JP6730795B2 - Vdrビタミンd結合ドメインを含む融合タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Description
[1]
ルシフェラーゼのN端ドメイン、ビタミンD受容体(以下、VDRと表記する)のビタミンD結合ドメインを少なくとも1個、及びルシフェラーゼのC端ドメインを含む融合タンパク質。
[2]
ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、及びガウシアルシフェラーゼルシフェラーゼから成る群から選ばれる[1]に記載の融合タンパク質。
[3]
ホタルルシフェラーゼは、配列表の配列番号28で示されるアミノ酸配列を有し、
N端ドメインは、1番から415番までのアミノ酸配列を有し、C端ドメインは、416番から550番までのアミノ酸配列を有する[1]に記載の融合タンパク質。
[4]
ウミシイタケルシフェラーゼは、配列表の配列番号30で示されるアミノ酸配列を有し、
N端ドメインは、1番から229番までのアミノ酸配列を有し、C端ドメインは、230番から311番までのアミノ酸配列を有する[1]に記載の融合タンパク質。
[5]
VDRは、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、またはウシのVDRである[1]に記載の融合タンパク質。
[6]
ヒトVDRは、配列表の配列番号32で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から427番までのアミノ酸配列を有する、[5]に記載の融合タンパク質。
[7]
マウスVDRは、配列表の配列番号34で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から422番までのアミノ酸配列を有する、[5]に記載の融合タンパク質。
[8]
ラットVDRは、配列表の配列番号36で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から423番までのアミノ酸配列を有する、[5]に記載の融合タンパク質。
[9]
サルVDRは、配列表の配列番号37で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から434番までのアミノ酸配列を有する、[5]に記載の融合タンパク質。
[10]
イヌVDRは、配列表の配列番号38で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から427番までのアミノ酸配列を有する、[5]に記載の融合タンパク質。
[11]
ウシVDRは、配列表の配列番号39で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から426番までのアミノ酸配列を有する、[5]に記載の融合タンパク質。
[12]
ビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列は変異を有する[1]〜[11]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[13]
ビタミンD結合ドメインを2個有する[1]〜[12]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[14]
[1]〜[13]のいずれかに記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA。
[15]
ベクター中に[14]に記載のDNAを含有するプラスミド。
[16]
[15]に記載のプラスミドを導入した細胞である形質転換細胞。
[17]
前記細胞は、哺乳動物または昆虫由来の細胞である[16]に記載の形質転換細胞。
[18]
ビタミンD受容体(以下、VDRと表記する)に結合性を示す物質のスクリーニング方法であって、
[16]または[17]に記載の形質転換細胞を、形質転換細胞にDNAが含有されるルシフェラーゼの基質、Mg2+、ATP及び酸素、並びに候補物質の共存下で培養し、培養中及び/又は培養後に発光を測定し、
発光量または強度の増減から、前記候補物質のVDRに対する結合性を評価して、VDRに結合性を示す物質を選択することを含む、前記スクリーニング方法。
[19]
前記形質転換細胞に導入されたプラスミドが含有するビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列をコードするDNAは、前記ビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列が変異を有し、前記アミノ酸配列の変異と疾患との関係から、前記疾患に関与する変異を有するビタミンD結合ドメインに特異的に結合する候補物質をスクリーニングする、[18]に記載のスクリーニング方法。
[20]
ビタミンD受容体(以下、VDRと表記する)に結合性を示す物質のスクリーニング方法であって、
[1]〜[13]のいずれかに記載の融合タンパク質を、ルシフェラーゼの基質、Mg2+、ATP及び酸素、並びに候補物質の共存下で作用させて、作用中及び/又は作用後に発光を測定し、
発光量または強度の増減から、前記候補物質のVDRに対する結合性を評価して、VDRに結合性を示す物質を選択することを含む、前記スクリーニング方法。
[21]
前記融合タンパク質が含有するビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列が変異を有し、前記アミノ酸配列の変異と疾患との関係から、前記疾患に関与する変異を有するビタミンD結合ドメインに特異的に結合する候補物質をスクリーニングする、[20]に記載のスクリーニング方法。
[22]
前記候補物質は、ステロイド骨格を有する化合物、脂肪酸類、脂溶性ビタミン類、又はポリフェノール類である[18]〜[21]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
本発明は、ルシフェラーゼのN端ドメイン、VDRのビタミンD結合ドメインを少なくとも1個、及びルシフェラーゼのC端ドメインを含む融合タンパク質に関する。
参考文献1:The Unique Tryptophan Residue of the Vitamin D Receptor Is Critical for Ligand Binding and Transcriptional Activation. JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH Volume 16, Number 1, 2001 39-45
参考文献2:Novel Compound Heterozygous Mutations in the Vitamin D Receptor Gene in a Korean Girl with Hereditary Vitamin D Resistant Rickets. J Korean Med Sci 2011; 26: 1111-1114
参考文献3:Crystal Structures of Hereditary Vitamin D-Resistant Rickets-Associated Vitamin D Receptor Mutants R270L and W282R Bound to 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Synthetic Ligands. J. Med. Chem. 2013, 56, 6745-6760
参考文献4:Mutations in the vitamin D receptor and hereditary vitamin D-resistant rickets. BoneKEy Reports 3, Article number: 510. (2014) 1-11
参考文献5:Crystal structure of hereditary vitamin D-resistant rickets-Associated mutant H305Q of vitamin D nuclear receptor bound to its natural ligand. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 121 (2010) 84-87
参考文献6:Mutations in the Vitamin D Receptor Gene in Four Patients with Hereditary 1,25-Dihydroxyvitamin D-Resistant Rickets. Arq Bras Endocrinol Metab 2008;52/8 1244-1251
参考文献7:The Vitamin D Receptor and the Syndrome of Hereditary 1,25-Dihydroxyvitamin D-Resistant Rickets. Endocrine Reviews 20(2): 156-188 1999
ルシフェラーゼのN端ドメインのアミノ酸配列をコードするDNA、ビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列をコードするDNA、及びルシフェラーゼのC端ドメインのアミノ酸配列をコードするDNAをそれぞれ常法により連結することで調製できる。
本発明は、VDRに結合性を示す物質の細胞内スクリーニング方法を包含する。本発明のスクリーニング方法は、本発明のプラスミドを導入した細胞を、形質転換細胞にDNAが含有されるルシフェラーゼの基質、Mg2+、ATP及び酸素、並びに候補物質の共存下で培養し、培養中及び/又は培養後に発光を測定し、
発光量または強度の増減から、前記候補物質のVDRに対する結合性を評価して、VDRに結合性を示す物質を選択することを含む。
本発明は、VDRに結合性を示す物質のスクリーニング方法であって、スクリーニングに細胞を用いないin vitroスクリーニング方法も包含する。本発明のin vitroスクリーニング方法は、本発明の融合タンパク質を、ルシフェラーゼの基質、Mg2+、ATP及び酸素、並びに候補物質の共存下で作用させて、作用中及び/又は作用後に発光を測定し、
発光量または強度の増減から、前記候補物質のVDRに対する結合性を評価して、VDRに結合性を示す物質を選択することを含む。
ヒト急性単球性白血病由来のTHP-1細胞からtRNAを抽出し、逆転写して合成したcDNAを鋳型とし、プライマー1および2(配列番号1および2)を用い、PCRによってヒトVDRを増幅した。PCRは、反応1(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 1分、30サイクル;鋳型DNA 10 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、 KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。PCR産物 1μLを1%アガロースゲルにより電気泳動した結果、目的の位置(約1.3 kb)に特異的な増幅が認められた(以下、1% アガロースゲルでの電気泳動は、単に電気泳動と略称する)。電気泳動による目的断片の増幅確認後、Zero blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)の取り扱い説明書に従い、PCR産物をpCR Blunt II-TOPO ベクターにクローニングし、塩化カルシウム法により大腸菌HST08株を形質転換し、カナマイシン 30μg/mLを含むLB寒天培地(ポリペプトン 10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 gおよび寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解)に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、2 mLのLB液体培地(カナマイシン30μg/mL含有)に植菌し、37℃、200 rpmで16時間振盪培養を行った。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出し、プラスミド濃度を260 nmの吸光度を用いて測定し、鋳型DNAとした。サイクルシークエンス反応は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて行った。配列解析の結果、ヒトのVDRをコードする遺伝子であることが確認できた。このプラスミドをpCR-Blunt II-TOPO-hVDRと命名した。
配列番号2:3'-ATATGCGGCCGCTCAGGAGATCTCATTGCCAAACAC-5'
例1で作製したpCR-Blunt II-TOPO-hVDRを鋳型とし、プライマー3および4(配列番号3および4)を用い、PCRによってLBD(hVDRのリガンド結合領域)を増幅した。また、Luc2(ホタルルシフェラーゼ)をコードするpGL4.31(Promega)ベクターを鋳型にし、プライマー5および6(配列番号5および6)、プライマー7および8(配列番号7および8)を用い、LucN(Luc2 1-1246 bp)、LucC(Luc2 1247-1650 bp)をPCRでそれぞれ増幅した。PCRは反応2(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 30秒、30サイクル;鋳型DNA 10 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。各PCR産物(LucN、LBD、LucC)1μLを電気泳動で増幅確認後、PCR産物各20 ngを混合したものと、プライマー5および8(配列番号5および8)を用い、オーバーラップPCR法によってLucN、LBD、LucCを連結した。PCRは反応3(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 1分30秒、30サイクル;PCR産物各 20 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。)PCR産物を電気泳動し、目的の位置(約2.2 kb)に特異的な増幅が認められた。PCR産物は、上述の方法により、pCR Blunt II-TOPOベクターにクローニングし、シークエンス解析後のプラスミドDNAをpCR Blunt II-TOPO-LucN-LBD-LucCと命名した。
配列番号4:3'-CGATGTCGCCGCTGTGCAGCCAGCCGGAGATCTCATTGCCAAACACTTCG-5'
配列番号5:3'-AATTCTCGAGATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG-5'
配列番号6:3'-GCTGCTCCTCAGACAGCTTGGGCCGGTCCTTGTCGATGAGAGCGTTTGTA-5'
配列番号7:3'-CGAAGTGTTTGGCAATGAGATCTCCGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCG-5'
配列番号8:3'-ATATGCGGCCGCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTCTTG-5'
例1で作製したpCR-Blunt II-TOPO-hVDRを鋳型とし、プライマー9および10(配列番号9および10)を用い、PCRによってLBD(VDRのリガンド結合領域)を増幅した。また、Luc2(ホタルルシフェラーゼ)をコードするpGL4.31(Promega)ベクターを鋳型にし、プライマー11および12(配列番号11および12)、プライマー13および14(配列番号13および14)を用い、LucC(Luc2 1247-1650 bp)、LucN(Luc2 1-1246 bp)をPCRでそれぞれ増幅した。PCRは反応2(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 30秒、30サイクル;鋳型DNA 10 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、 KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。各PCR産物(LucC、LBD、LucN)1μLを電気泳動で増幅確認後、PCR産物各20 ngを混合したものと、プライマー11および14(配列番号11および14)を用い、オーバーラップPCR法によってLucC、LBD、LucNを連結した。PCRは反応3(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 1分30秒、30サイクル;PCR産物各 20 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。)PCR産物を電気泳動し、目的の位置(約2.2kb)に特異的な増幅が認められた。PCR産物は、上記の方法により、pCR Blunt II-TOPOベクターにクローニングし、シークエンス解析後のプラスミドDNAをpCR Blunt II-TOPO-LucC-LBD-LucNと命名した。
配列番号10:3'-CTTCTTAATGTTTTTGGCATCTTCGGAGATCTCATTGCCAAACACTTCGA-5'
配列番号11:3'-AATCTCGAGATGGGCTGGCTGCACAGCGGC-5'
配列番号12:3'-GCTGCTCCTCAGACAGCTTGGGCCGCACGGCGATCTTGCCGCCCTTCTTG-5'
配列番号13:3'-TCGAAGTGTTTGGCAATGAGATCTCCGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAG-5'
配列番号14:3'-TAAGCGGCCGCTTAGTCCTTGTCGATGAGAGCGTTTGTAG-5'
例2および3で作製したpCR Blunt II-TOPO-LucN-LBD-LucCおよびpCR Blunt II-TOPO-LucC-LBD-LucNプラスミドDNA各約1μgを各3 Uの制限酵素XhoIおよびNotIで処理(37℃、1時間)し、電気泳動を行った。約2.2 kbのDNA断片を、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いてアガロースゲルから抽出・精製し、インサート断片(LucN-LBD-LucCおよびLucC-LBD-LucN)とした。哺乳動物細胞で発現させるためのpEBMulti-neoベクター(Wako)約1μgを各3 Uの制限酵素XhoIおよびNotIで処理(37℃、1時間)後、Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(TaKaRa)で切断末端を脱リン酸化処理し、エタノール沈殿によって精製したものをベクター断片とした。インサート断片とベクター断片はモル比が3:1〜10:1程度になるように混合し、等量のLigation High Ver.2(TOYOBO)を加え、16℃、1時間の反応を行った。その後、塩化カルシウム法により大腸菌HST08株を形質転換し、カナマイシン 30μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、2 mLのLB液体培地(カナマイシン30 (g/mL含有)に植菌し、37℃、200 rpmで16時間振盪培養を行った。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出し、その一部を3 Uの制限酵素XhoIとNotIで処理し、電気泳動によってインサートの導入を確認した。得られたプラスミドDNAを、それぞれpEBMulti-neo-LucN-LBD-LucC、pEBMulti-neo-LucC-LBD-LucNと命名した。以降の実験では、これらの構造物をVDRリガンド検出バイオセンサーまたは単にバイオセンサーと呼ぶ(化4)。
VDRリガンド検出バイオセンサーのLBD内に様々な変異(R274L、D299A、R391C、E420K)を有する変異型バイオセンサーを開発するために、PCR法によって変異を挿入した。pCR Blunt II-TOPO-LucC-LBD-LucN ベクターを鋳型にし、R274L変異体作製には、プライマー15および16(配列番号15および16)、D299A変異体作製には、プライマー17および18(配列番号17および18)、R391C変異体作製には、プライマー19および20(配列番号19および20)、E420K変異体作製には、プライマー21および22(配列番号21および22)を用いた。PCRは、反応4(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 3分30秒、16サイクル;鋳型DNA 10 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。PCR産物に、制限酵素DpnI 5Uを加えて37℃で3時間処理後、エタノール沈殿により精製し、5μLの超純水に溶解した。その後、塩化カルシウム法により大腸菌HST08株を形質転換し、カナマイシン 30μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、2 mLのLB液体培地(カナマイシン30μg/mL含有)に植菌し、37℃、200 rpmで16時間振盪培養を行った。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出し、得られたプラスミドDNAはシークエンスにより配列を確認後、例4と同様の方法で、pEBMulti-neo ベクターのXhoIとNotIサイトにそれぞれクローニングした。完成後のベクターは、pEBMulti-neo-LucC-LBD(R274L)-LucN、pEBMulti-neo-LucC-LBD(D299A)-LucN、pEBMulti-neo-LucC-LBD(R391C)-LucN、pEBMulti-neo-LucC-LBD(E420K)-LucNと命名した(化5)これらを総称して変異型バイオセンサーと呼ぶ。
配列番号16:3'-ACTCATTGGAGAGCAACATGATGACCTCAATG-5'
配列番号17:3'-CGTCAGTGACGTGCCCAAAGCCGGAC-5'
配列番号18:3'-TGGTCACGGCACTGACGCGGTACTTG-5'
配列番号19:3'-CCGACCTGTGCAGCCTCAATGAGGAGC-5'
配列番号20:3'-TGAGGCTGCACAGGTCGGCTAGCTTCTG-5'
配列番号21:3'-CTTGTGCTCAAAGTGTTTGGCAATGAG-5'
配列番号22:3'-CAAACACTTTGAGCACAAGGGGCGTTAGC-5'
アフリカミドリザルの腎臓由来のCOS-7細胞を10 % FBSを含むDMEM培地(フェノールレッド含有)に懸濁し、0.7〜1.0×106個の細胞を10 cmの培養皿に播種した。その後、5 % CO2、37℃で24時間培養後、リポフェクション法でCOS-7細胞内に遺伝子導入を行った。VDRリガンド検出バイオセンサーをコードするプラスミドDNA(pEBMulti-neo-LucN-LBD-LucC、pEBMulti-neo-LucC-LBD-LucN、 pEBMulti-neo-LucC-LBD(R274L)-LucN、pEBMulti-neo-LucC-LBD (D299A) -LucN、pEBMulti-neo-LucC-LBD(R391C)-LucN、pEBMulti-neo-LucC-LBD(E420K) -LucN)10μgを1 mlのOpti-MEM培地に懸濁し、DNA溶液とした。別のチューブに20μLのLipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen)と1 mlのOpti-MEM培地を懸濁し、準備しておいたDNA溶液と混和させて室温で20分静置した後、細胞に滴下した。細胞は、5 % CO2、37℃で24時間培養した。
遺伝子導入してから24時間後、培地を除去し、1×PBSで細胞を洗浄した。細胞をトリプシン処理によって剥がし、15 mLのコニカルチューブに回収後、500 rpmで3分間の遠心分離を行った。上清を除去した後、10 % CS-FBS(ホルモン類非含有血清)を含むDMEM(フェノールレッド非含有培地)に懸濁した細胞を、1ウェルあたり1.0×104個の細胞数で播種し、5 % CO2、37℃で24時間培養した。
遺伝子導入してから48時間後、終濃度0.5 mM D-Luciferin Monosodium Salt(Thermo Scientific)を含むL-15培地(フェノールレッド非含有)に培地交換し、室温で30〜60分静置した。VDRリガンド(アゴニストまたはアンタゴニスト)投与前を0分とし、各ウェルにVDRリガンドを投与してから経時的に発光測定を行った。VDRリガンドの溶媒として用いているエタノール(EtOH)の持ち込みは、終濃度0.1%とした。発光測定の機器には、マイクロプレートリーダーInfinite 200 Pro(TECAN)を用いた。また、VDRリガンド投与後のルシフェラーゼの発光量変化の原理は下に示した。
LucN-LBD-LucCまたはLucC-LBD-LucNバイオセンサーを発現させたCOS-7細胞を用いて25D3または1α,25D3を各濃度で投与してから120分間の発光変化量を比較した。発光変化量は、25D3または1α,25D3投与後120分時点での発光量を25D3または1α,25D3投与前の発光量で割って得られた値とした。LucN-LBD-LucCバイオセンサーは投与後の発光量は約60%減少したが(図1A)、LucC-LBD-LucNバイオセンサーは約80%減少した(図1B)。従って、LucC-LBD-LucNバイオセンサーのほうが25D3または1α,25D3検出時の発光減少量が大きいため、以降の実験ではこのバイオセンサーを基に用いることとした。
LucC-LBD-LucNバイオセンサーを発現させたCOS-7細胞を用い、天然型ビタミンD投与前の発光測定を行った後、天然型ビタミンD(VD2、VD3、25D2、25D3、1α,25D2、1α,25D3)を1、10、100、1000 nMの濃度で各ウェルに投与し、120分後に発光測定を行った。天然型ビタミンD投与後120分時点での発光量を天然型ビタミンD投与前の発光量で割り、算出した値を120分間における発光変化量とした。VD2(図2)およびVD3(図3)を投与しても、濃度依存的な発光量の減少は起こらなかった。それに対し、25D2、25D3、1α,25D2、1α,25D3を投与すると、濃度依存的に発光量が減少した。特に、1000 nMの濃度で作用させた場合は、LucC-LBD-LucNバイオセンサーの発光量が約80%減少した。100 nM の濃度で作用させた場合、25D2および25D3は発光量の減少は約40〜50%であったが、1α,25D2および1α,25D3は約80%減少した。従って、1α,25D2および1α,25D3は25D2および25D3よりも親和性が高いものと考えられる。
LucC-LBD-LucNバイオセンサーを発現させたCOS-7細胞を用い、ビタミンD誘導体類投与前の発光測定を行った後、ビタミンD誘導体類(MART-10、ED-71、AH-1、MM-1、O1C3、O2C3、)を下図4-AおよびBに示した濃度で投与し、120分後の発光測定を行った。ビタミンD誘導体類投与後120分時点での発光量をビタミンD誘導体類投与前の発光量で割り、算出した値を120分間における発光変化量とした。LucC-LBD-LucNバイオセンサーの発光量は、ビタミンD誘導体類の濃度依存的に減少した。その中でも、MART-10、AH-1、O1C3、O2C3については、10 nMでも発光量が約40%減少した。
様々な変異(R274L、D299A、R391C、E420K)を含むLucC-LBD-LucNバイオセンサーを発現させたCOS-7細胞を用い、VDRリガンド投与前の発光測定を行った後、25D3および1α,25D3を10、100、1000 nMの濃度で各ウェルに投与し、120分間における発光変化量を算出した(図5)。R274L型の変異は、くる病患者に認められる変異の一つであり、1α,25D3のLBDへの親和性が約1/1000以下に低下することが報告されている(非特許文献5)。100 nMの1α,25D3を投与すると、変異を含まないLucC-LBD-LucNバイオセンサーの発光量は約80%減少したが、LucC-LBD-LucN R274Lバイオセンサーの発光量は減少しなかった。
LucN-LBD-LucCバイオセンサー内のLBDを2分子持つ改良型バイオセンサーを作製するために、pCR Blunt II-TOPO-LucN-LBD-LucCを鋳型にし、プライマー23(配列番号23)および24(配列番号24)を用いLucN-LBD断片(約2.1 kb)、また、プライマー25(配列番号25)および26(配列番号26)を用いLBD-LucC断片(約1.3 kb)をそれぞれPCRで増幅した。PCRは、反応3(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 1分30秒、16サイクル;鋳型DNA 10 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。各PCR産物(LucN-LBDおよびLBD-LucC)1μLを電気泳動で増幅確認後、PCR産物各20 ngを混合したものと、プライマー23および26(配列番号23および26)を用い、オーバーラップPCR法によってLucN-LBDおよびLBD-LucCを連結した。PCRは反応5(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 2分、30サイクル;PCR産物各 20 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、 KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。)PCR産物を電気泳動し、目的の位置(約3.4 kb)に特異的な増幅が認められた。PCR産物は、エタノール沈殿により精製後、超純水に溶解した。各3Uの制限酵素XhoIおよびNotIで処理(37℃、1時間)後、再度エタノール沈殿により精製し、超純水に溶解したものをインサート断片(LucN-LBD-LBD-LucC)とした。インサート断片は、例4と同様の方法で、pEBMulti-neo ベクターのXhoIとNotIサイトにそれぞれクローニングした。完成後のベクターは、シーケンス解析によって配列の確認後、pEBMulti-neo-LucN-LBD-LBD-LucCと命名した(下記改良型バイオセンサーの構造のA参照)。
M13 rev 5'- CAGGAAACAGCTATGAC -3'
配列番号24:
5'-GCGATGTCGCCGCTGTGCAGCCAGCCGGAGATCTCATTGCCAAACACTTCGAG-3'
配列番号25:
5'-CTCGAAGTGTTTGGCAATGAGATCTCCCGGCCCAAGCTGTCTGAGGAGCAGC-3'
配列番号26:
M13 for 5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
LucC-LBD-LucN内のLBDを2分子持つ改良型バイオセンサーを作製するために、pCR Blunt II-TOPO-LucC-LBD-LucNを鋳型にし、プライマー26(配列番号26)および24(配列番号24)を用いLucC-LBD断片(約1.3 kb)、また、プライマー25(配列番号25)および23(配列番号23)を用いLBD-LucN断片(約2.1 kb)をそれぞれPCRで増幅した。PCRは、反応3(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 1分30秒、16サイクル;鋳型DNA 10 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。各PCR産物(LucC-LBDおよびLBD-LucN)1μLを電気泳動で増幅確認後、PCR産物各20 ngを混合したものと、プライマー23および26(配列番号23および26)を用い、オーバーラップPCR法によってLucC-LBDおよびLBD-LucNを連結した。PCRは反応5(94℃ 2分後、98℃ 10秒、56℃ 30秒、68℃ 2分、30サイクル;PCR産物各 20 ng、MgSO4 1.5 mM、dNTPs 0.2 mM、 KOD-plus neo-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x PCR Buffer for KOD plus neo)、プライマー各 0.3μM、最終液量20μLの条件で行った。)PCR産物を電気泳動し、目的の位置(約3.4 kb)に特異的な増幅が認められた。PCR産物は、エタノール沈殿により精製後、超純水に溶解した。各3Uの制限酵素XhoIおよびNotIで処理(37℃、1時間)後、再度エタノール沈殿により精製し、超純水に溶解したものをインサート断片(LucC-LBD-LBD-LucN)とした。インサート断片は、例4と同様の方法で、pEBMulti-neo ベクターのXhoIとNotIサイトにそれぞれクローニングした。完成後のベクターは、シーケンス解析によって配列の確認後、pEBMulti-neo-LucC-LBD-LBD-LucNと命名した(下記改良型バイオセンサーの構造のB参照)。
改良型バイオセンサー(pEBMulti-neo-LucN-LBD-LBD-LucCおよびpEBMulti-neo-LucC-LBD-LBD-LucN)を例6〜8に記載した方法で発現させたCOS-7細胞を用い、種々のビタミンD投与前の発光測定を行った後、以下に示す種々のビタミンD(VD2、VD3、25D2、25D3、1α,25D2、1α,25D3)を10、100、1000 nMの濃度で各ウェルに投与し、120分後に発光測定を行った。種々のビタミンD投与後120分時点での発光量を種々のビタミンD投与前の発光量で割り、算出した値を120分間における発光変化量とした。LucN-LBD-LBD-LucCおよびLucC-LBD-LBD-LucNバイオセンサー共に、VD2およびVD3を投与しても発光量は減少しなかったが、25D2、25D3、1α,25D2、1α,25D3を投与すると、濃度依存的に発光量が減少した(図6A-B)。種々のビタミンD投与後のLucN-LBD-LBD-LucCおよびLucC-LBD-LBD-LucNバイオセンサーの発光量について比較すると、LucN-LBD-LBD-LucCバイオセンサーは約80%減少したのに対し、LucC-LBD-LBD-LucNバイオセンサーは約90%減少した。また、例4で作製したLucC-LBD-LucNバイオセンサーでは、10 nMの1α,25D3を投与した場合の発光減少量は約30%であったが、LucC-LBD-LBD-LucNバイオセンサーでは発光減少量は約60%であった。以上のことから、LBDを2分子有するLucC-LBD-LBD-LucNバイオセンサーは、発光変化量が大きく、検出感度にも優れていることが示唆された。
アゴニスト(1α,25D3)を用いた場合とアンタゴニスト(NS-4)を作用させた場合の結果を図7に示す。アンタゴニスト(NS-4)を作用させた場合には、発光強度が濃度依存的に増加していることが分かる。
例4で作製したpEBMulti-neo-LucC-LBD-LucNプラスミドDNA 約1μgを各3 Uの制限酵素KpnIおよびNotIで処理(それぞれ37℃、1時間)し、電気泳動を行った。約2.2 kbのDNA断片を、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いてアガロースゲルから抽出・精製し、インサート断片(LucC-LBD-LucN)とした。TNT SP6 High-Yield Wheat GermProtein Expression System (Promega)を用いて、LucC-LBD-LucNタンパク質をin vitroで発現させるために、pCR Blunt II-TOPO vector約1μgを各3 Uの制限酵素KpnIおよびNotIで処理(それぞれ37℃、1時間)後、Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(TaKaRa)で切断末端を脱リン酸化処理し、エタノール沈殿によって精製したものをベクター断片とした。インサート断片とベクター断片はモル比が3:1〜10:1程度になるように混合し、等量のLigation High Ver.2(TOYOBO)を加え、16℃、1時間の反応を行った。その後、塩化カルシウム法により大腸菌HST08株を形質転換し、カナマイシン 30μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、2 mLのLB液体培地(カナマイシン30μg/mL含有)に植菌し、37℃、200 rpmで16時間振盪培養を行った。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出し、その一部を3 Uの制限酵素KpnIとNotIで処理し、電気泳動によってインサートの導入を確認した。得られたプラスミドDNAを鋳型とし、KOD plus Mutagenesis Kit(TOYOBO)の方法に従い、プライマー40および41(配列番号40および41)を用いPCRを行った。PCRは、反応1(94℃ 2分後、98℃ 10秒、68℃ 6分30秒、12サイクル;鋳型DNA 10 ng、dNTPs 0.2 mM、KOD-plus DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10 x Buffer for iPCR)、プライマー各 0.3μM、最終液量10μLの条件で行った。PCR産物に、制限酵素DpnI 5 Uを加えて37℃で3時間処理後の1μLとT4 Polynucleotide kinase 0.5μ(L, Ligation high 2.5μLを混和し16℃で1時間の反応を行った。その後、塩化カルシウム法により大腸菌HST08株を形質転換し、カナマイシン 30μg/mLを含むLB寒天培地(ポリペプトン 10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 gおよび寒天15 gを蒸留水1 Lに溶解)に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、2 mLのLB液体培地(カナマイシン30μg/mL含有)に植菌し、37℃、200 rpmで16時間振盪培養を行った。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出し、プラスミド濃度を260 nmの吸光度を用いて測定し、鋳型DNAとした。サイクルシークエンス反応は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて行った。配列解析の結果、SP6プロモーター配列の下流にLucC-LBD-LucNがコードされていることが確認できた。このプラスミドをpCR-Blunt II-TOPO-SP6-LucC-LBD-LucNと命名した(下記参照)。
配列番号41:3’-TGTTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTG-5’
TNT SP6 High-Yield Wheat GermProtein Expression System (Promega)を用いてin vitroでのタンパク質合成を行う。例2-1で作製したpCR-Blunt II-TOPO-SP6-LucC-LBD-LucN ベクター約10μgとTNT SP6 High-Yield Wheat Germ Master Mix 30μLを混和し、超純水で最終容量を50μLとした後、25℃で2時間の反応を行った。合成したタンパク質は-80℃で保存した。
例2-2で合成したLucC-LBD-LucNタンパク質(10-100 ng/μL)を25 mM Tris-HCl(pH 7.5)に懸濁し、タンパク質溶液とした。タンパク質溶液中のLucC-LBD-LucNタンパク質の濃度は0.5-5 ng/μLとした。次にLuciferase assay溶液(25 mM Tris-HCl(pH 7.5)、10 mM MgSO4、2 mM D-luciferin、2 mM ATP)を作製した。タンパク溶液20μLに、ビタミンD受容体リガンド(25D3, 1,25D3または NS-4)を添加し、室温で5分間の反応を行った。その後、20μLのLuciferase assay溶液を加えて混和し、マイクロプレートリーダーInfinite 200 Pro(TECAN)を用いて発光測定を行った。ビタミンD受容体リガンドは最終濃度0.01-1000 nM、溶媒として用いているエタノール(EtOH)の持ち込みは、終濃度1%になるように加えた。ビタミンD受容体リガンド添加後5分経過時の発光強度の相対値を図21に示す。その結果、COS-7細胞を用いて行った実験系と同様に、アゴニスト添加後には濃度依存的に発光量が減少し、アンタゴニスト添加後は、濃度依存的に発光量が増加した。COS-7細胞を用いた系では、検出までに約90分を要するが、in vitroの系では、約5分で同様の変化量を示した。
配列番号27: <ホタルルシフェラーゼ遺伝子配列>
配列番号28: <ホタルルシフェラーゼアミノ酸配列>
配列番号29: <ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子配列>
配列番号30: <ウミシイタケルシフェラーゼアミノ酸配列>
配列番号31: <ヒトビタミンD受容体塩基配列>
配列番号32:<ヒトビタミンD受容体アミノ酸配列>
配列番号33: <マウスビタミンD受容体塩基配列>
配列番号34:<マウスビタミンD受容体アミノ酸配列>
配列番号35: <ラットビタミンD受容体塩基配列>
配列番号36:<ラットビタミンD受容体アミノ酸配列>
配列番号37:<サルビタミンD受容体アミノ酸配列>
配列番号38:<イヌビタミンD受容体アミノ酸配列>
配列番号39:<ウシビタミンD受容体アミノ酸配列>
配列番号40〜41:PCR用プライマー
Claims (21)
- ルシフェラーゼのN端ドメイン、ビタミンD受容体(以下、VDRと表記する)のビタミンD結合ドメインを少なくとも1個、及びルシフェラーゼのC端ドメインからなり、少なくとも1個のVDRはルシフェラーゼのN端ドメインとルシフェラーゼのC端ドメインとの間にある融合タンパク質。
- ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、及びガウシアルシフェラーゼルシフェラーゼから成る群から選ばれる請求項1に記載の融合タンパク質。
- ホタルルシフェラーゼは、配列表の配列番号28で示されるアミノ酸配列を有し、
N端ドメインは、1番から415番までのアミノ酸配列を有し、C端ドメインは、416番から550番までのアミノ酸配列を有する請求項2に記載の融合タンパク質。 - ウミシイタケルシフェラーゼは、配列表の配列番号30で示されるアミノ酸配列を有し、
N端ドメインは、1番から229番までのアミノ酸配列を有し、C端ドメインは、230番から311番までのアミノ酸配列を有する請求項2に記載の融合タンパク質。 - VDRは、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、またはウシのVDRである請求項1に記載の融合タンパク質。
- ヒトVDRは、配列表の配列番号32で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から427番までのアミノ酸配列を有し、R158C、C190W、L227P、L233S、△K246、F251C、Q259P、Q259E、L263R、R274L、R274H、W286R、H305Q、I314S、G319V、E329K、V346M、R391C、E420K、及びE420Aから成る群から選ばれる少なくとも1種の変異を有することができる、請求項5に記載の融合タンパク質。
- マウスVDRは、配列表の配列番号34で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から422番までのアミノ酸配列を有し、R158C、L227P、L233S、△K241、F246C、Q254P、Q254E、L258R、R269L、R269H、W281R、H300Q、I309S、G314V、E324K、V331M、R386C、E415K、及びE415Aから成る群から選ばれる少なくとも1種の変異を有することができる、請求項5に記載の融合タンパク質。
- ラットVDRは、配列表の配列番号36で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から423番までのアミノ酸配列を有し、R158C、L227P、L233S、△K242、F247C、Q255P、Q255E、L259R、R270L、R270H、W282R、H301Q、I310S、G315V、E325K、V332M、R387C、E416K、及びE416Aから成る群から選ばれる少なくとも1種の変異を有することができる、請求項5に記載の融合タンパク質。
- サルVDRは、配列表の配列番号37で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から434番までのアミノ酸配列を有し、R165C、L234P、L240S、△K253、F258C、Q266P、Q266E、L270R、R281L、R281H、W293R、H312Q、I321S、G326V、E336K、V343M、R398C、E427K、及びE427Aから成る群から選ばれる少なくとも1種の変異を有することができる、請求項5に記載の融合タンパク質。
- イヌVDRは、配列表の配列番号38で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から427番までのアミノ酸配列を有し、R158C、L227P、L233S、△K246、F251C、Q259P、Q259E、L263R、R274L、R274H、W286R、H305Q、I314S、G319V、E329K、V346M、R391C、E420K、及びE420Aから成る群から選ばれる少なくとも1種の変異を有することができる、請求項5に記載の融合タンパク質。
- ウシVDRは、配列表の配列番号39で示されるアミノ酸配列を有し、そのビタミンD結合ドメインは、121番から426番までのアミノ酸配列を有し、R158C、C190W、L227P、L233S、△K244、F249C、Q257P、Q257E、L261R、R272L、R272H、W284R、H304Q、I313S、G318V、E328K、V335M、R390C、E419K、及びE419Aから成る群から選ばれる少なくとも1種の変異を有することができる、請求項5に記載の融合タンパク質。
- ビタミンD結合ドメインを2個有する請求項1〜11のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA。
- ベクター中に請求項13に記載のDNAを含有するプラスミド。
- 請求項14に記載のプラスミドを導入した細胞である形質転換細胞。
- 前記細胞は、哺乳動物または昆虫由来の細胞である請求項15に記載の形質転換細胞。
- ビタミンD受容体(以下、VDRと表記する)に結合性を示す物質のスクリーニング方法であって、
請求項15または16に記載の形質転換細胞を、形質転換細胞にDNAが含有されるルシフェラーゼの基質、Mg2+、ATP及び酸素、並びに候補物質の共存下で培養し、培養中及び/又は培養後に発光を測定し、
発光量または強度の増減から、前記候補物質のVDRに対する結合性を評価して、VDRに結合性を示す物質を選択することを含む、前記スクリーニング方法。 - 前記形質転換細胞に導入されたプラスミドが含有するビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列をコードするDNAは、前記ビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列が請求項6〜11のいずれかに記載の変異を有し、前記アミノ酸配列の変異と疾患との関係から、前記疾患に関与する変異を有するビタミンD結合ドメインに特異的に結合する候補物質をスクリーニングする、請求項17に記載のスクリーニング方法。
- ビタミンD受容体(以下、VDRと表記する)に結合性を示す物質のスクリーニング方法であって、
請求項1〜12のいずれかに記載の融合タンパク質を、ルシフェラーゼの基質、Mg2+、ATP及び酸素、並びに候補物質の共存下で作用させて、作用中及び/又は作用後に発光を測定し、
発光量または強度の増減から、前記候補物質のVDRに対する結合性を評価して、VDRに結合性を示す物質を選択することを含む、前記スクリーニング方法。 - 前記融合タンパク質が含有するビタミンD結合ドメインのアミノ酸配列が請求項6〜11のいずれかに記載の変異を有し、前記アミノ酸配列の変異と疾患との関係から、前記疾患に関与する変異を有するビタミンD結合ドメインに特異的に結合する候補物質をスクリーニングする、請求項19に記載のスクリーニング方法。
- 前記候補物質は、ステロイド骨格を有する化合物、脂肪酸類、脂溶性ビタミン類、又はポリフェノール類である請求項17〜20のいずれかに記載のスクリーニング方法。
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