JP5118899B2 - 高乳酸生産微生物及びその利用 - Google Patents
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Description
(a)酸性条件下での乳酸生産に対して負に作用する1種又は2種以上の内在性遺伝子の発現が抑制された微生物に乳酸生産能を付与する工程
(b)乳酸生産微生物において前記負に作用する1種又は2種以上の内在性遺伝子の発現を抑制する工程
本明細書において、「内在性遺伝子」とは、微生物において本来的に備わっている遺伝子であって異種又は外来でない遺伝子をいう。また、本明細書において「酸性条件下」とは、乳酸生産微生物に乳酸生産させるとき、培養開始後の乳酸による低下に対してアルカリによるpHの調整を全くしないときになりゆきで得られるpH条件(以下、単に非中和条件という。)又はpH4.5以下のpH条件をいう。なお、「酸性条件」はpH1.0以上であることが好ましく、より好ましくは2.0以上であり、さらに好ましくは2.5以上である。また、、好ましい上限pHは、培養開始時のpHによっても異なるので特に限定されないが、pH4.5以下であることが好ましく、より好ましくは、4.0以下であり、さらに好ましくは、pH3.5以下である。なお、「酸性条件下」には、これらの下限pH及び上限pHへのアルカリ等によるpH調整を伴っていてもよい。 なお、培地のpHは、培養初期にあっては、培地pHに依存している。したがって、培養初期にあっては中性付近のpHである。「酸性条件」は、通常、乳酸生産微生物による乳酸生産に伴って培地中に形成される。
本内在性遺伝子は、まず、本内在性遺伝子である可能性のある候補遺伝子(以下、本内在性遺伝子候補という。)を選抜し、これらの本内在性遺伝子候補から、当該遺伝子候補の発現が抑制された乳酸生産微生物の酸性和条件における乳酸生産能に基づいて選抜することができる。以下、本内在性遺伝子のスクリーニング方法について説明する。図1には、本内在性遺伝子のスクリーニング方法のフローの一例を示す。
本内在性遺伝子候補は、酸性条件下の乳酸生産能についてより低い前記乳酸生産能を有する親株とより高い前記乳酸生産能を有する当該親株の変異株との間で、酸性条件下で乳酸生産したとき前記変異株で特異的に発現量が減少する遺伝子群から選択することができる。すなわち、本内在性遺伝子候補は、こうした親株と変異株とを準備して、酸性条件下で乳酸生産させたときの遺伝子の発現解析等に基づいて取得することができる。
本内在性遺伝子のスクリーニングにあたっては、酸性条件下の乳酸生産能についてより低い乳酸生産能を有する親株とより高い乳酸生産能を有する当該親株の変異株とを準備する。親株としては、公知の乳酸生産微生物を用いることができる。乳酸生産微生物は、既に説明したように、こうした遺伝子組換え微生物としては、サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属を宿主とする遺伝子組換え体、カンジダ・ソノレンシス等のカンジダ属.の遺伝子組換え体、クリュイベロマイセス・ラクチス、クリュイベロミセス・サーモトレランス及びクリュイベロマイセス・マルシアヌス等のクリュイベロミセス属の遺伝子組換え体が挙げられる。なかでも、工業的な発酵生産に都合のよい酵母に高い乳酸生産能を付与した遺伝子組換え酵母を好ましく用いることができる。高い乳酸生産能を有する遺伝子組換え酵母としては、ピルビン酸脱炭酸酵素(PDC)遺伝子(好ましくはPDC1遺伝子)プロモーターの制御下にウシ等の外来性の乳酸脱水酵素(LDH)遺伝子を備える遺伝子組換え酵母が好ましい。これらの遺伝子組換え酵母に、酸性下で高い乳酸生産能を付与することにより、一層効率的な乳酸生産が可能になるからである。
本内在性遺伝子候補としては、酸性条件下での乳酸生産時において変異株において親株よりも特異的に発現量が減少する内在性遺伝子が挙げられる。本内在性遺伝子候補を選抜するには、まず、準備した親株と変異株とについて酸性条件下で乳酸生産工程を実施して、それぞれについて乳酸生産工程における遺伝子の発現量を取得し比較する。
次に、本内在性遺伝子を選抜する工程を実施する。この選抜工程では、本内在性遺伝子候補から選択される1種又は2種以上の内在性遺伝子の発現が抑制された乳酸生産微生物の酸性条件下での乳酸生産能に基づいて1種又は2種以上の本内在性遺伝子を選抜することができる。
本発明の乳酸生産微生物は、酸性条件下で乳酸生産可能な乳酸生産微生物であって、1種又は2種以上の本内在性遺伝子の発現が抑制された微生物とすることができる。発現の抑制対象である本内在性遺伝子については、既に述べたスクリーニング方法によって取得できるほか、本内在性遺伝子としてサッカロマイセス・セレビシエにおいて同定された本内在性遺伝子である、PIG1遺伝子、YGR110W遺伝子及びNRK1遺伝子から選択することができる。また、本発明の乳酸生産微生物における本内在性遺伝子としては、これら3種の遺伝子及びこれらのホモログが挙げられる。
本発明の乳酸生産微生物の作製方法は、乳酸生産能を有する微生物に対して本内在性遺伝子の発現を抑制するように遺伝子組換えするか、又は本内在性遺伝子の発現が抑制された微生物に乳酸生産能を付与するか、若しくは乳酸生産能も本内在性遺伝子の発現も抑制されていない微生物にこうした遺伝子組換えを逐次的にあるいは同時に施すかである。好ましくは、乳酸生産能を遺伝子組換えにより付与し、より好ましくは乳酸生産能に加えて本内在性遺伝子の発現の抑制も遺伝子組換えにより付与する。
本発明の核酸コンストラクトは、酸性条件下での乳酸生産能向上用のコンストラクトであって、PIG1遺伝子、YGR110W遺伝子及びNRK1遺伝子並びにこれらのホモログから選択される遺伝子の発現を抑制可能なヌクレオチド配列を備えることができる。本発明の核酸コンストラクトは、また、本発明のスクリーニング方法に用いる選抜対象微生物を作製するための核酸コンストラクトとして用いることもできる。すなわち、本内在性遺伝子選抜用として用いることもできる。
本発明の乳酸の製造方法は、本発明の乳酸生産微生物を酸性条件下で乳酸生産可能に培養する工程を備えることができる。本発明の乳酸製造方法によれば、酸性条件下で乳酸生産に負に作用する本内在性遺伝子の発現が抑制されているため、酸性条件下においても効率的な乳酸生産を行うことができる。
特願2002−362891に開示される乳酸生産性酵母(T165−25−2B、LDH6コピー株)を親株とし、この親株に数回のEMS変異を施し、全くアルカリによるpH調整を行わない非中和条件下で乳酸生産能力が向上したEMS突然変異株(以下、単に変異株という。)を選抜した。
初発菌体量:PCV=0.5%
発酵温度:32℃
培養液:15%YPD 500ml
kLa:0.005(200rpm、0.4ml/分)
実施例1におけるDNAマイクロアレイ解析によって選抜した発現減少量の大きい5種類の内在性遺伝子候補(YJL200C、PIG1、NRK1、YGR110W、BLM3)について、定量的PCR法にて遺伝子発現変動の再確認を実施した。実施例1で用いた特願2002−362891にて開示した変異処理を行っていない上記親株と同様に実施例1にて用いた変異株式会社とを実施例1と同様の非中和条件下で乳酸発酵を行い、発酵開始10時間後の菌体を採取し、実施例1と同様にしてRNAを調製した。得られたRNAを用いてOne Step SYBER RT−PCR Kit(タカラバイオ社製)に従ってcDNAを調製した。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。
YJL200C-F; 5'-AATGATGCTAGGTACTGATTCCCATA-3’ (26mer)(配列番号1)
YJL200C-R; 5'-CCAACCCCGATGGCAATAG-3' (19mer)(配列番号2)
PIGl遺伝子の発現確認用プライマー
PIGl-F; 5'-AAAGAAAAGAGGAGCGACCAGTAG-3' (24mer)(配列番号3)
PIGl-R; 5'-TCCGCCTTTATGGTTGCAA-3’ (l9mer)(配列番号4)
NRK1遺伝子の発現確認用プライマー
NRKl-F; 5'-CCAGAAAAGGATACCAGACTTTGG-3’ (24mer)(配列番号5)
NRKl-R; 5'-AGATTCATACACAAATTCGTCGAAAT-3’ (26mer)(配列番号6)
YGRll0W遺伝子の発現確認用プライマー
YGR110W-F; 5'-TGTTGTTGATGATGAGGGCAAT-3' (22mer)(配列番号7)
YGRll0W-R; 5'-AGCCTCAGGCACTGAGGTTTT-3' (21mer)(配列番号8)
BLM3遺伝子の発現確認用プライマー
BLM3-F; 5'-CCCCAGCAGGCGTGTCT-3' (l7mer)(配列番号9)
BLM3-R; 5'-GAGGCGGTTTCCATTTTTCA-3' (20mer)(配列番号10)
本実施例においては、実施例4で使用するための遺伝子組換えベクターを構築した。以下、図4に従って本実施例におけるベクターの構築について説明する。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはMolecular Cloning A Laboratory Manual second edition(Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989)に従った。また、反応に使用した一連の酵素類は、特に限定しない限り、すべて宝酒造社製のものを用いた。
TDH3P-F; 5'-AGCGTTGAATGTTAGCGTCAAC-3' (22mer)(配列番号11)
CYClT-R; 5'-ACATGCGTACACGCGTTTGTAC-3' (22mer)(配列番号12)
Yeast Knockout Strain Collection(Open Biosystems社製)より、実施例1及び2において選抜した5種類の遺伝子がそれぞれ破壊された遺伝子破壊株を取得した。これらの株をYPD培養液5mlで、30℃で対数増殖期(OD660nm=0.8)まで培養した。これにFrozen−EZ Yeast Transformation IIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例3にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素SacI/ApaIで処理し、遺伝子導入した。この形質転換試料を洗浄後、100μlの滅菌水に溶解させてハイグロマイシン選抜培地にプレーティングし、それぞれについて30°C静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
LDH-F; 5'-ATGGCTACTTTGAAAGATC-3' (19mer)(配列番号13)
LDH-R; 5'-TTATTAAAATTGCAATTCTTTTTG-3' (24mer)(配列番号14)
Δygl200c−LDH;MATα,ygl200c::kanMX,pdc1::Ppdc1−bovine L−LDH
Δpig1−LDH;MATα,pig1::kanMX,pdc1::Ppdc1−bovine L−LDH
Δnrk1−LDH;MATα,nrk1::kanMX,pdc1::Ppdc1−bovine L−LDH
Δygr110w−LDH;MATα,ygr110w::kanMX,pdc1::Ppdc1−bovine L−LDH
Δblm3−LDH;MATα,blm3::kanMX,pdc1::Ppdc1−bovine L−LDH
実施例4で作製した5種類の形質転換株についてL−乳酸生産量を測定して遺伝子破壊と乳酸生産との相関関係を検証した。
Claims (11)
- 乳酸生産酵母であって、
PIG1遺伝子、YGR110W遺伝子及びNRK1遺伝子からなる群から選択される1種又は2種以上の内在性遺伝子の発現が抑制されている酵母。 - 遺伝子組換え酵母である、請求項1に記載の酵母。
- サッカロマイセス属酵母である、請求項1又は2に記載の酵母。
- 前記内在性遺伝子は遺伝子組換えにより発現が抑制されている、請求項1〜3のいずれかに記載の酵母。
- 前記内在性遺伝子は遺伝子組換えにより破壊されている、請求項4に記載の酵母。
- ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターの制御下に外来性の乳酸脱水素酵素遺伝子を備える、請求項1〜5のいずれかに記載の酵母。
- PIG1遺伝子、YGR110W遺伝子及びNRK1遺伝子からなる群から選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現を抑制可能なポリヌクレオチドを備える、乳酸生産酵母における酸性条件下での乳酸生産能向上用のコンストラクト。
- 乳酸生産酵母の作製方法であって、
以下の工程(a)及び(b)のいずれかを実施する方法。
(a)PIG1遺伝子、YGR110W遺伝子及びNRK1遺伝子からなる群から選択される1種又は2種以上の内在性遺伝子の発現が抑制された酵母に乳酸生産能を付与する工程
(b)乳酸生産酵母においてPIG1遺伝子、YGR110W遺伝子及びNRK1遺伝子からなる群から選択される1種又は2種以上の内在性遺伝子の発現を抑制する工程 - 乳酸の製造方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の乳酸生産酵母を乳酸生産可能に培養する工程を備える、方法。 - 前記乳酸生産酵母は、L−乳酸を優勢的に生産可能な微生物である、請求項9に記載の方法。
- 前記乳酸生産酵母は、D−乳酸を優勢的に生産可能な微生物である、請求項9に記載の方法。
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