存能力減少を生じたために（図３１Ｃ）、これが細胞周期に対する効果に起因するのかを検討した。コントロールsiRNAトランスフェクトした細胞との比較において、siRNA４７２はコントロールsiRNA処理した細胞と比べてサブＧ０及びＳ期フラクション中の細胞の蓄積を生じた。コントロールsiRNA処理した細胞と比べてsiRNA４７２処理細胞中で、サブＧ０フラクションは１％から７．９％へ増加し、S期フラクションは１４．９％から２０．８％へ増加した（図３２Ａ）。サブＧ０及びＧ２での細胞周期停止はアポトーシスを表す。EphB4ノックダウンの結果としてのアポトーシスは、ELISAアッセイにより確認された。アポトーシスの投薬量依存性増加は、ＰＣ３細胞がコントロールsiRNAではなくsiRNA472でトランスフェクトされた場合に確認された（図３２Ｂ）。100nMで、siRNA４７２トランスフェクトされた細胞中ではコントロールsiRNAトランスフェクトされたＰＣ３細胞中よりも１５倍多くアポトーシスを生じた。
Ｉ．材料及び方法；
本実施例の材料及び方法の詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
実施例４（中皮腫中のEphB4の発現：治療のターゲット候補）
悪性中皮腫（ＭＭ）は、稀な新生物であり、最もしばしば胸膜性及び腹腔性漿液表面から生じる。胸膜腔は、最もしばしば患部となる部位であり（＞９０％）、次が腹膜である（６〜１０％）（Carboneら、2002、Semin Oncol．29：2-17）。これはアスベスト暴露とは強い関連性があり、約８０％の悪性中皮腫病はアスベストを摂取又は吸入した患者に生じる。この腫瘍は、現在に至るまで従来の治療法ではあまり効き目がなく、これらの患者の予後は非常に不良である（Leeら、2000、Curr Opin Pulm Med.6：267-74）。
悪性中皮腫の診断及び処理に関するいくつかの臨床性問題は、未だ解決されていない。胸膜又は腹部流体からの中皮腫の診断は非常に困難であり、しばしば胸腔鏡又は腹腔鏡又は開胸バイオプシー並びにこの腫瘍に選択的に発現するmeosthelin等の所定のマーカー用の免疫組織化学染色法を必要とする。現在まで、攻撃的な化学療法養生法及び長期間の放射線治療法であっても介入が治療効果のあるものとは証明されていない。多くのケースで生存平均値は、診断後たったの１２〜１８月である。
新規な診断用マーカー及び新しい診断用及び治療用アプローチに使用される標的を特定するために、中皮腫細胞及び臨床性サンプル系中のEphB4及びそのリガンドエフリンB2の発現を評価した。
Ａ．EphB4及びエフリンB2は中皮腫細胞系中で発現した；
悪性中皮腫細胞系中のエフリンB2及びEphB4の発現を、種々の方法によりＲＮＡ及び蛋白質レベルで決定した。ＲＴ-ＰＣＲは全ての４個の細胞系はエフリンB2及びEphB4を発現することを示した（図３３Ａ）。これらの細胞系中の蛋白質発現をウェスタンブロット法により決定した。EphB4の特異的バンドは１２０ｋＤに見られた。更に、エフリンB2を、ウェスタンブロット法で試験された全細胞系中に３７ｋＤバンドとして検出した（図３３Ｂ）。エフリンB2の特異的バンドは、陰性コントロールとして試験された２９３ヒト胎児腎臓細胞中に観察されなかった。
中皮腫細胞中のEphB4転写の存在を確認するために、in situハイブリダイゼーションをチャンバースライド上で培養されたＮＣＩ Ｈ２８細胞系に対して実施した。EphB4に対する特異的シグナルをアンチセンスプローブを使用して検出した。エフリンB2転写物も又同じ細胞系中に検出した。EphB4及びエフリンB2両方用のセンスプローブは陰性コントロールとして働き、細胞とハイブリダイズしなかった（図３４）。EphB4及びエフリンB2蛋白質の発現は、免疫蛍光分析により細胞系中に確認された（図３５）。３個の細胞系は強いEphB4の発現を示し、一方エフリンB2の発現はＨ２８及びＨ２０５２中に存在し、Ｈ２３７３中では弱く検出可能であった。
Ｂ．臨床性サンプル中のEphB4及びエフリンB2の発現の証拠；
胸膜の悪性中皮腫と診断された患者の胸水から培養された腫瘍細胞を単離し、パッセージ１でEphB4及びエフリンB2の両方について陽性染色を示した（図３５、最下列）。これらの結果は、中皮腫細胞系中でのEphB4及びエフリンB2の共発現を確認する。腫瘍細胞系中で見られるこれらの結果が、病状において発現を真に反映するかどうかを決定するために、腫瘍バイオプシーサンプルをEphB4及びエフリンB2のために免疫組織化学染色した。両方の蛋白質に対する抗体は、腫瘍細胞中で陽性染色を示した。代表的データを図３６に示す。
Ｃ．EphB4は中皮腫の細胞増殖及び移動に関係する；
EphB4の細胞増殖中の作用を、EphB4特異的消毒（antisepses）オリゴヌクレオチド及びsiRNAを使用して試験した。培養されたＨ２８のEphB4アンチセンスによる処理は、細胞生存能力を減少した。最も有効なEphB4発現阻害剤は、EphB4 AS-１０（図３７Ａ）であった。EphB4 siRNA４７２のトランスフェクションは、同じ効果を生じた（図３７Ｂ）。
ＭＭは局部的に進行する病気であり、しばしば拡張し胸壁、心臓及び食道等の隣接する重要器官中へ成長する。このin vitroプロセスを研究する試みにおいて、発明者らは以前に記載した技術を使用して創傷治癒アッセイを実施した（３：３６）。創傷がサブ接触性Ｈ２８細胞中へ導入された場合に、次の２８時間の間、細胞は創傷範囲内へ進行的に移動する。しかし、細胞をEphB4 AS-１０で２４時間予備処理してから創傷が導入された場合、この移動は実質的に完全に防止される（図３８Ａ）。ボイデンチャンバー（商標）アッセイによりEphB4 siRNAを使用した移動研究は、EphB4発現の阻害と共に細胞移動が非常に阻害されたことを示した（図３８Ｂ）。
Ｄ．材料及び方法；
本実施例の材料及び方法の詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
実施例５（EphB4は頭部癌及び頚部癌の扁平上皮細胞癌中で発現した：表皮増殖因子シグナル経路によるレギュレーション及び成長効果）
頭部癌及び頚部癌の扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）は、世界で最も頻度の高い第６位の癌であり、毎年９０００００病例が診断されると見積もられる。それはいくつかの発展途上国では全悪性疾患のほとんど５０％である。米国では、５００００人の新患者及び８０００人の死亡が毎年報告されている。タバコ発癌物質は、重要因子としてアルコール消費、年齢、性別及び民族的背景と共にこの病気の主要な病因性要因であると考えられる。
上部気管消化管の正常上皮及びその組織から生じる癌細胞間の相違は、特定の遺伝子中の突然変異及びそれらの発現の変更の結果である。これらの遺伝子は、ＤＮＡ修復、増殖、不死化、アポトーシス、侵潤及び血管形成を調節する。頭部癌及び頚部癌に関して、３個のシグナル経路の変更は充分な頻度で発生し、この病気の決定的な形質変換事由であると考えられる劇的な表現型変化を生じる。これらの変化として、ｐ５３腫瘍サプレッサーの突然変異、表皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の過発現及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６の不活性化が挙げられる。他の変化として、Ｒｂ突然変異、ｒａｓ活性化、サイクリンＤ増幅、及びｍｙｃ過発現等は、ＨＮＳＣＣ中ではより頻度が低い。
高いEphB4の発現は血液性悪性疾患、乳癌、子宮内膜癌及び腸癌中で報告されているが、EphB4蛋白質レベルに対しては限られたデータしかなく、ＨＮＳＣＣ等のこの蛋白質の腫瘍生物学に対する生物学的有意性データは完全に欠落している。
Ａ．ＨＮＳＣＣ腫瘍はEphB4を発現する；
免疫組織化学法（in situハイブリダイゼーション）及びウェスタンブロット法によりヒト腫瘍組織中でEphB4の発現を研究した。２０個の採取された有望な腫瘍組織を、ＩＲＢ認定に従って、EphＢ及びEphＡファミリーの他の構成員と反応しない特異的EphB4モノクローナル抗体と評価した。EphB4発現を染色強度を変化させて全ケースで観察する。図３９Ａ（左上）は代表的ケースを示し、Ｈ＆Ｅ腫瘍構造で明らかなように、EphB4は腫瘍領域中のみで発現したことを示す（図３９Ａ左下）。ストロマ中のEphB4の着色がないことに注目すべきである。第二に、リンパ節中の転移性腫瘍部位は陽性染色法を示し、一方リンパ節の残りの部分は陰性のままである（図３９Ａ、右上）。
In situハイブリダイゼーションを、腫瘍組織中のEphB4転写物の存在及び位置を決定するために実施した。EphB4特異的アンチセンスプローブに対する強いシグナルは、転写物の存在の表示を検出した（図３９Ｂ、左上）。腫瘍構造を示すＨ＆Ｅ染色（図３９Ｂ、左下）との比較は、シグナルが腫瘍細胞に局在化し、間質性領域には存在しないことを示す。エフリンB2転写物も又、EphB4と共に腫瘍サンプル中に検出され、そのシグナルは腫瘍細胞に局在化した（図３９Ｂ、右上）。EphB4又はエフリンB2センスプローブのいずれも、断片に対してハイブリッドせず、シグナルの特異性を示した。
Ｂ．ＨＮＳＣＣの主要な転移性部位での高いEphB4の発現；
主要な腫瘍（リンパ節転移）からの組織及び包含されていない組織のウェスタンブロット法を実施して、これらの部位中のEphB4発現の相対的なレベルを決定した。２０症例の腫瘍及び正常な隣接組織を採取し、陽性腫瘍のリンパ節でこれらの２０症例中の９例を採取した。代表的症例を図３９Ｃに示す。EphB4発現をそれぞれの腫瘍サンプルで観察した。同様に、全腫瘍陽性リンパ節は主要な腫瘍以上のEphB4発現を示した。正常な隣接組織中には発現は無いか最小で観察された。
Ｃ．ＨＮＳＣＣ細胞系中のＥＧＦＲ活性によるEphB4発現及びレギュレーション；
腫瘍細胞に限定されるEphB4の発現を示した後、次にＨＮＳＣＣ中のEphB4発現のin vitroモデルがあるかどうかの決定を試みた。６個のＨＮＳＣＣ細胞系をEphB4蛋白質発現についてウェスタンブロット法により検討した（図４０Ａ）。これらの大部分は強いEphB4発現を示し、その結果次の研究の基礎を確立した。ＥＧＦＲは強くＨＮＳＣＣと関係するために、EphB4発現はＥＧＦＲの活性化と関係するかを検討した。ＥＧＦＲ陽性細胞系であるＳＣＣ-１５でのパイロット実験は、最適時間は２４時間であり濃度１ｍＭの特異的ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８（図４０Ｂ）がEphB4の発現を阻害することを確認した。全細胞系を試験して、全体で活発なＥＧＦＲ発現があるが、ＳＣＣ-４では検出可能であるが強くないことをが示された（図４０Ｃ、上段）。ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８への応答において、EphB4合計量の顕著な損失が所定の細胞系（ＳＣＣ-１５及びＳＣＣ-２５）で観察された一方、他では効果は観察されなかった（ＳＣＣ-９、-１２、-１３及び-７１）。従って、ＳＣＣ-１５及び-２５は、ＥＧＦＲ活性によりレギュレートされるEphB4のモデルとして使用できる一方、ＳＣＣ-９、-１２、-１３及び-７１は、ＥＧＦＲ活性とは関係のないＨＮＳＣＣ中のEphB4のレギュレーションのモデルであり、その場合、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ＩＬ-６等の他の因子からインプットされてもよい、又、試験された全ての細胞系中でEphB4のリガンド、即ちエフリンB2の発現を表した。いくつかの系でEphB4と共に、エフリンB2発現はＥＧＦＲ活性によりレギュレートされる一方、それは他の細胞系とは関係ないことを示した。
明らかに、構成的ＥＧＦＲシグナルの阻害はＳＣＣ１５細胞中のEphB4レベルを抑制した。次にＥＧＦはEphB4を誘起できるかを試験した。その結果、図４１Ｂに示すようにEphB4レベルは、１０ｎｇ／mlＥＧＦでの２４時間処理の前に２４時間血清飢餓状態にされたＳＣＣ１５細胞中で誘起された（列１及び２）。図４１Ａに示されるＥＧＦＲ活性化用に公知の下流シグナル経路（参考としてYarden & Slikowski 2001参照）について、次にＥＧＦ仲介されたEphB4の誘導へのそれらのインプットを検討した。特異的キナーゼ抑制剤Ｕ７３１２２、ＳＨ-５及びＳＰ６００１２５での、ＰＬＣｇ、ＡＫＴ及びＪＮＫリン酸化のブロッキングはそれぞれ基底レベルを減少し、ＥＧＦ刺激されたEphB4の誘導をブロックした（図４１Ｂ、列３〜８）。反対に、ＥＲＫ１／２のＰＤ０９８０９５での阻害及びＰ１３-ＫのＬＹ２９４００２又はウォルトマニンでの阻害は、EphB4レベルのＥＧＦ誘導に対する検出可能な効果を示さなかった。しかし、ＥＲＫ１／２リン酸化が阻害された時に、EphB4基底レベルは減少した。興味深いことには、ＳＢ２０３５８０でのｐ３８ＭＡＰＫ活性の阻害は基底を増加したが、ＥＧＦはEphB4レベルを誘起しなかった。類似の結果がＳＣＣ２５細胞系でも見られた（データは記載しない）。
Ｄ．高発現細胞系中のEphB4の阻害は生存能力を減少させ細胞周期停止を生じる；
次に、siRNA又はＡＳ-ＯＤＮ法を使用して発現除去効果を検討して、ＨＮＳＣＣにおけるEphB4発現作用を研究した。EphB4配列への数個のsiRNAを展開し、それは、図４２Ａで表示したように程度を変化させるEphB4発現をノックダウンした。siRNA５０及び４７２でトランスフェクトされたＳＣＣ-１５、-２５及び-７１細胞系で、生存能力は減少し、それはEphB4発現のブロッキングに最も効果的であった（図４２Ｂ）。EphB4 siRNA１５６２及び２３０２又はエフリンB2siRNA２５４では生存能力への影響はほとんど観察されなかった。EphB4を発現しないＳＣＣ-４中では（参照図４０Ａ）、細胞生存能力の減少は生じなかった。siRNA５０及び４７２処理で見られた細胞生存能力減少はサブＧ０での細胞の蓄積のせいであり、アポトーシスを示す。この効果は、時間及び投薬量両方に依存する（図４２Ｃ及び表１）。反対に、EphB4レベルを減少するのに効果的でなかく、生存能力にわずかな影響しか示さなかったsiRNA２３０２は、ｍｏｃｋリポフェクタミン２０００（商標）トランスフェクションと比べて細胞周期中の変化を全く生じなかった。
本実施例のｓｉＲＮＡコンストラクトの詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
異なるEphB４のｓｉＲＮＡが細胞周期に対して与える影響
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更に、ヒトEphB4コーディング配列へ相補的な５０を超えるホスホロチオアートＡＳ-ＯＤＮを合成し、完全長EphB4発現プラスミドで一時的にトランスフェクトされた２９３細胞中でそれらのEphB4発現阻害能力を試験した。図４３Ａは、これらＡＳ-ＯＤＮのいくつかのEphB4発現に対する効果の代表的例を示す。ＡＳ-１０で発現は完全に阻止され、ＡＳ-１１はわずかな効果のみを示したことは重要である。ＳＣＣ１５細胞中の細胞生存能力への効果は、図４３Ｂに示されるようにEphB4発現の阻害に最も効果的であるＡＳ-ＯＤＮで最も顕著であった。ＡＳ-１０用のＩＣ50は約１μＭであった一方、１０μＭのＡＳ-１１でさえ生存能力の５０％減少を達成するためには充分ではなかった。ＡＳ-１０が細胞周期に対して有する効果を検討すると、サブＧ０フラクションは未処理細胞と比較して１．９％から１０．５％まで増加してアポトーシスを示したことが明らかになった（図４３Ｃ）。
Ｅ．EphB4は細胞移動をレギュレートする；
次にEphB4がＨＮＳＣＣの移動に作用するかを決定しようとした。
移動への寄与は、成長及び転移と関係する。移動は、創傷治癒／スクレープアッセイを使用して評価した。接触性ＳＣＣ１５及びＳＣＣ２５培養物を、無菌性プラスチックパスツールピペットを使用した単回スクレープにより創傷し、境界を明確に定める３ｍｍ帯を残した。試験化合物の存在下での細胞の清澄化領域中への移動を、２４、４８及び７２時間後に評価して定量化した。図４３Ｄに示されるように、細胞移動はEphB4発現をブロックするＡＳ-１０へ応答して顕著に減少した一方、不活性化合物のＡＳ-１及びスクランブルされたＯＤＮは効果が無いかほとんどなかった。ＡＳ-１０による移動の阻害も又ボイデンダブルチャンバー（商標）アッセイを使用して示された（図４３Ｅ）。
Ｆ．EphB4 AS-１０のin vivo抗腫瘍活性；
細胞生存能力及び運動性を減少するEphB4 AS-１０の効果を、Balb/Cヌードマウス中のＳＣＣ１５腫瘍異種移植で決定した。マウスへ毎日２０ｍｇ／ｋｇＡＳ-１０、センスＯＤＮ又は同体積のＰＢＳをＩ．Ｐ．注射する処理を、腫瘍細胞移植の翌日から開始した。ＡＳ-１０を投与されるマウス中の腫瘍の成長は、センスＯＤＮ又はＰＢＳ希釈剤単独のいずれかを投与されるマウスと比較して非常に遅滞した（図４４）。センスＯＤＮ処理した及びＰＢＳ処理したグループ間に相違がないため、ＯＤＮを原因とする非特異的効果は観察されなかった。
Ｇ．材料及び方法；
本実施例の材料及び方法の詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
実施例６（カポジ肉腫中でのエフリンB2発現はヒトヘルペスウィルスタイプ８により誘起される：静脈性から動脈性内皮へのフェノタイプ変換）
カポジ肉腫（ＫＳ）は多病巣性血管増殖性病として、最も通常は皮膚及び粘膜に現れ、次に内蔵器官への拡大する（１）。この病気の典型的特徴は、血管形成、水腫、リンパ単球核細胞の湿潤及び紡錘体腫瘍細胞の成長である。病理学上の、確立された障害は、スリット状空間の高密度の血管網を示す。ＫＳ血管網は、その基底膜の欠損及びこれらの脈管内部を覆う異常な紡錘体内皮細胞（腫瘍細胞）により正常な脈管からは明らかに区別できる。不良な脈管構造は、障害中のアルブミン、赤血球及び単核細胞を含む血液成分の蓄積を生じる（１）。ＫＳ腫瘍は内皮性起源であり；腫瘍細胞は多くの内皮性マーカーを発現し、マーカーとして例えば、「Ulex europeaus」凝集素-１（ＵＥＡ-１）用レクチン結合部位、ＣＤ３４、ＥＮ-４、ＰＡＬ-Ｅ（２）、及び内皮細胞特異的チロシンキナーゼレセプター、ＶＥＧＦＲ-１（Ｆｌｔ-１）、ＶＥＧＦＲ-２（Ｆｌｋ-１／ＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ-３（Ｆｌｔ-４）、Ｔｉｅ-１及びＴｉｅ-２（３、ＲＭ＆ＰＳＧ未公開データ）が挙げられる。ＫＳ細胞はＬＹＶＥ及びポドプラニン等のリンパ性内皮細胞関係蛋白質と共発現する（４）。
ヘルペスウィルスＨＨＶ-８はこの病気の病因性要因であると考えられている。この新しいヘルペスウィルス中の１９９４配列がＫＳ腫瘍組織中で特定され（５）、それに続き分子-疫学研究によりほとんど全ＫＳ腫瘍がウィルス性ゲノムを含有することが示された。血清疫学研究は、ＫＳでＨＩＶ感染した患者は最高のＨＨＶ-８有病率を有すること、及び第二にＨＩＶ感染しているがＫＳに罹患していない患者は、同様にＨＨＶ-８血清陽性である場合、それ以降の数年にわたりＫＳ発生のリスクが増加することを示した（６）。ＨＨＶ-８のＫＳへの作用の直接的証拠は、ＨＨＶ-８感染後の骨髄内皮細胞の形質転換（改質）である（７）。多くのＨＨＶ-８エンコードする遺伝子は、細胞性形質転換（改質）をもたらす（８参照）。しかし、最大の証拠は、この役割におけるＧプロテイン結合レセプター（ｖＧＰＣＲ）について蓄積された（９）。
ＫＳ腫瘍細胞は動脈性又は静脈性内皮由来かを検討した。更に、ＨＨＶ-８はＫＳモデル中で動脈性又は静脈性マーカーの発現に対して効果を有するかを検討した。ＫＳ腫瘍細胞は、エフリンB2動脈性マーカーを発現することが発見された。更に、エフリンB2発現は、ＫＳ及び内皮細胞系中のＨＨＶ-８ｖＧＰＣＲにより誘起された。エフリンB2は、エフリンB2発現又はシグナルの阻害は、ＫＳ細胞の生存能力及び機能に有害であるため、ＫＳ処理用の可能なターゲットである。
Ａ．ＫＳ腫瘍は、EphB4ではなくエフリンB2を発現する；
ＫＳ障害の非常な血管関連性及び腫瘍細胞の可能性のある内皮細胞起源は、それぞれ静脈性及び動脈性内皮細胞のマーカーである、EphB4及びエフリンB2の発現の検討に寄与した。EphB4転写物ではなくエフリンB2は、ＫＳバイオプシーの腫瘍細胞中にin situハイブリダイゼーションにより検出された（図４５Ａ）。エフリンB2アンチセンスプローブ及びＨ＆Ｅ染色で示される腫瘍細胞との陽性シグナルの比較は、エフリンB2発現は腫瘍細胞を含有するバイオプシーの面積に限られていることを示す。EphB4アンチセンスプローブでのＫＳ中のシグナルの欠如は、プローブの欠陥のせいではなく、この蛋白質を発現することが示されてた扁平上皮細胞癌中の転写物を検出したせいである（１８）。ＫＳ腫瘍組織中のエフリンB2の発現の追加的証拠は、ＦＩＴＣ複合抗ヒトFc抗体により検出された、EphB4／Fcシグナルの腫瘍細胞への局在化により与えられる。エフリンB2はEphB4用のたった一つのリガンドであるために、この試薬はエフリンB2の発現に特異的である（図４５Ｂ、左）。第二試薬のみで処理した隣接する断片は、特異的シグナルを示さない。二色共焦点顕微鏡は、エフリンB2陽性細胞中にＨＨＶ-８潜伏蛋白質ＬＡＮＡ１の存在を表し（図４５Ｃ、左）、それは腫瘍細胞であり、腫瘍脈管ではなくこの動脈性マーカーを発現していることを示した。腫瘍バイオプシーのＰＥＣＡＭ-１抗体での染色は、この腫瘍の高度な血管的性質を明らかにした（図４５Ｃ、右）。ＫＳバイオプシーに対するエフリンB2及びEphB4発現パターンの有病率のパイロット研究はＲＴ-ＰＣＲ分析により行った。６例のサンプル全部がエフリンB2に陽性であった一方、ただ２例がEphB4に弱陽性であった（データは記載しない）。
Ｂ．静脈性内皮細胞のＨＨＶ-８での感染は動脈性マーカーへのフェノタイプ変換を生じる；
次にＫＳの病因性要因と思われるＨＨＶ-８は、それ自身で内皮細胞中でのエフリンB2の発現を誘起しEphB4発現を抑制できるかを検討した。ＨＵＶＥＣ及びＨＨＶ-８と有効感染させたＢＣ-１リンパ腫細胞の共培養は、内皮細胞の効果的感染を生じた（１６）。充分な洗浄後に残っている内皮細胞の付着単層を、エフリンB2及びEphB4についてＲＴ-ＰＣＲ及び免疫蛍光により試験した。ＨＵＶＥＣは、EphB4静脈性マーカーをＲＮＡレベルで強く発現したが、エフリンB2は発現しなかった（図４６Ｂ）。反対に、ＨＨＶ-８感染させた培養物（ＨＵＶＥＣ／ＢＣ-１及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ-３）はエフリンB2を発現する一方、EphB4転写物はほとんど見られなかった。
ＨＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ／ＨＨＶ-８の培養物の、動脈／静脈マーカー及びウィルス性蛋白質についての免疫蛍光分析を、ＲＮＡ中に見られるものを反映する蛋白質発現中に変化があるかを決定するために行った。更に、蛋白質の細胞性局在化も決定できた。ＲＴ-ＰＣＲデータに適合するように、ＨＵＶＥＣはエフリンB2陰性及びEphB4陽性であった（図４６Ａ（ａ＆ｍ））。予測されるように、それらは核抗原（ＬＡＮＡ１）と関連するＨＨＶ-８潜伏を全く発現しなかった（図４６Ａ（ｂ、ｎ））。ＨＨＶ-８で有効に感染させたＢＣ-１細胞の共培養は、ウィルス性蛋白質ＬＡＮＡ１及びＯＲＦ５９の存在で示されるようにＨＵＶＥＣの感染を生じた（図４６Ａ（ｆ、ｒ））。ＨＨＶ-８感染させたＨＵＶＥＣは、今やエフリンB2を発現するがEphB4を発現しない（図４６Ａそれぞれ（ｅ、ｑ、ｕ））。エフリンB2及びＬＡＮＡ１共クラスターの発現は、併合画像中に黄色シグナルで示される（図４６Ａ（ｈ））。エフリンB2陽性でEphB4陰性のＨＨＶ-８感染させたＨＵＶＥＣは、同様に動脈性マーカーＣＤ１４８を発現する（１９）（図４６Ａ（ｊ、ｖ））。エフリンB2及びＣＤ１４８共クラスターの発現は、併合画像中に黄色シグナルで示される（図４６Ａ（ｌ））。未感染の、EphB4発現ＨＵＶＥＣはＣＤ１４８に陰性であった（記載せず）。
Ｃ．ＨＨＶ-８ｖＧＰＣＲはエフリンB2発現を誘起する；
個々のウィルス性蛋白質は全体のウィルスで観察されるエフリンB2の発現を誘起できるかを試験するために、ＫＳ-ＳＬＫ細胞をＨＨＶ-８ＬＡＮＡ、又はＬＡＮＡ△４４０又はｖＧＰＣＲで確実にトランスフェクトした。安定なクローンのウェスタンブロット法で、ｖＧＰＣＲでトランスフェクトされたＫＳ-ＳＬＫ中では、ＳＬＫ-ＬＡＮＡ又はＳＬＫ-ＬＡＮＡ△４４０と比較してエフリンB2が５倍誘導されることが明らかになった（図４７Ａ）。ベクター単独（ｐＣＥＦＬ）でトランスフェクトされたＳＬＫを、コントロールとして使用した。ＳＬＫ-ｖＧＰＣＲ及びＳＬＫ-ｐＣＥＦＬ細胞も又、一時的にトランスフェクトされたＫＳ-ＳＬＫ細胞中で、エフリンB2及びEphB4発現を免疫蛍光により試験した。図４７Ｂは、ＳＬＫ-ｐＣＥＦＬと比較してＳＬＫ-ｖＧＰＣＲ細胞中でより高いエフリンB2発現を示す。ＳＬＫ-ｐＣＥＦＬと比較してＳＬＫ-ｖＧＰＣＲ中ではEphB4について変化は観察されなかった。これは明らかにＳＬＫ-ｖＧＰＣＲ細胞はＳＬＫ-ｐＣＥＦＬ細胞と比較して高レベルのエフリンB2を発現したことを示す。これは、ＨＨＶ-８のｖＧＰＣＲは、ＫＳ中でエフリンB2の誘導及び動脈性フェノタイプ変換に直接含まれることを示唆する。ＨＨＶ-８はＨＵＶＥＣ中のエフリンB2の発現を誘起することは上記に示されているので、次にこれは、転写的効果により仲介されるかどうかを試験した。エフリンB2５’-フランキングＤＮＡ-ルシフェラーゼレポータープラスミドは、下記「材料及び方法」欄に示されるように構成され、ＨＵＶＥＣ中に一時的にトランスフェクトされた。エフリンB2５’-フランキングＤＮＡ配列-２４９１／-１１は、ＨＵＶＥＣ細胞中で最小活性を有する（図４７Ｃ）。これは、エフリンB2は動脈性であり静脈性マーカーではないことに適合する。しかし、培養物中のＨＵＶＥＣはいくつかのエフリンB2をＲＮＡレベルで発現することが示された。ＨＨＶ-８ｖＧＰＣＲの共トランスフェクションは、コントロール発現ベクターｐＣＥＦＬと比較してエフリンB2転写を約１０倍誘起する。だいたい同等な誘導がエフリンB2配列-２４９１／-１１、-１２４２／-１１、又は-５７７／-１１で観察され、それは、最大活性は-１２４２／-１１ルシフェラーゼ構築物で観察されるにもかかわらず、-５７７及び-１１間の要素がｖＧＰＣＲへの応答を媒介するのに充分であることを表す。
Ｄ．エフリンB2の発現はＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ-Ｃによりレギュレートされる；
次に公知のＫＳ増殖因子はエフリンB2発現のｖＧＰＣＲ-仲介された誘導中に含まれるかを検討した。ＳＬＫ-ｖＧＰＣＲ細胞をオンコスタチン-Ｍ、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ-Ｃの中和抗体で３６時間処理した。図４８Ａは、ＶＥＧＦの中和は、ＳＬＫ-ｖＧＰＣＲ細胞中でエフリンB2の発現を完全にブロックしたことを示す。より少ないが、非常なエフリンB2の減少も、ＶＥＧＦ-Ｃ及びＩＬ-８の中和で観察された。オンコスタチン-Ｍ又はＩＬ-６の中和で測定可能な効果は観察されなかった。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ-ＣはエフリンB2発現の誘導に必須であることを確認するために、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｃ又はＥＧＦで処理した。ＨＵＶＥＣは、２種の異なる濃度の個々の増殖因子（１０ｎｇ、１００ｎｇ／ml）を有する５％ＦＢＳを含有するＥＢＭ-２培地中で４８時間増殖した。ＶＥＧＦ-Ａ又はＶＥＧＦ-Ｃのみが投薬量依存性挙動でエフリンB2発現を誘起した（図４８Ｂ）。反対に、ＥＧＦはエフリンB2の発現に効果がなかった。
Ｅ．エフリンB2siRNAはＫＳ中のエフリンB2発現を抑制する；
３個のエフリンB2siRNAを「方法」段落記載のように合成した。ＫＳ-ＳＬＫ細胞をsiRNAでトランスフェクトして４８時間後、エフリンB2発現をウェスタンブロット法により決定した。エフリンB2siRNA１３７又は２５４は、siRNA EphB4 ５０又はsiRNAＧＦＰ等のコントロールsiRNAと比較して、エフリンB2発現を約７０％阻害した。エフリンB2 ６３siRNAは、上記２種のsiRNAエフリンB2よりも効果が低かった（図４９Ａ）。
Ｆ．エフリンB2は完全ＫＳ及びＥＣ生存能力、コード形成及びin vivo血管形成活性に必要である；
最も効果的エフリンB2siRNA（２５４）を、次にエフリンB2の発現阻害がＫＳ-ＳＬＫ又はＨＵＶＥＣ細胞の成長に効果を及ぼすかを決定するために使用した。ＫＳ-ＳＬＫ細胞の生存能力は、エフリンB2蛋白質レベルを阻害するのと同じsiRNAにより減少した（図４９Ｂ）。ＫＳ-ＳＬＫは高レベルのエフリンB2を発現し、その結果、エフリンB2発現の維持はこの設定では細胞生存能力に必須であることが示された。図４８Ｂに示されるように、ＨＵＶＥＣはＶＥＧＦにより刺激された場合以外はエフリンB2を発現しない。エフリンB2 siRNA２６４は、単独の増殖因子としてＶＥＧＦと共に培養されたＨＵＶＥＣの成長を劇的に減少した。反対に、ＨＵＶＥＣをＩＧＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦと共に培養した場合は、顕著な効果を示さなかった。コントロールとしてEphB4 siRNA５０は、どちらの培養条件下でもＨＵＶＥＣへ有害な効果を示さなかった（図４９Ｃ）。ＫＳ及び主要な内皮細胞の生存能力の阻害に加えて、EphB4-ＥＣＤはＨＵＶＥＣ及びＫＳ-ＳＬＫ中のコード形成及びマトリゲルプラグ（商標）アッセイ中のin vivo血管形成を抑制する（図５０）。
Ｇ．材料及び方法；
本実施例の材料及び方法の詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
実施例７（膀胱癌中のEphB4の発現：本発明の治療法の候補ターゲット）
図５１は膀胱癌細胞系中でのEphB4の発現（Ａ）及びＥＧＦＲシグナル経路によるEphB4発現のレギュレーション（Ｂ）を示す。
図５２は、ｐ５３のトランスフェクションは５６３７細胞中のEphB4の発現を阻害することを示す。
図５３はEphB4 siRNA４７２での処理による膀胱癌細胞系（５６３７）の増殖阻害を示す。
図５４はEphB4 siRNA４７２でトランスフェクトされた５６３７細胞のアポトーシス研究の結果を示す。
図５５はEphB4アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示す。５６３７細胞は、EphB4 AS-１０（１０μＭ）で処理された。
図５６は、EphB4 siRNAの細胞侵潤に対する効果を示す。５６３７細胞はsiRNA４７２又はコントロールsiRNAでトランスフェクトされた。
実施例８（EphB4アンチセンスプローブ及びＲＮＡｉプローブによるEphB4遺伝子発現の阻害）
EphB4を発現する細胞系を合成ホスホロチオアート改質オリゴヌクレオチドで処理し、２４時間後に採取した。細胞溶解産物を調製し、ウェスタンブロット法分析により、EphB4の相対的量を未処理のコントロール細胞と比較してプローブした。
細胞増殖の阻害に関する研究は、発現EphB4発現を特徴とするＨＮＳＣＣ細胞系中で行った。細胞生存能力の損失は、EphB4発現のノックダウンにより示された。細胞はin vitro処理され、４８-ウェルプレート中で培養され、１００００細胞／ウェルで接種された。試験化合物を添加し、細胞生存能力を３日目に試験した。EphB4アンチセンスプローブに対する結果を下記表６にまとめた。EphB4ＲＮＡｉプローブに対する結果を下記表７にまとめた。
本実施例のアンチセンス及びｓｉＲＮＡコンストラクトの詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
実施例９（エフリンB2アンチセンスプローブ及びＲＮＡｉプローブによるエフリンB2の遺伝子発現阻害）
ＫＳ ＳＬＫ；内因性高レベルのエフリンB2を発現する細胞系。細胞生存能力を、一定の投薬量のそれぞれのオリゴヌクレオチド（５μＭ）を使用して試験した。遺伝子発現ダウンレギュレーションを、完全長エフリンB2を安定して発現するように設計された細胞系２９３を使用して行った。エフリンB2を発現するＫＳ ＳＬＫも又一定の投薬量５０ｎＭで試験されたＲＮＡｉプローブへの応答である生存能力を試験するために使用した。蛋白質発現レベルを完全長エフリンB2を安定して発現する２９３細胞を使用して、一定の（fixed）５０ｎＭのＲＮＡｉプローブで２４時間処理後の細胞溶解産物中で測定した。
エフリンB2アンチセンスプローブについての結果は、下記表８にまとめた。エフリンB2ＲＮＡｉプローブについての結果は、下記表９にまとめた。
本実施例のアンチセンス及びｓｉＲＮＡコンストラクトの詳細な説明は米国特許出願公開第２００５００８４８７３号明細書に見出すことができる。
実施例１０（EphB4抗体は腫瘍増殖を阻害する。）
図５７は、Ｇ２５０及びプルダウンアッセイによるEphB4モノクローナル抗体の比較結果を示す。
図５８は、EphB4抗体はマトリゲル及び増殖因子の存在下でＳＣＣ１５細胞のin vivo腫瘍増殖を阻害することを示す。
ＢａＩｂＣヌードマウスへ２．５×１０6の生存腫瘍細胞ＳＣＣ１５を皮下注射した。ＳＣＣ１５は、頭部及び頚部扁平上皮細胞癌系である。腫瘍は、nu/nuマウス中に、マトリゲル及び増殖因子並びにＡｂ’と予備混合した２．５〜５×１０6細胞を皮下注射して開始され、腫瘍異種移植が開始された。マウスを注射１４日後に解剖した。ＳＣＣ１５は頭部及び頚部扁平上皮細胞癌系であり、Ｂ１６は黒色腫細胞系であり、ＭＣＦ-７は乳癌系である。これらの処理に対する腫瘍の応答を、ＰＢＳ注射を受けたコントロール処理マウスと比較した。動物の腫瘍増殖を毎日観察し、皮下腫瘍をカリパスを使用して毎２日に測定した。抗体番号１及び２３は、コントロールと比較して、特に追加的増殖因子添加なしのコントロールではＳＣＣ１５腫瘍サイズの顕著な退縮を示した。
図５９は、EphB4抗体は、ＳＣＣ１５頭部癌及び頚部癌腫瘍種の、アポトーシス、壊死及び血管形成減少を引き起こすことを示す。
血管形成をＣＤ-３１免疫組織化学法により評価した。処理及び未処理のマウスからの腫瘍組織断片をＣＤ３１用に染色した。アポトーシスを免疫組織化学TUNNEL法により評価し、BrdUアッセイにより増殖した。外科的除去に続き、腫瘍を標準手順に従い直ちに２ｍｍ連続断片へスライスし、パラフィン中に包埋した。パラフィン包埋した組織を５μｍへ断片化し、ワックスを除去し、組織を再水和した。再水和した組織に、抗原賦活（retreival）液中でマイクロ波を照射した。スライドをＰＢＳで洗浄し、TUNNEL法反応混合物（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びフルオレセイン標識化ヌクレオチド溶液）及びBrdUを完全に光を遮断した湿性チャンバー中に加えた。次にTUNNEL及びBrdU反応混合物を除去し、スライドを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合している抗フルオレセイン抗体を添加した。インキュベーション及び洗浄後、３，３’ジアミノベンジジンを添加した。マッソン社製トリクローム（商標）及びヘマトキシリン及びエオシンも又スライドを染色して形態を画像化するために使用した。マッソン社製トリクローム（商標）は、壊死及び線維症の画像化を可能とした。腫瘍は腫瘍／皮膚、筋肉境界から血液サポートを得た。腫瘍が成長するに従い、内側領域は栄養が欠乏した。これは壊死（細胞死）を、好ましくは腫瘍中央で導く。細胞死後、（腫瘍）組織は、繊維芽細胞組織で置換される。スライドを、得られたデジタル画像を２０倍拡大して画像化した。ＳＣＣ腫瘍の、投与された抗体それぞれで異なる形態が得られた。Ａｂ番号１は、アポトーシスではなく壊死及び線維症の増加部分を示した。Ａｂ番号２３は、アポトーシス、壊死及び線維症の増加及び脈管湿潤物の減少を示した。Ａｂ番号３５は、壊死及び線維症の増加、並びにアポトーシスのわずかな増加並びに脈管湿潤物の減少を示した。Ａｂ番号７９はアポトーシス、ネクローシス及び線維症の大きな増加を示した。Ａｂ番号９１は、アポトーシスに変化は無く、増殖の増加を示した。Ａｂ番号１３８は、アポトーシス、壊死、線維症の増加並びに増殖及び脈管湿潤物の減少を示した。コントロールＰＢＳで処理した腫瘍は、高い腫瘍密度及び活発な血管形成応答を示した。EphB4抗体で処理した腫瘍は、生存腫瘍細胞の領域中の腫瘍細胞密度の減少及び腫瘍血管形成の顕著な阻害、並びに腫瘍壊死及びアポトーシスを示した。
図６０は、異種移植における抗体の全身的投与は、異種移植でのＳＣＣ１５腫瘍の腫瘍退縮を導くことを示す。
又、EphB4モノクローナル抗体又はコントロールとして同体積のＰＢＳでの隔日治療は、第４日、腫瘍が確立された後に開始して１４日間連続した。ＩＰ又はＳＣのいずれかの全身的投与を投与したが顕著な違いは無かった。全実験を実験者の先入観を除くためにダブル-ブラインド手順で実施した。マウスを２週間の治療期間終結時に犠牲にした。腫瘍を死後直ちに採取し、固定化し、免疫組織化学的に処理した。EphB4抗体４０ｍｇ／ｋｇ体重を投与した。EphB4抗体での処理は、コントロール処理マウスと比べてヒトＳＣＣ腫瘍の増殖を非常に阻害した（ｐ＜０．０５）。EphB4抗体での処理は、コントロール処理マウスと比べて腫瘍重量を非常に阻害した（ｐ＜０．０５）。
実施例１１（HSA-EphB4細胞外領域融合及びPEG修飾EphB4細胞外領域）
Ａ．ＨＳＡ−EphB４細胞外領域融合の発生
XbaI-NotI形のヒト血清アルブミン断片をGCF2との融合体を作りだすためにPCR増幅し、TAクローニングしてpEF6に導入した。次いで、得られたベクターをXbaIで切断（部分消化）し、HSA断片（1.8kb）をクローニングしてpEF6-GCF2-XbaのXbaIサイトに導入し、融合体発現ベクターを作り出した。得られたベクターは、成熟蛋白質の４位がCからTへの（ThrからIleへの変異を導く）点突然変異を有していた。これをpEF6-GCF2-HSAmutと呼んだ。次のクローニング工程において、該突然変異は該突然変異部分をpEF6-GCF2-IF（ベクター片及びGCF2のN末端部分を含有）からの野生型KpnI断片に置換することによって除去した。この最終的なベクターをpEF6-GCF2と呼んだ。pEF6-GCF2のDNA配列を確認した。
HSA-EphB4前駆体蛋白質の予測されるアミノ酸は（SEQ ID NO:18）：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHS VRTYEVCDVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCK ETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKT LRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPV AGSCWDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQG TFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSW SRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLV EPWVWRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVT RSSPSSLSLAWAVPRAPSGAVLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKR GASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQSRDAHKSEVAHRFKDL GEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF GDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKODNPNLPRLVRPEVDVMC TAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLV TDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAE VENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLL LRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYK FQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWL NQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCF A EEGKKLVAASQAALGLである。
成熟型HSA-EphB4蛋白質の予測されるアミノ酸は（SEQ ID NO:19）：
LEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCDVQRAPGQ AHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTAT ALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQ DQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPREL WPVAGSCWDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCP ANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSWSRLNGSSLHLEWSA PLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWWVRGLRPDFT YTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPR APSGAVLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEA GYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQSRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQ YLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETY GEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKY LYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSA KQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGD LLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLA ADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSD RVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTA LVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
である。
pEF6-GCF2プラスミドの核酸配列は（SEQ ID NO:20）：
aatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcg cacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgateccctatggtcgactctcagtacaatctgctctg atgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaag gcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgt tgacattgattattgactaggcttttgcaaaaagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggacct tctaggtcttgaaaggagtgcctcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttg gggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgc ctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacac aggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcag tacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgctt gagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctc 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である。
Ｂ．細胞培養及びトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞系（２９３Ｔ細胞）を１０％の透析ウシ胎仔血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗体と共にＤＭＥＭ中に保持した。細胞を５％ＣＯ2／９５％空気の加湿した大気中にて３７℃で保持した。
EphB4細胞外領域、その断片及びEphB4-HSA融合体をコード化するプラスミドのトランスフェクションを、与えられたプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００試薬（インビトロゲン社）を用いて実施した。トランスフェクションの前日に、トランスフェクション時に８０％のコンフルエンスに達するように２９３T細胞を高密度で接種した。プラスミドＤＮＡ及びリポフェクタミン試薬を１：３の比率としてOpti-MEM Iの血清低減培地（インビトロゲン社）中で５分間希釈して混合し、DNA-リポフェクタミン複合体を形成した。各１０ｃｍ培養皿に対して、１０μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。２０分後、上記複合体を培地中の細胞に直接添加した。トランスフェクションから１６時間後に、培地を吸引し、無血清ＤＭＥＭで一度洗浄し、そして無血清ＤＭＥＭに取り替えた。分泌された蛋白質を４８時間後に条件培地を回収することにより採取した。条件培地は１０，０００ｇで２０分間遠心分離することにより浄化し、０．２μｍのフィルターで濾過し、精製に使用した。
Ｃ．EphB4細胞外領域及びEphB4細胞外領域−ＨＳＡ融合体のクロマトグラフィ分離
ＨＳＡに融合したEphB4細胞外領域は以下のように精製した。無血清培地中で増殖した一時的にトランスフェクトされた２９３細胞から７００ｍＬの培地を採取し、最終的な体積である１２０ｍＬに濃縮した［膜：（オメガ、７６ｍｍ）、５０ｋＤａ Ｃ／Ｏ］。濃縮後、サンプルのｐＨを６ｍＬの１Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）を加えることにより調節した。次いで、サンプルを開始用緩衝剤（ＳＢ）：20 mM NaAc, 20 mM NaCl, pH 5.5（O/N）で透析した。５ｍＬのＳＰ−セファロースをＳＢで平衡させてサンプルを搭載した。洗浄：１００ｍＬのＳＢ。ＮａＣｌ溶出：１２ｍＬ／画分及び２０ｍＭの増加。エフリンＢ２結合活性の大部分は１００ｍＭ及び１２０ｍＭ画分中に溶出した。
エフリンＢ２結合活性アッセイで活性な画分（ＳＰクロマトグラフィ、画分１００−１２０ｍＭ参照）を第二ステップであるＱカラム上での精製に使用した。取り出した画分を開始用緩衝剤＃２（ＳＢ２）：20 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, pH 8（O/N）で透析し、２ｍＬのＱセファロース上に搭載した。２０ｍＬのＳＢ２で洗浄した後、吸収された蛋白質をＮａＣｌで溶出した（３ｍＬ／画分、２５ｍＭの濃度増加）。得られた画分をＰＡＧＥ及びエフリンＢ２結合アッセイで分析した。２００ｍＭ及び２２５ｍＭの画分が最も多くの蛋白質及び最も高いＢ２結合活性を有していた。
可溶性EphB4細胞外領域蛋白質を以下のように精製した。３００ｍＬの条件培地（「細胞培養及びトランスフェクション」参照）を、３０ｋＤａ Ｃ／Ｏの限外濾過膜を用いて、最終体積である１００ｍＬに濃縮した。濃縮後、サンプルのｐＨを５ｍＬの１Ｍ 酢酸Ｎａ（ｐＨ５．５）を加えることにより調節した。次いで、サンプルを開始用緩衝剤（ＳｔＢ）：20 mM 酢酸Na, 20 mM NaCl, pH 5.5（O/N）で透析した。５ｍＬのＳＰ−セファロースをＳＢで平衡させてサンプルを搭載した。２０ｍＬのＳｔＢでカラムを洗浄した後、吸収された蛋白質を線形濃度勾配のＮａＣｌで溶出した（２０〜２５０ｍＭ、全溶出体積は２０カラムの体積）。蛋白質の純度をＰＡＧＥにより分析した。
Ｄ．ｓＢ４及びｓＢ４−ＨＳＡ融合蛋白質のビオチン化
溶解性EphB4細胞外領域蛋白質（ｓＢ４）及びＨＳＡに融合したEphB4細胞外領域（ＨＳＡ−ｓＢ４）の両方を、メーカーのプロトコルに従い、酸化剤としてのメタ−過ヨウ素酸ナトリウム及びEZ-Link Biotin Hydrazide (PIERCE社, Cat. # 21339)を用いてビオチン標識化した。ビオチン化ｓB4蛋白質のIn vitro安定性を、４０μLのマウス血清を用いて２．０×１０-9を３７℃で０、０．５、１，２及び３日間インキュベートすることにより試験した。２μLの磁性ビーズ及びB2-APを加えて更に１時間室温置いた。緩衝剤で２度洗浄した後、ｐｎＰＰを加えて１時間置いた。ビオチン化したｓＢ４蛋白質は３日間にわたり非常に安定であり、この期間内でＢ２結合活性は１０％未満しか失われなかった。
Ｅ．Ｂ４−ＨＳＡのエフリンＢ２結合特性
Ｂ４−ＨＳＡ融合体蛋白質がエフリンＢ２へ結合するためのEphB4細胞外領域の能力を保持しているかどうかを試験するため、精製したＢ４−ＨＳＡ融合体の能力をGCF2F, GCF2, GC, CF及びB4-Fc融合体（実施例１に記載のようにhIgGIに融合したB4の細胞外領域を含有）のそれと比較した。ビオチン化又はHisタグ化した蛋白質のサンプルを対応するアフィニティ磁性ビーズ及びB2-APに１時間室温で接種した後、PnPPを加えた。結合アッセイの結果を図６７に示す。B４−HSAはエフリンＢ２に対する結合活性の大部分を保持することが分かった。驚くべきことに、Ｂ４−ＨＳＡ蛋白質はエフリンＢ２に対する結合性がＢ４−Ｆｃ融合体よりも優れていた。
ＨＳＡのＣ末端へのEphB4細胞外領域の融合も生じ、これはエフリンＢ２へ結合する能力を保持すること、及びEphB4細胞外領域にわたって生体内での安定性が向上することが分かった。
Ｆ．マウス中でのＢ４−ＨＳＡ及びｓＢ４の安定性
精製したビオチン化ｓＢ４及びｓＢ４−ＨＳＡの生体内での安定性をアッセイした。各蛋白質をマウス当たり０．５ｎモルの量でマウスの尾に静脈内注射した。１５分（０日）、１、２，３及び６日の時間枠で各マウスの眼から血液を採取した。得られた血清の１０ｍＬを使用して、エフリンＢ２−アルカリホスファターゼ融合蛋白質及び固相としてのストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いた結合アッセイを行った。これら２種の蛋白質の安定性を図６８に示す。ｓＢ４−ＨＳＡはｓＢ４よりも優れた安定性を示すことが分かった。例えば、注射から１日後では、マウス血液中のｓＢ４−ＨＳＡのレベルはｓＢ４の５倍であった。
Ｇ．ビオチン化したｓＢ４のＰＥＧ化
ＰＥＧ化する前に、上述したビオチン化ｓＢ４蛋白質を３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外膜を用いて最終濃度２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。サンプルをカップリング緩衝剤：３０ｍＭリン酸塩、７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．００でＯ／Ｎ透析した。特に断りのない限り、ＰＥＧへの結合は反応性の直鎖状ＰＥＧを１０倍モル過剰として４℃で１８時間行った。使用した反応性ＰＥＧはＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート（分子量：約２０ｋＤａ）であった。分枝鎖状ＰＥＧ（例えば１０ｋＤａ、２０ｋＤａ又は４０ｋＤａ）を用いてＰＥＧへの結合を同様に行ってもよい。１０又は４０ｋＤａの他の直鎖状ＰＥＧ分子を使用してもよい。
ＰＥＧ化後、EphB4細胞外領域を含有する蛋白質のサンプルをＳｔＢでＯ／Ｎ透析した。３ｍＬのＳＰ−セファロースをＳｔＢで平衡化し、サンプルを搭載した。一点の変更：全容出量は４０カラム体積であることを除いて、吸収した蛋白質の洗浄及び溶出を上記（「可溶性EphB4細胞外領域及びそのＨＳＡへの融合体の精製」参照）と同様に実施した。図６９はＳＰ−セファロースカラム上におけるEphB4蛋白質のＰＥＧ誘導体のクロマトグラフィ分離を示す。ＰＥＧ修飾EphB4蛋白質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
二重修飾（ＰＥＧ化及びビオチン化）したｓＢ４をイオン交換クロマトグラフィにかけて非ＰＥＧ化、モノＰＥＧ化及びポリＰＥＧ化蛋白質をそれぞれ分離した。ＰＥＧ化したサンプルを２０ｍＭの酢酸Ｎａ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５でＯ／Ｎ透析して２ｍＬのＳＰ−セファロース上に搭載した。１０ｍＬの緩衝剤で洗浄した後、吸収された蛋白質をＮａＣｌで徐々に溶出する（３ｍＬ／画分、２５ｍＭのＮａＣｌの増加）ことによって分離した。得られた画分をＰＡＧＥ及びエフリンＢ２結合アッセイで分析した。
Ｈ．ＰＥＧ化条件がｓＢ４のエフリンＢ２結合性に与える影響
異なるｐＨ条件下でビオチン化ｓＢ４をＰＥＧ化する影響を測定した。ｓＢ４をｐＨ６，７又は８でＰＥＧ化し、ＰＥＧ化した産物に対してエフリンＢ２への結合性を試験した（図６９）。エフリンＢ２結合活性はＰＥＧ化をｐＨ６及びｐＨ７で行ったときは保持されたが、ｐＨ８で行ったときは部分的に失われた。
温度、ｐＨ、ｓＢ４に対するＰＥＧ化剤のモル比、及びＰＥＧ化反応の産物のエフリンＢ２への結合能力を含めたパラメータの追加的な組み合わせを試験した。最適化実験の結果を図７０に示す。これらの結果から塩基性ｐＨではＢ２結合活性が徐々に低下することが確認される。
Ｉ．ＰＥＧ化ｓＢ４種の精製
ビオチン化ｓB4蛋白質を３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外膜を用いて最終濃度２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。サンプルをカップリング緩衝剤：３０ｍＭのリン酸塩、７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．００でＯ／Ｎ透析した。ＰＥＧへの結合は反応性ＰＥＧを１０倍モル過剰として４℃で１８時間行った。二重修飾（ＰＥＧ化及びビオチン化）したｓＢ４をイオン交換クロマトグラフィにかけて非ＰＥＧ化、モノＰＥＧ化及びポリＰＥＧ化蛋白質をそれぞれ分離した。サンプルを２０ｍＭの酢酸Ｎａ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５でＯ／Ｎ透析して２ｍＬのＳＰ−セファロース上に搭載した。１０ｍＬの緩衝剤で洗浄した後、吸収された蛋白質をＮａＣｌで徐々に溶出する（３ｍＬ／画分、２５ｍＭのＮａＣｌの増加）ことによって分離した。図７１に示すように、得られた画分をＰＡＧＥで分析した。画分１，２及び３がポリPEG化、モノPEG化及び未PEG化のビオチン化ｓB4に対応することが分かった。
Ｊ．PEG化したEphB4誘導体のIn vitro特性
ＳＰカラム精製からのビオチン化及びＰＥＧ化したｓＢ４の画分１，２及び３（ポリPEG化、モノPEG化及び未PEG化のビオチン化ｓB4に対応）のエフリンB2への結合能力を標準的なアッセイを用いて試験した。本実験の結果を図７２に示す。結合活性の順は未ＰＥＧ＞モノＰＥＧ＞ポリＰＥＧであることが分かった。
画分のin vitroでの安定性も試験した。マウス血清中にて３７℃で３日間インキュベートした後のエフリンB2への結合活性の保持について画分を試験した。本実験の結果を図７３に示す。In vitro安定性の順はモノＰＥＧ＞未ＰＥＧ＞ポリＰＥＧであることが分かった。
Ｋ．マウス中におけるEphB4細胞外領域のＰＥＧ化誘導体の生体内安定性分析
ＳＰカラム精製からのビオチン化及びＰＥＧ化したｓＢ４の画分１，２及び３（ポリPEG化、モノPEG化及び未PEG化のビオチン化ｓB4に対応）を静脈内注射によってマウス内に０．５ｎモル／マウスの量で導入した。１０分、１、２及び３日の時間枠で各マウスから血液を採取した。得られた血清の１０ｍＬを使用して、エフリンＢ２−アルカリホスファターゼ融合蛋白質及び固相としてのストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いた結合アッセイを行った。１０分のときに得られたシグナルを１００％とした。各蛋白質に対する２匹のマウスは異なる血統とした。結果を図７４に示す。ＰＥＧ化は未ＰＥＧ化のEphB4よりも生体内でのEphB4の安定性を増加させることが分かった。
援用
ここで挙げた全ての刊行物及び特許は、それぞれの刊行物又は特許がまるで個別具体的に援用されることが指示されているかのように、それらの全部を本明細書に援用する。
本発明の具体例について議論してきたが、上記説明は例示のためであり本発明を限定するためではない。特許請求の範囲及び明細書の記載を基にして、本発明の多くの変形が当業者には理解できるだろう。本発明の範囲は特許請求の範囲（全ての均等物を含む）及び明細書（上記変形も含む）を参照することにより決定されるべきである。
Ｂ４ＥＣｖ３蛋白質のアミノ酸配列を示す（非切断EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す；SEQ ID NO:1）。 Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す；SEQ ID NO:2）。 Ｂ２ＥＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂エフリンB2リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す；SEQ ID NO:3）。 Ｂ４ＥＣｖ３-ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂EphB4リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す；SEQ ID NO:4）。 Ｂ２ＥＣ-ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂エフリンB2リーダーペプチドを含む前駆体の推定配列を示す；SEQ ID NO:5）。 Ｂ４ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ（プロテインＡ-アガロースベース）を示す。 Ｂ４ＥＣ-ＦＣ阻害アッセイ（溶液中阻害）を示す。 Ｂ２ＥＣ-ＦＣ結合アッセイ（プロテインＡ-アガロースベースアッセイ）を示す。 Ｂ４Ｅｃｖ３に応答するＨＵＡＥＣ走化性を示す。 Ｂ２ＥＣ-ＦＣに応答するＨＨＥＣの走化性を示す。 Ｂ２ＥＣに応答するＨＨＡＥＣの走化性を示す。 ＨＵＡＥＣ細管形成に対するＢ４Ｅｃｖ３の効果を示す。 ＨＵＡＥＣ細管形成に対するＢ２ＥＣ-ＦＣの効果を示す。 ヒトエフリンB2コンストラクトの概略図である。 ヒトEphB4コンストラクトの概略図である。 組み換え型可溶性EphB4ＥＣ蛋白質のドメイン構造を示す。ドメインの表示は下記の通りである：Ｌ＝リーダーペプチド、Ｇ＝球状（リガンド-結合領域）、Ｃ＝Ｃｙｓリッチ領域、Ｆ１、Ｆ２＝フィブロネクチン型IIIリピート、Ｈ＝６×Ｈｉｓタグ。 EphB4ＥＣ蛋白質の精製及びリガンド結合性を示す。精製されたEphB4由来の組み換え型可溶性蛋白質のＳＤＳ-ＰＡＡＧゲル電気泳動を示す（クマシー染色）。 Ｎｉ-ＮＴＡ-アガロースビーズ上に固定化したEphB4由来の組み換え型蛋白質へのエフリンB2-ＡＰ融合体の結合性を示す。三個の独立した試験結果をそれぞれの蛋白質ごとに示す。縦軸は４２０ｎｍでの光学密度。 EphB4ｖ３が走化性を抑制することを示す。 EphB4ｖ３がマトリゲル（商標）上の細管形成を抑制することを示す。代表的試験でのＢ４ｖ３による細管形成の強い阻害を示す。 蛋白質なしの細胞と比較において、Ｂ４ｖ３の濃度を増加させたときに得られる管長の減少及び接合数の減少量を示す。結果は、２ウェルを用いる三つの独立した試験から得られる平均値±S.D.（標準偏差）で示される。 可溶性EphB4は、ＭＴＳアッセイで評価して細胞毒性効果は検出されなかったことを示す。 マトリゲル（商標）アッセイにおいて、Ｂ４ｖ３は内皮細胞による侵潤及び細管形成を阻害することを示す。全ての侵潤細胞を検出するために、個々の切片を、トリクローム（商標、マッソン社製）で染色して合計侵潤細胞を検出して倍率２０倍で画像をとった。ＡＢ左上はＧＦなしのマトリゲルプラグの切片を示し、Ａの右上はＧＦを含むＢ４IｇＧを有する切片を示し、左下の区域はＧＦを含有し、右下はＢ４ｖ３の存在下でのＧＦを示す。内皮細胞の顕著な侵潤はＧＦ含有マトリゲルのみで観察された。右上はＢ４IｇＧにより誘起され侵潤された多数の細胞を有する領域を示し、Ｂ４ｖ３の二量体を表す。各写真の左上部はマトリゲルプラグ周囲に形成された細胞層に対応し、そこから細胞が右下隅の方向に位置するプラグの中央に向かって侵潤する。区域に分けたマトリゲルプラグの全細胞はScion Imageソフトウェア（商標）で定量化した。二つのプラグを用いた試験を２度行って得られた結果を、平均値±S.D.として示す。 EphB4由来の組み換え型可溶性蛋白質の存在下又はその非存在下で、エフリンB2-Fc融合体を用いた刺激に応答する、ＰＣ３細胞中のEphB4レセプターのチロシンリン酸化を示す。 生存率及び細胞周期に対する可溶性EphB4ＥＣＤの効果を示す。２種類のＨＮＳＣＣ細胞系に対する３日間の細胞生存率アッセイを示す。 Ａと同様に処理されたＨＮＳＣＣ-１５細胞中の細胞周期のＦＡＣＳ分析を示す。細胞を処理した結果、矢印により示されるようにサブＧ０／Ｇ1及びＳ／Ｇ２期の蓄積を生じた。 Ｂ４ｖ３はネズミ角膜hydron（商標）マイクロポケットアッセイにおいて血管内応答を阻害することを示す。 マトリゲル及び増殖因子の存在下でＳＣＣ１５、Ｂ１６及びＭＣＦ-７をｓＢ４ｖ３と共に注射すると、これらの細胞の生体内での腫瘍増殖が抑制されることを示す。 可溶性EphB4は、三種の腫瘍種：Ｂ１６（黒色腫）、ＳＣＣ１５（頭部癌及び頚部癌）及びＭＣＦ-７（乳癌）において、アポトーシス及び壊死を引き起こし、血管形成を減少させたことを示す。腫瘍はマトリゲル（商標）プラス増殖因子及び可溶性EphB4と予備混合して皮下注射される。１０〜１４日後、マウスにＦＩＴＣ-レクチン（緑）を静脈注射して血管灌流を評価した。コントロール用のＰＢＳで処理された腫瘍は、高い腫瘍密度及び活発な血管形成応答を示した。ｓEphB4で処理された腫瘍は、腫瘍細胞密度の減少及び生存腫瘍細胞領域での腫瘍血管形成の顕著な阻害、並びに腫瘍壊死及びアポトーシスを示した。 前立腺細胞系でのEphB4の発現を示す。種々の前立腺癌細胞系、正常前立腺由来の細胞系（ＭＬＣ）及びEphB4モノクローナル抗体でプローブした急性骨髄芽球性リンパ腫細胞（ＡＭＬ）の全細胞溶解産物のウェスタンブロットを示す。 ウェスタンブロット法により決定されるＰＣ３細胞中のEphB4のリン酸化を示す。 前立腺癌組織中のEphB4の発現を示す。代表的前立腺癌凍結切片をEphB4モノクローナル抗体（左上）又はアイソタイプ特異的コントロール（左下）で染色した。隣接するＢＰＨ組織はEphB4モノクローナル抗体で染色した（右上）。陽性シグナルは、腫瘍細胞中で茶色である。ストロマ及び正常上皮は陰性である。腫瘍組織において染色の膜局在化は、EphB4の膜貫通局在化と整合することに注意すべきである。右下グラフは、癌標本及び隣接するＢＰＨ組織から抽出されたＲＮＡの代表的ＱＲＴ-ＰＣＲを示す。 腫瘍抑制剤による前立腺癌細胞中のEphB4のダウンレギュレーション及びＲＸＲ発現を示す。ＰＣ３細胞は短縮（truncated）されたＣＤ４及びｐ５３若しくはＰＴＥＮ又はベクターのみで共トランスフェクトした（図２９Ａ）。２４時間後、ＣＤ４-分類された細胞を採取し、溶解し、ウェスタンブロット法でEphB4及び、標準蛋白質としてβ-アクチンの発現を順に分析した。図２９Ｂは種々の安定な細胞系に対する上記（Ａ）のウェスタンブロットを示す。ＬＮＣａＰ-ＦＧＦはＦＧＦ-８の安定なトランスフェクションクローンであり、一方ＣＷＲ２２Ｒ-ＲＸＲはＲＸＲレセプターを安定して発現する。ＢＰＨ-１は、良性肥大性前立腺上皮から確立した。 ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ-１による前立腺癌細胞中のEphB4のダウンレギュレーションを示す。図３０ＡはＥＧＦＲの特異的阻害剤であるＡＧ１４７８（１ｎＭ）で３６時間処理したとき又は処理しなかったときのＰＣ３細胞のウェスタンブロットを示す。EphB4シグナルの減少がＡＧ１４７８処理後に観察された。膜をストリップし、影響を受けていないβ-アクチンで再プローブした。図３０ＢはＩＧＦＲ-１を特異的に中和する抗体ＭＡＢ３９１で（２μｇ／ml；一晩）処理したとき又は処理しなかったときのＰＣ３細胞の３個の複製サンプルに対するウェスタンブロットを示す。膜をEphB4、ＩＧＦＲ-１及びβ-アクチン抗体で順にプローブした。ＩＧＦＲ-１シグナルは、ＭＡＢ３９１処理によって予測されるシグナルの抑制を示す。 発現及び前立腺細胞機能に対する特異的EphB4 ＡＳ-ＯＤＮ及びsiRNAの効果を示す。EphB4の完全長コンストラクトを安定して発現する２９３細胞を使用してsiRNA４７２がEphB4発現を阻害する能力を評価した。細胞をリポフェクタミン２０００（商標）を使用して５０ｎＭのＲＮＡｉでトランスフェクトした。コントロール用のsiRNA（緑蛍光蛋白質；ＧＦＰsiRNA）又はEphB4 siRNA４７２でトランスフェクションしてから４０時間後、EphB4モノクローナル抗体でプローブし、ストリップし、β-アクチンモノクローナル抗体で再プローブした細胞溶解産物のウェスタンブロットを示す。 完全長EphB4を一時的に発現する２９３中での発現に対するEphB4 AS-１０の効果を示す。細胞をＡＳ-１０又はセンスＯＤＮへ６時間曝露し、（Ａ）と同様にウェスタンブロット法により分析した。 方法セクションに記載のようにsiRNAで処理されたＰＣ３細胞の４８時間生存率アッセイを示す。三個の複製サンプルの平均±s.e.m.を示す。 方法セクションに記載のようにＯＤＮで処理したＰＣ３細胞の５日間生存率アッセイを示す。三個の複製サンプルの平均±s.e.m.を示す。 （Ａ）と同様に５０ｎＭのsiRNAの存在下でトランスフェクトされたＰＣ３細胞の移動のスクレープアッセイを示す。スクレープが単層で作られた直後（０ｈ）及び２０時間の連続培養後に得られた代表的な２０倍の顕微鏡写真を示す。コントロール用のsiRNAの場合には２０時間後のスクレープに多数の細胞が充填されたが、EphB4 siRNA４７２では充填されなかった。 ＡＳ-１０又はセンスＯＤＮ（両方とも１０μＭ）で処理した細胞に対する同様のアッセイを示す。 方法セクションに記載のようにsiRNA又はコントロール用のsiRNAでトランスフェクトしたＰＣ３細胞のマトリゲル（商標）侵潤アッセイを示す。下室チャンバー中で５ｍｇ／mlフィブロネクチンに応答するマトリゲル（商標）被覆されたインサートの下側への細胞移動を固定化し、ギムザ染色した。コントロール用siRNA及びsiRNA４７２で処理した細胞の代表的顕微鏡写真を示す。細胞数を高倍率視野で五箇所計測し、その平均±s.e.m.をグラフに示した（右下）。 細胞周期及びアポトーシスに関するEphB4 siRNA４７２の効果を示す。方法セクションに記載のフローサイトメトリーにより、siRNAでトランスフェクトしたＰＣ３細胞を上記トランスフェクションの２４時間後に細胞周期段階について分析した。ヨー化プロピジウム蛍光強度に対する細胞数のプロットを示す。siRNA４７２で処理した場合には７．９％の細胞母集団がアポトーシス性（サブＧ０ピーク中）であるのに対し、コントロール用のsiRNAでは１％がアポトーシス性であった。 方法セクションに記載の細胞死検出ＥＬＩＳＡプラスキットにより検出されたＰＣ３細胞のアポトーシスを示す。４０５ｎｍでの吸光度は、無核細胞断片中のヒストン及びＤＮＡ-ＰＯＤ量に比例して増加した。siRNA４７２及びＧＦＰ siRNA（コントロール）の表示濃度における三個のサンプルの平均±s.e.m.を示す。 EphB4及びエフリンB2が中皮腫細胞系中で発現されたことをＲＴ-ＰＣＲ（図３３Ａ）及びウェスタンブロット法（図３３Ｂ）によって示す。 中皮腫細胞中でのin situハイブリダイゼーションによるエフリンB2及びEphB4の発現を示す。チャンバースライド中で培養されたＮＣＩ Ｈ２８中皮腫細胞系は、エフリンB2又はEphB4へのアンチセンスプローブでハイブリッド化された（上列）。それぞれのハイブリダイゼーションに対するコントロールはセンスである（下列）。陽性反応は暗青の細胞質染色である。 中皮腫培養物中のEphB4及びエフリンB2の細胞性発現を示す。悪性中皮腫患者の胸水由来の初代細胞単離体、並びに細胞系ＮＣＩ Ｈ２８、ＮＣＩ Ｈ２３７３、及びＮＣＩ Ｈ２０５２のエフリンB2及びEphB4に対する免疫蛍光染色法である。緑色は、ＦＩＴＣで標識化された二次抗体の陽性シグナルである。免疫蛍光染色法の特異性は一次抗体が無い場合シグナルの欠落により示される（第一列）。細胞核はＤＡＰＩ（青色）で対比染色され、全細胞の位置が明らかになった。ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ蛍光の併合画像を示す。オリジナル倍率２００倍。 中皮腫腫瘍中のエフリンB2及びEphB4の発現を示す。悪性中皮腫バイオプシーの免疫組織化学。Ｈ＆Ｅ染色された切片は腫瘍構造を明らかに示した；左下パネルは一次抗体の無いバックグラウンドコントロールである。EphB4及びエフリンB2特異的染色は茶色である。オリジナル倍率２００倍。 Ｈ２８細胞の増殖に対するEphB4アンチセンスプローブの効果。 Ｈ２８細胞の増殖に対するEphB4 siRNAの効果を示す。 細胞移動に対するEphB4アンチセンスプローブの効果。 EphB4 siRNAの効果を示す。 EphB4はＨＮＳＣＣの一次組織及び転移で発現したことを示す。図３９Ａは、上段が本方法に記載のEphB4モノクローナル抗体で染色し、腫瘍細胞に局在化するＤＡＢ（茶色）で画像化した代表的保存用切片の免疫組織化学を示す。下段は、隣接する切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。濃紫染色は腫瘍細胞の存在を表す。右手カラムは、EphB4ポリクローナル抗体で染色し（右上）、ＤＡＢで画像化したリンパ節転移の凍結切片である。コントロール（中央）はヤギ血清でのインキュベーションであり、Ｈ＆Ｅ（底部）は染色されないストロマで囲まれた転移性病巣の位置を明らかにする。図３９Ｂは、ランオフ転写により生成した、DIG標識化EphB4（左カラム）及びエフリンB2（右カラム）のアンチセンス又はセンスプローブでプローブしたＨＮＳＣＣケースの連続凍結切片のin situハイブリダイゼーションを示す。ハイブリダイゼーションシグナル（暗青）はアルカリ-ホスファターゼ-複合抗DIG抗体を使用して検出し、切片をNuclear Fast Red（商標）で対比染色した。Ｈ＆Ｅで染色された連続切片を、腫瘍構造の例示のために示す（左下）。図３９Ｃは腫瘍（Ｔ）、無関係な正常組織（Ｎ）及びリンパ節バイオプシー（ＬＮ）から構成される患者サンプルの蛋白質抽出物のウェスタンブロットを示す。サンプルは、４〜２０％トリス-グリシンゲル中でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分別され、次にナイロン膜上で電気ブロッティングされた。膜は、EphB4モノクローナル抗体及びβ-アクチンＭｏＡｂで順にプローブした。化学発光シグナルをオートラジオグラフフィルム上で検出した。１２０ｋＤ位に移動したEphB4特異バンド及び４０ｋＤ位に移動したβ-アクチンを示す。β-アクチンシグナルをそれぞれのサンプルのローディング及び転移のためのコントロールとして使用した。 EphB4はＨＮＳＣＣ細胞系中で発現し、ＥＧＦによりレギュレートされることを示す。図４０ＡはＳＣＣ細胞系中のEphB4発現の試験結果を示す。図３９Ｃに記載のように、順にEphB4モノクローナル抗体でプローブし、ストリップし、β-アクチンモノクローナル抗体で再プローブされた全細胞溶解産物のウェスタンブロットを示す。図４０ＢはEphB4発現に対する特異的ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８の効果を示す。１０％ＦＣＳを補充された培地中で０〜１０００ｎＭ ＡＧ１４７８で２４時間処理（左）、又は１ｍＭ ＡＧ１４７８で４、８、１２又は２４時間処理（右）したＳＣＣ１５の粗細胞溶解産物に対してウェスタンブロット法を適用した。EphB4及びアクチンの有無を順にプローブした膜を示す。図４０Ｃは、ＳＣＣ細胞系中のEphB4発現に対するＥＧＦＲシグナルの阻害効果を示す。１０％ＦＣＳを含有する増殖培地（growth media）中に保持された細胞を、１μＭのＡＧ１４７８で２４時間処理し、その後、粗細胞溶解産物についてウェスタンブロット法により分析し、ＥＧＦＲ、EphB4、エフリンB2及びβ-アクチン抗体の有無を順にプローブした。ＥＧＦＲの特異的シグナルが１７０ｋＤ位に検出され、エフリンB2が３７ｋＤ位に、更にEphB4及びβ-アクチンが図４０Ｃ中に示されるように検出された。β-アクチンはローディング及び移動のコントロールとして働く。 ＥＧＦによるEphB4のレギュレーション機構を示す。図４１ＡはＥＧＦＲシグナル経路の概略図であり、作用部位及び使用された具体的なキナーゼ抑制剤の名前を赤で示す。図４１ＢではＳＣＣ１５細胞を２４時間血清飢餓状態とした後に、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ml）、３μＭ Ｕ７３１２２、又は５μＭ ＳＨ-５、５μＭ ＳＰ６００１２５、２５ｎＭ ＬＹ２９４００２、 -μＭ ＰＤ０９８０９５又は５μＭ ＳＢ２０３５８０の存在又は非存在下で２４時間のインキュベーションを更に行った。Ｎ／Ａは、同体積の希釈剤（ＤＭＳＯ）のみを加えた培養物を表す。細胞溶解産物をEphB4モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット法で分析した。β-アクチンシグナルは、蛋白質のローディング及び移動のコントロールとして働く。 特異的EphB4 siRNAは、EphB4発現及び細胞生存能力を抑制し、細胞周期停止を引き起こすことを示す。安定して完全長EphB4を発現する２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（商標）を使用して５０ｎＭのＲＮＡｉでトランスフェクトした。トランスフェクション４０時間後、細胞を採取、溶解及び加工してウェスタンブロット法を行った。膜をEphB4モノクローナル抗体でプローブし、ストリップし、蛋白質のローディング及び移動のコントロールとしてβ-アクチンモノクローナル抗体で再プローブした。スクランブルされた緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）配列に対する陰性試薬コントロールはＲＮＡｉであり、コントロールはリポフェクタミン２０００（商標）のみでトランスフェクションされる。 方法セクションに記載のようにsiRNAで４８時間処理したＳＣＣ細胞系のＭＴＴ細胞生存率アッセイを示す。三個のサンプルの平均±s.e.m.を示す。 siRNAで上記のようにトランスフェクトされたＳＣＣ１５細胞を、トランスフェクション２４時間後、方法セクションに記載のようにフローサイトメトリーにより細胞周期段階を分析した。プロピジウムアイオダイド蛍光強度に対する細胞数のプロットを示す。上列及び中央列は、siRNAトランスフェクションから１６時間後の細胞のプロットを示し、最下列はトランスフェクションから３６時間後の細胞のプロットを示す。具体的なsiRNA及び濃度は、それぞれのプロットで示される。Ｌｉｐｏ＝リポフェクタミン（商標）２００ｍｏｃｋトランスフェクション。 ＳＣＣ細胞に対する特定EphB4 ＡＳ-ＯＤＮのin vitro効果を示す。EphB4完全長発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした２９３細胞を、トランスフェクションから６時間後に上記アンチセンスＯＤＮで処理した。細胞溶解産物をＡＳ-ＯＤＮ処理から２４時間後に採取してウェスタンブロット法を適用した。 ＳＣＣ２５細胞を４８ウェルプレートへ均一密度で接種し、１、５、及び１０μＭのEphB4 ＡＳ-ＯＤＮで２及び４日目に処理した。細胞生存率を第５日にＭＴＴアッセイで測定した。三個のサンプルの平均値±s.e.m.を示す。EphB4蛋白質レベル阻害活性を示したＡＳ-ＯＤＮも又、ＳＣＣ１５細胞生存能力の効果的抑制剤であった。 未処理細胞（上部）と比較した３６時間ＡＳ-１０で処理したＳＣＣ１５細胞（底部）の細胞周期分析を示す。 プラスチックパスツールピペットでスクレープして単層中に３ｍｍ幅裂け目を作成したＳＣＣ１５細胞の融合培養物を示す。阻害性EphB4 ＡＳ-ＯＤＮ（ＡＳ-１０）及び非阻害性ＡＳ-ＯＤＮ（ＡＳ-１）の存在下で細胞の移動能力及び傷を閉じる能力を４８時間後に評価した。スクランブルされたＯＤＮは陰性コントロールＯＤＮとして含まれた。未処理の培養物はＯＤＮへ曝されなかった。試験開始時点で、全培養物は同一幅のスクレープ（裂け目）を示し、１μＭのEphB4 AS-１０中で４８時間後に観察されるものと類似であった。赤い括弧は当初のスクレープ幅を表す。 方法セクションに記載の２室アッセイにおいて、２０ｍｇ／mlのＥＧＦに応答したＳＣＣ１５細胞の移動を示す。未処理（ＮＴ）、ＡＳ-６及びＡＳ-１０で処理した細胞並びに、移動阻害の陽性コントロールとしての１０ｎｇ／mlタキソールの代表的顕微鏡写真を示す。 細胞数を５個の高倍率視野中で計測し、平均±s.e.m.をグラフ中に示す。 EphB4 ＡＳ-ＯＤＮは生体内で腫瘍増殖を抑制することを示す。５×１０6個の細胞を移植した次の日から２０ｍｇ／ｋｇ／日でEphB4 AS-１０又はスクランブルＯＤＮ処理したBalb/Cヌードマウス中でのＳＣＣ１５皮下腫瘍異種移植の増殖曲線である。コントロールマウスは同体積の希釈剤（ＰＢＳ）を投与された。６匹マウス／群の平均±s.e.m.を示す。＊Ｐ＝０．０００１（スクランブルＯＤＮ処理群と比較したスチューデントｔ-ｔｅｓｔによる。） EphB4ではなくエフリンB2がＫＳバイオプシー組織中で発現したことを示す。図４５Ａは、エフリンB2及びEphB4についてのアンチセンスプローブによるin situハイブリダイゼーションと、腫瘍構造を示すためにＨ＆Ｅ染色された対応する切片を示す。ＩＳＨ中の暗青色は、エフリンB2の陽性反応を表す。EphB4に対するシグナルは、カポジ肉腫バイオプシーでは検出されなかった。反対に、EphB4に対するＩＳＨシグナルは、扁平上皮細胞癌腫瘍細胞中で強い。エフリンB2はEphB4-ＡＰ融合蛋白質を使用したＫＳ中にも検出された（左下）。図４５Ｂは、EphB4／Fc融合蛋白質を用いたエフリンB2の検出を示す。隣接する断片は腫瘍構造を示すためにＨ＆Ｅで染色され（左）、黒い長方形は、方法セクションに記載のＦＩＴＣ標識化抗ヒトＦｃ抗体で検出されたEphB4／Ｆｃ処理した断片（中央）中に示される領域を表す。コントロールとして、隣接する断片をヒトＦｃフラグメントで処理した（右）。その断片へ結合するEphB4／Ｆｃから生じる特別なシグナルは、腫瘍細胞の範囲のみに観察される。図４５Ｃは、エフリンB2及びＨＨＶ８潜伏蛋白質ＬＡＮＡ（潜伏感染関連核抗原）１の共発現を示す。冷凍ＫＳバイオプシー材料のエフリンB2（赤）、ＬＡＮＡ１（緑）又はEphB4（赤）に対する抗体を用いた二重標識法-共焦点免疫蛍光学顕微鏡分析は、ＫＳバイオプシー中でのＬＡＮＡ１及びエフリンB2の共発現を直接的に示す。共発現は黄色で示される。プロピジウムアイオダイド染色（赤）された核を有する細胞中のＰＥＣＡＭ-１（緑）に対する抗体を用いたバイオプシーの二重標識法-共焦点画像は、腫瘍の血管特性を示す ＨＨＶ-８は静脈性内皮細胞中での動脈性マーカー発現を誘起することを示す。図４６Ａは動脈／静脈マーカー及びウィルス性蛋白質用のＨＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ-１の培養物の免疫蛍光を示す。材料及び方法のセクション中に記載のように、培養物をチャンバースライド中で成長させ、エフリンB2（ａ、ｅ、ｉ）、EphB4（ｍ、ｑ、ｕ）、ＣＤ１４８（ｊ、ｖ）、及びＨＨＶ-８蛋白質ＬＡＮＡ１（ｂ、ｆ、ｍ）又はＯＲＦ５９（ｒ）の免疫蛍光検出用に処理した。同一視野の併合画像中の黄色は、エフリンB2及びＬＡＮＡ又はエフリンB2及びＣＤ１４８の共発現を示す。生存細胞の位置は、第三カラム（ｃ、ｇ、ｋ、ｏ、ｓ、ｗ）中のＤＡＰＩ（青）での核染色法により明らかになった。顕微鏡写真は、代表的視野のものである。図４６Ｂは、ＨＵＶＥＣ及び２種のＨＨＶ-８に感染させた培養物（ＨＵＶＥＣ／ＢＣ-１及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ-３）の、エフリンB2及びEphB4に対するＲＴ-ＰＣＲを示す。エフリンB2生成物（２００ｂｐ）はＨＵＶＥＣ／ＢＣ-１中で観察され、ＨＵＶＥＣ／ＢＣ-３及びEphB4生成物（４００ｂｐ）はＨＵＶＥＣ中で観察される。また、インプットＲＮＡの量及び完全性のコントロールとしてβ-アクチンＲＴ-ＰＣＲを示す。 ＨＨＶ-８はカポジ肉腫細胞中の動脈性マーカー発現を誘起することを示す。図４７Ａは種々の細胞溶解産物に対するエフリンB2のウェスタンブロットを示す。ＳＬＫ-ｖＧＰＣＲはＨＨＶ-８ｖＧＰＣＲを発現するＳＬＫの安定なクローンであり、ＳＬＫ-ｐＣＥＦＬはエンプティ発現ベクターでトランスフェクトされたコントロール用の安定なクローンである。ＬＡＮＡ又はＬＡＮＡ△４４０でトランスフェクトされたＳＬＫ細胞は、それぞれＳＬＫ-ＬＡＮＡ及びＳＬＫ-△４４０である。蛋白質ローディング及び移動量をβ-アクチンモノクローナル抗体を用いて膜を再プローブすることにより決定した。図４７Ｂでは、発現ベクターｐｖＧＰＣＲ-ＣＥＦＬによるＫＳ-ＳＬＫ細胞の一時的トランスフェクションは、ＦＩＴＣ（緑）を用いた免疫蛍光染色法によって示されるように、エフリンB2の発現を生じた。一方、コントロールベクターｐＣＥＦＬは効果を示さなかった。ＫＳ-ＳＬＫ細胞（０．８×１０5／ウェル）を０．８μgのＤＮＡでリポフェクタミン２０００（商標）を使用してトランスフェクトした。２４時間後、方法セクションに記載のように細胞を固定化し、エフリンB2ポリクローナル抗体及びＦＩＴＣ複合二次抗体で染色した。図４７ＣではＨＵＶＥＣのｖＧＰＣＲによる一時的トランスフェクションは、エフリンB2ルシフェラーゼコンストラクトからの転写を誘導した。２４ウェルプレート中の８×１０3ＨＵＶＥＣを、Superfect（商標）を使用して、翻訳開始部位に関する-２９４１〜-１１、又は示されている２個の５’-欠失の配列を含有する０．８μｇ／ウェルのエフリンB2プロモーターコンストラクトで、８０ｎｇ／ウェルのｐＣＥＦＬ又はｐｖＧＰＣＲ-ＣＥＦＬと共にトランスフェクションした。ルシフェラーゼはトランスフェクションから４８時間後に測定され、誘導割合はグラフの右側に示される。ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃはプロモーターの無いルシフェラーゼコントロールベクターである。ルシフェラーゼは、ＧＰＣＲが共トランスフェクトされたβ-ガラクトシダーゼの発現を誘起したために、蛋白質へ規準化した。グラフは、複製物６個の平均値±ＳＥＭである。３個の複製物の同様な試験の１例を示す。 ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ-ＣがエフリンB2発現をレギュレートすることを示す。図４８Ａでは、抗体中和によるエフリンB2の阻害を示す。細胞は完全増殖培地（full growth medium）中で培養され、抗体（１００ｎｇ／ml）へ３６時間曝されてから採取及びウェスタンブロット法用の溶解が行われた。図４８Ｂでは、エフリンB2の発現の誘導のために細胞を、５％血清を含有し増殖因子を欠くＥＢＭ増殖培地中で培養した。個々の増殖因子を示されたように添加し、細胞を３６時間後に採取した。蛋白質ローディング及び移動量は膜をβ-アクチンモノクローナル抗体を用いて再プローブすることで測定した。 特異的siRNAでのエフリンB2ノックダウンは、ＶＥＧＦの存在下であるが、ＩＧＦ、ＥＧＦ又はｂＦＧＦの非存在下でのＫＳ細胞中の生存能力及びＨＵＶＥＣ増殖を抑制することを示す。図４９Ａでは、ＫＳ-ＳＬＫ細胞を種々のsiRNA、エフリンB2及びコントロールでトランスフェクトした。４８時間後、細胞を採取し、粗細胞溶解産物を４〜２０％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分別した。ウェスタンブロット法を、インハウスで生成されたエフリンB2に対するモノクローナル抗体を用いて行った。膜をストリップし、β-アクチンモノクローナル抗体（シグマ社製）で再プローブすると等価なローディング及び移動が示された。図４９ＢはエフリンB2及びEphB4 siRNAの存在下でのＫＳ-ＳＬＫ培養物の３日細胞生存率アッセイを示す。２４-ウェルプレート中の１×１０5細胞／ウェルを０、１０及び１００ｎｇ／mlのsiRNAでグラフに示すように処理した。方法セクションに記載のように、培養物の生存能力をＭＴＴアッセイで測定した。２個のサンプルの平均±標準偏差を示す。図４９Ｃでは、ＨＵＶＥ細胞をフィブロネクチンで被覆された８ウェルチャンバースライド上に接種した。ＨＵＶＥ細胞を、全成長サプリメントを含むＥＧＭ-２培地中で一晩増殖した。翌日、培地をＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ml）、又はＥＧＦ、ＦＧＦ及びＩＧＦを含有する培地に交換した。３７℃で２時間インキュベーションした後、細胞をリポフェクタミン２０００（商標、インビトロジェン社製）を使用して１０ｎＭのsiRNA含有Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地（商標）中でエフリンB2、EphB4又はコントロールとしての緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）に対しトランスフェクトした。細胞を２時間インキュベートし、次に複数の増殖因子を含有する新しい培地又はＶＥＧＦ単独をそれぞれウェルへ添加した。４８時間後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、直ちにデジタルカメラにより倍率１０倍で写真を撮った。 可溶性EphB4は、ＫＳ及びＥＣコード形成及び生体内血管形成を抑制することを示す。マトリゲル（商標）（上列）中のＨＵＶＥＣのコード形成アッセイを示す。指数関数的成長期の細胞を、マトリゲル（商標）上にプレートする前に表示濃度のEphB4細胞外領域（ＥＣＤ）で一晩処理した。細胞をトリプシン処理し、０．５mlマトリゲル（商標）を含有する２４-ウェルプレート中で培養した（１×１０5細胞／ウェル）。試験化合物の連続的存在下でマトリゲル（商標）上で培養した８時間後のコード形成の代表的な２０倍の位相コントラスト視野を示す。オリジナル倍率２００。マトリゲル（商標）上のコード形成アッセイで同様の方法で処理したＫＳ-ＳＬＫ細胞を示す（中央列）。最下列は生体内マトリゲル（商標）アッセイを示す。即ち、増殖因子及びEphB4 ＥＣＤ又はＰＢＳを含有するマトリゲル（商標）プラグを、マウスの中央腹部内に皮下移植した。７日後、プラグを除去し、断片化し、Ｈ＆Ｅで染色してマトリックス内への細胞移動を可視化した。大型管腔を有する無損傷の脈管がコントロール中に観察される一方、EphB4 ＥＣＤはほとんど完全にマトリゲル（商標）中への細胞の移動を阻害した。 膀胱癌細胞系中でのEphB4の発現（Ａ）及びＥＧＦＲシグナル経路によるEphB4発現のレギュレーション（Ｂ）を示す。 ｐ５３のトランスフェクションは５６３７細胞中のEphB4の発現を阻害することを示す。 EphB4 siRNA４７２での処理による膀胱癌細胞系（５６３７）の増殖阻害を示す。 EphB4 siRNA４７２でトランスフェクトされた５６３７細胞のアポトーシスについての研究結果を示す。 EphB4アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示す。５６３７細胞をEphB4 AS-１０（１０μＭ）で処理した（下図）。上図はコントロール細胞を示す。 EphB4 siRNAの細胞侵潤に対する効果を示す。５６３７細胞をsiRNA４７２又はコントロールsiRNAでトランスフェクトした。
Ｇ２５０及びプルダウンアッセイによるEphB4モノクローナル抗体の比較結果を示す。 EphB4抗体はＳＣＣ１５異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。 EphB4抗体はＳＣＣ１５、頭部癌及び頚部癌腫瘍種のアポトーシス、壊死及び血管形成減少を引き起こすことを示す。 EphB4抗体の全身的投与は腫瘍退縮を導くことを示す。 ヒトEphB4のゲノムヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO:6）。 ヒトEphB4のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO:7）。 ヒトエフリンB2のゲノムヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO:8）。 ヒトエフリンB2のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO:9）。 ヒトEphB4のアミノ酸配列を示す（SEQ ID NO:10）。 ヒトエフリンB2のアミノ酸配列を示す（SEQ ID NO:11）。 ＨＳＡ−EphB4融合蛋白質とその他のEphB4ポリペプチドのエフリンＢ２に対する結合性の比較を示す。 マウス内におけるEphB4−ＨＳＡ融合蛋白質とEphB4ポリペプチドの生体内安定性の比較を示す。 特定のpH条件下でPEG化した可溶性EphB4ポリペプチドのエフリンB2結合活性を示す。 SP−セファロンカラム上でのEphB4蛋白質のPEG誘導体のクロマトグラフィによる分離を示す。PEG修飾EphB4蛋白質の純度をPAGEにより分析した。PEG化反応産物のエフリンB2結合性についても示す。 クロマトグラフィによって分離した未PEG化、モノPEG化及びポリPEG化EphB4画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した純度を示す。 EphB4のＰＥＧ化反応後のクロマトグラフィ画分のエフリンB2への結合活性を示す。 EphB4のPEG化反応後のクロマトグラフィ画分を、３７℃で三日間マウス血清中にてインキュベートした後のエフリンB2への結合活性の保持状態を示す。 マウス内における未PEG化、モノPEG化及びポリPEG化EphB4画分の生体内安定性を示す。

Claims (26)

  1. EphB4蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列を含有し、ヒト血清アルブミンタンパク質と融合され、単離された可溶性ポリペプチドであって、該ポリペプチドは単量体であってエフリンB2ポリペプチドに特異的に結合し、しかも該ポリペプチドはEphB4とエフリンB2の間の相互作用から生じるシグナリングを阻害するポリペプチド。
  2. EphB4蛋白質の球状領域か、又はEphB4蛋白質の球状領域に少なくとも９０％は同一である配列を含有する請求項１のポリペプチド。
  3. EphB4蛋白質の前記細胞外領域が、図６５（SEQ ID NO:10）により特定されるアミノ酸配列の残基２９〜１９７と少なくとも９０％は同一である配列を含有する請求項１記載のポリペプチド。
  4. EphB4蛋白質の前記細胞外領域が、図６５（SEQ ID NO:10）により特定されるアミノ酸配列の残基２９〜５２６と少なくとも９０％は同一である配列を含有する請求項１記載のポリペプチド。
  5. 前記ヒト血清アルブミンタンパク質が成熟型である請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチドの生体内における血清中半減期は非修飾EphB4ポリペプチドのそれよりも少なくとも５０％長い請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドの生体内における血清中半減期は非修飾EphB4ポリペプチドのそれよりも少なくとも１００％長い請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドは下記：
    （ａ）エフリンB2活性の阻害；
    （ｂ）エフリンB2キナーゼ活性の阻害；
    （ｃ）EphB4キナーゼ活性の阻害；
    （ｄ）エフリンB2のクラスター化の阻害；及び
    （ｅ）EphB4のクラスター化の阻害；
    から選択される１又は２以上の活性を有する請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチド。
  9. 請求項１〜５の何れか一項記載のポリペプチド及び製薬上許容し得る担体を含有する医薬組成物。
  10. エフリンB2／EphB4を介したシグナルを阻害するのに使用する薬剤を調製するための請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチドの使用。
  11. 腫瘍の増殖速度を減少させるのに使用する薬剤を調製するための請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチドの使用。
  12. 患者の癌を治療するのに使用する薬剤を調製するための請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチドの使用。
  13. 患者の血管形成を阻害するのに使用する薬剤を調製するための請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチドの使用。
  14. 血管形成に関連した疾病に罹患した患者を治療するのに使用する薬剤を調製するための請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチドの使用。
  15. １個以上の修飾アミノ酸残基を含有する請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチド。
  16. 請求項１〜５何れか一項記載のポリペプチド及び製薬上許容し得る担体を含有する化粧組成物。
  17. 前記癌は、同等組織の非癌化細胞よりも高いレベルでエフリンB2及び／又はEphB4を発現する癌細胞を含む請求項１２記載の使用。
  18. 前記癌は転移性癌である請求項１２記載の使用。
  19. 前記腫瘍が結腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺腫瘍、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病から選択される請求項１２記載の使用。
  20. 前記癌が血管形成に依存する癌である請求項１２記載の使用。
  21. 前記癌が血管形成に依存しない癌である請求項１２記載の使用。
  22. EphB4蛋白質のフィブロネクチンタイプ３領域のアミノ酸配列を含有し、ヒト血清アルブミンタンパク質と融合され、単離された可溶性ポリペプチドであって、該ポリペプチドは癌のマウス異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害するポリペプチドであり、しかも該ポリペプチドは単量体であり、EphB4とエフリンB2の間の相互作用から生じるシグナリングを阻害するポリペプチド。
  23. エフリンB2に結合しない請求項２２記載のポリペプチド。
  24. EphB4蛋白質の球状領域の部分を含まない請求項２２記載のポリペプチド。
  25. 図６５（SEQ ID NO:10）の配列の３２４〜５２６のアミノ酸配列を含有する請求項２２記載のポリペプチド。
  26. 前記ヒト血清アルブミンタンパク質が成熟型である請求項２２に記載のポリペプチド。
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ES (1) ES2529451T3 (ja)
WO (1) WO2006034455A2 (ja)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887674B1 (en) 1998-04-13 2005-05-03 California Institute Of Technology Artery- and vein-specific proteins and uses therefor
AU2004220459B2 (en) * 2003-03-12 2010-08-05 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
US7381410B2 (en) * 2003-03-12 2008-06-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
PL2368553T3 (pl) 2003-04-08 2015-05-29 Progenics Pharm Inc Preparaty farmaceutyczne zawierające metylonaltrekson
EP1730196B1 (en) * 2004-03-12 2010-12-22 Vasgene Therapeutics, Inc. Antibodies binding to ephb4 for inhibiting angiogenesis and tumor growth
KR20070034465A (ko) 2004-03-12 2007-03-28 바스진 테라퓨틱스, 인크. 혈관형성 및 종양 성장을 억제하기 위한 폴리펩티드 화합물
ES2529451T3 (es) 2004-09-23 2015-02-20 Vasgene Therapeutics, Inc. Compuestos polipeptídicos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral
US8518962B2 (en) 2005-03-07 2013-08-27 The University Of Chicago Use of opioid antagonists
MX2007010833A (es) 2005-03-07 2009-02-17 Univ Chicago Uso de antagonistas opioides para atenuar proliferacion y migracion de células endoteliales.
US9662325B2 (en) 2005-03-07 2017-05-30 The University Of Chicago Use of opioid antagonists to attenuate endothelial cell proliferation and migration
US8524731B2 (en) 2005-03-07 2013-09-03 The University Of Chicago Use of opioid antagonists to attenuate endothelial cell proliferation and migration
AR057325A1 (es) 2005-05-25 2007-11-28 Progenics Pharm Inc Sintesis de (s)-n-metilnaltrexona, composiciones farmaceuticas y usos
AR057035A1 (es) 2005-05-25 2007-11-14 Progenics Pharm Inc SíNTESIS DE (R)-N-METILNALTREXONA, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y USOS
WO2007038395A2 (en) * 2005-09-23 2007-04-05 Vasgene Therapeutics, Inc. Use of ephrinb2 directed agents for the treatment or prevention of viral infections
JP5072275B2 (ja) * 2006-07-03 2012-11-14 テルモ株式会社 閉鎖小胞の分離方法、製剤の製造方法および評価方法
WO2008104803A2 (en) * 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
AU2008233129B2 (en) 2007-03-29 2014-03-20 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Peripheral opioid receptor antagonists and uses thereof
JP2010522756A (ja) 2007-03-29 2010-07-08 プロジェニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 結晶形およびその使用
ES2540551T3 (es) 2007-03-29 2015-07-10 Wyeth Llc Antagonistas de receptores opioides periféricos y usos de los mismos
WO2008156642A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 Vasgene Therapeutics, Inc. Non-immunoglobulin antigen binding scaffolds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
CN101959892B (zh) 2008-02-06 2014-01-08 普罗热尼奇制药公司 (r),(r)-2,2’-二-甲基纳曲酮的制备和用途
JP5647098B2 (ja) 2008-03-21 2014-12-24 ザ ユニヴァーシティー オヴ シカゴ オピオイド拮抗薬とｍＴＯＲ阻害薬を用いた治療
EP2127640A1 (en) 2008-05-27 2009-12-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Azide modified proteins
CA2676881C (en) 2008-09-30 2017-04-25 Wyeth Peripheral opioid receptor antagonists and uses thereof
JP5767117B2 (ja) * 2009-02-17 2015-08-19 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨークＴｈｅ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ Ｏｆ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃｉｔｙ Ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 腫瘍の治療に使用できるｐｔｅｎの細胞外形態の同定
JP5429865B2 (ja) * 2009-09-15 2014-02-26 学校法人日本大学 生体外創傷治癒試験用用具または創傷作製方法
AU2012253571A1 (en) 2011-05-09 2014-01-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Cancer treatments
US10307167B2 (en) 2012-12-14 2019-06-04 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10314594B2 (en) 2012-12-14 2019-06-11 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10813630B2 (en) 2011-08-09 2020-10-27 Corquest Medical, Inc. Closure system for atrial wall
US10413606B2 (en) 2012-10-01 2019-09-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating cancer with nanoparticle complexes of albumin-bound paclitaxel and anti-VEGF antibodies
US20140142689A1 (en) 2012-11-21 2014-05-22 Didier De Canniere Device and method of treating heart valve malfunction
CN103360464A (zh) 2013-07-17 2013-10-23 武汉摩尔生物科技有限公司 多肽、编码该多肽的dna分子、载体、制备方法及应用
US9566443B2 (en) 2013-11-26 2017-02-14 Corquest Medical, Inc. System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation
CA2952424C (en) 2014-06-16 2019-07-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating myelomas
US9446148B2 (en) 2014-10-06 2016-09-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-antibody compositions and methods of making and using the same
US10842626B2 (en) 2014-12-09 2020-11-24 Didier De Canniere Intracardiac device to correct mitral regurgitation
TW201707725A (zh) 2015-08-18 2017-03-01 美國馬友醫藥教育研究基金會 載體－抗體組合物及其製造及使用方法
TW201713360A (en) 2015-10-06 2017-04-16 Mayo Foundation Methods of treating cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
EP3399861A4 (en) 2016-01-07 2019-08-07 Mayo Foundation for Medical Education and Research INTERFERON CANCER TREATMENT METHODS
CA3014531A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hematologic cancer treatments
US11878061B2 (en) 2016-03-21 2024-01-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for improving the therapeutic index for a chemotherapeutic drug
CA3018341A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for reducing toxicity of a chemotherapeutic drug
US10618969B2 (en) 2016-04-06 2020-04-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-binding agent compositions and methods of making and using the same
CA3032947A1 (en) * 2016-08-05 2018-02-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Modified antibody-albumin nanoparticle complexes for cancer treatment
US11160876B2 (en) 2016-09-01 2021-11-02 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and compositions for targeting t-cell cancers
CA3035378A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-pd-l1 binding agent compositions for treating cancers
EP3509635A1 (en) 2016-09-06 2019-07-17 Vavotar Life Sciences LLC Methods of treating triple-negative breast cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
US11311631B2 (en) 2016-09-06 2022-04-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Paclitaxel-albumin-binding agent compositions and methods for using and making the same
EP3510048A1 (en) 2016-09-06 2019-07-17 Mayo Foundation for Medical Education and Research Methods of treating pd-l1 expressing cancer
US20220153791A1 (en) * 2019-02-13 2022-05-19 Vasgene Therapeutics Inc Ephb4-ephrin b2 receptor ligand pair as a novel marker for the treatment of prostate cancer
CA3152665A1 (en) * 2019-08-27 2021-03-04 Tonix Pharma Limited Modified tff2 polypeptides

Family Cites Families (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
GB8510219D0 (en) 1985-04-22 1985-05-30 Bass Plc Isolation of fermentation products
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5092885A (en) 1987-02-12 1992-03-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Peptides with laminin activity
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5192744A (en) 1990-01-12 1993-03-09 Northwestern University Method of inhibiting angiogenesis of tumors
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
ATE130517T1 (de) 1990-08-08 1995-12-15 Takeda Chemical Industries Ltd Intravaskulär embolisierendes mittel mit gehalt an einem die angiogenesis hemmenden stoff.
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
AU1411992A (en) 1991-01-15 1992-08-27 Robert A Bok A composition containing a tetracycline and use for inhibiting angiogenesis
JP3955316B2 (ja) 1991-06-21 2007-08-08 ザ・ワルター・アンド・エリザ・ホール・インスティテュート・オヴ・メディカル・リサーチ 新規レセプター型チロシンキナーゼ及びその用途
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US6331302B1 (en) * 1992-01-22 2001-12-18 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
WO1993015201A1 (en) 1992-01-22 1993-08-05 New England Deaconess Hospital Novel protein tyrosine kinases
US5635177A (en) * 1992-01-22 1997-06-03 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5506194A (en) 1992-07-13 1996-04-09 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Pyrazole derivatives and herbicidal compositions
CA2140002A1 (en) 1992-07-13 1994-01-20 Jay Stout A chemical method for selective modification of the n- and/or c-terminal amino acid .alpha.-carbon reactive group of a recombinant polypeptide or a portion thereof
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
ATE348110T1 (de) 1992-10-28 2007-01-15 Genentech Inc Hvegf rezeptor als vegf antagonist
AU685765B2 (en) 1992-11-13 1998-01-29 Amgen, Inc. (Eck) receptor ligands
US5824303A (en) * 1992-11-13 1998-10-20 Amgen Inc. Eck receptor ligands
US5512591A (en) * 1993-02-18 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Treatments for diseases characterized by neovascularization
US6228879B1 (en) 1997-10-16 2001-05-08 The Children's Medical Center Methods and compositions for inhibition of angiogenesis
ES2152753B1 (es) 1993-03-29 2001-09-01 Ct Investig Energeticas Ciemat Animales transgenicos para la determinacion de agentes que estimulan o reprimen la hiperproliferacion epidermica y el crecimiento del pelo
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
GB9404270D0 (en) 1994-03-05 1994-04-20 Delta Biotechnology Ltd Yeast strains and modified albumins
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US6303769B1 (en) * 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
US5864020A (en) * 1994-07-20 1999-01-26 Genentech, Inc. HTK ligand
WO1996003043A1 (en) 1994-07-26 1996-02-08 Rutgers, The State University Of New Jersey Human brain specific kinase
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5795734A (en) 1994-09-19 1998-08-18 President And Fellows Of Harvard College EPH receptor ligands, and uses related thereto
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
AU716924B2 (en) 1994-10-27 2000-03-09 Genentech Inc. AL-1 neurotrophic factor, a ligand for an EPH related tyrosine kinase receptor
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6057124A (en) 1995-01-27 2000-05-02 Amgen Inc. Nucleic acids encoding ligands for HEK4 receptors
WO1996026958A2 (en) 1995-02-27 1996-09-06 President And Fellows Of Harvard College Eph RECEPTOR LIGAND ELF-2
GB9508538D0 (en) * 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
EP0848755B2 (en) 1995-09-08 2011-02-09 Genentech, Inc. Vegf-related protein
CN1202932A (zh) 1995-10-23 1998-12-23 儿童医学中心公司 治疗用抗血管生成的组合物和方法
US5837534A (en) * 1995-11-14 1998-11-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Smooth muscle 22α promoter, gene transfer vectors containing the same, and method of use of the same to target gene expression in arterial smooth muscle cells
AUPN727795A0 (en) 1995-12-22 1996-01-18 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A novel receptor-type tyrosine kinase and use thereof
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6465431B1 (en) 1999-11-17 2002-10-15 Boston Life Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions comprising troponin subunits, fragments and homologs thereof and methods of their use to inhibit angiogenesis
US6696557B1 (en) 1996-04-19 2004-02-24 Genentech, Inc. AL-2 neurotrophic factor nucleic acid
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US5797954A (en) 1996-05-24 1998-08-25 Shaffer; Terry M. Accessing and deaccessing tools and methods
JP2000516201A (ja) 1996-05-31 2000-12-05 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 血管形成阻害方法及び血管形成阻害に有用な組成物
WO1998001548A1 (en) 1996-07-05 1998-01-15 Mount Sinai Hospital Corporation Oligomerized receptors which affect pathways regulated by transmembrane ligands for elk-related receptor tyrosine kinases
US6573256B2 (en) 1996-12-30 2003-06-03 Bone Care International, Inc. Method of inhibiting angiogenesis using active vitamin D analogues
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
DE69829891T2 (de) 1997-04-07 2005-10-06 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-VEGF Antikörper
WO1998045708A1 (en) 1997-04-08 1998-10-15 Sugen, Inc. Study and treatment of diseases related to specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases
US6440954B1 (en) * 1997-04-18 2002-08-27 President And Fellows Of Harvard College Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation
WO1999008696A1 (en) 1997-08-19 1999-02-25 Vanderbilt University METHODS FOR DETERMINING CELL RESPONSES THROUGH EphB RECEPTORS
WO1999017796A2 (en) 1997-10-02 1999-04-15 Leukosite, Inc. Modulation of lerk-2-mediated cell adhesion
CA2316303A1 (en) 1997-12-26 1999-07-08 Masaki Nakamura Suppressing agent of angiogenesis, containing dienogest as effective ingredient
JPH11215126A (ja) 1998-01-28 1999-08-06 Sharp Corp 情報処理装置
DE69921102T2 (de) * 1998-03-05 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Verfahren zur verbesserung der serum-halbwertszeit von biologisch aktiven molekülen
US6887674B1 (en) * 1998-04-13 2005-05-03 California Institute Of Technology Artery- and vein-specific proteins and uses therefor
US6864227B1 (en) * 1998-04-13 2005-03-08 California Institute Of Technology Artery-and vein-specific proteins and uses therefor
WO1999058126A1 (en) 1998-05-11 1999-11-18 The Endowment For Research In Human Biology, Inc. Use of neomycin for treating angiogenesis-related diseases
US6413513B1 (en) 1998-05-22 2002-07-02 Entremed, Inc. Compositions and methods for inhibiting endothelial cell proliferation and regulating angiogenesis using cancer markers
US6395718B1 (en) 1998-07-06 2002-05-28 Guilford Pharmaceuticals Inc. Pharmaceutical compositions and methods of inhibiting angiogenesis using naaladase inhibitors
GB9814926D0 (en) 1998-07-09 1998-09-09 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
EP1097165A4 (en) 1998-07-13 2001-09-12 Parkash S Gill NEW INHIBITORS OF ANGIOGENESIS AND TUMOR GROWTH
WO2000003726A1 (en) 1998-07-14 2000-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Lysine binding fragments of angiostatin
WO2000010507A2 (en) 1998-08-21 2000-03-02 The Children's Medical Center Corporation Use of melanin for inhibition of angiogenesis and macular degeneration
EP0999278B1 (en) 1998-10-02 2004-03-31 Universite Paris Vii Vascular specific regulatory elements contained in the desmin 5' flanking region
AUPP674898A0 (en) 1998-10-27 1998-11-19 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A method of treatment
IL142921A0 (en) 1998-11-20 2002-04-21 Genentech Inc USES FOR Eph RECEPTOR ANTAGONISTS AND AGONISTS TO TREAT VASCULAR DISORDERS
US6462075B1 (en) 1999-12-23 2002-10-08 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Chalcone and its analogs as agents for the inhibition of angiogensis and related disease states
CA2396114A1 (en) 2000-01-06 2001-07-12 Andrew Freywald Methods of modulation of the immune system
EP1268544A2 (en) 2000-03-31 2003-01-02 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2407086A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-01 Amgen, Inc. Integrin/adhesion antagonists
US20020081284A1 (en) 2000-08-03 2002-06-27 Li Dean Y. Manipulation of arterial-venous identity
WO2002026827A1 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Novartis Ag Extracellular polypeptides of eph b receptors and ephrin b ligands and the corresponding nucleic acid molecules
ES2367891T3 (es) 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
US6548477B1 (en) 2000-11-01 2003-04-15 Praecis Pharmaceuticals Inc. Therapeutic agents and methods of use thereof for the modulation of angiogenesis
WO2002040540A2 (en) * 2000-11-20 2002-05-23 California Institute Of Technology Artery smooth muscle- and vein smooth muscle-specific proteins and uses therefor
WO2002058538A2 (en) 2001-01-26 2002-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of imaging and targeting vasculature
EP1358211A2 (en) 2001-01-31 2003-11-05 Mount Sinai Hospital Methods for regulating the kinase domain of ephb2
WO2002079382A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 President And Fellows Of Harvard College B-ephrin regulation of g-protein coupled chemoattraction; compositions and methods of use
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
WO2002102854A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
CA2633171C (en) 2001-06-20 2012-11-20 Genentech, Inc. Antibodies against tumor-associated antigenic target (tat) polypeptides
CA2452578A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 The Hospital For Sick Children Ephrin and eph receptor mediated immune modulation
US20060241027A1 (en) * 2002-02-07 2006-10-26 Hans-Peter Hauser Hiv inhibiting proteins
WO2005051307A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Medimmune, Inc. Epha2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
CA2485373A1 (en) 2002-05-10 2003-11-20 Medimmune, Inc. Epha2 monoclonal antibodies and methods of use thereof
US20040091486A1 (en) 2002-05-10 2004-05-13 Kinch Michael S. EphA2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
US20040110150A1 (en) * 2002-12-10 2004-06-10 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of Ephrin-B2 expression
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
AU2002951409A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 North Western Adelaide Health Services Methods for regulating cancer
AU2004220459B2 (en) * 2003-03-12 2010-08-05 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
KR20050120663A (ko) * 2003-03-24 2005-12-22 세쿠오이아 파마큐티컬스 인코오퍼레이티드 장기간 작용하는 생물학적 활동 컨쥬게이트들
WO2004092343A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Inc. Epha2, hypoproliferative cell disorders and epithelial and endothelial reconstitution
WO2004091375A2 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Inc. Epha2 and non-neoplastic hyperproliferative cell disorders
CA2528549A1 (en) 2003-06-06 2005-06-02 Medimmune, Inc. Use of epha4 and modulator of epha4 for diagnosis, treatment and prevention of cancer
EP1677735B1 (en) * 2003-10-17 2014-07-23 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for modulating adipocyte function
EP1730196B1 (en) * 2004-03-12 2010-12-22 Vasgene Therapeutics, Inc. Antibodies binding to ephb4 for inhibiting angiogenesis and tumor growth
JP2008506366A (ja) * 2004-05-14 2008-03-06 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド 細胞表面受容体アイソフォームならびにその同定および使用方法
ES2529451T3 (es) * 2004-09-23 2015-02-20 Vasgene Therapeutics, Inc. Compuestos polipeptídicos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral

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