JP5204036B2

JP5204036B2 - 肺炎球菌の検出方法

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Publication number: JP5204036B2
Application number: JP2009128551A
Authority: JP
Inventors: 健二松山; 勝哉渡邊; 浩志前花
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2029-05-28
Also published as: JP2010276441A

Description

本発明は、肺炎球菌の検出方法に関する。

微生物感染症の診断は通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。感染症原因菌の検出には原因菌の分離培養を経て、その生化学的性状をもとに菌の同定を行う培養同定法、原因菌特異的遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子診断法、原因菌の表面抗原マーカーとの抗体の特異反応を利用して原因菌検出を行う免疫的手法に大別できるが、培養同定法、遺伝子診断法は検出結果を得るまでに時間がかかり、短時間にしかも高感度に原因菌を検出し、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で免疫法による診断が汎用されている。従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。

肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）は、肺炎などの呼吸器の感染症や全身性感染症を引き起こす細菌であり、気道の細菌性感染症の起炎菌として重要である。従来は、肺炎球菌の多糖成分に対する抗体を用いて尿中の肺炎球菌を検出していた。しかし、非特許文献１から３などに示されているように、この検出方法は、小児では健常人を含む咽頭常在菌に起因すると思われる擬陽性率が高く、肺炎などの原因菌の診断目的のためには実用的なものではなかった。

特許文献１には、種特異的であり、かつ同一種内のすべての血清型を検出できる微生物検出用抗体とその作製法、微生物検出方法及び微生物検出用試薬キットが記載されている。特許文献１では、各種の微生物について細胞内の同一機能分子、特にリボソーム蛋白質、とりわけリボソーム蛋白質ＲｉｂｏｓｏｍａｌＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２に対する抗体を作製し、対象微生物に特異的に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて微生物を検出している。

ＷＯ００／０６６０３号公報

Clinical Infectious Diseases, 2002;34:1025-10258 Journal of Clinical Microbiology, Oct. 2004, 4853-4855 感染症学雑誌、78巻、1号、18-21、2004

上記の通り、従来報告されている肺炎球菌の夾膜多糖抗原に対する抗体を用いて尿中の肺炎球菌を検出する検査方法では、小児患者では擬陽性率が高く実用的に使用することはできなかった。即ち、小児では咽頭に肺炎球菌が８０％以上の高頻度で常在するため、肺炎患者又は気管支炎患者でなくても陽性を示すことが多かった。また、症状が治癒しても、の尿中抗原の陽性化が維持されるため、治療の効果を正しく判断することが不可能であった。上記の通り、尿中の肺炎球菌を検出する方法であって、病態との相関性・特異性が高い方法が望まれていた。即ち、本発明の課題は、肺炎球菌感染患者の尿又は血清の検体から肺炎球菌に由来する抗原蛋白質を迅速かつ簡便に侵襲的苦痛を与えることなく検出することにより、肺炎球菌により肺炎・気管支炎を罹患している患者を特異的に検出する方法を提供することである。特に、本発明の課題は、肺炎球菌による病態との相関性が高いことを特徴とする、肺炎球菌感染患者の尿又は血清の検体における肺炎球菌を検出する方法を提供することである。

本発明者らは、肺炎球菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を使用して尿又は血清中の肺炎球菌を検出することにより、肺炎球菌により肺炎・気管支炎を罹患している患者を特異的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、下記の通りである。

（１）肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することを含む、該患者の肺炎球菌に起因する病態を検査する方法。
（２）抗体がモノクローナル抗体である、（１）に記載の方法。
（３）抗体が肺炎球菌と特異的かつ選択的に反応することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体として一次抗体及び二次抗体の２種類の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体として一次抗体及び二次抗体の２種類の抗体を用い、イムノクロマトグラフィーによるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する、（４）に記載の方法。
（６）肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を測定し、該測定結果に基づいて該患者の肺中の感染菌数を評価して該患者の病態を評価する、（１）から（５）の何れかに記載の方法。

本発明の方法によれば、肺炎球菌感染患者の尿又は血清の検体から肺炎球菌に由来する抗原蛋白質を迅速かつ簡便に侵襲的苦痛を与えることなく検出することができ、これにより肺炎球菌により肺炎・気管支炎を罹患している患者を特異的に検出することができる。特に、本発明の検出方法によれば、肺中に感染した肺炎球菌数と高い相関性を有する結果を得ることができるため、肺炎球菌による病態との相関性が高い検出を行うことができる。また、本発明の方法においては、肺中の感染菌数と相関する抗原シグナルが得られることにより小児の健常患者で擬陽性を示さない可能性が極めて高いため、小児患者での肺炎球菌感染検査に使用することができる。また、抗菌薬の投与により感染菌が減少した場合、治療効果と直結した検査結果を提供することが可能であり、病態特異性の高い肺炎球菌検査を行うことができる。

図１は、マウス肺中感染菌数とELISA法により検出したStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12濃度の比較を示す。図２は、実施例で用いたイムノクロマトグラフィー装置を示す。１は基材を示し、２は標識抗体含浸部材を示し、３はクロマト展開用膜担体を示し、４は吸収用部材を示し、５は試料添加用部材を示し、６は捕捉部位を示す。

以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することを含む、該患者の肺炎球菌に起因する感染病態と相関した肺炎球菌抗原を検査する方法である。

本発明で用いる抗体は、好ましくは、肺炎球菌と特異的に反応し、肺炎球菌以外の菌と反応しないことを特徴とする。肺炎球菌以外の菌としては、以下の実施例で交差反応性を試験した表１に記載の菌を挙げることができる。

本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよいが好ましくはモノクローナル抗体であることが望ましい。また本発明の抗体は、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の全長あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作成することができる。肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の塩基配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＷＯ００／０６６０３号公報の配列番号１９及び２０に記載されている。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないが、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＲｉｂｏｓｏｍａｌＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、本発明にはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。また該蛋白質の全長またはアミノ酸５残基以上、望ましくは８残基以上の部分ペプチドをＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などと融合させたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｌａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組み換えタイプのモノクローナル抗体も作製、適用することができる。

本発明で用いる肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体は、以下の方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。

ａ）肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の遺伝子配列は公知であるため他のリボゾーム蛋白質L7/L12の遺伝子配列が公知な微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。その後、他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ選択的に反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。

抗原蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後、すでに作製、取得済であった肺炎球菌のリボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２抗体によるウェスタンブロットなどの方法により肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の溶出画分を同定しさらに精製度の高い蛋白質を得ることができる。得られた精製肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマを取得し、a）と同様に目的の微生物に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより目的の抗体を取得することができる。

前記ａ）などの方法によって取得した本発明における肺炎球菌に特異的な抗体は例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチイムノアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用することにより、肺炎球菌に特異的な検出用試薬キットを提供することができる。

肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出するためには、例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにｃａｐｔｕｒｅ抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなどの既知の免疫測定手法を利用して、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することができる。

また該検出方法において必要となる肺炎球菌からの細胞内マーカー抗原の抽出が必要な場合、その方法としては、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ツイーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による肺炎球菌細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせによりそれぞれの検出系にあった試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。

本発明においては、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する２種類の抗体を、一次抗体及び二次抗体として用いるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することが好ましい。また、上記の２種類の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイは、好ましくは、ELISA法やイムノクロマトグラフィーにより行うことができる。ELISA法によるサンドイッチイムノアッセイにおいては、例えば、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する第一の抗体は、抗原蛋白質である肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を固相あるいは液相中で捕獲するｃａｐｔｕｒｅ抗体（一次抗体）として使用することができ、また、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する第二の抗体をパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾することにより得られる酵素標識抗体を、二次抗体として使用することができる。

本発明においては、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を測定し、該測定結果に基づいて該患者の肺中の感染菌数を評価して該患者の病態を評価することができる。患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の量の測定結果と、該患者の肺中の感染菌数とが相関することは、本発明により初めて見出された知見であり、これにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することによって、該患者の肺炎球菌に起因する病態を検査することが可能になった。

本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を産生するハイブリドーマの取得
国際公開ＷＯ００／０６６０３号公報の実施例５に記載の方法に従い、同公報に記載のハイブリドーマAMSP-１〜4とは別に、新たにStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12に対する抗体を産生するREAMSP-5からREAMSP-10の6株のハイブリドーマを取得した。

実施例２：Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を産生するハイブリドーマ用いた抗体生産と酵素標識
実施例１にて取得したREAMSP-5からREAMSP-10の6株のハイブリドーマを定法に従い培養、精製しモノクローナル抗体をそれぞれ回収した。

具体的には各ハイブリドーマを種細胞増殖用培地としてウシ胎児血清（FBS）を10％添加したTIL MediaI培地（IBL社製）5mlで1〜2×10⁵個/ml程度となるように希釈し、5%CO₂、37℃、25cm²培養フラスコ中で2-3日培養した。5〜10×10⁵個/ml程度に増殖した細胞を、さらに75cm²培養フラスコ中にて同様に増殖させた後、1〜2×10⁵個/ml程度となるように同様のFBS入り培地で希釈しローラーボトル中へ250mlに継代した。5％CO₂、37℃で2-3日培養した後、さらに250mlのFBS入り清培地を追加して2〜3日間培養を継続した。5〜10×10⁵個/ml程度にまで増殖させた後、すべての細胞を回収し、同量の無血清培養用培地（ASF0104N 味の素社）に置換した。4〜7日間培養したのち培養液を回収して2500ｒｐｍ、10分間の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は、ポアサイズ0.45μmで無菌濾過し、0.1%のアジ化ソーダ添加後4℃で保存した。取得した培養上清を0.05mole/lリン酸緩衝液（pH7）で5倍希釈後Hitrap-proteinGカラム（アマシャム社製、5ml）に吸着させ、リン酸緩衝液で５ベッドボリューム分洗浄後pH2.5の０．１Mグリシン-塩酸緩衝液で溶出し、フラクションを回収して各ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得た。

精製した抗体を１次あるいは2次抗体として用いるサンドイッチ系ELISA法にて各抗体、あるいはその組み合わせのStreptococcus pneumoniae菌の検出性能の評価に供した。 ELISA法測定の2次抗体としては対象となるモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ酵素標識したものを使用した。酵素標識にはホースラディッシュパーオキシダーゼ（SigmaグレードV）を用い、結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用し、Analytical Bio-chemistry132(1983)、68-73で述べられている方法に従って行った。

実施例３：Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体のStreptococcus pneumoniae菌検出可能で他の細菌と反応しない抗体の組み合わせのELISAでの評価

実施例２で取得した6種類のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体をそれぞれサンドイッチ系ELISAにより6種類の抗体をそれぞれ1次抗体、2次抗体として組み合わされ種々の組み合わせについてELISAにてStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12との反応性を評価した。

具体的には1次抗体として評価する抗体の10μg/ml、PBS溶液100μlを９６穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し４℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μl添加し室温で1時間反応させてプロッキングした。上澄み除去後洗浄液（0.02％Tween20、PBS）で数回洗浄し、Streptococcus pneumoniaeATCC27336株培養液（約１×10⁹乗/ml）を0.5%TritonX-100、PBS にて100倍に希釈したもの（最終濃度と0.5%TritonX-100、PBS（陰性コントロール）そのものを100μl添加し室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、実施例２で示した方法によりパーオキシダーゼ標識した各種Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を2次抗体として0.02%Tween20、PBSにて最終濃度１μg/mlになるように希釈してそれぞれ100ul添加し室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温10分間反応させた後1mol/lの塩酸を100μl添加し反応を停止したのち450nmの吸光度を測定し、陰性コントロールシグナルとの差によりStreptococcus pneumoniaeを検出可能なStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体の組み合わせを評価した。また、併せてStreptococcus pneumoniae以外の主な細菌についても同様の条件にて検出試験を実施した。その結果、Streptococcus pneumoniaeを特異的に検出可能なStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体の1次抗体、2次抗体のモノクローナル抗体の組み合わせとして1次抗体REAMSP-5（REAMSP-5株の産生する抗体）と2次抗体REAMSP-8（REAMSP-8株の産生する抗体）の組みあわせが得られた。

表１にこの抗体の組み合わせのStreptococcus pneumoniaeとの反応性および他の主な細菌との反応性を示す。ここで陽性（＋）はELISAでの吸光度と陰性コントロールの吸光度の差が少なくとも0.5以上、陰性（−）は吸光度と陰性コントロールの吸光度の差が0.1以下、弱陽性（±）は0.1〜0.5の値のものをそれぞれ示す。

実施例４：Streptococcus pneumoniae感染モデルマウス実験-１の肺中感染菌数と血清中Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12蛋白質濃度の相関性比較
本実験における肺炎球菌感染モデルマウスは以下に記載の条件にて作成した。
実験にはCBA/J系統の6週齢オスのマウスを使用し、それぞれのマウスの経鼻に3E+07CFU/ml濃度の肺炎球菌を30μl接種して感染させそれぞれ感染後の日数を変えて肺中の肺炎球菌感染菌数と血清中のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12濃度を測定した。作成したStreptococcus pneumoniae感染モデルマウスの肺中に感染した肺炎球菌菌数の測定は感染させたマウスの肺を生理食塩水1ml中で破砕した上で、血液寒天培地上コロニー形成能によりカウントして算出した。尚、Streptococcus pneumoniae感染モデルマウスは同じ条件で作成したものをそれぞれの採取日について複数匹準備、作成した。ELISA法による血清中のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度の測定はStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12を標準サンプルとして用い、実施例.3に記載のELISA条件にて血清を0.5%TritonX-100、PBS にて20倍に希釈して測定、標準サンプル濃度と吸光度との相関より血清中の濃度を換算して算出した。

作成したStreptococcus pneumoniae感染モデルマウスの肺中に感染したStreptococcus pneumoniae感染菌数と同マウス血清サンプル中のELISA法（1次抗体REAMSP-5と2次抗体REAMSP-8の組みあわせ）によって測定したStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度を表２に、肺中感染菌数と測定した血清中Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の相関を示したグラフを図１に示す。

表２および図１が示すように血清中のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度は肺炎球菌感染マウスの肺中の感染菌数と非常によく正の相関を示し、血清中Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12濃度が肺中感染菌数、つまり肺炎時の感染状態と非常によく相関する診断指標として好適であることが示唆された。

実施例５：Streptococcus pneumoniae感染モデルマウス-実験-2の肺中および咽頭洗浄液中の肺炎球菌感染菌数と尿サンプルを用いたStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキット、夾膜多糖抗原測定イムノクロマトキット（Binax肺炎球菌）の挙動比較

１）マウス感染モデル構築
本実験における肺炎球菌感染モデルマウスは以下に記載の条件にて作成した。
実験にはともに7週齢オスのマウスのCBA/J系統マウス（肺炎球菌感染感受性）とCBA/N系統マウス（肺炎球菌感染抵抗性）をそれぞれ使用し、それぞれのマウスの経鼻に約1E+06CFU/ml濃度の肺炎球菌を10μl接種を数分づつ時間をかけてゆっくりと経鼻接種することにより感染させそれぞれ感染後の日数を変えて肺中の肺炎球菌感染菌数測定用の肺サンプルと咽頭洗浄液を採取し、血液寒天培地上のコロニー形成能によりカウントしてStreptococcus pneumoniaeの菌数を算出するとともに尿サンプルを採取し、多糖抗原に対する抗体を採用するイムノクロマトキットであるBinax肺炎球菌（インバーネスメディカルジャパン）とStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキットに供し尿サンプルでの両キットの陽性、陰性を目視にて判定した。尚、Streptococcus pneumoniae感染モデルマウスは同じ条件で作成したものをそれぞれの採取日について複数匹準備、作成した。作成したStreptococcus pneumoniae感染モデルマウスの肺中に感染した肺炎球菌菌数の測定は感染させたマウスの肺中の菌数は採取した肺を生理食塩水1ml中で破砕した上で、血液寒天培地上コロニー形成能によりカウントして算出した。また咽頭洗浄液はマウス咽頭を1mlの生理食塩水で洗浄した液をサンプルとし、肺の場合と同様にコロニー形成能によりカウントして算出した。

２）Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキットの構成
尿サンプル測定の比較対象として持いた多糖抗原測定イムノクロマトキットは市販の肺炎球菌尿中夾膜多糖抗原測定キットである“Binax肺炎球菌”キット（インバーネスメディカルジャパン社）を使用した。Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12抗体を採用したイムノクロマトグラフィー方式のキットの構成方法を以下に示す。

（a）金コロイド標識Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12抗体の調製
金コロイド標識するStreptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12抗体にはREAMSP-8株由来のモノクローナル抗体を使用した。BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.5を混合し、金コロイド標識する抗REAMSP-8リボソーム蛋白質L7/L12抗体100μg/mLを加え室温で5分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識抗リボソーム蛋白質L7/L12抗体（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。

（b）Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質 L7/L12抗原測定用イムノクロマトグラフィー装置の作成
図２に示されるイムノクロマトグラフィー装置を下記の手順で作成した。
（b−1）Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。
REAMSP-5株由来のStreptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12 モノクローナル抗体 1.5ｍｇ/ｍLが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/ｃｍでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％カゼイン溶液に30分、次いで0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位6とした。

（b−2）金コロイド標識抗体含浸部材
10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材2とした。
（b−3）イムノクロマトグラフィー装置の作成
上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を貼り合せた後、5mm幅に切断し、図2と同様のイムノクロマトグラフィー装置を作成した。

3）試験
イムノクロマトキットによる尿中のStreptococcus pneumoniae由来多糖抗原（Binax）とリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度の検出はそれぞれ採取したマウス尿検体をおおよそ20倍に生理食塩水で希釈したのち検出に供した。即ち市販のStreptococcus pneumoniae由来多糖抗原（Binax）キットの場合はキット仕様書に記載の方法に従い生理食塩水希釈後の尿サンプルを測定した。また、Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキットの場合は同生理食塩水希釈サンプルをさらに5倍希釈となるように添加液(ＴｒｉｔｏｎＸ-100 0．5％、ＮａＣｌ 0．2Ｍ)に加えたものを被験試料とした。そして、同被験試料120μlを上記（2）で得られたイムノクロマトグラフィー装置の試料添加用部材5にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位6で捕捉されたリボソーム蛋白質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色ラインの有無により判定した。

このようにして肺炎球菌感染抵抗性（CBA/N）、感受性（CBA/J）の2種類のマウスを用いて作成した感染モデルマウスの咽頭洗浄液および肺中の感染肺炎球菌菌数と尿をサンプルとして検出した多糖抗原検査用キットBinax肺炎球菌およびStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体により構成したイムノクロマトキットの陽性ラインの検出、目視判定結果を表３に示す。

肺炎球菌抵抗性マウスCBA/N系列（表.2網掛け表示）では咽頭へのマウス感染・定着はみられるが、肺にはほとんど感染が見られず、逆に肺炎球菌感受性マウスCBA/J系列（表３：白抜き表示）では咽頭からに肺に肺炎球菌が感染し、明らかに肺炎状態の感染モデルを形成している。これらの“咽頭常在モデル（CBA/N）”、“肺炎モデル（CBA/J）”の2種類の感染状態のモデルマウスに対して尿中夾膜多糖抗原検査用キットであるBinax肺炎球菌ではその両方で陽性を示している。したがって肺に感染がない、つまり肺感染を起こしていない、いわゆる“咽頭常在”状態でも陽性反応を示すことが示唆される。一方、抗Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマト診断キットでは、肺に対する肺炎球菌の感染が明確ないわゆる肺炎球菌性“肺炎”になっている “肺炎モデル（CBA/J）”では陽性を示したが、肺に感染がない、つまり肺感染を起こしていない状態の“咽頭常在モデル（CBA/N）”のマウスではすべて陰性となっており、興抗Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を用いた尿中蛋白質の検出が肺炎状態をより直接的かつ特異的にモニタリングする指標となることが明らかとなった。

本発明によれば、肺炎球菌リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を採用することにより、尿又は血清中の肺炎球菌抗原を肺炎病態特異的に検出することが可能である。

Claims

肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することを含む、該患者の肺炎球菌に起因する病態を検査するために肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する方法。
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
抗体が肺炎球菌と特異的かつ選択的に反応することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体として一次抗体及び二次抗体の２種類の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体として一次抗体及び二次抗体の２種類の抗体を用い、イムノクロマトグラフィーによるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する、請求項４に記載の方法。
肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を測定し、該測定結果に基づいて該患者の肺中の感染菌数を評価して該患者の病態を評価するために肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する請求項１から５の何れかに記載の方法。