JP2014158430A

JP2014158430A - セルラーゼの生産方法

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Publication number: JP2014158430A
Application number: JP2013030148A
Authority: JP
Inventors: Yosuke Natori; 陽祐名取; Yuji Kodama; 裕司児玉
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2013-02-19
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2014-09-04

Abstract

【課題】セルラーゼを効率良く生産することができる、セルラーゼの生産方法を提供する。
【解決手段】recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌（Bacillus subtilis）を用いてセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産方法。前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させるセルラーゼの生産方法。前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のｒｅｃＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌であるセルラーゼの生産方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、セルラーゼの生産方法に関する。

セルラーゼは、セルロースのβ-1,4グルコシド結合を加水分解する酵素の総称であり、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼと共に加水分解酵素の代表的存在である。セルラーゼの基質となるセルロースは、植物細胞壁の主成分として年間１０００億トン以上も生産されるバイオマスであり、衣料、紙、建築材料等に有効利用されている。またセルロースは、グルコースが直鎖状に結合した巨大分子であるため、分解によって燃料物質やより高付加価値の代謝物質に変換が可能である。そのため、セルロースの効率的分解や、その分解産物の有効利用に関する研究が広く行われている。セルロースを高付加価値物質に変換する場合、通常、セルロース原料を前処理によって高反応性セルロースに変換した後、グルコースなどの低分子糖に分解する。得られた低分子糖は微生物による発酵等の化学反応を経て、高付加価値物質へと変換される。近年、この一連のセルロース分解工程においては、より経済的な方法として、セルラーゼよる酵素分解が一般に利用されており、セルラーゼの需要が高まっている。

大量に且つ廉価にセルラーゼを生産するには更なる生産性の向上が必要であり、これまでに遺伝子組換え技術を用いたセルラーゼ生産方法がこれまでに検討されている。例えば、特許文献１には、セルラーゼをコードする遺伝子をバシラス・エスピー（Bacillus sp．）などの宿主微生物に導入し、セルラーゼを生産する方法が記載されている。

一方、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、近年のゲノム解読の結果からは、細胞増殖／***、代謝、核酸合成、情報伝達に関わる遺伝子群、さらに多くの機能未知の遺伝子群が存在することが明らかにされている。一方で、工業的な有用物質生産に微生物を用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され安定に生存できる環境が与えられるため、ゲノム上にコードにされる遺伝子のなかには、有用物質の生産にとっては不要な或いは有害な働きをする遺伝子も存在する。
そこで、不要な或いは有害な働きをすると考えられる遺伝子を欠失又は不活性化することによって、有用物質（例えば異種タンパク質）の生産性を向上させるといった試みが行われている。例えば、特許文献２には、転移因子を有する納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）のrecA遺伝子を欠損させることにより、植え継ぎを繰り返した場合であっても転移因子の抑制によりポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性を安定に保持できることが記載されている。
これに対して、特許文献３には、枯草菌においてrecA遺伝子を欠損させた場合、導入するプラスミドが宿主細胞内で不安定となる場合があることが記載されている。

特開２０００−２１００８１号公報特開２０１０−５７３８８号公報特開平１−１９１６８９号公報

本発明は、セルラーゼを効率良く生産することができる、セルラーゼの生産方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、セルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、異種セルラーゼの生産効率に優れた、異種セルラーゼ生産用組換え微生物を提供することを課題とする。

これまでに、細胞膜のリン脂質に関連する遺伝子などを欠損させた枯草菌を用いたセルラーゼの生産方法についてはこれまでに検討が進んでいる。しかし、相同組換えに関連する遺伝子を欠損させた微生物を用いたセルラーゼの生産方法について、これまでに報告はされていない。
そこで、本発明者等はセルラーゼの生産方法について鋭意検討を行った。その結果、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を培養してセルラーゼを生産させることで、セルラーゼの生産性が上昇することを見出した。本発明はこの知見に基づき完成されたものである。

本発明は、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産方法に関する。
また、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてセルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法に関する。
さらに、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された、異種セルラーゼ生産用組換え微生物に関する。

本発明のセルラーゼの生産方法は、セルラーゼを効率良く生産することができる。
また、本発明のセルラーゼの生産性向上方法は、recA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失及び不活性化させない場合と比較してセルラーゼの生産性を向上させることができる。
さらに、本発明の異種セルラーゼ生産用組換え微生物は、異種セルラーゼを効率良く生産することができる。

SOE-PCR断片を用いた２重交差法によるrecA遺伝子欠失手順の一例を示す説明図である。

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、国際コンソーシアムの成果として報告され（Kunst F.，et al.，Nature，1997，vol．390，p．249-256）、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis（BSORF DB）（http://bacillus.genome.ad.jp/参照)、BSORF Bacillus subtilis Genome Database（http://bacillus.genome.ad.jp/参照）において公開されている。

本明細書において、アミノ酸配列の同一性及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Lipman，DJ.，Pearson．WR.，Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。

本明細書における「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION（Joseph Sambrook，David W．Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）記載の条件が挙げられる。前記「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７１℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７４℃以上がより好ましい。これら「ストリンジェントな条件」により、塩基配列同一性では約８０％以上又は約９０％以上の塩基配列を有する遺伝子の確認が可能である。
上記ＳＳＣおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。

本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。

本発明において、「セルラーゼの生産性向上」とは、組換え微生物の１回の培養でセルラーゼの生産性が向上することを指す。

本明細書において、「異種セルラーゼ」とは、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有するセルラーゼに変異が導入されたセルラーゼを指す。さらに、「セルラーゼをコードする遺伝子の導入」又は「異種セルラーゼをコードする遺伝子の導入」とは、セルラーゼをコードする遺伝子又は前記異種セルラーゼをコードする遺伝子を枯草菌に発現可能に導入することを指す。
遺伝子の導入方法は、前記遺伝子の発現が可能であれば制限はないが、プラスミド等のベクターを用いて前記遺伝子の導入することが好ましい。当該ベクターの種類は、適宜選択することができるが、宿主内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。好ましいプラスミドの例としては、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等が挙げられる。

本発明で用いる組換え微生物は、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌である。枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化することで、枯草菌のセルラーゼ生産能を向上させることができる。本発明では、このような枯草菌を培養し、枯草菌にセルラーゼを産生させる。

本明細書において、recA遺伝子は組換え酵素の１種であり相同組換え活性を有するRecAをコードする遺伝子である。ここで、枯草菌BSU16940株のRecAのアミノ酸配列を配列番号１０に、配列番号１０のアミノ酸配列からなるRecAをコードするrecA遺伝子の塩基配列を配列番号９に、それぞれ示す。
なお、本発明においてrecA遺伝子は配列番号９に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への１〜数個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号９に示す塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号９に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子をrecA遺伝子に相当する遺伝子とする。

本発明において、recA遺伝子は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質

recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化は、recA遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、又は、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行なうことができるが、標的遺伝子を物理的に欠失させることが好ましい。
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。

recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、常法を使用することができる。例えば、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を分断して不活性化することが可能である（Leenhouts，K.，et al.，Mol．Gen．Genet.，1996，vol．253，p．217-224）。
特に、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Itaya，M.，Tanaka，T.，Mol．Gen．Genet.，1990，vol．223，p．268-272）、このような方法を繰り返すことによって、目的の組換え微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法としては、変異誘発剤の使用や親微生物への紫外線、ガンマ線等の照射によっても実施可能である。この場合、標的とする構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、または標的遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。さらに、より効率的な手法として、標的とする遺伝子の上流、下流領域を含むが標的とする遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE（splicing by overlap extension）-PCR法（Horton，RM.，et al.，Gene，1989，vol．77，p．61-68）によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノム上の標的とする遺伝子の外側の２箇所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的とする遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である（図１参照）。

本発明で用いる組換え微生物は、枯草菌であれば特に制限はないが、納豆菌を除く枯草菌が好ましく、Bacillus subtilis Marburg No．168系統株がより好ましい。また、本発明で用いる組換え微生物は、本来的にセルラーゼ生産能を有していない枯草菌であってもよいし、本来的にセルラーゼ生産能を有している枯草菌であってもよい。本来的にセルラーゼ生産能を有していない枯草菌の場合、異種セルラーゼ生産能を付与するために、異種セルラーゼをコードする遺伝子（以下、本明細書において「異種セルラーゼ遺伝子」ともいう）を枯草菌に導入する必要がある。一方、本来的にセルラーゼ生産能を有している枯草菌の場合、生産性向上に対してより大きな効果を図るべく、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化を行なえばよい。さらに、本発明で用いる組換え微生物は、トランスポゾン(Tn)や挿入配列(IS)などの転移因子を有さないことが好ましい。

セルラーゼ遺伝子としては特に制限はなく、通常のセルラーゼ遺伝子を採用することができるが、異種セルラーゼ遺伝子が好ましい。本発明において異種セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Biochem．J.，280，309，1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバシラス（Bacillus）属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるバシラス・エスピーKSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼが挙げられる。

バシラス・エスピーKSM-S237株のセルラーゼのアミノ酸配列を配列番号１２に、配列番号１２のアミノ酸配列からなるセルラーゼをコードするセルラーゼ遺伝子（転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域を含む）の塩基配列を配列番号１１に、それぞれ示す。
なお、本発明において好ましく用いられる異種セルラーゼ遺伝子は配列番号１１に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、セルラーゼ遺伝子には、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、セルラーゼ遺伝子には、配列番号１１に示す塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、セルラーゼ遺伝子には、配列番号１１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子をセルラーゼ遺伝子に相当する遺伝子とする。

本発明において、異種セルラーゼ遺伝子は下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質

前記セルラーゼとして、配列番号１２のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、少なくとも、配列番号１２のアミノ酸配列において、１１１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、１５１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、１９０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、２６２位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２６４位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、且つ２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼが好ましい。これらのアミノ酸残基はアルカリセルラーゼにおいて必須なアミノ酸であることが推定されている（Hakamadaら，Biosci．Biotechnol．Biochem.，2000，vol．64，p．2281-2289など参照）。

セルラーゼ遺伝子は、枯草菌由来の遺伝子に限定されず、上述の好ましい遺伝子であれば、バシラス・エスピーなど枯草菌以外の微生物に由来するセルラーゼ遺伝子であってもよい。

セルラーゼ遺伝子は、セルラーゼを生産することが知られている微生物から常法に従って単離することができる。セルラーゼ生産能を有する微生物としては、バシラス・エスピーKSM-S237株（FERM BP-7875）、バシラス・エスピーKSM-64株（FERM BP-2886）等を挙げることができ、これら微生物からセルラーゼ遺伝子を単離することができる。

宿主枯草菌に導入されるセルラーゼ遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが好ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、さらに分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、セルラーゼ遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０１２−１３５２１４号公報、特開２０００−２１００８１号公報、特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス・エスピーKSM-S237株（FERM BP-7875）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域がセルラーゼの構造遺伝子と適正に結合されていることが好ましい。より具体的には配列番号１１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、セルラーゼの構造遺伝子と適正に結合されていることが好ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。

セルラーゼ遺伝子の導入方法については、通常の方法により行えばよく、特開２０１２−１３５２１４号公報、特開２０００−２１００８１号公報、特開平４−１９０７９３号公報などを参照することができ、本発明ではこれらの文献に記載の方法を取り込むことができる。

本発明において、recA遺伝子を欠失又は不活性化する時期、及びセルラーゼ遺伝子の枯草菌への導入時期は特に限定されない。例えば、recA遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌にセルラーゼ遺伝子を導入して組換え微生物を作製してもよい。あるいは、セルラーゼ遺伝子を導入した枯草菌のゲノム上のrecA遺伝子を欠失又は不活性化してもよい。

以上で説明した本発明の組換え微生物を用いることによって、セルラーゼを優れた生産性で製造することができる。製造されたセルラーゼは、化粧品、医薬品、食品、洗剤、各種化成品原料等の様々な用途に使用することができる。特に、本発明の組換え微生物においては、従来の遺伝子組換え技術によるセルラーゼ生産方法と比較して優れた生産性が得られることから上記用途で利用されるセルラーゼの生産コストを大幅に低減することができる。

本発明の方法によるセルラーゼの生産は、上記組換え微生物を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、セルラーゼを採取・精製することにより行えばよい。培養に使用される培地の組成及び培養条件等、又はセルラーゼの採取及び精製等の手順については、当業者が適宜選択することができる。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、微生物及び用途を開示する。

＜１＞recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産方法。
＜２＞枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてセルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法。

＜３＞前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１＞又は＜２＞項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
＜４＞前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜５＞前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させる、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜６＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター（好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK）を用いて枯草菌に導入された、前記＜５＞項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜７＞前記異種セルラーゼが、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有しているセルラーゼに変異が導入されているセルラーゼである、前記＜５＞又は＜６＞項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜８＞前記セルラーゼ又は異種セルラーゼがファミリー５に属するセルラーゼである、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜９＞前記セルラーゼ又は異種セルラーゼをコードする遺伝子が下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
＜１０＞前記セルラーゼ又は異種セルラーゼが、配列番号１２のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、配列番号１２のアミノ酸配列において、１１１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、１５１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、１９０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、２６２位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２６４位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼである、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜１１＞前記セルラーゼ又は異種セルラーゼをコードする遺伝子が、その上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜１２＞前記セルラーゼ又は異種セルラーゼをコードする遺伝子に、前記転写開始制御領域、前記翻訳開始制御領域及び前記分泌シグナル領域からなる３領域が結合している、前記＜１１＞項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜１３＞前記分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域がセルラーゼをコードする遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものがセルラーゼをコードする遺伝子と適正な形で結合されている、前記＜１１＞又は＜１２＞項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜１４＞前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜１５＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
＜１６＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No．168系統株である、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。

＜１７＞枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された、異種セルラーゼ生産用組換え微生物。

＜１８＞前記recA遺伝子が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１７＞項記載の微生物。
＜１９＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター（好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK）を用いて枯草菌に導入された、前記＜１７＞又は＜１８＞項記載の微生物。
＜２０＞前記異種セルラーゼが、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有しているセルラーゼに変異が導入されているセルラーゼである、前記＜１７＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２１＞前記異種セルラーゼがファミリー５に属する異種セルラーゼである、前記＜１７＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２２＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１７＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２３＞前記異種セルラーゼが、配列番号１２のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、配列番号１２のアミノ酸配列において、１１１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、１５１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、１９０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、２６２位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２６４位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼである、前記＜１７＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２４＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、その上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する、前記＜１７＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２５＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子に、前記転写開始制御領域、前記翻訳開始制御領域及び前記分泌シグナル領域からなる３領域が結合している、前記＜２４＞項記載の微生物。
＜２６＞前記分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域がセルラーゼをコードする遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが異種セルラーゼをコードする遺伝子と適正な形で結合されている、前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の微生物。
＜２７＞前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記＜１７＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の微生物。
＜２８＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜１７＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の枯草菌。
＜２９＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No．168系統株である、前記＜１７＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の微生物。

＜３０＞異種セルラーゼ生産用組換え微生物としての、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌の使用。
＜３１＞異種セルラーゼの生産のための、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌の使用。
＜３２＞recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌を、異種セルラーゼ生産用組換え微生物として使用する方法。

＜３３＞前記recA遺伝子が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜３０＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３４＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター（好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK）を用いて枯草菌に導入された、前記＜３０＞〜＜３３＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３５＞前記異種セルラーゼが、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有しているセルラーゼに変異が導入されているセルラーゼである、前記＜３０＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３６＞前記異種セルラーゼがファミリー５に属する異種セルラーゼである、前記＜３０＞〜＜３５＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３７＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜３０＞〜＜３６＞項記載の使用又は方法。
＜３８＞前記異種セルラーゼが、配列番号１２のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、配列番号１２のアミノ酸配列において、１１１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、１５１位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、１９０位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、２６２位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２６４位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、２５５位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼである、前記＜３０＞〜＜３７＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３９＞前記異種セルラーゼ遺伝子が、その上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する、前記＜３０＞〜＜３８＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜４０＞前記異種セルラーゼをコードする遺伝子に、前記転写開始制御領域、前記翻訳開始制御領域及び前記分泌シグナル領域からなる３領域が結合している、前記＜３９＞項記載の使用又は方法。
＜４１＞前記分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域がセルラーゼをコードする遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが異種セルラーゼをコードする遺伝子と適正な形で結合されている、前記＜３９＞又は＜４０＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜４２＞前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記＜３０＞〜＜４１＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜４３＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜３０＞〜＜４２＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜４４＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No．168系統株である、前記＜３０＞〜＜４３＞のいずれか１項記載の使用又は方法。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、表１には、本実施例で使用したプライマーの名称、その塩基配列及び配列番号をまとめて示した。ここで、表１に示す塩基配列において、下線部分は制限酵素認識配列を示している。また、本実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ社製）及びKOD-Plus-Neo DNA Polymerase（東洋紡績社製）、並びに付属の試薬類を用いた。

製造例１枯草菌改変体の作製
図１に示す手順に従い、recA遺伝子を欠失させた枯草菌改変体を作製した。

（１）遺伝子欠失用遺伝子断片の作製
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したRECA-F1（配列番号１）及びRECA-R1（配列番号２）のプライマーセットを用いて、ゲノム上のrecA遺伝子の上流領域に隣接する約０．９ｋｂの断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、RECA-F2（配列番号３）及びRECA-R2（配列番号４）のプライマーセットを用いて、ゲノム中のrecA遺伝子の下流領域に隣接する約０．８ｋｂの断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、プラスミドpDG1727（Guerout-Fleury et al.，Gene.，1995，vol．167，p．335-336；Bacillus Genetic Stock Center［http://www.bgsc.org/］より入手可能）のＤＮＡを鋳型とし、表１に示したSPC-F（配列番号５）及びSPC-R（配列番号６）のプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｓｐｃ）を含む約１．０ｋｂの断片（Ｃ）を調製した。

次に、得られたＤＮＡ断片（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合して鋳型とし、RECA-F1（配列番号１）及びRECA-R2（配列番号４）のプライマーセットを用いたSOE−PCRにて3断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合し、約２．７ｋｂの遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。

（２）コンピテントセルの作製
枯草菌１６８株をCI培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０３質量％アミケース（SIGMA社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０μｇ／ｍＬトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ₆₀₀）の値が１程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部（０．５ｍＬ）を分取し、遠心分離にて菌体のみを回収後、１ｍＬのCII培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０１５質量％アミケース（SIGMA社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に菌体を再懸濁することで、枯草菌株のコンピテントセル懸濁液を調製した。

（３）枯草菌１６８株の形質転換
前記（２）で調製したコンピテントセル懸濁液１００μＬに、前記（１）で得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を最終濃度が１５μｇ／ｍＬ以上となるよう添加し、３７℃で９０分間振盪培養後、１００μＬのＬＢ液体培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ）を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。その後、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ、１．５質量％寒天）に培養液１０μＬ又は１００μＬを塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲ及びシークエンスによってrecA遺伝子がＳｐｃ耐性遺伝子に置換した目的とする枯草菌改変体であることを確認した。以上のようにして、recA遺伝子欠失株（kao119株）を構築した。

製造例２セルラーゼ遺伝子導入用ベクターの構築
バチルス・エスピーKSM-S237株（FERM BP-7875）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、237UB1プライマー（配列番号７）及び237DB1プライマー（配列番号８）のプライマーセットを用いて、KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報参照）の断片（３．１ｋｂ）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。このＰＣＲ反応では、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いた。
増幅したＤＮＡ断片をBamHI制限酵素処理し、断片をシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドpHY-S237を作成した。

製造例３セルラーゼ遺伝子導入用ベクターの導入による枯草菌の形質転換
野生株である枯草菌１６８株、及び製造例１で作製した枯草菌変異株（kao119株）に対し、製造例２で作製した組換えプラスミドpHY-S237を用い、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet.，1979，vol．168，p．111）によって各菌株に導入した。

実施例セルラーゼ生産性評価
製造例３にて得られた形質転換体を５ｍＬのＬＢ培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１５ｐｐｍテトラサイクリン）で一夜３０℃で振盪培養を行った。この培養液０．４ｍＬをそれぞれ２×Ｌ−マルトース培地（２質量％トリプトン、１質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、７．５質量％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）２０ｍＬに接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った（Ｎ＝３）。

遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside（生化学工業）を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとし、セルラーゼ生産量は比活性より算出した。結果を表２に示す。なお、セルラーゼ生産量は、枯草菌168株の生産性に対する相対値で表記した。

表２の結果から明らかなように、アルカリセルラーゼ活性測定の宿主としてrecA遺伝子欠損株（kao119株）を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較してセルラーゼの生産性が向上した。

以上の結果から、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてセルラーゼを生産することで、セルラーゼの生産性が向上することがわかる。

Claims

recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌（Bacillus subtilis）を用いてセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産方法。
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１記載のセルラーゼの生産方法。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項１又は２記載のセルラーゼの生産方法。
前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させる、請求項１〜３のいずれか１項記載のセルラーゼの生産方法。
枯草菌（Bacillus subtilis）のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてセルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法。
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５記載のセルラーゼの生産性向上方法。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項５又は６記載のセルラーゼの生産性向上方法。
前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させる、請求項５〜７のいずれか１項記載のセルラーゼの生産性向上方法。
枯草菌（Bacillus subtilis）のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された、異種セルラーゼ生産用組換え微生物。
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１１記載の微生物。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質