JP5204036B2 - Method for detecting pneumococci - Google Patents
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Description
本発明は、肺炎球菌の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting pneumococcus.
微生物感染症の診断は通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。感染症原因菌の検出には原因菌の分離培養を経て、その生化学的性状をもとに菌の同定を行う培養同定法、原因菌特異的遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子診断法、原因菌の表面抗原マーカーとの抗体の特異反応を利用して原因菌検出を行う免疫的手法に大別できるが、培養同定法、遺伝子診断法は検出結果を得るまでに時間がかかり、短時間にしかも高感度に原因菌を検出し、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で免疫法による診断が汎用されている。従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。 Diagnosis of microbial infection is usually confirmed by detecting causative bacteria at the site of infection or by detecting antibodies against causative bacteria in serum and body fluids. In particular, this diagnosis is important in the sense that detection of the causative bacteria enables rapid treatment of the patient. Infectious disease-causing bacteria can be detected through isolation culture of the causative bacteria, culture identification method that identifies the bacteria based on its biochemical properties, amplification by PCR method etc. based on the causative bacteria-specific gene and detection It can be broadly divided into immunodiagnostic methods that detect the causative bacteria by using the specific reaction of the antibody with the surface antigen marker of the causative bacteria, but the culture identification method and the genetic diagnosis methods require time to obtain the detection results. Diagnosis by an immunological method is widely used because it detects causative bacteria with high sensitivity in a short time and leads to rapid and appropriate treatment for patients. Conventional detection of infectious disease-causing bacteria by immunization methods uses various combinations of marker antigens and antibodies depending on the species.
肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）は、肺炎などの呼吸器の感染症や全身性感染症を引き起こす細菌であり、気道の細菌性感染症の起炎菌として重要である。従来は、肺炎球菌の多糖成分に対する抗体を用いて尿中の肺炎球菌を検出していた。しかし、非特許文献１から３などに示されているように、この検出方法は、小児では健常人を含む咽頭常在菌に起因すると思われる擬陽性率が高く、肺炎などの原因菌の診断目的のためには実用的なものではなかった。 Streptococcus pneumoniae is a bacterium that causes respiratory infections and systemic infections such as pneumonia, and is important as a causative agent of bacterial infections of the respiratory tract. Conventionally, Streptococcus pneumoniae was detected in the urine using an antibody against the polysaccharide component of Streptococcus pneumoniae. However, as shown in Non-Patent Documents 1 to 3 and the like, this detection method has a high false positive rate that seems to be caused by pharyngeal resident bacteria including healthy persons in children, and is intended for diagnosis of causative bacteria such as pneumonia. For it was not practical.
特許文献１には、種特異的であり、かつ同一種内のすべての血清型を検出できる微生物検出用抗体とその作製法、微生物検出方法及び微生物検出用試薬キットが記載されている。特許文献１では、各種の微生物について細胞内の同一機能分子、特にリボソーム蛋白質、とりわけリボソーム蛋白質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を作製し、対象微生物に特異的に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて微生物を検出している。 Patent Document 1 describes a microorganism-detecting antibody that is species-specific and capable of detecting all serotypes within the same species, a method for producing the same, a microorganism-detecting method, and a microorganism-detecting reagent kit. In Patent Document 1, antibodies against the same functional molecules in cells, particularly ribosomal proteins, particularly ribosomal protein Ribosomal Protein L7 / L12 are prepared for various microorganisms, and antibodies that react specifically with the target microorganism are selected. Microorganisms are detected using this antibody.
上記の通り、従来報告されている肺炎球菌の夾膜多糖抗原に対する抗体を用いて尿中の肺炎球菌を検出する検査方法では、小児患者では擬陽性率が高く実用的に使用することはできなかった。即ち、小児では咽頭に肺炎球菌が８０％以上の高頻度で常在するため、肺炎患者又は気管支炎患者でなくても陽性を示すことが多かった。また、症状が治癒しても、の尿中抗原の陽性化が維持されるため、治療の効果を正しく判断することが不可能であった。上記の通り、尿中の肺炎球菌を検出する方法であって、病態との相関性・特異性が高い方法が望まれていた。即ち、本発明の課題は、肺炎球菌感染患者の尿又は血清の検体から肺炎球菌に由来する抗原蛋白質を迅速かつ簡便に侵襲的苦痛を与えることなく検出することにより、肺炎球菌により肺炎・気管支炎を罹患している患者を特異的に検出する方法を提供することである。特に、本発明の課題は、肺炎球菌による病態との相関性が高いことを特徴とする、肺炎球菌感染患者の尿又は血清の検体における肺炎球菌を検出する方法を提供することである。 As described above, the conventionally reported test method for detecting pneumococci in urine using an antibody against capsular polysaccharide antigen of pneumococci has a high false positive rate in pediatric patients and could not be used practically. . That is, pneumococci are frequently present in the pharynx at a high frequency of 80% or more in children, and thus, even if they are not pneumonia patients or bronchitis patients, they are often positive. In addition, even if the symptoms are cured, urinary antigen positivity is maintained, so that it is impossible to correctly determine the effect of treatment. As described above, a method for detecting pneumococci in urine and having a high correlation and specificity with a disease state has been desired. That is, an object of the present invention is to detect pneumoniae-derived antigenic proteins from urine or serum samples of patients with pneumococcal infection quickly and easily without causing invasive pain. It is to provide a method for specifically detecting a patient suffering from. In particular, an object of the present invention is to provide a method for detecting pneumococci in a urine or serum sample of a pneumococcal infection patient, which is highly correlated with a pathological condition caused by pneumococci.
本発明者らは、肺炎球菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を使用して尿又は血清中の肺炎球菌を検出することにより、肺炎球菌により肺炎・気管支炎を罹患している患者を特異的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、下記の通りである。 The present inventors specifically detected patients suffering from pneumonia and bronchitis due to pneumococci by detecting pneumococci in urine or serum using an antibody against the ribosomal protein L7 / L12 of pneumococci. The inventors have found that it can be detected, and have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
（１） 肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することを含む、該患者の肺炎球菌に起因する病態を検査する方法。
（２） 抗体がモノクローナル抗体である、（１）に記載の方法。
（３） 抗体が肺炎球菌と特異的かつ選択的に反応することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体として一次抗体及び二次抗体の２種類の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５） 肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体として一次抗体及び二次抗体の２種類の抗体を用い、イムノクロマトグラフィーによるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出する、（４）に記載の方法。
（６） 肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を測定し、該測定結果に基づいて該患者の肺中の感染菌数を評価して該患者の病態を評価する、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
(1) A method for examining a pathological condition caused by Streptococcus pneumoniae in a patient, comprising detecting Streptococcus pneumoniae ribosome protein L7 / L12 in a patient's urine or serum using an antibody against Streptococcus pneumoniae ribosome protein L7 / L12 .
(2) The method according to (1), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the antibody reacts specifically and selectively with pneumococci.
(4) The pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 is detected in the urine or serum of a patient by sandwich immunoassay using two types of antibodies, a primary antibody and a secondary antibody, as antibodies against pneumococcal ribosomal protein L7 / L12. ) To (3).
(5) Detection of pneumococcal ribosome protein L7 / L12 in urine or serum of patients by sandwich immunoassay using two types of antibodies, primary antibody and secondary antibody, as antibodies against pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 The method according to (4).
(6) Using an antibody against pneumococcal ribosomal protein L7 / L12, pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 in the patient's urine or serum is measured, and the number of infectious bacteria in the patient's lung is determined based on the measurement result. The method according to any one of (1) to (5), wherein the disease state of the patient is evaluated by evaluation.
本発明の方法によれば、肺炎球菌感染患者の尿又は血清の検体から肺炎球菌に由来する抗原蛋白質を迅速かつ簡便に侵襲的苦痛を与えることなく検出することができ、これにより肺炎球菌により肺炎・気管支炎を罹患している患者を特異的に検出することができる。特に、本発明の検出方法によれば、肺中に感染した肺炎球菌数と高い相関性を有する結果を得ることができるため、肺炎球菌による病態との相関性が高い検出を行うことができる。また、本発明の方法においては、肺中の感染菌数と相関する抗原シグナルが得られることにより小児の健常患者で擬陽性を示さない可能性が極めて高いため、小児患者での肺炎球菌感染検査に使用することができる。また、抗菌薬の投与により感染菌が減少した場合、治療効果と直結した検査結果を提供することが可能であり、病態特異性の高い肺炎球菌検査を行うことができる。 According to the method of the present invention, an antigenic protein derived from pneumococci can be detected from urine or serum samples of pneumococcal infection patients quickly and easily without causing invasive pain.・ Patients suffering from bronchitis can be specifically detected. In particular, according to the detection method of the present invention, a result highly correlated with the number of Streptococcus pneumoniae infected in the lung can be obtained, so that detection highly correlated with the pathological condition caused by Streptococcus pneumoniae can be performed. Further, in the method of the present invention, since it is highly possible that an antigen signal correlating with the number of infectious bacteria in the lung is obtained, it is highly probable not to show false positives in pediatric healthy patients. Can be used. In addition, when the number of infectious bacteria is reduced by administration of antibacterial drugs, it is possible to provide a test result directly linked to the therapeutic effect, and a pneumococcal test with high pathological condition can be performed.
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することを含む、該患者の肺炎球菌に起因する感染病態と相関した肺炎球菌抗原を検査する方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The present invention results from pneumococci of a patient comprising detecting Streptococcus pneumoniae ribosome protein L7 / L12 in a patient's urine or serum using an antibody against Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12. This is a method for examining a pneumococcal antigen correlated with an infectious condition.
本発明で用いる抗体は、好ましくは、肺炎球菌と特異的に反応し、肺炎球菌以外の菌と反応しないことを特徴とする。肺炎球菌以外の菌としては、以下の実施例で交差反応性を試験した表１に記載の菌を挙げることができる。 The antibody used in the present invention is preferably characterized in that it specifically reacts with pneumococci and does not react with bacteria other than pneumococci. Examples of the bacteria other than pneumococci include the bacteria described in Table 1 which were tested for cross-reactivity in the following examples.
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよいが好ましくはモノクローナル抗体であることが望ましい。また本発明の抗体は、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の全長あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作成することができる。肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の塩基配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＷＯ００／０６６０３号公報の配列番号１９及び２０に記載されている。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないが、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、本発明にはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。また該蛋白質の全長またはアミノ酸５残基以上、望ましくは８残基以上の部分ペプチドをＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などと融合させたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組み換えタイプのモノクローナル抗体も作製、適用することができる。 The antibody used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody. The antibody of the present invention can be prepared using the full length of pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as an antigen. The base sequence and amino acid sequence of pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 are known, and are described, for example, in SEQ ID NOs: 19 and 20 of WO00 / 06603. The length of the peptide for producing the antibody is not particularly limited, but in the case of an antibody against pneumococcal ribosome protein L7 / L12, it is sufficient that the protein has a characteristic length, preferably 5 amino acids or more, particularly preferably A peptide having 8 or more amino acids may be used. This peptide or full-length protein is directly or after cross-linking with a carrier protein such as KLH (keyhole-limpet hemocyanin) or BSA (bovine serum albumin) and then inoculated to an animal together with an adjuvant as necessary, and then the serum is collected to recover the ribosomal protein. An antiserum containing an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the L7 / L12 protein can be obtained. Further, the antibody can be purified from the antiserum and used. The animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep, rabbits and the like are particularly preferable for producing polyclonal antibodies. In the present invention, it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing hybridoma cells. In this case, a mouse is preferable. The full length of the protein or a partial peptide of 5 or more amino acids, preferably 8 or more residues, fused with GST (glutathione-S-transferase) or the like is purified or used as an antigen without purification. You can also. Gene recombination expressed in cells using immunoglobulin genes isolated by various methods and gene cloning methods shown in the literature (Antibodies a laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory) Types of monoclonal antibodies can also be made and applied.
本発明で用いる肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体は、以下の方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。 Although the antibody with respect to the pneumococcal ribosome protein L7 / L12 protein used by this invention can be acquired by the following method or other similar methods, it is not limited to these methods.
ａ）肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の遺伝子配列は公知であるため他のリボゾーム蛋白質L7/L12の遺伝子配列が公知な微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。その後、他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ選択的に反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。 a) Since the gene sequence of pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 is known, the number of amino acids in the region where the gene sequence of other ribosomal protein L7 / L12 is less similar to the amino acid sequence of the protein in known microorganisms is 5 The target antibody can be obtained by synthesizing about 30 peptide fragments and preparing a monoclonal antibody using the peptide fragment as an immunogen. In addition, the full-length sequence of the gene can be obtained by using conventional gene manipulation techniques such as gene amplification by PCR techniques using DNA sequences at both ends of the known gene as probes, and hybridization methods using homologous partial sequences as template probes. can do. Then, construct a fusion gene with other protein genes, insert the corresponding fusion gene into the host by a known gene transfer method using E. coli etc. as the host, and express it in large quantities, and then antibody affinity for the protein used as the fusion protein The target protein antigen can be obtained by purifying the expressed protein by a column method or the like. In this case, since the full-length protein of pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 serves as an antigen, obtaining an antibody against the amino acid portion conserved among microorganisms does not meet the purpose of the present invention. Therefore, for the antigen obtained by this method, a hybridoma that produces a monoclonal antibody is obtained by a known technique, and a target antibody is selected by selecting a clone that produces an antibody that selectively reacts only with the corresponding microorganism. Can be acquired.
抗原蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後、すでに作製、取得済であった肺炎球菌のリボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２抗体によるウェスタンブロットなどの方法により肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の溶出画分を同定しさらに精製度の高い蛋白質を得ることができる。得られた精製肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマを取得し、a）と同様に目的の微生物に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより目的の抗体を取得することができる。 If the degree of purification of the antigen protein is insufficient, it is purified by known methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, etc., and then the ribosomal protein of Streptococcus pneumoniae already prepared and obtained An elution fraction of pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 can be identified by a method such as Western blotting using L7 / L12 antibody, and a protein with a higher degree of purification can be obtained. Based on the obtained purified pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 antigen, a hybridoma is obtained by a known method, and a hybridoma that produces an antibody that specifically reacts with the target microorganism is selected in the same manner as in a). Antibodies can be obtained.
前記ａ）などの方法によって取得した本発明における肺炎球菌に特異的な抗体は例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチイムノアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用することにより、肺炎球菌に特異的な検出用試薬キットを提供することができる。 The antibody specific for pneumococci in the present invention obtained by the method such as a) is, for example, an agglutination reaction in which the antibody is adsorbed on polystyrene latex particles, an ELISA method which is a known technique performed in a microtiter plate, Used for all known immunoassay methods such as immunochromatography, sandwich immunoassay using colored particles or particles having color developing ability, or magnetic microparticles coated with capture antibodies together with the antibodies labeled with enzymes or phosphors. Thus, a reagent kit for detection specific to pneumococci can be provided.
肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出するためには、例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにｃａｐｔｕｒｅ抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなどの既知の免疫測定手法を利用して、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することができる。 In order to detect pneumococcal ribosome protein L7 / L12 in urine or serum of a patient using an antibody against pneumococcal ribosome protein L7 / L12, for example, an agglutination reaction in which the antibody is adsorbed on polystyrene latex particles, A sandwich assay using ELISA, which is a well-known technique performed in a titer plate, an existing immunochromatography method, colored particles or particles having color developing ability, or magnetic particles coated with a capture antibody together with the antibody labeled with an enzyme or a phosphor The pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 can be detected in the urine or serum of a patient using known immunoassay techniques such as
また該検出方法において必要となる肺炎球菌からの細胞内マーカー抗原の抽出が必要な場合、その方法としては、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ツイーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による肺炎球菌細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせによりそれぞれの検出系にあった試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。 When extraction of intracellular marker antigens from pneumococci required in the detection method is necessary, the method includes Triton X-100 (Triton X-100), Tween-20 (Tween-20) and the like. However, known cell structure disruption methods can be used, such as treatment with extraction reagents using various surfactants, enzyme treatment using enzymes such as appropriate proteases, and disruption of pneumococcal cells by physical methods. It is desirable to set optimum extraction conditions with reagents suitable for each detection system by combining surfactants and the like.
本発明においては、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する２種類の抗体を、一次抗体及び二次抗体として用いるサンドイッチイムノアッセイにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することが好ましい。また、上記の２種類の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイは、好ましくは、ELISA法やイムノクロマトグラフィーにより行うことができる。ELISA法によるサンドイッチイムノアッセイにおいては、例えば、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する第一の抗体は、抗原蛋白質である肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を固相あるいは液相中で捕獲するｃａｐｔｕｒｅ抗体（一次抗体）として使用することができ、また、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する第二の抗体をパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾することにより得られる酵素標識抗体を、二次抗体として使用することができる。 In the present invention, pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 can be detected in urine or serum of a patient by sandwich immunoassay using two types of antibodies against pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 as primary and secondary antibodies. preferable. In addition, the sandwich immunoassay using the above-mentioned two kinds of antibodies can be preferably performed by ELISA or immunochromatography. In a sandwich immunoassay by ELISA, for example, the first antibody against pneumococcal ribosome protein L7 / L12 is a capture antibody (primary antibody) that captures pneumococcal ribosomal protein L7 / L12, which is an antigenic protein, in a solid phase or liquid phase. In addition, an enzyme-labeled antibody obtained by modifying a second antibody against pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase by a known method is used as a secondary antibody. Can be used as
本発明においては、肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を測定し、該測定結果に基づいて該患者の肺中の感染菌数を評価して該患者の病態を評価することができる。患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２の量の測定結果と、該患者の肺中の感染菌数とが相関することは、本発明により初めて見出された知見であり、これにより、患者の尿又は血清中の肺炎球菌リボゾーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を検出することによって、該患者の肺炎球菌に起因する病態を検査することが可能になった。 In the present invention, Streptococcus pneumoniae ribosome protein L7 / L12 in a patient's urine or serum is measured using an antibody against pneumococcal ribosome protein L7 / L12, and an infectious bacterium in the lung of the patient is measured based on the measurement result. The number can be evaluated to assess the patient's condition. Correlation between the measurement result of the amount of pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 in the urine or serum of a patient and the number of infectious bacteria in the lung of the patient is a finding found for the first time by the present invention. By detecting pneumococcal ribosomal protein L7 / L12 in the patient's urine or serum, it became possible to examine the pathological condition caused by pneumococci of the patient.
本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１：Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を産生するハイブリドーマの取得
国際公開ＷＯ００／０６６０３号公報の実施例５に記載の方法に従い、同公報に記載のハイブリドーマAMSP-１〜4とは別に、新たにStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12に対する抗体を産生するREAMSP-5からREAMSP-10の6株のハイブリドーマを取得した。
Example 1: Obtaining a hybridoma producing Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody According to the method described in Example 5 of International Publication WO00 / 06603, apart from the hybridoma AMSP-1 to 4 described in the same publication, Six hybridomas from REAMSP-5 to REAMSP-10 that newly produce antibodies against Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 were obtained.
実施例２：Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を産生するハイブリドーマ用いた抗体生産と酵素標識
実施例１にて取得したREAMSP-5からREAMSP-10の6株のハイブリドーマを定法に従い培養、精製しモノクローナル抗体をそれぞれ回収した。
Example 2: Antibody production and enzyme labeling using a hybridoma producing Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody Six hybridomas of REAMSP-5 to REAMSP-10 obtained in Example 1 were cultured, purified and monoclonalized. Each antibody was collected.
具体的には各ハイブリドーマを種細胞増殖用培地としてウシ胎児血清（FBS）を10％添加したTIL MediaI培地（IBL社製）5mlで1〜2×105個/ml程度となるように希釈し、5%CO2、37℃、25cm2培養フラスコ中で2-3日培養した。5〜10×105個/ml程度に増殖した細胞を、さらに75cm2培養フラスコ中にて同様に増殖させた後、1〜2×105個/ml程度となるように同様のFBS入り培地で希釈しローラーボトル中へ250mlに継代した。5％CO2、37℃で2-3日培養した後、さらに250mlのFBS入り清培地を追加して2〜3日間培養を継続した。5〜10×105個/ml程度にまで増殖させた後、すべての細胞を回収し、同量の無血清培養用培地（ASF0104N 味の素社）に置換した。4〜7日間培養したのち培養液を回収して2500ｒｐｍ、10分間の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は、ポアサイズ0.45μmで無菌濾過し、0.1%のアジ化ソーダ添加後4℃で保存した。取得した培養上清を0.05mole/lリン酸緩衝液（pH7）で5倍希釈後Hitrap-proteinGカラム（アマシャム社製、5ml）に吸着させ、リン酸緩衝液で５ベッドボリューム分洗浄後pH2.5の０．１Mグリシン-塩酸緩衝液で溶出し、フラクションを回収して各ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得た。 Specifically, each hybridoma is diluted with seed medium growth medium with 10% of fetal bovine serum (FBS) in 5 ml of TIL MediaI medium (IBL) to be about 1 to 2 × 10 5 cells / ml. The cells were cultured for 2-3 days in a 25 cm 2 culture flask at 37 ° C., 5% CO 2 . After the cells grown to about 5-10 × 10 5 cells / ml are further grown in the same manner in a 75 cm 2 culture flask, the same medium containing FBS so that the cell volume is about 1-2 × 10 5 cells / ml. Diluted to 250 ml into roller bottles. After culturing for 2-3 days at 37 ° C. with 5% CO 2 , 250 ml of FBS-containing clear medium was further added, and culturing was continued for 2 to 3 days. After growing to about 5-10 × 10 5 cells / ml, all cells were collected and replaced with the same amount of serum-free culture medium (ASF0104N Ajinomoto Co., Inc.). After culturing for 4 to 7 days, the culture solution was collected, and a culture supernatant containing the target antibody was obtained by centrifugation at 2500 rpm for 10 minutes. The culture supernatant was aseptically filtered with a pore size of 0.45 μm, and stored at 4 ° C. after addition of 0.1% sodium azide. The obtained culture supernatant is diluted 5-fold with 0.05 mole / l phosphate buffer (pH 7), adsorbed on a Hitrap-protein G column (Amersham, 5 ml), washed with phosphate buffer for 5 bed volumes, pH 2. Elution was performed with 5 0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer, and fractions were collected to obtain monoclonal antibodies produced by each hybridoma.
精製した抗体を１次あるいは2次抗体として用いるサンドイッチ系ELISA法にて各抗体、あるいはその組み合わせのStreptococcus pneumoniae菌の検出性能の評価に供した。 ELISA法測定の2次抗体としては対象となるモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ酵素標識したものを使用した。酵素標識にはホースラディッシュパーオキシダーゼ（SigmaグレードV）を用い、結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用し、Analytical Bio-chemistry132(1983)、68-73で述べられている方法に従って行った。 Each antibody or a combination thereof was subjected to evaluation of the detection performance of Streptococcus pneumoniae bacteria by sandwich ELISA using the purified antibody as a primary or secondary antibody. As a secondary antibody for ELISA measurement, a target monoclonal antibody labeled with a peroxidase enzyme was used. Enzyme labeling uses horseradish peroxidase (Sigma grade V) and conjugation uses the reagent S-acetylthioacetic acid N-hydroxysuccinimide, according to the method described in Analytical Bio-chemistry 132 (1983), 68-73. went.
実施例３：Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体のStreptococcus pneumoniae菌検出可能で他の細菌と反応しない抗体の組み合わせのELISAでの評価 Example 3: Evaluation of Streptococcus pneumoniae Ribosomal Protein L7 / L12 Antibody Combination of Antibodies that Detect Streptococcus pneumoniae and Does Not React with Other Bacteria by ELISA
実施例２で取得した6種類のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体をそれぞれサンドイッチ系ELISAにより6種類の抗体をそれぞれ1次抗体、2次抗体として組み合わされ種々の組み合わせについてELISAにてStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12との反応性を評価した。 Six types of Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibodies obtained in Example 2 were combined as a primary antibody and a secondary antibody, respectively, by sandwich ELISA and 6 different antibodies were combined as Streptococcus pneumoniae ribosomal proteins. Reactivity with L7 / L12 was evaluated.
具体的には1次抗体として評価する抗体の10μg/ml、PBS溶液100μlを９６穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し４℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μl添加し室温で1時間反応させてプロッキングした。上澄み除去後洗浄液（0.02％Tween20、PBS）で数回洗浄し、Streptococcus pneumoniaeATCC27336株培養液（約１×109乗/ml）を0.5%TritonX-100、PBS にて100倍に希釈したもの（最終濃度と0.5%TritonX-100、PBS（陰性コントロール）そのものを100μl添加し 室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、実施例２で示した方法によりパーオキシダーゼ標識した各種Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を2次抗体として0.02%Tween20、PBSにて最終濃度１μg/mlになるように希釈してそれぞれ100ul添加し室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温10分間反応させた後1mol/lの塩酸を100μl添加し反応を停止したのち450nmの吸光度を測定し、陰性コントロールシグナルとの差によりStreptococcus pneumoniaeを検出可能なStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体の組み合わせを評価した。また、併せてStreptococcus pneumoniae以外の主な細菌についても同様の条件にて検出試験を実施した。その結果、Streptococcus pneumoniaeを特異的に検出可能なStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体の1次抗体、2次抗体のモノクローナル抗体の組み合わせとして1次抗体REAMSP-5（REAMSP-5株の産生する抗体）と2次抗体REAMSP-8（REAMSP-8株の産生する抗体）の組みあわせが得られた。 Specifically, 10 μg / ml of an antibody to be evaluated as a primary antibody and 100 μl of PBS solution were dispensed into a 96-well ELISA plate (Nunc Maxsorp ELISA plate) and adsorbed overnight at 4 ° C. After removing the supernatant, 200 μl of a 1% bovine serum albumin solution (in PBS) was added and reacted at room temperature for 1 hour for blocking. After removing the supernatant, it was washed several times with a washing solution (0.02% Tween20, PBS), and the Streptococcus pneumoniae ATCC27336 strain culture solution (about 1 × 10 9 power / ml) diluted 100-fold with 0.5% TritonX-100, PBS (final) Concentration, 0.5% TritonX-100 and 100 μl of PBS (negative control) itself were added and reacted at room temperature for 1 hour, and after removing the supernatant, various Streptococcus pneumoniae ribosomal proteins L7 labeled with peroxidase by the method described in Example 2 were used. / L12 antibody as a secondary antibody was diluted with 0.02% Tween20 and PBS to a final concentration of 1 μg / ml, 100 ul each was added and allowed to react for 1 hour at room temperature. After that, add 100 µl of TMB solution (KPL), react for 10 minutes at room temperature, add 100 µl of 1 mol / l hydrochloric acid, stop the reaction, measure the absorbance at 450 nm, and determine the difference from the negative control signal by Streptococcus pneumoniae Can be detected The combination of L7 / L12 antibody of Streptococcus pneumoniae was evaluated, and the detection test was carried out under the same conditions for the main bacteria other than Streptococcus pneumoniae, so that Streptococcus pneumoniae could be detected specifically. Streptococcus pneumoniae Ribosome protein L7 / L12 antibody primary antibody, secondary antibody monoclonal antibody combination as a combination of primary antibody REAMSP-5 (antibody produced by REAMSP-5 strain) and secondary antibody REAMSP-8 (REAMSP-8 A combination of antibodies produced by the strain was obtained.
表１にこの抗体の組み合わせのStreptococcus pneumoniaeとの反応性および他の主な細菌との反応性を示す。 ここで陽性（＋）はELISAでの吸光度と陰性コントロールの吸光度の差が少なくとも0.5以上、陰性（−）は吸光度と陰性コントロールの吸光度の差が0.1以下、弱陽性（±）は0.1〜0.5の値のものをそれぞれ示す。 Table 1 shows the reactivity of this antibody combination with Streptococcus pneumoniae and the reactivity with other major bacteria. Here, positive (+) is at least 0.5 or more difference in absorbance between ELISA and negative control, negative (−) is less than 0.1 difference between absorbance and negative control, and weak positive (±) is 0.1 to 0.5 Each of the values is shown.
実施例４：Streptococcus pneumoniae感染モデルマウス実験-１の肺中感染菌数と血清中Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12蛋白質濃度の相関性比較
本実験における肺炎球菌感染モデルマウスは以下に記載の条件にて作成した。
実験にはCBA/J系統の6週齢オスのマウスを使用し、それぞれのマウスの経鼻に3E+07CFU/ml濃度の肺炎球菌を30μl接種して感染させ それぞれ感染後の日数を変えて肺中の肺炎球菌感染菌数と血清中のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12濃度を測定した。作成したStreptococcus pneumoniae感染モデルマウスの肺中に感染した肺炎球菌菌数の測定は感染させたマウスの肺を生理食塩水1ml中で破砕した上で、血液寒天培地上コロニー形成能によりカウントして算出した。 尚、Streptococcus pneumoniae感染モデルマウスは同じ条件で作成したものをそれぞれの採取日について複数匹準備、作成した。ELISA法による血清中のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度の測定はStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12を標準サンプルとして用い、実施例.3に記載のELISA条件にて血清を0.5%TritonX-100、PBS にて20倍に希釈して測定、標準サンプル濃度と吸光度との相関より血清中の濃度を換算して算出した。
Example 4: Streptococcus pneumoniae infection model mouse experiment-1 Correlation comparison between the number of bacterial infections in the lung and serum Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 protein concentration The pneumococcal infection model mice in this experiment were as described below. Created.
In the experiment, CBA / J 6-week-old male mice were used, and each mouse was inoculated with 30 μl of 3E + 07 CFU / ml of Streptococcus pneumoniae to infect the lungs after changing the number of days after infection. The number of Streptococcus pneumoniae infections and the serum Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 concentration were measured. The number of Streptococcus pneumoniae infections in the lungs of the prepared Streptococcus pneumoniae infection model mice was calculated by crushing the lungs of the infected mice in 1 ml of physiological saline and counting them by colony forming ability on blood agar medium. did. In addition, Streptococcus pneumoniae infection model mice were prepared under the same conditions, and a plurality of mice were prepared for each collection date. The concentration of Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 in the serum by ELISA was measured using Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 as a standard sample. Measurement was performed by diluting 20 times with PBS, and the serum concentration was calculated from the correlation between the standard sample concentration and the absorbance.
作成したStreptococcus pneumoniae感染モデルマウスの肺中に感染したStreptococcus pneumoniae感染菌数と同マウス血清サンプル中のELISA法（1次抗体REAMSP-5と2次抗体REAMSP-8の組みあわせ）によって測定したStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度を表２に、肺中感染菌数と測定した血清中Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の相関を示したグラフを図１に示す。 Streptococcus pneumoniae number of Streptococcus pneumoniae infection model mice prepared by Streptococcus pneumoniae infection in the lungs and ELISA method in the mouse serum sample (combination of primary antibody REAMSP-5 and secondary antibody REAMSP-8) The concentration of ribosomal protein L7 / L12 is shown in Table 2, and a graph showing the correlation between the number of infectious bacteria in the lung and the measured Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 is shown in FIG.
表２および図１が示すように血清中のStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度は 肺炎球菌感染マウスの肺中の感染菌数と非常によく正の相関を示し、血清中Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12濃度が肺中感染菌数、つまり肺炎時の感染状態と非常によく相関する診断指標として好適であることが示唆された。 As shown in Table 2 and FIG. 1, the concentration of Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 in serum is very well positively correlated with the number of infectious bacteria in the lung of pneumococcal mice, and the serum Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 It was suggested that the / L12 concentration is suitable as a diagnostic index that correlates very well with the number of bacterial infections in the lung, that is, the infection state during pneumonia.
実施例５：Streptococcus pneumoniae感染モデルマウス-実験-2の肺中および咽頭洗浄液中の肺炎球菌感染菌数と尿サンプルを用いたStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキット、夾膜多糖抗原測定イムノクロマトキット（Binax肺炎球菌）の挙動比較 Example 5: Streptococcus pneumoniae-infected model mouse-Immunochromatography kit employing Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody using the number of pneumococcal infections and urine samples in the lung and pharyngeal lavage fluid of Experiment-2, capsular polysaccharide antigen Comparison of behavior of immunochromatography kit (Binax pneumococci)
１）マウス感染モデル構築
本実験における肺炎球菌感染モデルマウスは以下に記載の条件にて作成した。
実験にはともに7週齢オスのマウスのCBA/J系統マウス（肺炎球菌感染感受性）とCBA/N系統マウス（肺炎球菌感染抵抗性）をそれぞれ使用し、それぞれのマウスの経鼻に約1E+06CFU/ml濃度の肺炎球菌を10μl接種を数分づつ時間をかけてゆっくりと経鼻接種することにより感染させ それぞれ感染後の日数を変えて肺中の肺炎球菌感染菌数測定用の肺サンプルと咽頭洗浄液を採取し、血液寒天培地上のコロニー形成能によりカウントしてStreptococcus pneumoniaeの菌数を算出するとともに 尿サンプルを採取し、多糖抗原に対する抗体を採用するイムノクロマトキットであるBinax肺炎球菌（インバーネス メディカル ジャパン）とStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキットに供し 尿サンプルでの両キットの陽性、陰性を目視にて判定した。 尚、Streptococcus pneumoniae感染モデルマウスは同じ条件で作成したものをそれぞれの採取日について複数匹準備、作成した。 作成したStreptococcus pneumoniae感染モデルマウスの肺中に感染した肺炎球菌菌数の測定は感染させたマウスの肺中の菌数は採取した肺を生理食塩水1ml中で破砕した上で、血液寒天培地上コロニー形成能によりカウントして算出した。また咽頭洗浄液はマウス咽頭を1mlの生理食塩水で洗浄した液をサンプルとし、肺の場合と同様にコロニー形成能によりカウントして算出した。
1) Construction of mouse infection model A pneumococcal infection model mouse in this experiment was prepared under the conditions described below.
Both 7-week-old male mice, CBA / J strains (susceptibility to pneumococcal infection) and CBA / N strains (resistance to pneumococcal infection), were used for each experiment. Inoculate with 10 μl of pneumococci at a concentration of 06 CFU / ml by nasal inoculation slowly over several minutes, changing the number of days after infection and lung samples for measuring the number of pneumococcal infections in the lung The pharyngeal lavage fluid is collected, counted by colony-forming ability on blood agar medium, and the number of Streptococcus pneumoniae bacteria is calculated. A urine sample is collected, and Binax pneumococci (Inverness Medical) is an immunochromatography kit that employs antibodies against polysaccharide antigens. Japan) and Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody immunochromatography kits were used. It was determined Te. In addition, Streptococcus pneumoniae infection model mice were prepared under the same conditions, and a plurality of mice were prepared for each collection date. The number of Streptococcus pneumoniae infections in the lungs of the prepared Streptococcus pneumoniae model mice was measured by crushing the collected lungs in 1 ml of physiological saline and then on the blood agar medium. Counting was performed based on the colony forming ability. The pharyngeal lavage fluid was calculated by counting the colony-forming ability in the same manner as in the case of the lung, using a solution obtained by washing the mouse pharynx with 1 ml of physiological saline.
２）Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキットの構成
尿サンプル測定の比較対象として持いた多糖抗原測定イムノクロマトキットは市販の肺炎球菌尿中夾膜多糖抗原測定キットである“Binax肺炎球菌”キット（インバーネスメディカルジャパン社）を使用した。Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12抗体を採用したイムノクロマトグラフィー方式のキットの構成方法を以下に示す。
2) Structure of immunochromatography kit employing Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody Polysaccharide antigen measurement immunochromatography kit as a comparison target for urine sample measurement is "Binax pneumococci" which is a commercially available pneumococcal urinary capsular polysaccharide antigen measurement kit "Kit (Inverness Medical Japan) was used. The construction method of an immunochromatographic kit employing Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody is shown below.
（a）金コロイド標識Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12抗体の調製
金コロイド標識するStreptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12抗体にはREAMSP-8株由来のモノクローナル抗体を使用した。BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.5を混合し、金コロイド標識する抗REAMSP-8リボソーム蛋白質L7/L12抗体100μg/mLを加え室温で5分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識抗リボソーム蛋白質L7/L12抗体（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
(A) Preparation of colloidal gold-labeled Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody A monoclonal antibody derived from the REAMSP-8 strain was used as the colloidal gold-labeled Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody. Add 0.1M potassium phosphate pH7.5 to 0.9mL of colloidal gold solution (particle size 60nm) manufactured by BBInternational, add 100μg / mL of anti-REAMSP-8 ribosomal protein L7 / L12 antibody labeled with colloidal gold, and let stand for 5 minutes at room temperature. Place the antibody on the gold colloid particle surface, add 10% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution so that the final concentration in the gold colloid solution is 1%, After blocking with BSA, a gold colloid-labeled anti-ribosomal protein L7 / L12 antibody (hereinafter referred to as “gold colloid-labeled antibody”) solution was prepared. This solution was centrifuged (15000 × rpm, 5 minutes) to precipitate the colloidal gold labeled antibody, and the supernatant was removed to obtain a colloidal gold labeled antibody. The colloidal gold labeled antibody was suspended in 20 mm Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 0.25% BSA, 2.5% sucrose and 35 mm NaCl to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.
（b）Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質 L7/L12抗原測定用イムノクロマトグラフィー装置の作成
図２に示されるイムノクロマトグラフィー装置を下記の手順で作成した。
（b−1）Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。
REAMSP-5株由来のStreptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質L7/L12 モノクローナル抗体 1.5ｍｇ/ｍLが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/ｃｍでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％カゼイン溶液に30分、次いで0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。Streptococcus pneumoniaeリボソーム蛋白質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位6とした。
(B) Creation of Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antigen immunochromatography apparatus The immunochromatography apparatus shown in Fig. 2 was prepared by the following procedure.
(B-1) Streptococcus pneumoniae ribosomal protein Capture site of complex of L7 / L12 antigen and colloidal gold labeled antibody A nitrocellulose membrane having a width of 25 mm and a length of 300 mm was prepared as a
A solution containing 1.5 mg / mL of Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 monoclonal antibody derived from REAMSP-5 strain was added at 1 μL / cm at a position 10 mm from the end of the chromatographic development starting point side in the
（b−2）金コロイド標識抗体含浸部材
10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材2とした。
（b−3）イムノクロマトグラフィー装置の作成
上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を貼り合せた後、5mm幅に切断し、図2と同様のイムノクロマトグラフィー装置を作成した。
(B-2) Colloidal gold labeled antibody impregnated member
A 10 mm × 300 mm belt-shaped glass fiber pad was impregnated with 2 mL of the colloidal gold labeled antibody solution, and this was dried under reduced pressure at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 2.
(B-3) Preparation of immunochromatography apparatus In addition to the
3）試験
イムノクロマトキットによる尿中のStreptococcus pneumoniae由来多糖抗原（Binax）とリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12の濃度の検出はそれぞれ採取したマウス尿検体をおおよそ20倍に生理食塩水で希釈したのち検出に供した。 即ち市販のStreptococcus pneumoniae由来多糖抗原（Binax）キットの場合はキット仕様書に記載の方法に従い生理食塩水希釈後の尿サンプルを測定した。また、Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマトキットの場合は同生理食塩水希釈サンプルをさらに5倍希釈となるように添加液(ＴｒｉｔｏｎＸ-100 0．5％、ＮａＣｌ 0．2Ｍ)に加えたものを被験試料とした。そして、同被験試料120μlを上記（2）で得られたイムノクロマトグラフィー装置の試料添加用部材5にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位6で捕捉されたリボソーム蛋白質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色ラインの有無により判定した。
3) Test The concentration of Streptococcus pneumoniae-derived polysaccharide antigen (Binax) and ribosomal protein L7 / L12 in urine was detected by immunochromatography kit after each sampled mouse urine sample was diluted approximately 20 times with physiological saline. . That is, in the case of a commercially available Streptococcus pneumoniae-derived polysaccharide antigen (Binax) kit, a urine sample after dilution with physiological saline was measured according to the method described in the kit specifications. In the case of an immunochromatography kit employing Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody, the same physiological saline diluted sample is further added to an additive solution (Triton X-100 0.5%, NaCl 0.2M). The added sample was used as a test sample. Then, 120 μl of the test sample was dropped with a micropipette onto the sample addition member 5 of the immunochromatography apparatus obtained in (2) above, chromatographed, left at room temperature for 15 minutes, and then captured at the
このようにして肺炎球菌感染抵抗性（CBA/N）、感受性（CBA/J）の2種類のマウスを用いて作成した感染モデルマウスの咽頭洗浄液および肺中の感染肺炎球菌菌数と尿をサンプルとして検出した多糖抗原検査用キットBinax肺炎球菌およびStreptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体により構成したイムノクロマトキットの陽性ラインの検出、目視判定結果を表３に示す。 Samples of the pharyngeal lavage fluid and the number of infected pneumococcal bacteria and urine in the lungs were prepared using two types of mice with resistance to pneumococcal infection (CBA / N) and sensitivity (CBA / J). Table 3 shows the detection and visual determination results of the immunochromatography kit composed of the polysaccharide antigen test kit Binax pneumococci and Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibodies detected as
肺炎球菌抵抗性マウスCBA/N系列（表.2網掛け表示）では咽頭へのマウス感染・定着はみられるが、肺にはほとんど感染が見られず、逆に肺炎球菌感受性マウスCBA/J系列（表３：白抜き表示）では咽頭からに肺に肺炎球菌が感染し、明らかに肺炎状態の感染モデルを形成している。これらの“咽頭常在モデル（CBA/N）”、“肺炎モデル（CBA/J）”の2種類の感染状態のモデルマウスに対して尿中夾膜多糖抗原検査用キットであるBinax肺炎球菌ではその両方で陽性を示している。したがって肺に感染がない、つまり肺感染を起こしていない、いわゆる“咽頭常在”状態でも陽性反応を示すことが示唆される。一方、抗Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を採用したイムノクロマト診断キットでは、肺に対する肺炎球菌の感染が明確ないわゆる肺炎球菌性“肺炎”になっている “肺炎モデル（CBA/J）”では陽性を示したが、肺に感染がない、つまり肺感染を起こしていない状態の“咽頭常在モデル（CBA/N）”のマウスではすべて陰性となっており、興抗Streptococcus pneumoniaeリボゾーム蛋白質Ｌ7/Ｌ12抗体を用いた尿中蛋白質の検出が肺炎状態をより直接的かつ特異的にモニタリングする指標となることが明らかとなった。 Streptococcus pneumoniae resistant mouse CBA / N series (Table.2 shaded) shows mouse infection and colonization in the pharynx, but almost no infection in the lung, conversely pneumococcal susceptible mouse CBA / J series In (Table 3: white display), Streptococcus pneumoniae is infected from the pharynx to the lung, and clearly forms a pneumonia infection model. Binax Streptococcus pneumoniae, a kit for testing urinary capsular polysaccharide antigens, was used in these two types of infected mouse models, the “pharyngeal resident model (CBA / N)” and “pneumonia model (CBA / J)”. Both are positive. Therefore, it is suggested that even if there is no infection in the lung, that is, no pulmonary infection occurs, the so-called “pharyngeal resident” state shows a positive reaction. On the other hand, the immunochromatographic diagnostic kit using the anti-Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 antibody is positive in the “pneumonia model (CBA / J)” in which pneumococcal “pneumonia” with clear infection of pneumococci to the lung is known. However, all of the mice in the “pharyngeal resident model (CBA / N)” in which there was no infection in the lung, that is, no pulmonary infection, were negative, and the anti-Streptococcus pneumoniae ribosomal protein L7 / L12 It was revealed that the detection of urinary protein using antibodies can be an index for monitoring pneumonia more directly and specifically.
本発明によれば、肺炎球菌リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を採用することにより、尿又は血清中の肺炎球菌抗原を肺炎病態特異的に検出することが可能である。 According to the present invention, it is possible to specifically detect pneumococcal antigens in urine or serum by employing an antibody against pneumococcal ribosomal protein L7 / L12.
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