JP5170734B2 - Gene screening methods and gene sets for cancer testing - Google Patents

Description

本発明は、早期がんの検査方法に関する。より詳しくは、サンプル中（血液、便など）の特定遺伝子セットの発現を指標としたがん細胞のスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a method for examining early cancer. More specifically, the present invention relates to a method for screening cancer cells using the expression of a specific gene set in a sample (blood, feces, etc.) as an index.

日本人のがん死亡の原因で最も多いのは胃がんである。しかし、近年胃がんは減少傾向にあり、それに代って増加傾向の著しいのが大腸がんである。全がん死亡者の中にしめる大腸がんの割合は、1955年から年々確実に増えており、21世紀には死亡者数は胃がんを抜いてトップになるともいわれている。   Gastric cancer is the most common cause of cancer death in Japanese. However, gastric cancer has been decreasing in recent years, and colon cancer has been increasing significantly instead. The proportion of colorectal cancer among all cancer deaths has steadily increased year by year since 1955, and it is said that the number of deaths surpasses stomach cancer in the 21st century.

一方で、大腸がんは進行が比較的緩やかであり、進行がんでも治癒切除が完全に行なわれれば予後は比較的良好であり、Dukes A, Dukes B, Dukes Cそれぞれの５年生存率は 95％、80％、50〜60％とされている。しかし、かなり進行するまで自覚症状が少なく確定診断時にすでに転移や浸潤などを起こして切除不可能な場合も少なくない。このため、早期発見が強く求められている(参考:国立がんセンター がんの統計)。   On the other hand, the progression of colorectal cancer is relatively slow, and the prognosis is relatively good if complete curative resection is performed even for advanced cancer. The 5-year survival rates of Dukes A, Dukes B, and Dukes C are 95%, 80%, 50-60%. However, there are few cases in which subjective symptoms are few until they progress considerably, and metastasis or infiltration has already occurred at the time of definitive diagnosis and cannot be removed. For this reason, early detection is strongly demanded (Reference: National Cancer Center Cancer Statistics).

現在、大腸がんの検診には主に便潜血反応という方法が用いられている。便潜血検査とは血液中のヘモグロビンを化学的に測定し、肉眼ではそれとは認識できない大腸の内腔表面からの出血を検出する方法である。この方法は非常に鋭敏で、便に血液がごく微量混じっているだけでも検出が可能である。しかしながら、化学的便潜血反応は、感度は良いが、ヒトのヘモグロビンに特異的ではなく、食物として食べた肉や緑色野菜、薬物などとも反応して偽陽性が見られるため、検査前には厳密な食事制限を必要とする。   Currently, a method called fecal occult blood reaction is mainly used for screening for colorectal cancer. The fecal occult blood test is a method in which hemoglobin in the blood is chemically measured to detect bleeding from the luminal surface of the large intestine that cannot be recognized by the naked eye. This method is very sensitive and can be detected even with a very small amount of blood in the stool. However, the chemical fecal occult blood reaction has good sensitivity, but is not specific to human hemoglobin, and it reacts with meat, green vegetables, drugs, etc. eaten as food, so it is strictly before testing. Need a dietary restriction.

さらに近年、抗体を用いて便中のヒトヘモグロビンを特異的に検出する免疫学的便潜血反応という手法が開発され、この方法が実際の検査に現在用いられている。免疫学的便潜血反応は、便中のヒトヘモグロビンを特異的に検出するが、ヘモグロビンは便中では壊れやすいため、免疫法では壊れたヘモグロビンは測定できないという問題がある。   Furthermore, in recent years, a technique called immunological fecal occult blood reaction that specifically detects human hemoglobin in feces using an antibody has been developed, and this method is currently used in actual tests. The immunological fecal occult blood reaction specifically detects human hemoglobin in the stool, but since hemoglobin is fragile in the stool, there is a problem in that broken hemoglobin cannot be measured by the immunization method.

また、この方法における陽性率は進行がんでは90%であるが、早期がんと進行がんをあわせた全ステージでは50%に過ぎない(非特許文献２参照)。すなわち、大腸がん患者の2人に1人は見逃される可能性がある。また、出血を確認する検査方法であるためがん以外の痔でも陽性になり、陽性反応が出た人の中で実際に大腸がんである確率(陽性的中率)は約1〜2%程度でしかない(非特許文献３参照)。さらに、偽陽性率(健常人が陽性になる確率)は5〜10%であり、更なる改善が望まれている。   Further, the positive rate in this method is 90% in advanced cancer, but it is only 50% in all stages including early cancer and advanced cancer (see Non-Patent Document 2). That is, one in two people with colorectal cancer can be missed. In addition, because it is a test method to check bleeding, the probability of having colon cancer among those who have tested positive for non-cancer sputum (positive predictive value) is about 1-2% (See Non-Patent Document 3). Furthermore, the false positive rate (probability that a healthy person becomes positive) is 5 to 10%, and further improvement is desired.

これに対し、腫瘍マーカーによる診断方法も提案されている。大腸がんの腫瘍マーカーとしては、Carcinoembryonic antigen (CEA)、CA19-9、NCC-ST-439、STNなどがあるが、治療効果の判定や再発のモニターとして用いられている(非特許文献１参照)。便中のDNA(K-RAS、P53、APCなど)のmutationをターゲットにする方法も研究されている。しかしながら、便中のDNA(K-RAS、P53、APCなど)のmutationをターゲットにする方法は、実用化へのハードルが高く、まだ研究段階である。   On the other hand, a diagnostic method using a tumor marker has also been proposed. As a tumor marker for colorectal cancer, there are Carcinoembryonic antigen (CEA), CA19-9, NCC-ST-439, STN, etc., which are used for determination of therapeutic effect and monitor for recurrence (see Non-Patent Document 1). ). A method for targeting mutation of DNA (K-RAS, P53, APC, etc.) in stool is also being studied. However, methods for targeting the mutation of fecal DNA (K-RAS, P53, APC, etc.) have high hurdles for practical use and are still in the research stage.

腫瘍マーカーによる方法においてすら、病期別腫瘍マーカー陽性率は治癒切除可能なDukes Cにおいても、CEA、CA19-9、NCC-ST-439、STNで各々36%、30%、35%、21%にすぎず、早期大腸がんの発見に関して十分な腫瘍マーカーであるとはいえないものであった(非特許文献１参照)。
大倉久直他 大腸がんの腫瘍マーカー、CRC1(4)、42-47、1992 Launoy G et al., Int. J. Cancer, 1997, 73: 220-224 Jack SM, et al., N. Engl. J. Med., 2000, 343(22):1603-1607 Even in the tumor marker method, the tumor marker positive rate by stage is 36%, 30%, 35%, and 21% in CEA, CA19-9, NCC-ST-439, and STN, respectively, even in Dukes C, which can be curatively resected However, it was not a sufficient tumor marker for the detection of early colorectal cancer (see Non-Patent Document 1).
Hisao Naokura et al. Tumor marker for colorectal cancer, CRC1 (4), 42-47, 1992 Launoy G et al., Int. J. Cancer, 1997, 73: 220-224 Jack SM, et al., N. Engl. J. Med., 2000, 343 (22): 1603-1607

本発明の課題は、従来の方法に比べて高精度にがん患者を検出することが可能ながんの早期診断方法を提供することにある。   The subject of this invention is providing the cancer early diagnosis method which can detect a cancer patient with high precision compared with the conventional method.

上記課題を解決するため、本発明者らは検討を重ねた結果、便中から回収した細胞の遺伝子発現を分析することによりがん細胞をスクリーニングする方法、及びその遺伝子セットを見出した。   In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made extensive studies and found a method for screening cancer cells by analyzing gene expression of cells collected from feces and a gene set thereof.

本発明に係る便中の大腸がん細胞を検出する方法は、
（ｉ）検出の対象となる遺伝子群を、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別する工程、
（ｉｉ）便中における前記選別された遺伝子群の発現を分析することで、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出する工程、
を有しており、
前記（ｉ）の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより行われ、
該選別された遺伝子群が、表１に記載の７７種の遺伝子から選択されるものであり、
ＪＵＮＤおよびＴＰＴ１と、さらに表３に記載の２６種の遺伝子から選択される２種とを少なくとも含む、
ことを特徴とする大腸がん細胞の検出方法である。

The method for detecting colorectal cancer cells in stool according to the present invention comprises:
(I) selecting a gene group to be detected based on the results of expression analysis in cancer cells and normal cells;
(Ii) a step of detecting cancer cells without sieving with normal cells by analyzing expression of the selected genes in the stool;
Have
The selection of the gene group in the step (i) is performed by comparing gene expression of cells in the stool of a healthy person and a cancer patient,
The selected gene group is selected from the 77 genes listed in Table 1,
Including at least a JUND and TPT1, two and which is further selected from the 26 genes listed in Table 3,
This is a method for detecting colorectal cancer cells.

本発明は、便中から回収した細胞の遺伝子発現を分析することによりがん細胞、特に大腸がん細胞をスクリーニングする方法、及びその遺伝子セットを提供する。便から回収された細胞について、本発明の方法でスクリーニングされた遺伝子の発現を調べることによって高精度に大腸がんの早期診断が可能となる。   The present invention provides a method for screening cancer cells, particularly colon cancer cells, by analyzing gene expression of cells collected from feces, and a gene set thereof. By examining the expression of genes screened by the method of the present invention for cells collected from stool, early diagnosis of colorectal cancer becomes possible with high accuracy.

本発明は、便中から回収される細胞において、正常細胞のほとんどは死んでおり、がん細胞のみが生きているという特徴（Matsushita, H. et al. Gastroenterology 129, 1918-1927 (2005)）を利用した点に特徴がある。便中のがん細胞を検出するための遺伝子セットは生存する正常細胞及び生存するがん細胞で発現が確認され、死滅した細胞では発現が確認されない遺伝子群から選抜される。このようにして選抜された遺伝子の、便中から回収された細胞における発現を分析することによって、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出することが可能となる。   The present invention is characterized in that, in cells collected from feces, most normal cells are dead and only cancer cells are alive (Matsushita, H. et al. Gastroenterology 129, 1918-1927 (2005)). It is characterized by the use of. A gene set for detecting cancer cells in the stool is selected from a group of genes whose expression is confirmed in living normal cells and living cancer cells and whose expression is not confirmed in dead cells. By analyzing the expression of the gene thus selected in cells collected from the stool, cancer cells can be detected without sifting with normal cells.

本発明の便中のがん細胞を検出する方法は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を少なく
とも有する。
（ｉ）以下の（１）〜（３）の条件を満たす遺伝子群を、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別する工程。 The method for detecting cancer cells in stool of the present invention has at least the following steps (i) and (ii).
(I) A step of selecting a gene group satisfying the following conditions (1) to (3) based on the results of expression analysis in cancer cells and normal cells.

（１）生存する正常細胞で発現が確認される、
（２）生存するがん細胞で発現が確認される、
（３）死滅した細胞では発現が確認されない。
（ｉｉ）便中における前記選別された遺伝子群の発現を分析することで、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出する工程。
但し、ＳＥＰＰ１（NM_005410）、ＲＰＬ２７Ａ（NM_000990）、ＡＴＰ１Ｂ１（NM_001677）、ＳＦＮ（NM_006142）、ＲＰＳ１１（NM_001015）、ＲＰＬ２３（NM_000978）は工程（ｉ）で選別される遺伝子群から除外する（遺伝子名カッコ内にAccession Numberを付す）。 (1) Expression is confirmed in living normal cells,
(2) expression is confirmed in a living cancer cell,
(3) Expression is not confirmed in dead cells.
(Ii) A step of detecting cancer cells by analyzing the expression of the selected gene group in the stool without sieving with normal cells.
However, SEPP1 (NM_005410), RPL27A (NM_000990), ATP1B1 (NM_001677), SFN (NM_006142), RPS11 (NM_001015), and RPL23 (NM_000978) are excluded from the gene group selected in step (i) (in parentheses in gene name) With an Accession Number).

（ｉ）の工程での遺伝子の発現分析は、がん細胞あるいは正常細胞から抽出したmRNA（mRNAから調製されたcDNA、cRNAなどの核酸試料を含む）を、発現の有無を検証したい遺伝子を検出するための核酸プローブとハイブリダイゼーションさせることにより行うことができる。検証対象として、ヒトゲノムがコードする全遺伝子を対象とすることができる。また、公共のデータベースから取得した情報に基づいて選別した、上記条件（１）を満たす遺伝子を対象として、上記条件（２）および（３）の条件を満たす遺伝子を選別することで細胞の発現分析を行ってもよい。   The gene expression analysis in the step (i) detects a gene whose mRNA is extracted from cancer cells or normal cells (including nucleic acid samples such as cDNA and cRNA prepared from mRNA) and whose expression is to be verified. This can be performed by hybridization with a nucleic acid probe. All genes encoded by the human genome can be targeted for verification. Moreover, cell expression analysis is performed by selecting genes satisfying the above condition (2) and (3) for genes satisfying the above condition (1) selected based on information obtained from a public database. May be performed.

（ｉ）の工程で用いるがん細胞としては、あらゆる種類のがん化した細胞が対象となるが、（ｉｉ）の工程で検出しようとするがん細胞であることが好ましい。   The cancer cells used in the step (i) are all types of cancerous cells, but are preferably cancer cells to be detected in the step (ii).

（ｉｉ）の工程での便中における遺伝子群の発現は、便から直接調製したmRNA、
タンパク質などを試料として分析してもよいが、好ましくは便に含まれる細胞を回収し、回収された細胞から調製したmRNAまたはタンパク質を試料として分析する。細胞の回収には、細胞表面に発現する蛋白質に対する抗体を用いたアフィニティー精製などの慣用技術を用いることができる。 The expression of genes in stool in the step (ii) is mRNA directly prepared from stool,
Protein or the like may be analyzed as a sample, but preferably cells contained in stool are collected, and mRNA or protein prepared from the collected cells is analyzed as a sample. For the cell recovery, a conventional technique such as affinity purification using an antibody against a protein expressed on the cell surface can be used.

（ii）の工程での遺伝子群の発現分析は、（i）の工程で選別された遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ、翻訳物であるポリペプチド、さらに翻訳後の修飾を受けたタンパク質などの発現を検出することにより行うことができる。転写レベルで発現を検出する場合は、選抜された遺伝子群の各遺伝子を増幅可能なプライマーを用いてmRNA（cDNAを含む）をPCRし、予測される鎖長の増幅断片の有無を確認することで遺伝子の発現を検出できる。   The gene group expression analysis in the step (ii) is performed by expressing mRNA, which is a transcript of the gene selected in the step (i), a polypeptide which is a translation product, and a protein subjected to post-translational modification. This can be done by detecting. When detecting expression at the transcription level, PCR should be performed on mRNA (including cDNA) using primers that can amplify each gene in the selected gene group, and the presence or absence of an amplified fragment of the expected chain length should be confirmed. Can detect gene expression.

本発明での死滅した細胞の判別には、一般的な判定法である、Trypan BlueやErythrosin Bなどの色素を使用する分染法を用いることができ、死滅している細胞では色素が細胞膜を透過するため、染色される細胞を死滅した細胞と判断できる。   In the present invention, dead cells can be discriminated by using a general staining method, such as trypan blue or Erythrosin B, which is a dyeing method that uses dyes such as Trypan Blue and Erythrosin B. Since it permeates, the cells to be stained can be determined as dead cells.

以下、本発明について詳細に説明するが、いずれの記述も本発明内容を好適に実施するための一例であり、本発明による他の実施形態を制限するものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail, but any description is an example for suitably carrying out the contents of the present invention, and does not limit other embodiments according to the present invention.

本発明による大腸がんの診断に有用な情報を提供するため、大腸がん患者の便から回収した細胞で高い発現が認められ、健常者の便から回収した細胞では発現がないか極めて低いと判断された遺伝子を各種の発現解析により選び出した。   In order to provide useful information for diagnosis of colorectal cancer according to the present invention, high expression is observed in cells collected from stool of patients with colorectal cancer, and there is no or very low expression in cells collected from stool of healthy individuals The determined gene was selected by various expression analyses.

本発明の遺伝子選抜方法は、便中から回収される細胞において、正常細胞のほとんどは死んでおり、がん細胞のみが生きているという特徴を利用している。言い換えると、生存する細胞では高い発現が認められ、死滅した細胞では発現が確認されない遺伝子を選抜することであると言える。   The gene selection method of the present invention utilizes the feature that, in cells collected from feces, most normal cells are dead and only cancer cells are alive. In other words, it can be said to select genes that are highly expressed in living cells but not confirmed in dead cells.

市販のマイクロアレイにより、大腸がん患者の便から回収した細胞、健常者の便から回収した細胞、及び末梢血について、約39000遺伝子の発現プロファイルを取得した。これらの結果と公共のデータベースとを用いて77遺伝子を選抜した（表1）。本発明のスクリーニング方法で選別される遺伝子の条件の１つである、生存する正常細胞で発現が確認されるかの検証は、正常細胞で実際に発現を解析してもよいし、公共のデータベースを利用して情報を取得してもよい。正常細胞での発現を検証するために選ばれる「正常細胞」には、がん細胞でない細胞であれば限定なく用い得る。   Using a commercially available microarray, an expression profile of about 39000 genes was obtained for cells collected from the stool of colorectal cancer patients, cells collected from the stool of healthy subjects, and peripheral blood. Using these results and a public database, 77 genes were selected (Table 1). Verification of whether expression is confirmed in a living normal cell, which is one of the conditions of a gene selected by the screening method of the present invention, may be the actual expression analysis in a normal cell, or a public database You may acquire information using. The “normal cell” selected for verifying expression in normal cells can be used without limitation as long as it is not a cancer cell.

表1の77遺伝子は、大腸がん患者の便から回収した細胞において発現が認められ、健常者の便から回収した細胞においては発現が認められなかった遺伝子群である。   The 77 genes in Table 1 are a group of genes whose expression was observed in cells collected from the stool of colorectal cancer patients but not in cells collected from the stool of healthy subjects.

更に、表1の遺伝子群の中から末梢血において発現が認められなかった遺伝子を選抜した（表2）。表2に示した遺伝子群は、回収された検体中に血液が含まれていたとしても正しくがん細胞の有無を検出することができることから、大腸がんの検査で問題になっている痔による擬陽性判定を減らすことが可能である。   Furthermore, genes that were not expressed in peripheral blood were selected from the gene group shown in Table 1 (Table 2). The gene groups shown in Table 2 can accurately detect the presence or absence of cancer cells even if blood is contained in the collected specimens. It is possible to reduce false positive determination.

また、上記の方法で選抜された遺伝子（表１に記載の７７種）はリボソーマル蛋白質遺伝子を多く含んでいる(表3参照)。具体的には表３に挙げる２６種のリボソーマルタンパク質遺伝子である。一般にリボソーマル蛋白質遺伝子の発現は細胞の成長速度に比例している。がん細胞がとりわけ成長速度が速いこと、また便から回収された細胞において正常細胞のほとんどが死んでいるということから、リボソーマル蛋白質遺伝子の発現を分析することによる便を検体とした大腸がんスクリーニングが有用であることが見出された。すなわち、今回選抜された以外のリボソーマル蛋白質遺伝子もスクリーニングに有用であるといえる。よって、公知のリボソーマル蛋白質遺伝子の一部または全部を用いてスクリーニング方法の工程（ii）のがん細胞の検出を行ってもよいし、工程（i）で選別する遺伝子群に含まれるリボソーマル蛋白質遺伝子群を用いて工程（ii）のがん細胞の検出を行ってもよい。   In addition, the genes selected by the above method (77 species described in Table 1) contain many ribosomal protein genes (see Table 3). Specifically, it is 26 kinds of ribosomal protein genes listed in Table 3. In general, the expression of a ribosomal protein gene is proportional to the cell growth rate. Colorectal cancer screening using stool specimens by analyzing the expression of ribosomal protein genes because cancer cells have a particularly fast growth rate and most normal cells are dead in cells collected from stool. Was found to be useful. That is, it can be said that ribosomal protein genes other than those selected this time are also useful for screening. Therefore, detection of cancer cells in step (ii) of the screening method may be performed using a part or all of known ribosomal protein genes, or ribosomal protein genes contained in the gene group selected in step (i) You may detect the cancer cell of a process (ii) using a group.

本発明によるがん細胞のスクリーニング方法は、工程（i）で選抜される遺伝子群として上記表1、表2、または表3に記載の遺伝子セットを用いて、工程（ii）の大腸がん細胞のスクリーニングを好適に行うことができる。工程（ii）のスクリーニングは遺伝子セットから選択した2種以上の遺伝子の発現の有無もしくは発現量を測定することによって行なう。遺伝子の発現の有無もしくは発現量は、検体サンプル中のmRNAの有無もしくは量を測定しても良いし、該遺伝子産物である蛋白の有無もしくは量を免疫染色やELISAを用いて検出しても良い。   The cancer cell screening method according to the present invention uses the gene set described in Table 1, Table 2, or Table 3 as the gene group selected in Step (i), and colon cancer cells in Step (ii). Can be suitably screened. The screening in step (ii) is performed by measuring the presence or absence or expression level of two or more genes selected from the gene set. The presence / absence or expression level of the gene may be determined by measuring the presence / absence or amount of mRNA in the sample, or the presence / absence or amount of the protein that is the gene product may be detected using immunostaining or ELISA. .

便から回収された細胞から抽出される検体RNAは一般に微量（サブマイクログラム）であることが多いため、遺伝子の発現を調べるためには通常増幅工程が必要とされる。増幅方法としては、in vitro transcription反応が一般的に用いられる。増幅処理後、RT-PCR反応等によって表1、表2、表3に記載された遺伝子セットから選択した遺伝子の発現の有無を調べることができる。また、一度に多数の遺伝子発現を調べる方法としては、DNAマイクロアレイが好適に利用可能である。   Since sample RNA extracted from cells collected from stool is generally very small (submicrogram), an amplification step is usually required to examine gene expression. As an amplification method, in vitro transcription reaction is generally used. After the amplification treatment, the presence or absence of expression of a gene selected from the gene set described in Table 1, Table 2, or Table 3 can be examined by RT-PCR reaction or the like. Moreover, as a method for examining the expression of a large number of genes at once, a DNA microarray can be suitably used.

工程（ｉｉ）の遺伝子発現分析には、工程（ｉ）で選抜された遺伝子群の各遺伝子の転
写産物を特異的に増幅するためのプライマー、または遺伝子群の各遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズするプローブを設計して用いることができる。便中のがん細胞検出用プローブには、遺伝子セットにおける各遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡまたはそのｃＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列からなるプローブが好適である。ここで、遺伝子の転写産物には、ｍＲＮＡのほかにｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ，ｃＲＮＡの配列が含まれる。本発明は、これらのプライマーまたはプローブを含む、便中のがん細胞検出用キットを包含する。また本キットは、ＰＣＲあるいはハイブリダイゼーションに用いる試薬を含む構成とすることができる。 In the gene expression analysis in the step (ii), a primer for specifically amplifying a transcription product of each gene of the gene group selected in the step (i) or a transcription product of each gene of the gene group Hybridizing probes can be designed and used. The probe for detecting cancer cells in the stool is preferably a probe comprising a nucleic acid sequence that hybridizes with mRNA or its cRNA, which is a transcription product of each gene in a gene set, under stringent conditions. Here, in addition to mRNA, gene transcription products include cDNA and cRNA sequences prepared from mRNA. The present invention includes a kit for detecting cancer cells in stool containing these primers or probes. In addition, the kit can include a reagent used for PCR or hybridization.

本発明で選抜された遺伝子は、便から回収された細胞中の大腸がん細胞の有無に強い相関を有するため、その発現レベルを測定することにより、大腸がん細胞のスクリーニングを行うことが出来る。回収された細胞中に微量でもがん細胞が含まれていれば検出可能であるため、特に大腸がんの早期診断に好適に用いることが可能である。   Since the gene selected in the present invention has a strong correlation with the presence or absence of colon cancer cells in cells collected from stool, colon cancer cells can be screened by measuring their expression levels. . Since even a trace amount of cancer cells can be detected in the collected cells, it can be detected, and thus can be suitably used particularly for early diagnosis of colorectal cancer.

本発明のがん細胞のスクリーニング方法は、標識されたプローブの蛍光強度や放射線強度により、各遺伝子の発現レベルを高感度に測定することができる。測定にあたっては、各遺伝子、検体ごとにしかるべき規格化を行い、各検体間で比較可能な判定を行うことで、より精度の高い判定が可能になる。例えば検体ごとにRNAの回収量に差がある場合には、細胞ごとに一定量の発現が知られているハウスキーピング遺伝子(例えばベータアクチン)などの発現量との比較を行うことで、その回収量の補正を行うことが可能である。   The screening method for cancer cells of the present invention can measure the expression level of each gene with high sensitivity based on the fluorescence intensity and radiation intensity of the labeled probe. In the measurement, appropriate standardization is performed for each gene and specimen, and judgment that can be compared between specimens is performed, so that judgment with higher accuracy is possible. For example, if there is a difference in the amount of RNA recovered from sample to sample, the amount is recovered by comparing with the expression level of a housekeeping gene (for example, beta actin) that is known to express a certain amount for each cell. It is possible to correct the amount.

大腸がん細胞のスクリーニングは、上記のような遺伝子（mRNA）の解析のほか、表1、表2、及び表3に記載の遺伝子の翻訳産物である蛋白の発現量を解析することによっても実施可能である。遺伝子産物である蛋白の発現量の解析は、当該蛋白に特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法などの周知の方法によって実施できる。よって、本発明には、便中のがん細胞を検出するための抗体であって、遺伝子セットにおける各遺伝子から翻訳されるポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体が含まれる。   In addition to the above gene (mRNA) analysis, colorectal cancer cell screening is also performed by analyzing the expression level of the protein that is the translation product of the genes listed in Table 1, Table 2, and Table 3. Is possible. Analysis of the expression level of a protein that is a gene product can be performed by a well-known method such as Western blotting, dot blotting, slot blotting, ELISA, and RIA using an antibody specific to the protein. Therefore, in the present invention, an antibody for detecting cancer cells in stool, which is derived from a polypeptide translated from each gene in a gene set and specifically binds to the polypeptide Is included.

本発明は、便中のがん細胞を検出するためのマーカー遺伝子セットであって、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別される、以下の（１）〜（３）の条件を満たす遺伝子群（但し、ＳＥＰＰ１、ＲＰＬ２７Ａ，ＡＴＰ１Ｂ１、ＳＦＮ、ＲＰＳ１１、ＲＰＬ２３を除く）のいずれ２種以上の遺伝子もしくはその遺伝子発現産物からなる、便中のがん細胞検出用マーカー遺伝子セットを包含する。
（１）生存する正常細胞で発現が確認される、
（２）生存するがん細胞で発現が確認される、
（３）死滅した細胞では発現が確認されない。 The present invention is a marker gene set for detecting cancer cells in stool, and is selected based on the results of expression analysis in cancer cells and normal cells, as described in (1) to (3) below. Includes a marker gene set for detecting cancer cells in stool, consisting of any two or more genes of gene groups that satisfy the conditions (except SEPP1, RPL27A, ATP1B1, SFN, RPS11, and RPL23) or gene expression products thereof. To do.
(1) Expression is confirmed in living normal cells,
(2) expression is confirmed in a living cancer cell,
(3) Expression is not confirmed in dead cells.

本発明のマーカー遺伝子は、便を検体として用いる場合に、がん細胞の存在を示す指標となる遺伝子もしくは遺伝子発現産物である。遺伝子発現産物とは、遺伝子の発現量と相関する物質であって、遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ（ｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡを含む）、翻訳物であるポリペプチド、さらに翻訳後の修飾を受けたタンパク質などを含む。遺伝子の発現分析（遺伝子間の発現比較を含む）は、転写レベル（ｍＲＮＡ量）または翻訳レベル（タンパク質量）でのマーカー遺伝子の発現の有無あるいは発現量を測定することにより行うことができる。   The marker gene of the present invention is a gene or gene expression product that serves as an indicator of the presence of cancer cells when stool is used as a specimen. A gene expression product is a substance that correlates with the expression level of a gene, and is a gene transcript mRNA (including cDNA obtained from mRNA), a translation polypeptide, and further post-translational modifications. Including protein. Gene expression analysis (including comparison of expression between genes) can be performed by measuring the presence or absence or expression level of the marker gene at the transcription level (mRNA amount) or translation level (protein amount).

上記条件（２）のがん細胞とは、あらゆる種類のがん化した細胞を含み得るが、好ましくは、便中から検出しようとする種類のがん細胞である。そのような好ましい態様の一つでは、マーカー遺伝子セットは、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより選抜された、表１に記載の７７種のいずれか２種以上の遺伝子もしくは遺伝子発現産物からなる。マーカー遺伝子セットは、特に大腸がん細胞の検出に好適に用いることができる。また、マーカー遺伝子セットは、末梢血で発現が確認される遺伝子を排除した構成とすることで痔による擬陽性判定を減らすことができ好ましい。そのような好ましい態様の一つでは、マーカー遺伝子セットは、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより選抜された、表２に記載の４８種のいずれか２種以上の遺伝子もしくは遺伝子発現産物からなる。さらに、本発明は、リボソーム蛋白質遺伝子群（但し、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＳ１１、ＲＰＬ２３を除く）の２種以上の遺伝子もしくは遺伝子発現産物からなる、便中のがん細胞検出用マーカー遺伝子セットを包含する。そのような好ましい態様の一つは、健常者とがん患者の便中の細胞のリボソーム蛋白質遺伝子の発現を比較することにより選抜された、２種以上のリボソーム蛋白質遺伝子もしくはその遺伝子発現産物からなる便中のがん細胞検出用マーカー遺伝子セットである。そのようなマーカー遺伝子セットとして、表３に記載の２６種のいずれか２種以上の遺伝子もしくは遺伝子発現産物からなるものが好適である。   The cancer cells of the above condition (2) can include all types of cancerous cells, but are preferably the types of cancer cells to be detected in stool. In one such preferred embodiment, the marker gene set is selected from any of the 77 species listed in Table 1 selected by comparing the gene expression of cells in the stool of healthy subjects and cancer patients. It consists of more than species genes or gene expression products. The marker gene set can be suitably used particularly for detection of colorectal cancer cells. In addition, the marker gene set is preferably configured to exclude genes whose expression is confirmed in peripheral blood, thereby reducing false positive determination due to sputum. In one such preferred embodiment, the marker gene set is selected from any of the 48 species listed in Table 2 selected by comparing the gene expression of cells in the stool of healthy subjects and cancer patients. It consists of more than species genes or gene expression products. Furthermore, the present invention includes a marker gene set for detecting cancer cells in stool, comprising two or more genes or gene expression products of a ribosomal protein gene group (excluding RPL27A, RPS11, and RPL23). One of such preferred embodiments comprises two or more ribosomal protein genes or gene expression products thereof selected by comparing the expression of ribosomal protein genes in the stool of healthy subjects and cancer patients. It is a marker gene set for detecting cancer cells in feces. As such a marker gene set, those consisting of any two or more of the 26 types of genes or gene expression products described in Table 3 are suitable.

表のAccession Numberの欄には、The International Nucleotide Sequence Databases（INSD）における登録番号を記載している。   In the Accession Number column of the table, the registration number in The International Nucleotide Sequence Databases (INSD) is described.

以下、具体的な実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples.

（実施例１）遺伝子の選抜方法
＜（1）便からの細胞分離＞
発現解析に用いるがん細胞を分離するために手術前の大腸がん患者由来便を検体として使用した。便の使用に関しては事前に被験者へ実験内容の説明を行い、同意を得た。 (Example 1) Gene selection method <(1) Cell separation from stool>
In order to isolate cancer cells used for expression analysis, stool derived from a colon cancer patient before surgery was used as a specimen. Regarding the use of stool, we explained the contents of the experiment to the subjects in advance and obtained consent.

便（約5〜80g）が入ったストマッカーバッグに200mlの10%FBS含有Hanks液（ニッスイ）を入れ、シールした後、ストマッカーを用いて（200rpm，1min）便の懸濁液を作成した。   200 ml of 10% FBS-containing Hanks solution (Nissui) was placed in a stomacher bag containing stool (about 5 to 80 g), sealed, and then a stool suspension was prepared using the stomacher (200 rpm, 1 min).

フィルタ付きストマッカーバッグを使用した場合はバッグ内のフィルタを用いて懸濁液をろ過した。フィルターがないストマッカーバッグを使用した場合は筒状プラスチック容器にセットした漏斗型フィルタに懸濁液を通してろ過し、ろ液をビーカーに回収した。ろ液はさらに、50mlの遠沈管5本に分注した。   When a stomacher bag with a filter was used, the suspension was filtered using the filter in the bag. When a stomacher bag without a filter was used, the suspension was filtered through a funnel filter set in a cylindrical plastic container, and the filtrate was collected in a beaker. The filtrate was further dispensed into five 50 ml centrifuge tubes.

遠沈管1本当たり、40μlのBer-EP4抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、 ダイナル社）を加え、ミックスローター(VMR-5、 AS ONE社)を用いて混和し（4℃、60rpm、30分間）、ろ液中の細胞をBer-EP4抗体に結合させた。   Add 40 μl of Ber-EP4 antibody-bound magnetic beads (Dynabeads Epithelial Enrich, Dynal) per centrifuge tube, and mix using a mix rotor (VMR-5, AS ONE) (4 ° C, 60 rpm, 30 minutes) ), And the cells in the filtrate were bound to the Ber-EP4 antibody.

各遠沈管を磁石スタンド（Dynal MPC-1、ダイナル社）にセットした後、マイルドミキサー（SI-36、TAITEC社）上に横向きに置き、15分間シーソー運動を行い（60往復／1分間）、ろ液を混和し、磁気ビーズを遠沈管側壁へ集めた。   After setting each centrifuge tube on a magnet stand (Dynal MPC-1, Dynal), place it sideways on a mild mixer (SI-36, TAITEC) and perform a seesaw motion for 15 minutes (60 reciprocations / 1 minute) The filtrate was mixed and the magnetic beads were collected on the side wall of the centrifuge tube.

ろ液を除去した後、遠沈管をスタンドから外し、一本当たり500μlの10%FBS含有Hanks液を加えて、壁面に集められたビーズを洗浄した。   After removing the filtrate, the centrifuge tube was removed from the stand, and 500 μl of Hanks solution containing 10% FBS was added per bottle to wash the beads collected on the wall surface.

ビーズを含んだ洗浄液をあらかじめ500μlの10%FBS含有Hanks液が入れられたエッペンチューブ（1.5ml用）5本に回収した。軽く懸濁後、磁石スタンド（Dynal MPC-S、ダイナル社）にセットし、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた。   The washing solution containing the beads was collected in five Eppendorf tubes (for 1.5 ml) in which 500 μl of Hanks solution containing 10% FBS was previously placed. After lightly suspending, it was set on a magnet stand (Dynal MPC-S, Dynal), and magnetic beads were collected on the side wall of the Eppendorf tube.

洗浄液を除去した後、エッペンチューブをスタンドから外し、1本当たり1mlの10%FBS含有Hanks液を加えて、壁面に集められたビーズを洗浄した。同様に、チューブを磁石スタンドにセットし、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた後、上清を除去して、細胞−ビーズ複合体のペレットを得た。続いて、このペレットからISOGEN（ニッポンジーン）を使用してRNAを抽出した。   After removing the washing solution, the Eppendorf tube was removed from the stand, and 1 ml of Hanks solution containing 10% FBS was added per bottle to wash the beads collected on the wall surface. Similarly, the tube was set on a magnet stand, and magnetic beads were collected on the side wall of the Eppendorf tube, and then the supernatant was removed to obtain a cell-bead complex pellet. Subsequently, RNA was extracted from this pellet using ISOGEN (Nippon Gene).

正常細胞における発現を解析するために健常者の便を検体として、同様の方法によりRNAを抽出した。
＜（2）マイクロアレイによる約39000遺伝子の発現プロファイルの取得とマーカー遺伝子の選抜＞
（1）で抽出したtotal RNAをターゲットとしてマイクロアレイ(human U133 oligonucleotide probe arrays (Affymetrix社 米国))を用いてゲノム網羅的遺伝子発現解析を行った。実験方法は製造会社の推奨する方法に従った。以下、これについて簡単に記述する。 In order to analyze the expression in normal cells, RNA was extracted by the same method using the stool of a healthy person as a specimen.
<(2) Acquisition of approximately 39000 gene expression profiles and selection of marker genes by microarray>
Using the total RNA extracted in (1) as a target, genome-wide gene expression analysis was performed using a microarray (human U133 oligonucleotide probe arrays (Affymetrix, USA)). The experimental method followed the method recommended by the manufacturer. This is briefly described below.

ターゲットとしては大腸がん患者の便から分離した細胞RNA４サンプル、および健常者の便から分離した細胞RNA7サンプル分を混合したもの、計５サンプルについて発現解析を実施した。   As a target, expression analysis was performed on a total of 5 samples, which were a mixture of 4 cellular RNA samples isolated from stool of colon cancer patients and 7 cellular RNA samples isolated from stool of healthy subjects.

5 μg の total RNA からT7RNApolymeraseのプロモーターを有するcDNAを合成後、7-transcription法によってビオチン化cRNAプローブを作製した。次に、化学的に切断した10μg のcRNA をマイクロアレイと45 ℃、16 時間反応させた。アレイは 6xSSPEで 25 ℃で洗浄し、さらに二次洗浄液 (100 mM MES (pH6.7), 0.1 M NaCl, and 0.01% Tween 20) で50 ℃で洗浄した。次に、再会合した分子をstreptavidin phycoerythrin (Molecular Probes)で染色後、6xSSPEで洗浄し、さらにbiotinylated anti-streptavidin IgGを反応させ、streptavidin phycoerythrin で再度染色し、6xSSPEで洗浄した。マイクロアレイ上のシグナルは GeneArray scanner (Affymetrix)を用いて3μmの解像度で読み込み、その強度をコンピュータソフトMicroarray Suite 5.0 (Affymetrix)を用いて解析した。   After synthesizing a cDNA having a T7 RNA polymerase promoter from 5 μg of total RNA, a biotinylated cRNA probe was prepared by the 7-transcription method. Next, 10 μg of chemically cleaved cRNA was reacted with the microarray at 45 ° C. for 16 hours. The array was washed with 6 × SSPE at 25 ° C., and further washed with a secondary washing solution (100 mM MES (pH 6.7), 0.1 M NaCl, and 0.01% Tween 20) at 50 ° C. Next, the re-associated molecule was stained with streptavidin phycoerythrin (Molecular Probes), washed with 6xSSPE, further reacted with biotinylated anti-streptavidin IgG, stained again with streptavidin phycoerythrin, and washed with 6xSSPE. The signal on the microarray was read at a resolution of 3 μm using a GeneArray scanner (Affymetrix), and the intensity was analyzed using the computer software Microarray Suite 5.0 (Affymetrix).

遺伝子発現量の解析はMicrosoft Excelを用い、上記大腸がん症例において発現が確認され、健常者の便に含まれる細胞では発現が検出されない遺伝子を選抜した結果、77種の遺伝子が選ばれた(表1)。これら77遺伝子の全ては、便を検体とした大腸がんスクリーニングのマーカーとして発明者らが考えた条件を満たしている。   The analysis of gene expression was performed using Microsoft Excel, the expression was confirmed in the above colon cancer cases, and 77 genes were selected as a result of selecting genes whose expression was not detected in cells contained in the stool of healthy subjects ( table 1). All of these 77 genes satisfy the conditions considered by the inventors as a marker for colorectal cancer screening using stool as a specimen.

更に、末梢血で発現が検出されない遺伝子48遺伝子を77遺伝子の中から選び出した(表2)。なお、血液における発現を解析するために、末梢血を検体として用いた。RNAの抽出には末梢血をそのまま用い、ISOGEN（株式会社ニッポンジーン）にて処理を行った。このようにして選抜した48遺伝子は、検体中に血液が混入していたとしてもがん細胞の有無を判定することができ、便を検体とした大腸がんスクリーニングのマーカーとして発明者らが考えた条件を満たしている。   Furthermore, 48 genes whose expression was not detected in peripheral blood were selected from 77 genes (Table 2). In order to analyze the expression in blood, peripheral blood was used as a specimen. Peripheral blood was used for RNA extraction as it was and treated with ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.). The 48 genes selected in this way can determine the presence or absence of cancer cells even if blood is mixed in the specimen, and the inventors consider it as a marker for colorectal cancer screening using stool as a specimen. The conditions are met.

上記の方法で選抜された遺伝子はリボソーマル蛋白質遺伝子を多く含んでいる。一般にリボソーマル蛋白質遺伝子の発現は細胞の成長速度に比例している。がん細胞がとりわけ成長速度が速いこと、また便から回収された細胞において正常細胞のほとんどが死んでいるということから、リボソーマル蛋白質遺伝子の発現を分析することによる、便を検体とした大腸がんスクリーニングが有用であることが見出された。すなわち、今回選抜された以外のリボソーマル蛋白質遺伝子もスクリーニングに有用であるといえる。   Genes selected by the above method contain many ribosomal protein genes. In general, the expression of a ribosomal protein gene is proportional to the cell growth rate. Colorectal cancer using stool as a specimen by analyzing the expression of ribosomal protein gene, because cancer cells have a particularly fast growth rate and most normal cells are dead in cells collected from stool. Screening has been found useful. That is, it can be said that ribosomal protein genes other than those selected this time are also useful for screening.

（実施例2）
大腸がん患者便から分離した細胞を用いたRT-PCR解析 実施例1で選抜した77遺伝子のうちランダムに4遺伝子(RPS20、RPS29、RPL38、TXN)を選抜し、それぞれに関して4人の健常人及び4人の大腸がん患者の便から分離した細胞中のRNAを用いてRT-PCRによる発現解析を行った。なお、上記4遺伝子のプライマーは表4に示す。また、実験手順は以下の通りである。 (Example 2)
RT-PCR analysis using cells isolated from stool of colorectal cancer patients 4 genes (RPS20, RPS29, RPL38, TXN) were randomly selected from the 77 genes selected in Example 1, and 4 healthy persons were selected for each. And the expression analysis by RT-PCR was performed using RNA in the cells isolated from the stool of four colorectal cancer patients. The primers for the above 4 genes are shown in Table 4. The experimental procedure is as follows.

(i)cDNA合成(1回目)
上記で得られたtotal RNAのうち1μgをInvitrogen社製 SUPER SCRIPT Choice Systemを用
いてオリゴ(dT)プライマーによる逆転写反応を行った。total RNA(10μl)に100μMのT7-oligo dT 24 primer を1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後、氷上にて2分以上置き、急冷させた後、表5に示した試薬を加えて、37℃で2分間保温した。 (i) cDNA synthesis (first time)
1 μg of the total RNA obtained above was subjected to reverse transcription reaction with oligo (dT) primer using SUPER SCRIPT Choice System manufactured by Invitrogen. Add 1 μl (1 μg) of 100 μM T7-oligo dT 24 primer to total RNA (10 μl), and incubate at 65 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was placed on ice for 2 minutes or more and rapidly cooled, then the reagents shown in Table 5 were added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 2 minutes.

その後、SuperScriptII RTを1μl加えて、37℃で1時間保温した。こうして、1st strand cDNA溶液約20μlを回収した。   Thereafter, 1 μl of SuperScript II RT was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thus, about 20 μl of 1st strand cDNA solution was recovered.

続いて、2nd strand cDNA合成を下記に示す方法により行った。1st strand cDNA溶液に、表6に示した通りに試薬を加え、16℃で2時間保温した。   Subsequently, 2nd strand cDNA synthesis was performed by the method shown below. Reagents were added to the 1st strand cDNA solution as shown in Table 6 and incubated at 16 ° C. for 2 hours.

さらに、T4 DNA polymerase 2μlを加えて16℃で5分間保温し、2nd strand cDNAの末端を平滑化した。次に、2nd strand cDNAの精製を行った。上記の生成物に対し、表7に示した通りに試薬を加え15,000 rpmで10分間遠心した。   Furthermore, 2 μl of T4 DNA polymerase was added and incubated at 16 ° C. for 5 minutes to smooth the ends of the 2nd strand cDNA. Next, 2nd strand cDNA was purified. Reagents were added to the above product as shown in Table 7, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes.

続いて、クロロホルム150μlを加え、15,000 rpmで10分間遠心し、上清のみを採取し、別のチューブへ移した。さらに、表8に示した通りに試薬を加え室温で15分間保持し、15,000 rpmで10分間遠心し、上清のみを採取し、別のチューブへ移した。   Subsequently, 150 μl of chloroform was added and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant was collected and transferred to another tube. Furthermore, as shown in Table 8, the reagent was added and kept at room temperature for 15 minutes, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant was collected and transferred to another tube.

そして、70% エタノール500μlを加え15,000 rpmで10分間遠心し(エタノールリンス)し、今度は沈殿のみを残し、溶液を捨てた。残った沈殿に対し、表9に示した通りに試薬を加え室温で15分間保持し、15,000 rpmで10分間遠心し、沈殿のみを残して溶液を捨てた。   Then, 500 μl of 70% ethanol was added and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes (ethanol rinsing). This time, only the precipitate was left and the solution was discarded. Reagents were added to the remaining precipitate, as shown in Table 9, and kept at room temperature for 15 minutes, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the solution was discarded leaving only the precipitate.

残った沈殿に対し、70% エタノール500μlを加え15,000 rpmで10分間遠心し、溶液を捨てた。最後に、風乾させ、8μlの水に溶解させた。   To the remaining precipitate, 500 μl of 70% ethanol was added and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the solution was discarded. Finally, it was air-dried and dissolved in 8 μl of water.

(ii) cRNAの合成:in vitro transcription (1回目)
Ambion社製MEGAscriptT7Kitを用いて以下の反応を行った。(i)で作成した、cDNA溶液8μlに対し、表10に示した通りに試薬を加え、37℃で5時間保温した。次に、DNase ( RNase free ) 1μlを加え37℃で15分間保温し、DNAを除去した。 (ii) cRNA synthesis: in vitro transcription (first round)
The following reaction was performed using MEGAscriptT7Kit manufactured by Ambion. Reagents were added as shown in Table 10 to 8 μl of the cDNA solution prepared in (i) and incubated at 37 ° C. for 5 hours. Next, 1 μl of DNase (RNase free) was added and incubated at 37 ° C. for 15 minutes to remove DNA.

続いて、cRNAの精製を行った。表11に示した通りに試薬を加え15,000 rpmで5分間遠心し、さらに、イソプロパノール300μlを加えて室温で15分間保温し、15,000 rpmで10分間遠心し、上清のみを採取し、別のチューブへ移した。そして、70% エタノール500μlを加え15,000 rpmで5分間遠心し、沈殿のみを残して溶液を捨て、風乾させ、8μlの蒸留水に溶解させた。   Subsequently, cRNA was purified. Add reagents as shown in Table 11, centrifuge at 15,000 rpm for 5 minutes, add 300 μl of isopropanol, incubate at room temperature for 15 minutes, centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes, collect only the supernatant, and separate the tube. Moved to. Then, 500 μl of 70% ethanol was added and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes. The solution was discarded leaving only the precipitate, air-dried, and dissolved in 8 μl of distilled water.

(iii) cDNA合成(2回目)
上記で得られたcRNA溶液に対し、ランダムヘキサマープライマーを用いて2回目の逆転写反応を行った。0.5μg/μl ランダムヘキサマーを1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後氷上にて2分以上置き、急冷させた後、前述の表12に示した通りに試薬を加えて、37℃で2分間保温する。その後、SuperScriptII RTを1μl加えて、37℃で1時間保温する。こうして、1st strand cDNA溶液約20μlを回収した。続いて、RNase H 1μlを加えてRNAの除去を行う。37℃で20分間保温し、RNAとDNAを離すため95℃で2分間保温し、その後氷上にて2分以上置き、急冷させる。 (iii) cDNA synthesis (second time)
A second reverse transcription reaction was performed on the cRNA solution obtained above using a random hexamer primer. Add 0.5 µg / µl of random hexamer (1 µg) and incubate at 65 ° C for 10 minutes. Then, place on ice for 2 minutes or more, quench, add reagents as shown in Table 12 above, and incubate at 37 ° C for 2 minutes. Then add 1 μl of SuperScript II RT and incubate at 37 ° C. for 1 hour. Thus, about 20 μl of 1st strand cDNA solution was recovered. Subsequently, RNA is removed by adding 1 μl of RNase H. Incubate at 37 ° C for 20 minutes, incubate at 95 ° C for 2 minutes to separate RNA and DNA, then place on ice for at least 2 minutes to cool down.

次に、2nd strand cDNA合成を下記に示す方法により行った。1st strand cDNA溶液に100μMのT7-oligo dT 24 primer を1μl (1μg)加え、68℃で5分間保温後、42℃で10分間保温する。そして、表12に示した通りに試薬を加え、16℃で2時間保温する。さらに、T4 DNA polymerase 2μlを加えて16℃で5分間保温し、2nd strand cDNAの末端を平滑化する。
次に、2nd strand cDNAの精製を行う。 Next, 2nd strand cDNA synthesis was performed by the method shown below. Add 1 μl (1 μg) of 100 μM T7-oligo dT 24 primer to the 1st strand cDNA solution, incubate at 68 ° C for 5 minutes, and then incubate at 42 ° C for 10 minutes. Then, add the reagents as shown in Table 12, and incubate at 16 ° C. for 2 hours. Add 2 μl of T4 DNA polymerase and incubate at 16 ° C for 5 minutes to smooth the ends of the 2nd strand cDNA.
Next, 2nd strand cDNA is purified.

上記の生成物に対し、フェノール150μlを加え15,000 rpmで10分間遠心する。続いて、クロロホルム150μlを加え、15,000 rpmで10分間遠心し、上清のみを採取し、別のチューブへ移す。さらに、表15に示した通りに試薬を加え室温で15分間保持し、15,000 rpmで10分間遠心し、上清のみを採取し、別のチューブへ移す。そして、70% エタノール500μlを加え15,000 rpmで10分間遠心し(エタノールリンス)し、今度は沈殿のみを残し、溶液を捨てる。残った沈殿に対し、表16に示した通りに試薬を加え室温で15分間保持し、15,000 rpmで10分間遠心し、沈殿のみを残して溶液を捨てる。残った沈殿に対し、70% エタノール500μlを加え15,000 rpmで10分間遠心し、溶液を捨てる。最後に、風乾させ、22μlの蒸留水に溶解させる。
(iv) cRNAの合成:in vitro transcription (2回目)
(iii)で作成した、cDNA溶液22μlに対し、(ii)で行ったのと同様の方法でcRNAの合成を行った。ただし、最後は10μlの蒸留水に溶解させた(RNA量は5μg〜10μg)。
(v) 逆転写反応(1st strand cDNA合成)
(iv)で作成した、cRNA溶液10μlに対し、0.5μg/μl ランダムヘキサマーを1μl (1 μg)加え、65℃で10分間保温する。その後氷上にて2分以上置き、急冷させた後、表12に示した通りに試薬を加えて、逆転写反応が効率良く起きるように37℃で2分間保温する。 To the above product, add 150 μl of phenol and centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes. Subsequently, 150 μl of chloroform is added and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant is collected and transferred to another tube. Further, add reagents as shown in Table 15, hold at room temperature for 15 minutes, centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes, collect only the supernatant, and transfer to another tube. Add 500 μl of 70% ethanol and centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes (ethanol rinse), this time leaving only the precipitate and discarding the solution. To the remaining precipitate, add reagents as shown in Table 16, hold at room temperature for 15 minutes, centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes, and discard the solution leaving only the precipitate. Add 500 μl of 70% ethanol to the remaining precipitate, centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes, and discard the solution. Finally, air dry and dissolve in 22 μl distilled water.
(iv) cRNA synthesis: in vitro transcription (2nd round)
cRNA was synthesized in the same manner as in (ii) with respect to 22 μl of the cDNA solution prepared in (iii). However, the final solution was dissolved in 10 μl of distilled water (RNA amount was 5 μg to 10 μg).
(v) Reverse transcription reaction (1st strand cDNA synthesis)
Add 1 μl (1 μg) of 0.5 μg / μl random hexamer to 10 μl of cRNA solution prepared in (iv), and incubate at 65 ° C. for 10 minutes. Then, place on ice for 2 minutes or more, quench, add reagents as shown in Table 12, and incubate at 37 ° C for 2 minutes so that the reverse transcription reaction takes place efficiently.

その後、SuperScriptII RTを1μl加えて、37℃で1時間保温する。続いて、RNase Hを1μl加えてRNAの除去を行う。37℃で20分間保温し、RNAとDNAを離すため95℃で2分間保温し、その後氷上にて2分以上置き、急冷させる。上記反応液約20μlに20μlの精製水を加え、そのうち1μlを鋳型としてPCRを行った。
(vi)PCR増幅反応
回収された1st strand cDNA溶液をテンプレートとして、選抜した4遺伝子に関し、PCR増幅を行った。プライマーとしては表4に記載のプライマーセットを用いた。 Then add 1 μl of SuperScript II RT and incubate at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, 1 μl of RNase H is added to remove RNA. Incubate at 37 ° C for 20 minutes, incubate at 95 ° C for 2 minutes to separate the RNA and DNA, and then place on ice for 2 minutes or more to quench. 20 μl of purified water was added to about 20 μl of the reaction solution, and PCR was performed using 1 μl of the purified solution as a template.
(vi) PCR amplification reaction Collected 1st PCR amplification was performed on the selected 4 genes using the strand cDNA solution as a template. The primer set shown in Table 4 was used as a primer.

PCR反応はインビトロジェン株式会社製PCRキットAccuPrime Taqを用い、表13に示した反応液を調製した。調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、表14の温度サイクル・プロトコルに従って、PCR増幅反応を行った。PCR終了後の反応液は4℃で保存した。   For the PCR reaction, PCR kit AccuPrime Taq manufactured by Invitrogen Corporation was used, and the reaction solutions shown in Table 13 were prepared. About the prepared reaction liquid, PCR amplification reaction was performed according to the temperature cycle protocol of Table 14 using the commercially available thermal cycler. The reaction solution after completion of PCR was stored at 4 ° C.

(3)実験結果
得られた各PCR産物の10μlを用いて1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、EtBr溶液で染色した。4遺伝子による結果として、4人の健常人の便はすべて陰性であったのに対して、4人の大腸がん患者の便では、1以上の遺伝子が陽性であった（表15）。すなわち、これらの遺伝子が大腸がんをスクリーニングするのに適していることが示された。 (3) Experimental results Using 10 μl of each of the obtained PCR products, 1.5% agarose gel electrophoresis was performed and stained with EtBr solution. As a result of the 4 genes, the stool of all 4 healthy individuals was negative, while the stool of 4 patients with colorectal cancer was positive for one or more genes (Table 15). That is, it was shown that these genes are suitable for screening colorectal cancer.

Claims (5)

便中の大腸がん細胞を検出する方法であって、
（ｉ）検出の対象となる遺伝子群を、がん細胞及び正常細胞における発現分析の結果に基づいて選別する工程、
（ｉｉ）便中における前記選別された遺伝子群の発現を分析することで、正常細胞とのふるいわけをせずにがん細胞を検出する工程、
を有しており、
前記（ｉ）の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより行われ、
該選別された遺伝子群が、表１に記載の７７種の遺伝子から選択されるものであり、
ＪＵＮＤおよびＴＰＴ１と、さらに表３に記載の２６種の遺伝子から選択される２種とを少なくとも含む、
ことを特徴とする大腸がん細胞の検出方法。

A method for detecting colon cancer cells in stool,
(I) selecting a gene group to be detected based on the results of expression analysis in cancer cells and normal cells;
(Ii) a step of detecting cancer cells without sieving with normal cells by analyzing expression of the selected genes in the stool;
Have
The selection of the gene group in the step (i) is performed by comparing gene expression of cells in the stool of a healthy person and a cancer patient,
The selected gene group is selected from the 77 genes listed in Table 1,
Including at least a JUND and TPT1, two and which is further selected from the 26 genes listed in Table 3,
A method for detecting colorectal cancer cells.

前記選別された遺伝子群には、ＲＰＳ２９、ＲＰＬ３８、ＲＰＳ２０、ＴＸＮが含まれる請求項１に記載の大腸がん細胞の検出方法。The method for detecting colorectal cancer cells according to claim 1, wherein the selected gene group includes RPS29, RPL38, RPS20, and TXN. 前記遺伝子群を選別する工程において、更に末梢血で発現が確認される遺伝子を排除する請求項１または２に記載の大腸がん細胞の検出方法。 The method for detecting colon cancer cells according to claim 1 or 2, wherein in the step of selecting the gene group, genes whose expression is confirmed in peripheral blood are further excluded. 前記（ｉ）の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞の遺伝子の発現を比較することにより行われ、該選別された遺伝子群が、表２に記載の４８種の遺伝子から選択される少なくとも２種である、請求項３に記載の大腸がん細胞の検出方法。

The selection of gene groups in the step (i) is performed by comparing the expression of genes in cells in the stool of healthy subjects and cancer patients. The method for detecting colorectal cancer cells according to claim 3, wherein there are at least two types selected from genes of the species.

前記（ｉ）の工程における遺伝子群の選別が、健常者とがん患者の便中の細胞のリボソーム蛋白質遺伝子の発現を比較することにより行われることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の大腸がん細胞の検出方法。 Wherein the selection of genes in the steps (i), any one of claims 1 to 4, characterized in that is carried out by comparing the expression of ribosomal protein genes of cells in stool of healthy persons and cancer patients The method for detecting colorectal cancer cells according to 1.