JP5099560B2 - 一分子型生物発光可視化プローブ - Google Patents
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Description
FRET現象を利用したNRリガンドの検出プローブ(特許文献1、非特許文献6、7)は、前記のとおり、短時間でのリガンド検出を可能とするとともに、アゴニストとアンタゴニストをそれぞれ正確に分別検出可能であるという点において優れている。ただし、測定対象の細胞に存在する2つの発色団からは常に自己蛍光(autofluorescence)が発せられているため、LBDへのリガンド結合を検出するためには、2つの発色団の波長変化を高精度で測定するための大係りの測定装置とフィルターシステムを構える必要がある。また観測できる細胞の数に限りがあるために(数個)、その観測結果に一般性欠如の問題点があった。
(1) 前記プローブを生細胞に導入し、
(2) 生細胞に候補物質を共存させ、そして
(3) 生細胞に発光を生じさせる候補物質を目的物質として特定する、
ことを特徴とするアゴニストスクリーニング方法を提供する。
(1) 前記プローブを生細胞に導入し、
(2) 生細胞に候補物質を共存させ、
(3) 生細胞に既知アゴニストを共存させ、そして
(4) 生細胞からの発光を減少させる候補物質を目的物質として特定する、
ことを特徴とするアンタゴニストスクリーニング方法を提供する。
発明の効果
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例1:ホタル・ルシフェラーゼ(FLuc)を発光酵素とするプローブ
(1-1)プラスミドの構築
N末端(FLuc-N; 1-415アミノ酸)およびC末端(FLuc-C; 416-510アミノ酸)ドメインはそれぞれに特有の制限酵素サイトをドメインの端に導入するために、適切なプライマーとFLucの全長cDNAを含む鋳型プラスミドを用いて増幅した。AR LBD(672-910アミノ酸)をコードするcDNAはドメインの両端に適切な制限酵素サイトを導入すべくPCRで修飾した。AR N末端ドメイン(AR NTD)モチーフ(11アミノ酸:20RGAFQNLFQSV30)およびそのアラニン変異体(11アミノ酸:20RGAAQNLFQSV30)をコードするDNAオリゴマーはエキシジェン(東京、日本)で購入した。増幅した各断片は対応する制限酵素で切断したpcDNA3.1(+)ベクター骨格(Invitrogen)にサブクローニングした。構築したプラスミドはBigDye Terminator Cycle SequencingキットとABI Prism310遺伝子解析装置より配列確認を行った。
子宮頸部がん由来のHeLa細胞は10% ステロイド欠損牛胎児血清(FBS)と1% ペニシリン−ストレプトマイシン(P/S)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM; Sigma)を用いて12穴プレートで37 ℃、5% CO2インキュベーターで培養した。12穴プレート中のHeLa細胞にpAR-NC、pAR-CN、pAR-mutをトランスフェクションするためにTransIT-LT1(Mirus)を用いた(24時間で8%のトランスフェクション効率)。細胞は12時間培養し、下記の実験に用いた。
6穴プレートの中のHeLa細胞にpAR-NC、pAR-CN、pAR-mutをトランスフェクションし、16時間培養した。細胞は一度PBSで洗浄し、100 μLの溶解バッファー(1% ドデシル硫酸ナトリウム、10% グリセロール、10% 2-メルカプトエタノール、0.001% ブロモフェノールブルー、50 mM トリス−塩酸、pH 6.8)で溶解した。サンプルは10%アクリルアミドゲルで電気泳動し、それをニトロセルロース膜に転写し、抗-FLuc抗体(Promega)あるいは抗-アクチン抗体(Sigma)でブロッティングした。ブロットした膜をアルカリフォスファターゼを連結した二次抗体とインキュベートし、最終的にECL化学発光基質溶液(GE healthcare)で可視化した。
12穴プレートの中のHeLa細胞にプラスミドをトランスフェクションし、16時間培養した。細胞を種々のステロイドあるいは化学物質で20分間刺激した。リガンドにより回復した酵素活性を、Bright-Glo (Promega)あるいはDual-luciferase基質溶液(Promega)を用いて製造者マニュアルに従って算出した。Bright-Glo基質溶液の簡潔な手順は以下の通りである。12穴プレートの中のHeLa細胞にpAR-NCを一過的にトランスフェクションしPBSで洗浄した。80 μLの基質溶液をプレートの各ウェルに加えた。37 ℃で3分間インキュベーションした後、細胞破砕液からの発光強度をルミノメーター(Minilumat LB9506; Berthold)で記録した。蛋白質の総量は下記の規格化の為にBradford試薬を用いて順次測定した。測定した蛋白質総量に対して規格化したルシフェラーゼ発光は、細胞溶解液の1μgからの発光強度を表すRLU/μg protein (Bright-Glo)として表記した。
12穴プレートに培養したHeLa細胞にpAR-NCをトランスフェクションした。細胞をかき集め二本の試験管に等量ずつ分注した。それぞれの試験管の細胞は100 μLのルシフェリン基質溶液でけん濁した。基質を加えてすぐに、それぞれの試験管の発光強度をルミノメーターで1分間隔でモニターした。基質を加えて5分後、DMSOあるいは5α-dihydroxytestosterone (DHT)をそれぞれ最終濃度で0.1% DMSOあるいは10-6M DHTとなるように加えた。各々の試験管からの発光強度はさらに15分間モニターした。
種々のアンドロジェンアンタゴニストのDHT作動性に対する阻害効果について、pAR-NCとpTK-Rlucを共発現するHeLa細胞を用いて検証した。HeLa細胞にpAR-NCとpTK-RLucをトランスフェクションし、16時間インキュベーションした。各々のウェルのHeLa細胞を0.1% DMSOあるいは5 x 10-4 Mのアンタゴニスト(vinclozolin、 procymidone、CPA、あるいはflutamide)で20分間刺激した。コントロールを除くすべての細胞をさらに10-5M DHTで20分間刺激した。各々のウェルの発光強度をDual-luciferase基質溶液で測定した。
本発光プローブの発光強度の可逆性をDHT添加と除去により見積もった。12穴プレートに培養したHeLa細胞にpAR-NCをトランスフェクションした。16時間インキュベーションした後、細胞を10-5M DHTで20分間刺激した。それから、メディウムを10% ステロイド欠損FBSと1% P/Sを含んだDMEMで置き換えた。メディウムを換えた後0.5、1、2、4時間の時点で、発光強度の変化をBright-Glo基質溶液添加後、それぞれ測定した(図9)。
(2-1)作製した3つのインディケーターのアンドロジェン感受性の比較
図2に示したように、3種類のプラスミドを作製した。pAR-CNおよびpAR-NCはFLuc-Nおよび-Cの順序は異なるが、同じFQNLFモチーフを含んでいる。FQNLFモチーフのアラニン変異を持つpAR-mutも、発光強度が確かにAR LBDとFQNLFモチーフとの相互作用によるものかどうかを検証するために作製した。
1)プローブが正しく発現しているのか、2)どの程度の融合蛋白質量が発現しているのかを測定するためにウェスタンブロッティングを行った。結果は図4に示したとおりである。ネガティブコントロールであるHeLa細胞そのもの(レーン1)に加えて、pAR-CN(レーン2)、pAR-NC (レーン3)、あるいはpAR-mut(レーン4)をそれぞれ発現するのHeLa細胞を10%アクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。抗-AR抗体(Santa Cruz)は92 kDaの特異的バンドを認識し、そのサイズは期待した融合蛋白質のサイズと同じであった。レーン2、3、4が似たようなバンドの太さを示したことからpAR-CN、pAR-NC、pAR-mutから同じ量の融合蛋白質が発現していることが確認できた。プラスミド間の発現量が同様であることは、図3で見られた発光強度の違いがプローブ蛋白質量の違いによらず、リガンド感受活性の違いによるものであることを意味する。
pAR-NCを発現するHeLa細胞からのDHT依存性を一分間隔でモニターした(図5)。結果によると、DHT刺激により細胞は急激に発光強度を増加させ、9分後最強値に達した。この反応動態(キネティクス)は、アンドロジェンとAR LBDの結合から促されたAR LBDとFQNLFモチーフとの完全な会合に9分を要するということを示している。以前のFRETに基づくアンドロジェン研究は、アンドロジェンAR分子内の折りたたみには7分間を要することを示していた。この二つの方法間で観察された応答時間の違いは、以下の理由によるものであると考えられる。すなわち、FRETに基づく以前の蛍光プローブ研究が全長のARを用いていたことに対して、本発光プローブはFQNLFモチーフを用いたことなど、実験設定の違いによるのかも知れない。本プローブは、ベースライン発光強度の約20倍までの極度に高い発光シグナル対バックグラウンド比を示した。このような本プローブの高い感度は、バックグラウンド蛍光の低さなど発光固有の本質的な長所による側面もある。高いシグナル対バックグラウンド比に対するもう一つ別の理由は、分割FLuc間最適自己相補を引き出すプローブ分子を設計できたこととFLucの切断点そのものの適切性によるものだとも考えられる。
「発光強度」のステロイドホルモン「濃度」依存性を測定した(図6)。pAR-NCを発現するHeLa細胞をステロイドホルモンの5α-hydroxytestosterone(DHT)、testosterone(T)、19-nortestosterone(19T)、あるいは17β-estradiol(E2)で20分間刺激した。引き続きDual-luciferase基質溶液で発光させた。その結果、リガンド選択性は次のように減少していった:DHT > 19T > T > E2 > vehicle (0.1% DMSO)。DHTの50%有効濃度(EC50)は3.9 x 10-6 Mで、検出限界は10-7 Mあたりであった。この結果は1)本分子プローブは異なったステロイドを高い感度で区別できること、2)本分子プローブは、一般的に20分以内に、ステロイドの活性のハイスループット測定を提供する、ことを示す。
アンタゴニストとして知られるいくつかの合成化学物質に関して、DHTのアゴニスト活性に対するアンタゴニスト効果を検査した(図8)。化学物質の中で、CPAはステロイド様化学構造を持つアンタゴニストである。一方、vinclozolin、procymidone、およびflutamideは非ステロイド様化学構造を持つアンタゴニストである。pAR-NCを発現するHeLa細胞をまず5x10-4Mのぞれぞれのアンタゴニストで20分間刺激し、10-5 MのDHTで引き続き20分間刺激した。全ての化学物質はDHTにより発生させられた発光強度に対してアンタゴニスト活性を示した。この化学物質のアンタゴニスト効果は次のような傾向で減少していった:flutamide (78%) > CPA (73%) > procymidone (68%) > vinclozolin (57%)。括弧の中の数字は、それぞれのアンタゴニストを20分間暴露した後のDHT作動性の発光の阻害率を表す。
AR LBD-FQNLFモチーフ結合のリガンド作動性動態について、アンドロジェン処理と除去後の発光強度変化に基づいて探索した(図9、10)。
図11に構成図を示したキメラDNAをpcDNA 3.1(+)ベクターに組み込み、プローブ発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドは、CBLucの一分子型プローブという意味の英文頭文字からpSimbe(SIngle Molecule-format probe using click Beetleの略称)と名づけた。LBDとしてAR LBDを有し、LBD相互作用ペプチドとしてヒトAR NTD由来のFQNLFモチーフ(20RGAFQNLFQSV30)を持ったものをpSimbe-FQ、アフリカツメガエルTIF2由来の順列LXXLLモチーフ(686KHKILHRLLQDSS698)を持ったものをpSimbe-LXP、その逆順列LXXLLモチーフ(698SSDQLLRHLIKHK686)を持ったものをpSimbe-LXAとそれぞれ名づけた。また、CBLucのN末端(CBLuc-N)とC末端(CBLuc-C)はそれぞれ図11中に示したアミノ酸配列からなるものを使用した。[A]と[a]との組合せでプラスミド[1]となり、順次にプラスミド[2]、[3]・・・[10]となる。図12は全長CBLucのアミノ酸配列であり、図中の矢印はプラスミド[1]-[7]の切断位置を示す。プラスミド[8]-[10]はCBLuc-NとCBLuc-Cの一部が重複しているか欠失している。また、星印はプラスミド[3]の切断位置(439/440)を示す。
表1
pSimbe-FQ[1]−[10]を対象とし、10-5 M DHT刺激によって回復された発光強度を指標として、一分子に適用できるCBLuc切断位置を検討した。結果は図13に示したとおりであり、10種類のプラスミドの中で、プラスミド[3]、[6]、[9]、[10]が明確なバッグラウンド対比発光強度増加を示した。
(2) AR LBDと各相互作用ペプチドの結合能力の検討
pSimbe-FQ、pSimbe-LXP、pSimbe-LXAをHeLa細胞に発現させ、AR LBDとそれと相互作用すると知られているペプチドの結合能力を、10-5 M DHT有り無し条件下で比較した。なお、CBLucの切断位置は、前記プラスミド[3]と同様である。
(3) LXXLLモチーフとAR LBDまたはGR LBDとの結合強度の相対的比較
LBDの典型例としてAR LBDおよびGR LBDをそれぞれ使用し、相互作用ペプチドとして逆順列LXXLLモチーフおよび順列LXXLLモチーフを持つ、それぞれ4種類のプラスミドを作成した。すなわち、AR LBDに順列LXXLLモチーフをつなげたプラスミドをpSimbe-LXP、AR LBDに逆順列LXXLLモチーフをつなげたプラスミドをpSimbe-LXA、GR LBDに順列LXXLLモチーフをつなげたプラスミドをpSimbe-GRP、GR LBDに逆順列LXXLLモチーフをつなげたプラスミドをpSimbe-GRAと名づけた。なお、CBLucの切断位置は前記プラスミド[3]と同様である。これらのプラスミドをMCF-7細胞に発現させ、プローブによる発光強度を10-5M DHT有り無し条件で比較した。
(4) 細胞種におけるリガンド選択性の検討。
(5) プローブ発現の検討
pSimbi[3]、pSimbe-LXPおよびpSimbe-LXAの各発現プラスミドをMCF-7細胞に導入し、各プローブの発現をウエスタンブロット分析した。
(6) 各種ステロイドホルモンによるpSimbi系列プローブ発光強度の濃度検定曲線
pSimbi[3]およびpSimbe-LXAをそれぞれMCF-7細胞に導入し、一連の違う濃度のDHT、19T(19-nortestosterone)、T、E2でそれぞれ刺激し、発光強度を測定した(図18)。
(7) アンタゴニストの測定
pSimbe-LXAをMCF-7細胞で発現させ、10-6 M DHTによるプローブ発光に対するCPA(cyproterone acetate)の抑制作用を検討した。
(8) DHT刺激後のpSimbeプローブ発光強度の経時変化
pSimbe-LXAをMCF-7細胞で発現させ、DHTの濃度に依存的な発光強度の経時変化を測定した。
(9) pSimbeプローブの繰り返し測定
pSimbe-LXAをMCF-7細胞で発現させ、20分間の10-5M DHT刺激と培地交換によるDHT除去を2回ずつ行い、その間の発光強度変化をモニターした。
(10) 各種リガンドの男性ホルモン活性の測定
pSimbe-LXAをMCF-7細胞に発現させ、DHT、19T、T、E2、progesterone(proges)、mifepristone(Mif;RU486))、vinclozolin(vin)、procymidone(procy)、cyprote
rone acetate(CPA)、phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)でそれぞれ刺激した場合の発光強度を測定した。コントロールとしてはvehicle #1(0.1% DMSO)およびvehicle #2(0.02 M phosphoric buffer saline (PBS))を使用した。
Claims (10)
- 生細胞における標的特異的リガンドを検出するプローブであって、リガンドを結合した場合にその立体構造を変化させるリガンド結合分子の両端に、コメツキムシ・ルシフェラーゼ(CBLuc)を分割したN末端側ポリペプチド(N-CBLuc)とC末端側ポリペプチド(C-CBLuc)とがそれぞれ連結されており、
N-CBLucが配列番号27の1-412アミノ酸配列からなる場合は、C-CBLucは配列番号27の413-542アミノ酸配列からなり、
N-CBLucが配列番号27の1-439アミノ酸配列からなるペプチドの場合は、C-CBLucは配列番号27の437-542アミノ酸配列、440-542アミノ酸配列または443-542アミノ酸配列からなり、
N-CBLucが配列番号27の1-442アミノ酸配列からなる場合は、C-CBLucは配列番号27の443-542アミノ酸配列からなり、
リガンド結合分子にリガンドが結合した場合のみ、N-CBLucとC-CBLucとが自己相補して発光シグナルを発することを特徴とする一分子型生物発光可視化プローブ。 - リガンド結合分子が、リガンド結合ドメイン(LBD)と、LBDへのリガンドの結合によってLBDと相互作用するドメイン(LBD相互作用ドメイン)とが連結した融合分子である請求項1のプローブ。
- リガンドが核内受容体リガンド、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャーまたはG蛋白質結合型受容体リガンドである請求項1のプローブ。
- LBDがアンドロゲン受容体LBDであり、LBD相互作用ドメインがアンドロゲン受容体のコアクチベーターペプチドであって、コアクチベーターペプチドがアンドロゲン受容体のN末端FQNLFモチーフを含むペプチド(FQNLFペプチド)またはアフリカツメガエルTIF2のLXXLLモチーフを含むペプチド(LXXLLペプチド)であり、アンドロゲン受容体リガンドを検出する請求項2のプローブ。
- 請求項1から4記載のいずれかのプローブを生細胞で発現することのできる発現ベクター。
- 請求項1から4記載のいずれかのプローブ、または請求項5記載の発現ベクターと、CBLucの基質を含むリガンド検出キット。
- LBDに結合する未知のアゴニストをスクリーニングする方法であって、
(1) 請求項1から4記載のいずれかのプローブを生細胞(ただし、ヒト個体内に存在するものを除く)に導入し、
(2) 生細胞に候補物質を共存させ、そして
(3) 生細胞に発光を生じさせる候補物質を目的物質として特定する、
ことを特徴とするアゴニストスクリーニング方法。 - 請求項5記載の発現ベクターを生細胞で発現させることによってプローブを生細胞に導入する請求項7のアゴニストスクリーニング方法。
- 既知のリガンドとLBDとの結合を阻害する未知のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
(1) 請求項1から4記載のいずれかのプローブを生細胞(ただし、ヒト個体内に存在するものを除く)に導入し、
(2) 生細胞に候補物質を共存させ、
(3) 生細胞に既知アゴニストを共存させ、そして
(4) 生細胞からの発光を減少させる候補物質を目的物質として特定する、
ことを特徴とするアンタゴニストスクリーニング方法。 - 請求項5記載の発現ベクターを生細胞で発現させることによってプローブを生細胞に導入する請求項9のアンタゴニストスクリーニング方法。
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