DE19741607A1 - Synthetische Polypeptide zur Diagnose und Therapie von Prionerkrankungen - Google Patents
Synthetische Polypeptide zur Diagnose und Therapie von PrionerkrankungenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf synthetische Polypeptide, die insbe
sondere bei der Diagnose, Vorbeugen und Behandlung von einer Reihe von
übertragbaren, degenerativen neurologischen Erkrankungen Verwendung finden
können. Diese Erkrankungen werden unter dem Begriff spongiforme Enzephalopatien
oder auch Prionerkrankungen zusammengefaßt. Sie treten in unterschiedlichen
Säugetierspezies auf, z. B. als Scrapie bei Schafen, als BSE bei Kühen und
als Kuru oder Creutzfeldt-Jacob-Krankheit bei Menschen.
Als einziges mit dem infektiösen Agens assoziiertes Molekül wurde bislang ein
krankheitsspezifisches Prionprotein (PrPSc) gefunden, das eine abnorme Isoform
eines normalen Wirtsproteins (PrPC) unbekannter Funktion ist. Beide Isoformen
PrPSc und PrPC stimmen bezüglich Molekulargewicht und Aminosäuresequenz
überein. Sie unterscheiden sich in ihrer räumlichen Faltung und ihren Eigen
schaften. Während z. B. PrPC überwiegend α-helicale Sekundärstrukturen besitzt,
löslich und proteaseverdaubar ist, weist PrPSc vor allem β-Faltblattstrukturen auf,
ist unlöslich und kann von Proteasen nur teilweise abgebaut werden. Viele Indizien,
insbesondere die Abwesenheit von anderen Molekülen außer PrPSc im
Prion, und vor allem die Abwesenheit von Nukleinsäuren, deuten darauf hin, daß
PrPSc eine (wenn nicht die) zentrale Rolle bei der Auslösung der oben genannten
Krankheiten zukommt. Es wird angenommen daß PrPSc-Proteine in der Lage
sind, normale PrPC-Proteine in die krankheitsspezifische Faltung zu konvertieren,
was die Infektiosität von PrPSc-Proteinen erklären würde.
Es scheint daher vielversprechend ausgehend von PrPSc als zentralen Krank
heitsmolekül Therapie- oder Diagnosemöglichkeiten zu entwickeln.
Aufgabe der Erfindung ist in diesem Zusammenhang, synthetische Polypeptide
bereitzustellen, die immunogene Eigenschaften oder generell Bindungseigen
schaften des PrPSc nicht jedoch dessen Infektiösität aufweisen.
Gelöst wird die Aufgabe mit synthetischen Polypeptiden entsprechend des An
spruchs 1.
Es handelt sich dabei um Polypeptide, die eine oder mehrere definierte Sequenzen
des PrP (PrP bezeichnet das Prionprotein im allgemeinen unabhängig von
seiner Konfiguration) enthalten, wobei diese Sequenzen von PrPSc-bindenden
Substanzen in z. B. den weiter unten beschriebenen Mapping-Experimenten erkannt
werden. Es gibt eine ganze Reihe von unterschiedlichen PrPSc-spezifisch
bindenden Substanzen. Beispiele hierfür sind weiter unten angegeben.
Zusammengefaßt enthalten die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide
dann mindestens eine Sequenz, die im nativen PrPSc an dessen Oberfläche an
geordnet ist und dort alleine oder in Verbindung mit weiteren der im Rahmen der
Erfindung einsetzbaren Sequenzen eine Bindungsstelle bilden. An der Ausbildung
dieser PrPSc-spezifischen Oberflächenstrukturen ist mindestens eine der
beiden im Strukturmodell des rekombinanten PrP vorhandenen β-
Faltblattstrukturen, oder beide, beteiligt. Es wird angenommen, daß diese Strukturen
im PrPSc als Nukleationspunkt bei der Ausbildung der Oberfläche einen
dominierenden Einfluß haben.
Künstliche Polypeptide, die im nativen PrPSc vorhandene Bindungsstelle simulieren,
können sowohl zur Therapie oder Diagnose als auch zur Vorbeugung und
sonstigen Anwendungszwecken von Interesse sein.
Unter die Erfindung fallen insbesondere synthetische Polypeptide, die einen oder
mehrere der im Anspruch 2 genannten folgenden Sequenzbereiche aufweisen:
- a) Gly-R1-Asp-R2-Glu-Asp-Arg-(Tyr-Tyr)
- b) (Gln)-(Val)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)
- c) Cys-R7-Thr-Gln-Tyr-R8-R9-Glu-Ser-R10-Ala-(R11Tyr)
- d) (Tyr-Arg)-Glu-Asn-Met-R12-Arg-Tyr-Pro-Asn-(Gln-Val-Tyr)
in denen R1
= Asn oder Ser, R2
= Trp oder Tyr, R3
= Arg oder Lys, R4
= Met,
Val oder Ala, R5
= Gln, Glu oder Arg, R6
= Ser oder Asn, R7
= Val, Thr oder
Ile, R8
= Gln oder Glu, R9
= Lys, Arg oder Gln, R10
= Gln oder Glu, R11
und Tyr,
Ser oder Ala und R12
= His, Tyr oder Asn ist und die in Klammern angegebenen
Aminosäuren nicht zwingend vorhanden sind.
Weitere synthetische Polypeptide im Rahmen der Erfindung können nach An
spruch 3 eine oder mehrere der folgenden Sequenzen enthalten:
- e) Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly
- f) Lys-Pro-R14-Lys-Pro-Lys-Thr-R14-R15-Lys-His-R16-Ala-Gly
- g) Tyr-R16-Leu-Gly-Ser
- h) Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-R17-R17-His-Phe-Gly-R14-Asp
- i) Asn-Met-R18-Arg-Tyr-(Pro-R14)-(Gln-Val-Tyr-Tyr-R19)
in denen R14
= Asn oder Ser, R15
= Met, Leu oder Phe, R16
= Met oder Val,
R17
= Ile, Leu oder Met, R18
= His, Tyr oder Asn und R19
= Lys oder Arg ist und
die in Klammern gesetzten Aminosäuren oder Sequenzbereiche nicht zwingend
vorhanden sind.
Die Sequenzen gemäß Anspruch 2 und 3 wurden in sogenannten "Mapping-
Experimenten" auf einer immobilisierten Peptidbank gefunden. Auf der benutzten
Peptidbank (erhältlich von Jerini Biotools, Berlin) sind 104 Peptide mit jeweils
13 Aminosäuren mit ihrem C-terminalen Ende auf einer Cellulosemembran befestigt.
Sie decken die gesamte Sequenz des PrP (PrP bezeichnet im folgenden generell
die dem Prionprotein zugrundeliegende Aminosäuresequenz unabhängig
von der Konformation) ab und sind so angeordnet, daß sie um jeweils zwei Ami
nosäuren verschoben sind, d. h. jeweils 11 Aminosäuren zwischen zwei benachbarten
Peptiden überlappen. In mehreren Mapping-Experimenten wurden Peptidbänke
mit unterschiedlichen PrPSc bindenden Substanzen beaufschlagt und die
Bindung dieser Substanzen an spezielle Sequenzbereiche unter Verwendung z. B.
eines Chemolumineszenz-Kits (ECL, Amersham, USA) sichtbar gemacht.
Zur Ermittlung der Sequenzen gemäß Anspruch 2 wurden in "Mapping-
Experimenten" als PrPSc-bindende Substanzen ein PrPSc-spezifischen Antikörper
mit der Bezeichnung 15B3 und (wie in eigenen Vorversuchen gezeigt wurde
ebenfalls PrPSc-spezifisches) rekombinantes bovines-PrP (rbPrP) mit der in Fig. 4
angegebenen Sequenz eingesetzt. Zur Herstellung von rbPrP kann z. B. eine Zell
linie (z. B. E. coli) mit einem Vektor, der rbPrP exprimiert, in einem geeigneten
Medium (z. B. Luria-Broth) angezogen und dann aus den Inklusionskörpern der
Zellen nach Lysis und weiteren konventionellen Reinigungsmethoden das Prion-
Protein isoliert werden (siehe auch Hornemann et als., FEBS-Letters (97) 413 (2;
277-28)).
Bei 15B3 handelt es sich um einen unlängst von den Erfindern entdeckten mono
klonalen PrPScAntikörper. Hybridomazellen, die die genannten (PrPSc spezifischen)
Antikörper 15B3 produzieren, wurden am 13. Februar 1997 unter der
Nummer DSM ACC2298 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH in Braunschweig hinterlegt.
In beiden Fällen erkannten die beiden unterschiedlichen bindenden Substanzen,
der Antikörper 15B3 und das rekombinante rbPrP übereinstimmend die Sequenzen
a-d gemäß Anspruch 1, wie für 15B3 in Fig. 1 und für rbPrP in Fig. 2 wieder
gegeben.
Die in Fig. 1 und 2 angegebenen Nummern bezeichnen die unterschiedlichen
Peptidsequenzen der Bank, an denen der monoklonale Antikörper 15B3 bzw.
rbPrP bindet. Die erfindungsgemäßen Sequenzen entsprechend dabei jeweils den
den jeweiligen räumlich benachbarten Bindungspeptiden gemeinsamen Bereichen.
Fig. 2 gibt dabei wie bereits erwähnt das Ergebnis eines Mappingexperi
mentes wieder, dessen Bedingungen dem in Fig. 1 dargestellten Experiment ent
sprechen. Hier wurde lediglich der Antikörper 15B3 gegen rekombinantes bovines
rbPrP ausgetauscht. Die Bindungsstellen des rekombinanten rbPrP sind auf
der aus technischen Gründen nicht besser wiederzugebende Darstellung mit
Markierungen hervorgehoben. Es handelt sich um mit Fig. 1 übereinstimmende
Bindungsstellen.
Die in Anspruch 3 angegebenen Sequenzen wurden ebenfalls mittels Mappingex
perimenten ermittelt. Allerdings wurde hier als erkennende Substanz nicht ein
Antikörper oder rbPrP, sondern der Farbstoff Kongorot eingesetzt, dessen spezifische
Bindung für PrPSc bereits seit längerem bekannt ist (Prusiner et al., Cell
35, 349-358; 1983). Fig. 3 zeigt die entsprechende Peptidbank mit den angefärbten
Bindungsbereichen, aus denen wie oben angegeben die Sequenzen e-i ermittelt
wurden.
In den Fig. 1-3 erkennt man, daß es sich bei den Sequenzen a-d bzw. e-i um nicht
linear zusammenhängende Sequenzen aus PrP handelt. An einem 3-
dimensionalen Modell eines C-terminalen Fragments von rekombinantem Maus-
PrP konnte gezeigt werden, daß sich hier zwei der im Anspruch 2 angegebenen
Sequenzen a-d in räumlicher Nähe zueinander befinden. Mit großer Wahrscheinlichkeit
ist davon auszugehen, daß bei der Konformationsänderung auch die beiden
anderen Sequenzen eine andere Position einnehmen, dergestalt daß im PrPSc
wohl alle vier Sequenzen a-d benachbart angeordnet sind und mit hoher Wahr
scheinlichkeit ein konformationelles Epitop ausbilden.
Die beanspruchten Sequenzen stellen damit Sequenzbereiche dar, die in einer
Peptidbank einzeln von z. B. einem PrPSc-spezifischen Antikörper erkannt werden
und die darüber hinaus mit hoher Wahrscheinlichkeit im nativen PrPSc-
Protein einzeln oder zu mehreren einen oberflächlichen Bindungsbereich z. B.
ein Epitop ausbilden. Unter Epitop wird der spezifische Ort auf der
Oberfläche des PrPSc-Proteins verstanden, der z. B. durch das Idiotyp von 15B3
gebunden werden kann.
Erfindungsgemäß werden damit synthetische Polypeptide bereitgestellt, die im
Mindestfall eine der von den genannten PrPSc bindenden Substanzen in der Pep
tidbank erkannten Sequenzen (sowie möglicherweise zusätzliche) enthalten.
Künstliche Polypeptide, die einen antigenen Bereich von PrPSc aufweisen, sind
bereits in der WO 93/11153 angegeben worden. Die dort genannten Sequenzen
stellen relativ umfangreich Ausschnitte aus der PrP-Sequenz dar. Die genaue Abgrenzung
einer Sequenz, die z. B. ein Epitop ausbildet oder daran beteiligt ist,
fehlt, was insbesondere den räumlichen Nachbau von minimalen synthetischen
Polypeptiden mit z. B. der immunogenen Wirkung von PrPSc erschwert bzw. unmöglich
macht.
Wie oben ausgeführt, können die synthetischen Polypeptide im Minimalfall le
diglich aus einer der z. B. im Anspruch 2 oder genannten Sequenzen bestehen. Es
ist aber auch möglich, sie mit geeigneten weiteren Sequenzen, die im Folgenden
Konformationssequenzen genannt werden, zu verbinden.
Theoretisch wäre es z. B. möglich, die z. B. die Sequenzen ggf. über diese Konforma
tionssequenzen und eventuelle weitere Sequenzen dergestalt untereinander zu
verbinden, daß die vermutete räumliche Anordnung im PrPSc-Protein simuliert
wird. Im Idealfall würde man auf diese Weise ein Protein mit einer Oberfläche
(Epitop) erhalten, in dem wie im PrPSc mehrere räumlich benachbarte Bindungs
stellen enthalten sind.
Erfindungsgemäß ist in einer Ausgestaltung zunächst jedoch vorgesehen, lediglich
eine der beanspruchten Sequenz (Sequenz b) dergestalt mit einer Konfor
mationssequenz zu verknüpfen, daß ein synthetisches Polypeptid mit ausreichender
immunogener Bindungswirkung z. B. für 15B3 entsteht, wie Untersuchungen
der Erfinder zeigten. Ein Polypeptid in dieser Ausgestaltung kann eine der beiden
folgenden Sequenzen aufweisen:
- j) (X)-(Gly)-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-Z-Tyr- Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)-(Y)
- k) (X)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6(Asn-Gln)-Z-(Gly)-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-(Y)
wobei X und Y beliebige Aminosäuresequenzen sind, Z ein üblicher Spacer z. B.
Gly-Gly ist, R3
= Arg oder Lys, R5
= Gln, Glu oder Arg, R6
= Ser oder Asn
und R13
= Met oder Val ist und die in Klammern gesetzten Sequenzbereiche
nicht zwingend vorhanden sein müssen.
Die Sequenz j enthält in ihrem C-terminalen Bereich die Sequenz b, die über z. B.
den Spacer Gly-Gly mit der sich N-terminal anschließenden Konformationsse
quenz verbunden ist. In der Sequenz k ist die Abfolge genau umgekehrt. Weitere
geeignete Spacer sind generell alle solche Sequenzen, die ausreichende Flexibilität
zwischen den verbundenen Peptidbereichen gewährleisten und keinen Einfluß
auf die Konformation haben.
Beide bevorzugt eingesetzten synthetischen Polypeptide wurden ausgehend von
der Feststellung konzipiert, daß in PrPSc verstärkt β-Faltblatt-Strukturen auftreten,
wobei in aller Regel sequenzauf- oder abwärts eine Konformationssequenz
vorliegt, die eine β-Faltblatt-Struktur induziert. Die synthetischen Polypeptide
gemäß Anspruch 6 wurden daher mit geeigneten Konformationssequenzen ausgestattet,
um die Epitopsequenz in einer für PrPSc-spezifischen β-Faltblatt-Struktur
anzuordnen.
Wie allgemein bekannt, können Aminosäuren in Abhängigkeit von ihrer Größe
und ihrer Polarität bzw. Ladung unterschiedlichen Gruppen zugeordnet werden.
Man nennt die in eine Gruppe fallenden Aminosäuren untereinander homolog
und unterscheidet folgende 5 Gruppen:
- 1.) Kleine aliphatische nicht polare oder nur geringfügig polare Säuren: Alanin, Serin, Threonin und in Grenzen Glycin, Prolin
- 2.) Polare, negativ geladene Säuren und ihre Amide Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure und Glutamin
- 3.) Polare, positiv geladene Säuren: Histidin, Arginin, Lysin
- 4.) Große aliphatische, nicht polare Säuren: Methionin, Leucin, Isoleucin, Valin, Cystein
- 6.) Große aromatische Säuren: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
In vielen Fällen können in Peptidsequenzen enthaltene Aminosäuren durch ent
sprechende Säuren aus derselben Gruppe ersetzt werden, ohne daß die Eigenschaften
der Sequenz dadurch eine Änderung erfahren. Unter die Erfindung fallen
daher auch solche Sequenzen, die nicht den explizit genannten Formeln entsprechen,
sondern in denen ein Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren gegen
eine homologe Säure vorgenommen wurde.
Weiterhin kann grundsätzlich davon ausgegangen werden, daß Aminosäurese
quenzen unabhängig von ihrer Bildungseinrichtung unter bestimmten Umständen
ähnliche Bindungseigenschaften, insbesondere Antikörperbindungseigenschaften
haben können. Man spricht in diesem Fall von retro-Aminosäuresequenzen und
bezeichnet damit übereinstimmende Sequenzen, die in C- oder N-terminaler
Richtung gebildet sind (z. B. [N-terminal]-Glu-Ala-Val-Leu-[C-terminal], [N-
terminal]-Leu-Val-Ala-Glu-[C-terminal]). Falls die verwendeten Aminosäuren
statt der in Tieren vorkommenden L-Form in der chiralen D-Gegenform vorliegen,
so werden die Epitopbereiche spiegelbildlich ausgebildet und ebenfalls von
einigen Antikörpern erkannt, wobei sich die Isotypen der Anikörper in diesen
Eigenschaften unterscheiden. Man spricht in diesem Fall von inverso-
Aminosäuresequenzen. Falls sowohl inverso als auch retro-Aminosäuren verwendet
werden, ergeben sich z. B. übereinstimmende Epitopbereiche, die unein
geschränkt von dem zur ursprünglichen Sequenz spezifischen Antikörper gebunden
werden. Der Vorteil der Verwendung von z. B. retro-inverso-
Aminosäuresequenzen besteht darin, daß D-Aminosäuren vom Organismus langsamer
abgebaut werden, da sie von den abbauenden Enzymen schlechter erkannt
werden. Der gleiche Effekt kann auch durch die Substitution von nicht natürlichen
Aminosäuren erzielt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können daher
auch in retro- und/oder inverso Form vorliegen oder weiterhin auch nicht natürliche
(also nicht von Organismus produzierte) Aminosäuren enthalten. Nichtnatürliche
Aminosäuren lassen sich durch Synthetisierung von z.B. zusätzlichen Seitenketten
oder reaktiven Gruppen gezielt mit speziellen Eigenschaften und an
bestimmte Anwendungszwecke angepaßt herstellen.
Wie oben ausgeführt, können die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide
insbesondere bei der Behandlung, Vorbeugung oder auch Diagnose von Prioner
krankungen eingesetzt werden.
Es ist insbesondere daran gedacht, die erfindungsgemäßen synthetischen Poly
peptide als Impfstoff darzustellen. Dazu wird z. B. eine ausreichende Menge Pep
tid mit Freund's komplettem Adjuvans aufgelöst und subkutan oder intramuskulär
injiziert. In mehrwöchigen Abständen wird wiederum eine immunogene Menge
Peptid in Freund's inkomplettem Adjuvans aufgelöst und injiziert (Boost). Ziel
der Impfung ist, eine Immunantwort zu provozieren, die die endogene Produktion
von Antikörpern beinhaltet, die spezifisch PrPSc erkennen und neutralisieren
bzw. kennzeichnen können, so daß körpereigene Abwehrmechanismen einer Er
krankung vorbeugen bzw. den Krankheitsprozeß verlangsamen bzw. stoppen
können.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die synthetischen Polypeptide in der Diagnose
und Therapie einzusetzen. Nach der herrschenden Konversionstheorie wird
davon ausgegangen, daß PrPSc und/oder PrPC auch untereinander binden. Ge
stützt wird diese Annahme durch weitere Mappingversuche der Erfinder, in denen
gezeigt wurde, daß (wie aus Fig. 2 zu entnehmen) rekombinantes bovines
rbPrP an ähnlichen Sequenzbereichen bindet wie der oben genannte Antikörper
15B3.
Die erwähnten Bindungseigenschaften kann man sich z. B. bei der Therapie
zunutze machen. Denkbar wäre, die erfindungsgemäßen Polypeptide in den Körper
eines erkrankten Patienten hirngängig zu applizieren und dort dem infektiösen
PrPSc als Bindungspartner zur Verfügung zu stellen. Auf diese Weise könnte
man die Konversionsrate möglicherweise drastisch senken und das Fortschreiten
der Krankheit verlangsamen. Zu Diagnosezwecken wäre es denkbar, in Probe
material eventuell erhaltenes PrPSc mittels der erfindungsgemäßen Polypeptide
spezifisch zu binden und dann auf geeignete Weise nachzuweisen.
Die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide sind nicht auf die angegebenen
Sequenzen beschränkt. Denkbar sind auch Peptide, die in derivatisierter
Form vorliegen. Interessant könnte es z. B. sein, solche Peptide mit einem Carrier
bzw. Immunogen, wie z. B. Diphteriatoxid oder BSA zur Verstärkung der Im
munantwort zu verbinden. Eine weitere Möglichkeit der Derivatisierung wäre die
Verknüpfung mit Markern, wie z. B. Biotin oder Peroxidase bzw. mit Enzymen
oder Nukleinsäuren. Denkbar wäre schließlich auch, Signalsequenzen vorzusehen,
die die Durchgängigkeit der Peptide in gewünschte Kompartimente erleichtern.
Gedacht ist dabei insbesondere an die Blut-Hirn-Schranke, deren Passage
durch Verwendung von Signalsequenzen, die z. B. an Transferrinrezeptor binden,
erleichtert werden können.
Wie oben mehrfach angesprochen, sollen die erfindungsgemäßen synthetischen
Polypeptide bei der Therapie, Diagnose und Prophylaxe von Prionerkrankungen
Verwendung finden. In Verbindung mit allen genannten Anwendungszwecken ist
ein wesentliches Element, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide einzeln oder
in Verbindung mit weiteren Substanzen einem Patienten verabreicht werden, wobei,
wie oben ausgeführt, derivatisierte Formen eingesetzt werden können, um die
Gängigkeit in bestimmte Kompartimente zu erhöhen.
Die Herstellung der Polypeptide kann auf beliebige Weise erfolgen. Entweder
direkt über übliche Peptidsynthese-Techniken oder aber auch indirekt über RNA-
oder DNA-Synthese und dann mittels konventioneller molekularbiologischer
Techniken. Dementsprechend richtet sich ein weiterer Aspekt der Erfindung auf
ein DNA-Molekül, das in der Lage ist, eins der erfindungsgemäßen Polypeptide
zu kodieren. Vorzugsweise wird ein solches DNA-Molekül (ggf. auch in einer
längeren Sequenz) in einem geeigneten Expressionsvektor zur Verfügung gestellt.
Es handelt sich hierbei um Routinetechniken.
Die Erfindung richtet sich weiterhin auch auf einen Kit zur Diagnose von PrPSc
bzw. von Antikörpern gegen PrPSc, der mindestens eins der erfindungsgemäßen
Polypeptide enthält. Man macht sich hierbei die Tatsache zunutze, daß die Polypeptide
spezifisch am PrPSc und an den dagegen gerichteten Antikörpern zu binden
vermögen.
Wie oben bereits angesprochen kann eine der zu Ermittlung der Polypeptidse
quenzen eingesetzten bindenden Substanzen rekombinantes bovines rbPrP sein.
Es hat sich überraschend herausgestellt, daß rekombinantes rbPrP in der Lage ist,
spezifisch an PrPSc zu binden und an der entsprechenden Peptidbank die selben
Sequenzen zu erkennen, wie der Antikörper 15B3 (siehe Fig. 2).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung von rekombi
nantem rbPrP-Protein entsprechend der Sequenz in Fig. 4. Es hat sich herausge
stellt, daß bei Verabreichung von rekombinantem rbPrP mit der angegebenen Sequenz
PrPSc-spezifische Antikörper produziert werden. Diesen Effekt kann man
sich insbesondere im Rahmen der Prophylaxe oder Therapie zunutze machen,
indem man einem Patienten rekombinantes rbPrP als Impfstoff aufbereitet verabreicht
und eine entsprechende Immunantwort auslöst.
Die Ausgestaltung ist selbstverständlich nicht auf die Verwendung von bovinem
rbPrP gemäß Fig. 4 beschränkt. Genauso gut können rekombinante PrP-
Sequenzen mit artspezifischen Abweichungen von der in Fig. 4 gezeigten rbPrP-
Sequenz verwendet werden.
Schließlich betrifft die Erfindung auch noch ein Verfahren zur Herstellung von
PrPSc-spezifischen Antikörpern. Zur Immunisierung wird nicht menschlichen
Säugetieren mindestens eins der erfindungsgemäßen Polypeptide in einer zur
Immunisierung ausreichenden Dosis verabreicht und der dagegen gebildete Anti
körper mit üblichen Methoden isoliert.
Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich schließlich auch zur Verwendung in
sogenannten pharmazeutischen oder chemischen Libraries, mit denen neue
Wirkstoffe getestet bzw. ermittelt werden, die spezifisch an PrPSc binden.
Claims (18)
1. Synthetisches Polypeptid, das eine oder mehrere definierte Sequenzen von
PrP oder davon abgeleitete Sequenzen enthält, die von PrPSc-bindenden
Substanzen erkannt werden.
2. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz einer der
folgenden Formeln entspricht und mindestens eine der genannten Sequenzen
oder eine Kombination mehrerer Sequenzen enthalten ist:
- a) Gly-R1-Asp-R2-Glu-Asp-Arg-(Tyr-Tyr)
- b) (Gln)-(Val)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)
- c) Cys-R7-Thr-Gln-Tyr-R8-R9-Glu-Ser-R10-Ala-(R11Tyr)
- d) (Tyr-Arg)-Glu-Asn-Met-R12-Arg-Tyr-Pro-Asn-(Gln-Val-Tyr)
3. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz einer der
folgenden Formeln entspricht und mindestens eine der genannten Sequenzen
oder eine Kombination mehrerer Sequenzen enthalten ist:
- e) Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly
- f) Lys-Pro-R14-Lys-Pro-Lys-Thr-R14-R15-Lys-His-R16-Ala-Gly
- g) Tyr-R16-Leu-Gly-Ser
- h) Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-R17-R17-His-Phe-Gly-R14-Asp
- i) Asn-Met-R18-Arg-Tyr-(Pro-R14)-(Gln-Val-Tyr-Tyr-R19)
4. Synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Sequenz gegebenenfalls über eine übliche Spacersequenz mit
einer "Konformations"-sequenz gekoppelt ist, die die Ausbildung einer de
finierten Konformation des synthetischen Polypeptids induziert.
5. Synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch ge
kennzeichnet, daß die "Konformations"-sequenz die Ausbildung eines β-
Strands induziert.
6. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 2, 4 und 5 entsprechend einer der
folgenden Formeln:
- e) (X)-(Gly)-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-Z-Tyr- Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6-(Asn-Gln)-(Y)
- f) (X)-Tyr-Tyr-R3-Pro-R4-Asp-R5-Tyr-R6(Asn-Gln)-Z-(Gly)-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-(R13)-(Y)
7. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß es in mindestens einer Teilsequenz in retro-
Form vorliegt.
8. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens eine der enthaltenen Aminosäuren
in der D-Form vorliegt.
9. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß es in derivatisierter Form vorliegt.
10. Pharmazeutische Zubereitung zur Therapie von Prionerkrankungen, dadurch
gekennzeichnet, daß sie mindestens eines der in den Ansprüchen 1-9
genannten synthetischen Polypeptide oder mindestens eine die definierten
Sequenzen erkennende PrPSc-bindende Substanz in einer zur Therapie
oder Vorbeugung ausreichenden Dosis enthält.
11. Mittel zur Diagnose von Prionerkrankungen, dadurch gekennzeichnet,
daß es mindestens eines der in den Ansprüchen 1-9 genannten synthetischen
Polypeptide oder mindestens eine die definierte Sequenzen erkennende
PrPSc-bindende Substanz in einer für den jeweiligen Nachweis ausreichenden
Dosis enthält.
12. Impfstoff zur Vorbeugung und Therapie von Prionerkrankungen mit min
destens einem der Polypeptide gemäß den Ansprüchen 1-9 oder mindestens einer
die definierten Sequenzen erkennende PrPSc-spezifischen Substanz in
einer zur Immunisierung ausreichenden Dosis.
13. Pharmazeutische Zubereitung zur Diagnose oder Impfstoff nach
einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, daß die enthaltene
PrPSc-bindende Substanz rekombinant erzeugtes rbPrp mit der in Fig. 4
wiedergegebenen Formel bzw. artspezifischer Abweichungen davon ist.
14. DNA-Molekül, das mindestens für eines der synthetischen Polypeptide
nach den Ansprüchen 1 bis 9 kodiert.
15. Kit zur Detektion PrPSc bzw. von Antikörpern dagegen, dadurch ge
kennzeichnet, daß er mindestens ein synthetisches Polypeptid nach den
Ansprüchen 1 bis 9 enthält.
16. Verfahren zur Herstellung von PrPSc spezifischen Antikörpern, dadurch
gekennzeichnet, daß nicht-menschliche Säugetiere mit mind. einem Polypeptid
gemäß der Ansprüche 1-9 immunisiert werden und der bzw. die dagegen
gebildete(n) Antikörper nach einer zur Immunisierung ausreichenden
Zeitperiode auf üblichem Wege aus dem Säugetier isoliert werden.
17. Verfahren zur Detektion von PrPSc spezifischen Oberflächensequenzbe
reichen, dadurch gekennzeichnet, daß eine PrP-spezifischer Peptidbank
mit PrPSc-bindenden Substanzen inkubiert und mittels gängiger Visualisa
tionstechniken die bindenden Bereiche der Peptidbank sichtbar gemacht
und daraus die Sequenzbereiche ermittelt werden.
18. Verwendung der Polypeptide nach den Ansprüchen 1-9 in einer pharma
zeutischen oder chemischen Library zur Detektion von PrPSc-
spezifischen Wirkstoffen.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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