JP5176521B2 - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents
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Description
以下、第1実施形態を説明する。本実施形態は、蛍光共焦点レーザ走査顕微鏡システムの実施形態である。
以下、第2実施形態を説明する。本実施形態は、第1実施形態のシステムを利用して光刺激とイメージングとを同時に行う光刺激観察方法の実施形態である。
・レーザ光源2:紫外レーザ光源(波長405nm)
・レーザ光源3:アルゴンレーザ光源(波長488nm)
・ダイクロイックミラー9:488nmを含む短波長側の光を透過し、かつ4 88nmよりも長波長側の光を反射するもの
・ダイクロイックミラー10D,13D:405nm付近(幅10nm程度) の光を透過し、かつ488nmを含む長波長側の光を反射するもの
・第1のフィルタ10E:405nm付近(幅10nm程度)の光を透過し、 これより長波長側の光を透過しないもの
・第2のフィルタ10F:488nmを含む長波長側の光を透過し、40 5nm付近(幅10nm程度)の光を透過しないもの
光刺激観察の手順は、図2に示すとおりである。
コントローラ20は、レーザユニット1の使用光源をレーザ光源3(アルゴンレーザ光源)に設定すると共に、光路切替ユニット10,13の設定素子を、図3に示すとおり、ダイクロイックミラー10D,13Dの組み合わせに設定する。同時に第1のフィルタ10Eと第2のフィルタ10Fも光路R1,R2に挿入される。
コントローラ20は、レーザユニット1、共振型ガルバノスキャナ12、及び光検出器19を駆動し、アルゴンレーザ光で標本16の全観察領域(図3下部参照)のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本16の蛍光画像データは、コンピュータ21へ送出される。
コンピュータ21は、標本16の蛍光画像データをモニタ22へ出力し、その画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させる。ユーザは、入力器23を操作し、所望する部分領域をコンピュータ21へ指定する。ユーザが指定した部分領域の情報は、コントローラ20へと送出される。
コントローラ20は、制御型ガルバノスキャナ11のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定すると共に、レーザユニット1の使用光源をレーザ光源2,3の双方(紫外レーザ光源及びアルゴンレーザ光源)に設定する。
コントローラ20は、レーザユニット1、制御型ガルバノスキャナ11、共振型ガルバノスキャナ12、及び光検出器19を駆動し、紫外レーザ光で標本16の部分領域(図4下部参照)へ光刺激を与えると共に、アルゴンレーザ光で標本16の全観察領域(図3下部参照)のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本16の蛍光画像データは、コンピュータ21へ送出される。
コンピュータ21は、標本16の蛍光画像データをモニタ22へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激がなされたときの標本16の様子を観察することができる。コンピュータ21は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存する。(以上、ステップ6)。
以下、第3実施形態を説明する。本実施形態は、第1実施形態のシステムを利用して光刺激とイメージングとに共通の光源を使用する光刺激観察方法の実施形態である。
・レーザ光源3:アルゴンレーザ光源(波長488nm)
・ダイクロイックミラー9:488nmを含む短波長側の光を透過し、かつ488nmよりも長波長側の光を反射するもの
なお、本実施形態では、レーザ光源3,ダイクロイックミラー10D,13Dを使用しないので、これらの設定は任意である。したがって、顕微鏡本体100の設定は、第2実施形態のそれと同じでもよい。
コントローラ20は、レーザユニット1の使用光源をレーザ光源3(アルゴンレーザ光源)に設定すると共に、光路切替ユニット10,13の設定素子を、図6に示すとおり、全反射ミラー10M,13Mの組み合わせに設定する。なお、この時点では、レーザユニット1の出射光の強度は、イメージング用の強度(低強度)に設定されているものとする。
コントローラ20は、レーザユニット1、共振型ガルバノスキャナ12、及び光検出器19を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光で標本16の全観察領域(図6下部参照)のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本16の蛍光画像データは、コンピュータ21へ送出される。
コンピュータ21は、標本16の蛍光画像データをモニタ22へ出力し、その画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させる。ユーザは、入力器23を操作し、所望する部分領域をコンピュータ21へ指定する。ユーザが指定した部分領域の情報は、コントローラ20へ送出される。 (ステップ4)
コントローラ20は、制御型ガルバノスキャナ11のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定する。また、コントローラ20は、レーザユニット1の出射光の強度を、光刺激用の強度(高強度)に変更すると共に、光路切替ユニット10,13の設定素子を、図7に示すとおり、中空ブロック10B,13Bの組み合わせに変更する。
コントローラ20は、レーザユニット1及び制御型ガルバノスキャナ11を駆動して、高強度のアルゴンレーザ光で標本16の部分領域(図7下部参照)へ光刺激を与える。なお、このときにはイメージングの必要は無く、光検出器19を駆動する必要は無い。
コントローラ20は、レーザユニット1の出射光の強度を、イメージング用の強度(低強度)に変更すると共に、光路切替ユニット10,13の設定素子を、図6に示すとおり、全反射ミラー10M,13Mの組み合わせに変更する。
コントローラ20は、レーザユニット1、共振型ガルバノスキャナ12、及び光検出器19を駆動して、低強度のアルゴンレーザ光で標本16の全観察領域(図6下部参照)のイメージングを行う。このイメージングで取得された標本16の蛍光画像データは、コンピュータ21へ送出される。
コンピュータ21は、標本16の蛍光画像データをモニタ22へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激直後の標本16の様子を観察することができる。コンピュータ21は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存する(以上、ステップ8)。
なお、上述した顕微鏡本体100では、光源ユニット1に搭載される光源を2種類としたが、3種類以上としてもよい。刺激用レーザ光源3に可視光のレーザ(波長430nmなど)を用いてもよい。紫外レーザ光源、アルゴンレーザ光源の他に、2光子刺激に用いられるIRレーザ光源(例えば波長710nm)や波長可変のIRレーザ光源(例えば波長760nmから960nm)などを搭載してもよい。また、複数のIRレーザ光源や複数波長を同時出力するIRレーザ光源を使用して、2光子で刺激とイメージングを行ってもよい。
さらに望ましくは、これらの反射波長帯域の90%以上の領域で反射率98%以上であれば、波長特性が十分均一であると見なすことができ、ダイクロイックミラー10D,13Dの入射角に依存する波長特性(反射率)の変化も小さくな。これにより、標本16の観察領域の蛍光画像データを、全視野で良好なSN比で取得することができる。
最後に、第4実施形態として、ハーフミラーを使用した光刺激観察方法の1例を簡単に説明する。ここでは、顕微鏡本体100の設定内容が第3実施形態のそれと同じであるとの前提で説明する。
コントローラ20は、レーザユニット1の使用光源をレーザ光源3(アルゴンレーザ光源)に設定すると共に、光路切替ユニット10,13の設定素子をハーフミラーに設定する。なお、この時点では、レーザユニット1の出射光の強度は、イメージング用の強度(低強度)に設定されているものとする。
コントローラ20は、レーザユニット1、共振型ガルバノスキャナ12、及び光検出器19を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光で標本16の全観察領域のイメージングを行う。イメージングで取得された標本16の蛍光画像データは、コンピュータ21へ送出される。
コンピュータ21は、標本16の蛍光画像データをモニタ22へ出力し、その画面上で、ユーザに対し光刺激を行うべき一つまたは複数の部分領域を指定させる。ユーザは、入力器23を操作し、所望する部分領域をコンピュータ21へ指定する。ユーザが指定した部分領域の情報は、コントローラ20へ送出される。
コントローラ20は、制御型ガルバノスキャナ11のスキャン領域を、ユーザの指定した一つまたは複数の部分領域に設定する。また、コントローラ20は、レーザユニット1の出射光の強度を、光刺激用の強度(高強度)に変更する。
コントローラ20は、レーザユニット1及び制御型ガルバノスキャナ11を駆動し、高強度のアルゴンレーザ光で標本16の部分領域へ光刺激を与える。なお、このときには光検出器19を駆動する必要は無い。
コントローラ20は、レーザユニット1のレーザ光源3(アルゴンレーザ光源)の強度を低強度(イメージング用)に変更する。
コントローラ20は、レーザユニット1、共振型ガルバノスキャナ12、及び光検出器19を駆動し、低強度のアルゴンレーザ光で標本16の全観察領域のイメージングを行う。取得された標本16の蛍光画像データは、コンピュータ21へ送出される。
コンピュータ21は、標本16の蛍光画像データをモニタ22へ出力する。その画面上で、ユーザは、光刺激直後の標本16の様子を観察することができる。コンピュータ21は、その蛍光画像データを、必要に応じて保存する(以上、ステップ8)。
Claims (11)
- 光源部からの光を被観察面へ導き、該被観察面からの光を検出器へ導く光路分割手段と、
前記光路分割手段と前記被観察面との間に配置され、かつ前記光路分割手段と前記被観察面との間の光路を、経路の異なる第1光路と第2光路との間で分離する光路切替手段と、
前記第1光路へ配置された第1のスキャナと、
前記第2光路へ配置され、かつ前記第1のスキャナとは独立に駆動される第2のスキャナとを備え、
前記光路切替手段は、
前記第1光路及び前記第2光路の一方の分岐箇所に配置された第1の光路切替ユニットと、
前記第1光路及び前記第2光路の他方の分岐箇所に配置された第2の光路切替ユニットとからなり、
前記第1の光路切替ユニットと前記第1のスキャナとの間、及び前記第1の光路切替ユニットと前記第2のスキャナとの間にそれぞれ配置された複数のフィルタをさらに備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。 - 前記フィルタは、前記第1の光路切替ユニットに設けられた保持部材により保持されていることを特徴とする請求項1に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記第1の光路切替ユニット及び前記第2の光路切替ユニットは、ミラー、ビームスプリッタの少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記ビームスプリッタが複数の透過帯域を有するダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項3は記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記ビームスプリッタは、反射帯域と、反射帯域より短波長側の透過帯域を有するダイクロイックミラーであり、反射帯域は、波長幅70nm以上で反射率95%以上であることを特徴とする請求項4に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記ビームスプリッタは、反射帯域と、反射帯域より短波長側の透過帯域を有するダイクロイックミラーであり、反射帯域は、波長幅130nm以上で反射率95%以上であることを特徴とする請求項4に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記ビームスプリッタは、反射帯域と、反射帯域より短波長側の透過帯域を有するダイクロイックミラーであり、反射帯域は、波長幅260nm以上で反射率95%以上であることを特徴とする請求項4に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記ダイクロイックミラーは、反射波長帯域の90%以上の領域で反射率98%以上であることを特徴とする請求項1〜7の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記第1の光路切替ユニット及び前記第2の光路切替ユニットは同じ歯数の歯車が形成されたターレットからなり、前記歯車が互いに噛み合うように隣接配置されていることを特徴とする請求項1〜8に記載のレーザ走査顕微鏡。
- 前記光源部は、
波長の異なる複数種類の光源、複数の赤外光光源、又は複数の異なる波長の赤外光を出射する1つの光源を備えることを特徴とする請求項1〜9の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡。 - 前記第1のスキャナ及び前記第2のスキャナの少なくとも一方は共振型ガルバノスキャナであることを特徴とする請求項1〜10の何れか一項に記載のレーザ走査顕微鏡。
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