JP5120965B2 - セルロース含有材料からの有用物質の生産方法 - Google Patents
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Description
また、上記先行技術に開示されるように、イオン液体を用いてセルロース含有材料を前処理したとしても、イオン液体処理後のセルロース含有材料を糖化し微生物によって効率的に有用物質を生産する方法はいまだ知られていない。
以下の工程(a)及び(b):
(a)セルロース含有材料とイオン液体とを接触させて前記セルロース含有材料に前記イオン液体を浸透させる工程、
(b)前記イオン液体の存在下で前記セルロース含有材料中のセルロースを含む炭素源を、セルラーゼを生産する微生物で糖化しつつ発酵する工程、
を、備える、方法が提供される。
(c)セルロース含有画分とセルロース非含有画分とに固液分離する工程、
を備えることができる。また、この場合、さらに、以下の工程(d):
(d)前記工程(c)で分離されたセルロース非含有画分である前記イオン液体を回収し、前記工程(a)に供給する工程、を備えていてもよい。
(セルロース含有材料)
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体をいう。セルロースにおけるグルコースの重合度は特に限定しないが、好ましくは200以上である。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び/又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
有用物質としては特に限定しないで、グルコースを利用して微生物が生成可能なものであればよい。例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル(コエンザイムQ10、ビタミン及びその原料等)、乳酸等の有機酸、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法は、セルロース含有材料とイオン液体とを接触させて前記セルロース含有材料中に前記イオン液体を浸透させる工程、を備えることができる。浸透工程では、液相であるイオン液体と固相であるセルロース含有材料とを接触させる。イオン液体は、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスに浸透性を有しており、セルロース含有材料の少なくとも一部を溶解、又は崩壊させ又はその構造を緩和することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、セルロースは、多くの場合、疎水性領域と親水性領域とを併せ持つ高分子材料である。イオン液体は、そのカチオンとアニオンとの組み合わせにより、水への親和性が異なるが、上記のとおり、セルロースは、疎水性領域と親水性領域とを併せ有するため、種々の態様でセルロース含有マトリックスに浸透してセルロースの構造を緩和できると考えられる。また、イオン液体は、セルロースに対して浸透性を有するほか、実バイオマスにおいてセルロースと共存するリグニンやヘミセルロースへの浸透性を有し、これらと相互作用しこれらの構造を緩和する作用を有していると考えられる。したがって、いずれの形態によっても、結果として、少なくともセルロースの構造を緩和するかセルロースの周囲の構造を緩和するかして、セルラーゼによるアタックを受けやすくなると考えられる。
浸透工程においては、各種のイオン液体を用いることができる。発酵工程で液体状態である必要があるため、融点は好ましくは80℃以下である。さらに好ましくは40℃以下であり、最も好ましくは20℃以下である。浸透工程で用いるイオン液体の種類は問わないで、疎水性イオン液体及び親水性イオン液体を利用できる。その後の発酵工程を考慮すると、親水性イオン液体を用いることが好ましい。本明細書において、親水性イオン液体は、水と二相分離せずに混合するイオン液体をいうものとする。なお、親水性イオン液体は、少なくとも、微生物による発酵温度の範囲で水と混合するイオン液体であればよい。セルロース含有材料へ浸透性を有する親水性イオン液体は、例えば、セルロース含有材料と混合したとき、セルロース含有材料を懸濁ないし分散することができるようなイオン液体が挙げられる。
本明細書に開示される生産方法においては、浸透工程後に、さらに、セルロース含有画分とセルロース非含有画分とに固液分離する工程を備えることができる。すなわち、浸透工程が、セルロース含有材料中のセルロースの構造緩和を意図しており、セルロースのイオン液体への溶解を意図していないときには、固相であるセルロース含有材料中にほとんどのセルロースが存在する。すなわち、固相がセルロース含有画分であり、イオン液体がセルロース非含有画分である。この場合、固液分離によって、浸透工程に用いたイオン液体を再利用に都合のよい形で簡易に回収することができるとともに、セルロース含有材料から過剰のイオン液体を除去することで、後段の発酵工程における、イオン液体がセルラーゼやセルラーゼ生産微生物に及ぼす悪影響を回避又は抑制して、セルロースの分解効率及び発酵効率を向上させることができる。なお、浸透工程において、セルロース含有材料にイオン液体が浸透できる量又はそれに近い量のみが供給されている場合には、固液分離工程は必ずしも要しない。また、セルラーゼ生産微生物のイオン液体耐性が強化されている場合も同様に、固液分離工程は必ずしも要しない。
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、イオン液体の存在下に、セルロース含有材料中のセルロースを含む炭素源を、セルラーゼを生産する微生物で糖化しつつ発酵する工程を備えることができる。こうした発酵工程によれば、セルロース含有材料を利用して有用物質を発酵生産するのにあたり、過酷で高エネルギーを要する前処理やその影響を取り除くための洗浄、さらには糖化のステップを省略化又は簡略化できる。
発酵工程後に、発酵液に固相残渣がある場合、この残渣を固液分離により回収してもよい。回収した固相は、セルラーゼによる分解残渣であり、セルロース含有材料中の非セルロース画分(典型的にはリグニンを含み、ヘミセルロースも含まれる。)を回収できる。この残渣は、芳香族系高分子であるリグニンを高率で含有しており、かつ、このリグニンは過度な縮合等が抑制されているため、多種の用途に利用が可能である。また、リグニンを分解する酵素と接触させることで、フェノール系化合物を得ることもできる。さらに、この固相残渣に、セルロースが残存する場合には、再度、浸透工程及び発酵工程に供してもよい。
本明細書に開示される有用物質の生産方法においては、固液分離工程によってセルロース含有材料から分離されたイオン液体を回収し、さらに浸透工程や他の用途に利用するイオン液体の再利用工程を含んでいてもよい。イオン液体の再利用は、工程全体のコストを大きく低下させることができる。再利用工程は、発酵工程後の培養液からイオン液体を回収することによっても可能である。培養液からのイオン液体の回収は、蒸留等によって行うことができる。
イオン液体処理したバイオマスからのアルコール製造技術を検証するに際し、イオン液体が酵母のエタノール発酵および生育性に及ぼす影響を検討した。すなわち、糖化発酵に利用する遺伝子組換え酵母の培養を実施した。YPDプレート培地上のMT8−1株のコロニーからYPD液体培地(30ml)へ植菌し、30℃、150rpmで24時間培養した。上記培養液をYPD液体培地400mlにOD=0.05となるように加え、30℃、150rpmで72時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、脱イオン水で2回洗浄した。
本実施例では、図2(b)に示すプロセスを検証するため、セルロース分解酵素を酵母表層に提示した遺伝子組換え酵母(アーミング酵母)を利用した以下の実験を実施した。すなわち、糖化発酵に利用する遺伝子組換え酵母の培養を実施した。最小培地(SD選択)プレート培地上のセルラーゼ表層提示酵母(アーミング酵母)のコロニーからSD選択液体培地30mlへ植菌し、30℃、150rpmで24時間培養した。上記培養液を、SD培地に終濃度で20g/lとなるようにカザミノ酸を添加した培地(SDC選択培地)400mlにOD=0.05となるように加え、30℃、150rpmで96時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、脱イオン水で2回洗浄した。
本実施例では、図2(a)に示すプロセスを検証するため、実施例2で使用したセルロース分解酵素を酵母表層に提示した遺伝子組換え酵母(アーミング酵母)を利用した以下の実験を実施した。すなわち、糖化発酵に利用する遺伝子組換え酵母の培養を実施した。最小培地(SD選択)プレート培地上のセルラーゼ表層提示酵母(アーミング酵母)のコロニーからSD選択液体培地5mlへ植菌し、30℃、120rpmで40時間培養した。上記培養液をSDC選択培地50mlに加え、30℃、100rpmで48時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、脱イオン水で2回洗浄した。
Claims (16)
- セルロース含有材料から有用物質を生産する方法であって、
以下の工程(a)及び(b):
(a)セルロース含有材料とイオン液体とを接触させて前記セルロース含有材料に前記イオン液体を浸透させる工程、
(b)前記イオン液体の存在下で前記セルロース含有材料中のセルロースを含む炭素源を、セルラーゼを分泌又は表層提示する酵母で糖化しつつ発酵する工程、
を、備える、方法。 - 前記イオン液体は、1−エチル−3−メチルイミダゾリウムジエチルホスフェート、1−エチル−3−メチルイミダゾリウムアセテート、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムアセテート及び1−エチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドから選択される1種又は2種以上である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)において、前記イオン液体の濃度は500mM以下である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記工程(b)において、前記イオン液体の濃度は300mM以下である、請求項3に記載の方法。
- 前記工程(b)において、前記イオン液体の濃度は200mM以下である、請求項4に記載の方法。
- 前記酵母は、前記セルラーゼを表層提示する酵母である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記セルラーゼは、セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記セルラーゼは、β−グルコシダーゼをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母はSaccharomyces cerevisiaeを宿主とする遺伝子組換え酵母である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(a)は、前記セルロース含有材料及び前記イオン液体を加熱することを含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- さらに、前記工程(a)の後、前記工程(b)に先だって、以下の工程(c):
(c)前記工程(a)後の前記イオン液体と前記セルロース含有材料とを、前記イオン液体を含むセルロース含有画分とセルロース非含有画分とに固液分離する工程、
を備える、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 - 前記セルロース含有材料は、植物細胞壁由来のセルロース含有マトリックスを含むバイオマスである、請求項11に記載の方法。
- 前記工程(c)は、前記イオン液体が浸透したセルロース含有材料を固相の前記セルロース含有画分として固液分離する工程であり、
前記工程(b)は、前記セルロース含有画分に対して前記酵母と前記酵母のための培地を供給して発酵する工程である、請求項12に記載の方法。 - 前記イオン液体は、1−エチル−3−メチルイミダゾリウムジエチルホスフェート、1−エチル−3−メチルイミダゾリウムアセテート、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムアセテート及び1−エチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドから選択される1種又は2種以上であり、
前記酵母は、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼを表層提示する酵母である、請求項13に記載の方法。 - さらに、前記工程(b)の後に、前記セルロース含有画分中のリグニンを含む残渣を回収する固液分離工程を備える、請求項11〜14のいずれかに記載の方法。
- さらに、以下の工程(d):
(d)前記工程(c)で分離されたセルロース非含有画分である前記イオン液体を回収し、前記工程(a)に供給する工程、
を備える、請求項11〜15のいずれかに記載の方法。
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