JP5201988B2 - プリオン蛋白質リガンドとしての置換トリアジン、及び、プリオンを検出又は除去するための該置換トリアジンの使用 - Google Patents
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Description
a)置換されていてもよい6〜18個の炭素原子を有する単環式又は多環式芳香族炭素環部分、例えば、フェニル、ナフタレン、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アズレン、クリセン、インダセン、インデン、フッ素、フェナレン及びフェナントレン;或いは
b)アリールとシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルが互いに融合して環状構造を形成する、置換されていてもよい部分飽和多環式芳香族炭素環部分、例えば、インドリニル、テトラヒドロナフチル、インデニル又はインダニル環 を指す。
a)1つ又はそれ以上の環部分が炭素以外の元素、例えば、N,O又はSである、置換されていてもよい単環式アリールであり、好ましい例は単環式又は二環式であり、例として、ベンズイミダゾイル、ベンズチアゾイル、フリル、イミダゾイル、インドリル、インドリジニル、イソキサゾイル、イソキノリル、イソチアゾイル、オキサジアゾイル、ピラニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾイル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、1,3,4−チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル及びトリアゾリル基が挙げられ、特に明示しない場合、本明細書で述べる1つ又はそれ以上のアリール基置換基により任意に置換され、或いは
b)ヘテロアリールと、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニル基とが互いに融合して環状構造を形成する、置換されていてもよい部分飽和多環式ヘテロ炭素環部分(このような基はpyrindanyl基を含み、特に明示する場合を除き、本明細書で述べる1つ又はそれ以上のアリール基置換基に置換されていてもよい)を指す。
a)X1及びX2が共に窒素であることが好ましく;
b)Z及びYが共にNR4を表し、特にR4が水素である場合が好ましく;
c)mは好ましくは0〜4、より好ましくは0〜3、最も好ましくは1〜3であり;
d)Q1が−NR11R12であることが好ましく、R11及びR12は結合される窒素原子とともにヘテロシクロアルキル基を形成することが好ましく;
e)nが好ましくは0〜4、より好ましくは0〜2、最も好ましくは0であり;
f)R21及びR22は結合される炭素原子又は窒素原子とともにシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基を形成することが好ましい。
a)X1及びX2が共に窒素であることが好ましく;
b)Z及びYが共にNR4を表し、特にR4が水素である場合が好ましく;
c)pは好ましくは0〜4、より好ましくは0〜3であり;
d)R1は好ましくは1つ又は2つのカルボキシル基に置換され、当該カルボキシル基の少なくとも1つがアルキレン鎖−(CH2)p−CH3の末端炭素原子に担持され;
e)qは好ましくは0〜4、より好ましくは0〜3、最も好ましくは1又は2であり;
f)Arが、フェニル、フェノキシ、トリル、クロロベンジル、メトキシベンジル、フルオロベンジル、ピリジル及びインドイルからなる群より選択される1つ又はそれ以上の置換基により置換されていてもよい、単環式炭素環又は複素環芳香族基であることが好ましい。Arは更に好ましくはフェニル、フェノキシ又はピリジルである。
一般的に、化学式(I)の化合物を調製し得る方法は当業者には明らかである。例えば、WO 97/10887に開示されている合成の方法を参照し得る。
リガンドは次のように同定することができる。模倣物ライブラリー(Mimetic libraries)を合成し、プリオン分析物への結合能に関してスクリーニングする。プリオン分析物をカラムに通し、結合した分析物を、プリオン蛋白質に特異的な標識抗体による方法のような従来の方法を用いて検出する。分析物が結合したビーズが好適なリガンドとして同定される。
プリオン又はプリオンの断片に結合するリガンドは、種々の分析用途、調製用途及び診断用途に有用である。プリオン結合性リガンドはビーズ又は膜のような支持体に固定され、プリオンに結合し、試料からプリオンを除去するために用い得る。リガンドが結合した固相を、プリオン−リガンド複合体の形成を生じさせるのに十分な条件下で試料(例えば体液)と接触させると、試料中のプリオン蛋白質がリガンドに結合する。次に、固相を試料から分離し、これによって固相に結合したリガンドに結合したプリオン蛋白質を試料から除去する。汚染物の除去のための樹脂及び膜は当該技術分野で公知であり、例えば、Baumbachらに付与された米国特許第5,834,318号及びWO 01/77687に開示されている。
本明細書で述べるリガンドは、生体試料中のプリオン蛋白質の存在を検出する、或いはこれを定量する方法においても有用である。前記列記されたような生体試料(前記列記分に限定されないが)は、プリオン蛋白質とリガンドの複合体の形成を生じさせるのに十分な条件下でリガンドと接触させられる。次に、当該複合体は従来の方法によって検出され、これにより生体試料中のプリオンの存在を検出する。
リガンド−プリオン複合体、又は抗リガンド抗体又はリガンド−プリオン複合体を、当業者に公知の任意の方法で検出・定量できる。これらの方法としては分光比色法、ラディオグラフィー、電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散クロマトグラフィー等の生化学分析法等、及び液体又はゲル沈降法、免疫拡散法(単一又は二重)、免疫電気泳動法、放射線免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸収体分析法(ELISA)、免疫蛍光分析法等の種々の免疫的方法が挙げられる。
当業者は、分析中及び試料からの分析試料の分離中において非特異的結合を減少させることが望ましいことが多い旨を理解し得よう。分析において固体基質上に固定化されたリガンド又は捕捉物質が用いられる場合、固体基質に対する非特異的結合の量を最小にすることが望ましい。この様な非特異的結合の低減法は当業者に公知である。典型的には、この手法には基質を蛋白質性組成物で被覆する工程が含まれる。具体的には、ウシ及びヒト血清アルブミン(BSA)、脱脂粉乳及びゼラチンが広く使用される。
試料中のプリオン蛋白質の存在を検出・定量するためにウエスターンブロット分析を使用し得る。この技術は一般に、SDSの存在下に分子量に基づいて試料をゲル電気泳動によって分離する工程と、分離された蛋白質を適当な固体支持体(ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は修飾ナイロンフィルター)に転移する工程と、結合した試料を本明細書記載のリガンドとインキュベーションする工程が含まれる。リガンドは固体支持体上に固定化されたプリオンペプチドと特異的に結合する。これらのリガンドを直接標識するか、又はその後にリガンドに特異的に結合する標識抗体を用いて検出し得る。
支持マトリックスに結合させられていない本明細書に記載のリガンドは、プリオン有機体を有する哺乳動物の感染で生じるTSEの処置に対する治療及び予防用途に有用である。このリガンドは、PrPscのPrPscへの結合を阻害することにより、PrPscの重合を阻止し得る。さらに、該リガンドはPrPscのPrPcへの結合阻害を阻止し、PrPscで媒介されるPrPcのPrPscへの転換を減少させ、その結果、臨床症状の発症を遅らせる。その上、反応性試薬の添加によりリガンド自体を修飾可能であり、その修飾分子はPrPsc蓄積部位を標的とする。この様な組成物は、様々な医薬配送系における使用に適している。
下記の表に記載のプリオン結合性リガンドは以下の様に定義される。
エポキシド活性化プラビーズ6XL(Purabead6XL)上のミメティックリガンドの2種の8×8コンビナトリアルライブラリー(ライブラリーA及びB)を合成した。プラビーズ6XLは耐久性を持たせるために架橋された多孔性ビーズ状アガロース支持体である。その合成法はWO97/10887に記載の方法と類似し、当業者によって容易に再現可能である。まとめると、合成終了後、各ライブラリー構成要素には、柔軟なアミノ化スペーサーによってプラビーズ6XLに結合したトリアゾール成分が含まれていた。各ライブラリー構成要素のトリアゾール成分を他の2種のアミンでさらに置換した。
このライブラリーの柔軟なアミノ化スペーサーは炭素原子3個の長さであり、これは架橋プラビーズ6XLとエピクロルヒドリン及びアンモニアとの逐次反応により導入された。各ライブラリー構成要素のトリアゾール上に取り込まれた前記他の2種のアミンが表1にまとめられており、これらのアミンは式(I)の−Z−R1及び−Y−R2基に対応する。アミンは以下の番号で呼ばれ、リガンドは2個の2−アダマンタミン基を含む1/1で定義されるリガンド、1個の4−(2−アミノエチル)モルホリン基及び1個の2−アダマンタミン基を含む2/1で定義されるリガンド等である。
2=4−(2−アミノエチル)モルホリン
3=1−(2−アミノエチル)ピペリジン
4=1−(2−アミノエチル)ピペラジン
5=(+/−)−2−アミノボルナン
6=1−(2−アミノプロピル)−2−ピロリドン
7=3−アミノキヌクリジン
8=1−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン
9=N,N−ジメチルエチレンジアミン
このライブラリーの柔軟なアミノ化スペーサーの長さは炭素数10個であり、これは架橋プラビーズ6XLと1,4−ブタンジオールグリシジルエーテル及びアンモニアとの逐次反応で導入された。表2に各ライブラリー構成要素のトリアジン上に取り込まれた前記他の2種のアミンをまとめるが、これらのアミンは以下の番号で呼ばれる。
11=2−アミノエチルピリジン
12=3−アミノベンジルアルコール
13=フェネチルアミン
14=チラミン
15=4−フルオロベンジルアミン
16=4−メチルベンジルアミン
17=2−(4−クロロフェニル)エチルアミン
18=トリプタミン
19=グリシン
20=L−グルタミン酸
21=DL−バリン
22=5−アミノ吉草酸
23=4−アミノ酪酸
24=L−チロシン
25=ε−アミノカプロン酸
ライブラリーを数回さかさにし、静止させて重力で水切りし、次いでウエルあたり1mLの水で2回洗浄し、1mLの10mMPBS(pH7.4)で1回洗浄した。ウエルを停止させ、ウエルあたり0.5mLのPBSを加えた。ライブラリーを冷蔵庫で終夜保存した。それぞれ1.8mLの10%ハムスター脳ホモジェネート(HaBH)を含むチューブ2本を液体窒素中の貯蔵庫から取り出し、解凍した。180μLの5%ザルコシルを各チューブに加えた。懸濁液を転置しながら室温で30分間インキュベーションし、次いで卓上型マイクロ遠心機中で、13,400rpmで10分間遠心した。上澄を集め、PBSで1:10に希釈した(HaBHの最終希釈1:100)。ライブラリーを重力で水切りし、ウエルあたり500mLのHaBHを加え、収集プレートに重力で滴下した。ウエルの滴下後、各ウエルをさらに500mLのPBSで洗浄し、洗浄液を同じ収集プレートに採集した。この収集プレートを「非結合」とラベルした。各ウエルにPBS中の1M NaClを500μL加え、「塩溶出」とラベルした別な収集プレートに集め、次いで500μLの2%酢酸溶液を加え「酢酸溶出」とラベルした収集プレートに集めた。各樹脂の26μL分をミクロ遠心チューブに移し、残りの結合プリオンの分析のために保存した。「非結合」、「塩溶出」及び「酢酸溶出」液を収集プレート内で凍結した。
「非結合」試料の各50μLを50μLの2×試料緩衝液/還元剤(インビトロゲン(Invitrogen)NuPGE LDS試料緩衝液4×(25μL)、インビトロゲンNuPAGE試料還元剤(10μL)及びACSグレード水(15μL)の混合物)に加えた。各チューブを90℃で10分間加熱した。
ゲルをゲルカセットから取り外し、ACS水で3回濯いだ(25mL、5分)。ゲルをインビトロゲンSimplyBlue Safestainで1時間にわたって染色し、その後ACS水で3回洗浄(25mL、1時間)して脱色した。
17ウエルNuPAGEゲルカセット(カタログ番号NP0349)を脱イオン水で濯ぎ、レーンを1× NuPAGE泳動用緩衝液で濯いだ。ゲルをXcel Mini−Gelモジュール(インビトロゲン・カタログ番号EI0001)又は相当する装置に置いた。貯蔵溶液(インビトロゲン20× NuPAGE MES泳動用緩衝液、カタログ番号NP0002又はNP0002−02)から得た1×泳動用緩衝液で下部チャンバーを満たした。上部チャンバーを抗酸化剤(インビトロゲン・カタログ番号NP0005)を含む1×泳動用緩衝液で満たした。
プラビーズ6XLベースマトリックスに付着させたリガンド5/4を有する吸着体を実施例1と同様に合成し、式(VI)の化合物を得た。
本発明実施例はライブラリーA及びBに使用したアミンを含むいくつかのリガンドの調製について説明するが、これはアミノ化ポリメタクリレート支持体(トーヨーパール(Toyopearl)650M)上においての説明であって、アガロース上における場合の説明ではない。
トーヨーパールAFアミノ650M(36g)を素焼ロート上で36mLの逆浸透水で10回洗浄し、1M燐酸カリウム(36mL、pH7.0)中に再懸濁した。ゲルを排液し、1M燐酸カリウム(27mL、pH7.0)と逆浸透水(27mL)中に再懸濁した。この混合液をガラス反応容器に移して攪拌し、54mLのアセトンを加えた。混合液を0℃に冷却し、冷アセトン(27mL、0℃)に溶解した塩化シアヌル酸(2.7g)を加え、混合液を0〜4℃で1時間攪拌した。得られたジクロロトリアジン活性化生成物のスラリーを焼結ガラス上に注ぎ、アセトン水溶液(50%v/v、180mL)、逆浸透水(180mL)、アセトン水溶液(50%v/v、180mL)及び逆浸透水(360mL)で洗浄した。
ジクロロトリアジン活性化トーヨーパール650Mから、下記の様に様々なモノクロロトリアジン中間体を調製した。
第2段階反応用のアミン溶液を以下の様に調製した。
ビーズ状ポリメタクリレートマトリックス(トーヨーパール)に付着させた親和性リガンドを含む化合物を実施例3に記載の通りに合成した。正常ハムスター脳ホモジェネートで説明した手順(実施例2)を用い、ヒト濃縮赤血球(RBCC)中に固定(spike)したスクラピー感染ハムスター脳の抽出液(1%w/v)を調製した。ポリメタクリレート親和性吸着体によるPrPscの結合を、吸着体スラリーを1mlミクロカラムに充填し、実施例2に記載の手順を用いて固定されたRBCCを試用して評価した。親和性吸着体から抽出された試料のSDS−PAGE及びウエスターンブロット分析を、SDS−PAGE還元剤と混合する前に第2セットの試料の一部をプロテイナーゼKで処理したこと以外は実施例1と同様に実施した。
1%(w/v)ヒト散発性CJD脳ホモジェネートで固定したRBCCを用いて、実施例4に記載の実験を繰り返した。ウエスターンブロット分析により、リガンド5/4、19/13、5/3、22/13及び3/4を含むポリメタクリレート樹脂は全て、ヒト濃縮赤血球の存在下でヒト散発性CJD脳由来のPrPに対し高い親和性を示すことが示された。
ビーズ状ポリメタクリレートマトリックス(トーヨーパール)に付着させたリガンド5/4を有する親和性吸着体を、実施例3に記載の通りに合成した。ヒト保存血漿及びヒト全血中に固定したスクラピー感染ハムスター脳の抽出液(1%w/v)を、正常ハムスター脳ホモジェネート及びRBCCで説明した手順(実施例2)を用いて調製した。吸着体スラリーを1mLマイクロカラムに充填し、実施例2に記載の手順を用いて固定した血漿及び全血試料に試用することにより、ポリメタクリレート親和性吸着体によるPrPscの結合を評価した。親和性吸着体から抽出した試料のSDS−PAGE及びウエスターンブロット分析を、SDS−PAGE還元剤と混合する前に第2セットの試料の一部をプロテイナーゼKで処理した以外は実施例1と同様に実施した。
Claims (3)
- プリオン蛋白質を親和性結合させるための下記式(I)で表される化合物の生体外における使用:
R2は基−(CH2)n−Q2を表し、式中、nは0〜7であり、Q2は−CR21R22R23又は−NR21R22を表し、ここでR23は水素、アルキル、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表し、R 21 及びR 22 は、結合される炭素又は窒素原子とともに、置換されていてもよいシクロアルキル又は置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基を形成し;
R3は水素又はアリール基の置換基であるか、又はR3はスペーサー分子を介して任意に結合した固体支持体であり;
Zは酸素原子、硫黄原子又はNR4を表し;
Yは酸素原子、硫黄原子又はNR5を表し;
ここで、R4及びR5は同じであっても異なっていてもよく、水素、1〜6個の炭素原子を有する置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいベンジル又は置換されていてもよいβ−フェニルエチルを表し;
X1及びX2は共に窒素原子を表す)。 - YとZは共にNHを表し;
R1は基−(CH2)2−Q1を表し;
Q1はピペリジル又はピペラジニルを表し;
R2で表される基−(CH2)n−Q2におけるnは0または2であり、Q2は1−ピペリジル、アダマンチル又はノルボニルを表す、請求項1に記載の使用。 - 生体から取り出した試料中のプリオン蛋白質を検出し、かつ/又は生体から取り出した試料からプリオン蛋白質を除去する方法であって、請求項1または請求項2に示される化合物に試料を生体外で接触させる工程を含む、該方法。
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