JP5084984B2 - 免疫原複合体およびそれに関する方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は概して荷電有機担体および荷電抗原、より詳しくは、負電荷を有する有機担体および正電荷を有する抗原を含んでなる免疫原複合体に関する。本発明の複合体は、特に、抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球応答の誘導を促進するための治療薬および/または予防薬として有用である。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
発明の背景
本明細書において著者によって引用される刊行物の文献詳細は記載の最後に収録されている。
【0003】
同一の抗原提示細胞(APC)への抗原およびアジュバントの同時送達は適当な免疫応答の誘導に好ましく、必須である場合もあるという考えが広がりつつある。例えば、サポニンをベースとしたアジュバントのCD3 +CTL応答を誘導する能力は、それらの同時送達を必要とする機構である、抗原のエンドソーム逃避を引き起こす能力に起因する。アジュバントと抗原の安定な複合体を含んでなる粒子形成は同時送達を達成するための最も単純な方法である。ISCOM(商標)技術の有用性はいく分かはサポニンの免疫調節性活性に由来し、いく分かはそれらの疎水性または両親媒性免疫原と複合体を形成する能力に由来する。しかしながら、多数の分子は疎水性領域を欠いており、実際は、かかる分子はそれらのより容易な発現および精製のために組換えタンパク質が好ましい。
【0004】
従って、抗原と担体の同時送達を促進するが、通常は十分に安定な複合体を形成しない免疫原複合体を開発する必要がある。例えば、疎水性領域を欠く抗原とアジュバントを含んでなる複合体。
【0005】
本発明の糸口となる研究では、本発明者らは抗原とアジュバントなどの有機担体の静電気的結合に基づく免疫原複合体を開発した。静電気的結合は抗原と有機担体の免疫系への同時送達を可能にする。従って、静電気的結合を確立することによって、例えば抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導するという目的ために、注目される抗原(それらの疎水性に関わらず)を有機担体と同時送達できる。
【0006】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本明細書およびその後に続く請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解す必要がない限り、「含む」および「含んでなる」などの語尾変化は示された整数もしくは工程または一連の整数もしくは工程を包含するが、いずれかのその他の整数もしくは工程または一連の整数もしくは工程を除外するものではないことを意味すると理解される。
【0007】
本明細書はプログラムPatentInバージョン2.0を用いて作製され、本明細書において文献の後に示されるアミノ酸配列情報を含む。各アミノ酸配列は数値的指標によって<210>、続いて、配列識別子によって(例えば、<210>1、<210>2など)配列を列挙することによって同定される。各アミノ酸配列についての配列の長さ、種類(タンパク質(PRT)など)および供給生物はそれぞれ数値的指標フィールド<211>、<212>および<213>で提供される情報によって示されている。本明細書において参照されるアミノ酸配列は数値的指標フィールド<400>で提供される情報によって、さらに配列識別子(例えば、<400>1、<400>2など)によって規定される。
【0008】
本発明の1つの態様は荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体に関する。
【0009】
より詳しくは、本発明のもう1つの態様は負電荷を有する有機担体および正電荷を有する抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0010】
本発明のさらにもう1つの態様は負電荷を有する有機担体および正電荷を有するタンパク質を含んでなり、有機担体とタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0011】
本発明のさらにもう1つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0012】
本発明のなおさらなるもう1つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、そのアジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0013】
本発明のさらにもう1つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0014】
本発明のなおさらなるもう1つの態様は負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、かつ、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する
【0015】
本発明のさらなる態様は1種以上の医薬上許容される担体および/または希釈剤とともに、有効成分として荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を含んでなるワクチン組成物に関する。
【0016】
本発明のもう1つのさらなる態様は哺乳類において抗原に対する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含む方法に関する。
【0017】
本発明のさらにもう1つのさらなる態様は哺乳類において病状を治療する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含み、組成物の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延、または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法に関する。
【0018】
本発明のさらにもう1つのさらなる態様は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物の病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止するための医薬の製造における使用に関する。
【0019】
本発明のなおさらにもう1つのさらなる態様は病状の発症または進行の阻害、停止、遅延または防止に用いる薬剤に関し、薬剤は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物を含んでなる。
【0020】
本明細書を通して用いられる一文字および三文字略語が表1に定義されている。
【0021】
【0022】
好ましい具体例の詳細な説明
本発明は一部分は静電気的相互作用を利用して抗原と担体を結合させ、それによって、特に、これらの分子の免疫系への同時送達を促進する免疫原複合体製剤の開発に基づいている。本発明の免疫原複合体は特に、疎水性領域を含まない免疫原に対する細胞傷害性Tリンパ球応答の刺激の促進に用いるのに好適である。
【0023】
従って、本発明の1つの態様は荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体に関する。
【0024】
「複合体」とは2種以上の異なる相互作用性化学成分の実体を表すと理解されるべきである。
【0025】
「荷電」有機担体または抗原とは全体的に正の電気的電荷または全体的に負の電気的電荷を示す有機担体または抗原として理解されるべきである。「全体的に」とは所与の分子が含んでなる個々の正および負電荷の総計を意味する。個々の正および負電荷の総計が全体的に電気的中性をもたらす場合には、本発明の範囲内では分子は「荷電」とは考えられない。好ましくは、抗原は全体的に正電荷を含んでなり、かつ、有機担体は全体的に負電荷を含んでなる。
【0026】
従って、より詳しくは、本発明は負電荷を有する有機担体および正電荷を有する抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0027】
「静電気的に結合した」とは有機担体および抗原が静電気的相互作用を含む手段によって連結、結合または会合していることを指す。従って、静電気的相互作用が抗原および有機担体の複合をもたらす唯一の引力である場合もあると理解されるべきである。しかしながら、その他の例では、静電気的相互作用の形成がまた、その他の相互作用力の形成をもたらすか、またはそれと関連し得る。
【0028】
「抗原」とはそれに対して免疫応答、特に、細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導すると考えられるいずれかの分子を指すと理解されるべきである。抗原はタンパク質性または非タンパク質性分子のいずれであってもよく、この分子は単独で投与される場合には免疫原性であってもそうでなくともよい。本発明の抗原は天然に得ることもできるし、または組換えによってもしくは合成によっても製造できる。抗原はその単離または合成に続いて本発明における使用に先立ってさらなる改変(例えば、その抗原性を向上させるための構造または配列改変)を必要とする場合もある。本発明に用いるのに好適な抗原としては、限定されるものではないが、ウイルスから単離したコアタンパク質または核タンパク質、ウイルス様粒子(VLP)などの非コアウイルスタンパク質、悪性および非悪性細胞の抗原、細菌性抗原、寄生虫抗原ならびに合成および組換えポリトープが挙げられる。
【0029】
好ましくは、抗原はタンパク質である。「タンパク質」とはタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドならびにそれらの誘導体および同等物を包含すると理解されるべきである。タンパク質は種々の程度にグリコシル化もしくは非グリコシル化、リン酸化もしくは脱リン酸化されていてもよく、かつ/または、タンパク質に融合、連結、結合または会合した、アミノ酸、脂質、炭水化物またはその他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質などのある程度のその他の分子含んでいてもよい。前記の「タンパク質」としてはアミノ酸の配列を含んでなるタンパク質ならびにアミノ酸、脂質、炭水化物またはその他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質などのその他の分子と結合したタンパク質を含む。
【0030】
前記に定義されるように、本発明の抗原はまたポリトープであり得る。本ポリトープは合成または組換え法(例えば、国際特許公開WO96/03144を参照)によって製造すればよい。
【0031】
好ましい具体例によれば、負電荷を有する有機担体および正電荷を有するタンパク質を含んでなり、有機担体とタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が提供される。
【0032】
これに関しては、本発明の免疫原複合体に含まれる抗原は、その最初の、すなわち天然の形態では正電荷を有しても、負電荷を有してもまたは中性電荷を有してもよい。抗原が正電荷を有する場合であっても、弱く正電荷を有し、従って、その正電荷度を増加させ、その結果、負電荷を有する有機担体との複合体形成がより促進されるための改変を必要とする場合もある。例えば、抗原が弱く正電荷を有する場合には、その正電荷度を増加させることは、限定されるものではないが、抗原へのさらなる正電荷の化学的付加または抗原へのポリリジンの付加などによる正電荷の組換えによる付加をはじめとする当業者に公知のいくつかの方法のいずれか1つによって達成できる。これは特に抗原がタンパク質である場合に用いられる。抗原の正電荷度を増加させるために用いられ得るその他の方法としては、限定されるものではないが、pH改変、化学修飾または抗原の負電荷のアルギニンなどの正電荷を有する分子での中和が挙げられる。同様に、抗原が中性または負電荷を有する場合には、かかる方法論を用いることによってその全体的な電荷を全体的に正電荷に変換することができる。負電荷を有する抗原の全体的に正電荷を表すための変換は、ほとんどのタンパク質は自然状態では負電荷を有するので抗原がタンパク質である場合には特に重要であり得る。
【0033】
注目される抗原の電荷が十分に正であれば、正電荷を有する抗原の沈殿が有機担体との複合体形成に先立って起こらないことを確実にすることが必要となる。これに関しては、抗原沈殿を防ぐためのいずれかの好適な方法を用いればよい。例えば、抗原可溶性は抗原凝集を引き起こす力を破壊することによって維持できる。これらの力の破壊は、例えば抗原に尿素およびグアニジンなどの溶液カオトロピック剤、DMSO(ジメチルスルホキシド)およびアセトニトリルなどの溶媒、双性イオンなどの中間体、TritonX−100およびCHAPS(3−[(3−コルアミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート)などの界面活性剤、DTT(ジチオスレイトール)およびシステインなどの還元剤およびEDTA(エチレンジアミン四酢酸)などのキレート剤を組み込むことによって達成することができる。可溶性はまた、抗原溶液のpHを変更することによって、またはアルキル化またはアセチル化などによる極性もしくはイオン性分子を導入するための抗原の化学修飾によって維持することができる。抗原が「有機担体」と接触している時にこれらの沈殿防止剤を漸進的または段階的に除去するか、または抗原を軽く変性させることにより、抗原の制御された沈殿がをもたらされ、同時に有機担体との結合の増加が生じ得る。
【0034】
「有機担体」とは抗原がそれと結合する場合に抗原に対する免疫応答、特に、細胞傷害性Tリンパ球応答の誘導を促進する、いずれかの分子、分子の凝集塊または複合体、化合物またはその他の実体と理解されるべきである。本担体は「有機的」であり、これに関しては、「有機的」とは天然に、組換えによってまたは合成によって得たかまたは誘導したかの、炭素の化合物と理解されるべきである。特に好ましい具体例では、有機担体はアジュバントである。「アジュバント」とは免疫応答のいずれか1種以上の態様を刺激、増強またはアップレギュレートするよう機能する、いずれかの有機分子、有機分子の凝集塊または複合体、化合物またはその他の実体を意味する。例えば、アジュバントは炎症を誘導し、それにより免疫応答細胞を抗原局在化部位に引きつけ得る。あるいは、アジュバントは抗原をゆっくりと放出し、それによって免疫系の進行中の刺激を提供し得る。本発明に用いるのに好適なアジュバントの例としては、限定されるものではないが、サポニン、サポニン複合体、ISCOMATRIXTM(商標)として知られるサポニン、コレステロールおよび脂質からなる免疫刺激性複合体のいずれか1種以上の成分(例えば、サポニン成分、および/またはリン脂質成分)、リポソームまたは水中油エマルションが挙げられる。[ISCOMATRIX(商標)の組成および製造は国際特許出願PCT/SE86/00480、オーストラリア特許第558258号および同第632067号および欧州特許公開第0180564号に詳細に記載されており、それらの開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる]。アジュバントのさらなる例としては、限定されるものではないが、Cox and Coulter, 1992, 1997 and 1999という刊行物に列挙されるものが挙げられる。本有機担体は天然に生じ得るかまたは合成によってもしくは組換えによって誘導できると理解されるべきである。
【0035】
従って、本発明はいっそうより好ましくは負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体を提供する。
【0036】
好ましくは、アジュバントはサポニンまたはサポニン複合体を含んでなる。より好ましくは、サポニン複合体はISCOMATRIX(商標)である。
【0037】
本発明の有機担体はまた、その最初のまたは天然の形態では負電荷を有しても、正電荷を有してもまたは中性であってもよい。負電荷度を増加させること(例えば、有機担体が弱くしか負電荷を有さない場合には)または中性のまたは正電荷を有する有機担体を負電荷を有する有機担体に変換することもまた、当業者に公知の好適な方法のいずれかによって達成できる。例えば、有機担体が水中油エマルションである場合には、非極性尾部を有するいずれかの陰イオン界面活性剤の組み込みが、界面活性剤の尾部を油的へ挿入し、それにより負電荷を有する頭部を露出させることによりエマルションに全体的な負電荷を付与するであろう。サポニン複合体アジュバントの負電荷は、例えば、複合体形成の際に負電荷を有する脂質を加えることによって増加させることができる。
【0038】
担体の負電荷を増加させ得る界面活性剤の例としては、限定されるものではないが、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸およびタウロデオキシコール酸が挙げられる。担体の負電荷を増加させ得る脂質の例としては、限定されるものではないが、リン脂質(好ましくはホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジン酸、最も好ましくはカルジオリピン)および細菌脂質(好ましくはモノホスホリル脂質A(MPL)、最も好ましくは国際特許公開WO95/14026に記載されるOM174などのジホスホリル脂質A)が挙げられる。
【0039】
本発明を何ら限定するものではないが、本発明者らは本荷電有機担体および荷電抗原がそれぞれ自然状態で負および正電荷を有する場合には本発明の目的が達成され得るということを確定した。しかしながら、いっそうより有効な免疫原複合体は自然状態で負電荷を有する本有機担体がより多くの負電荷を付与され(好ましくはカルジオリピンまたはジホスホリル脂質Aの添加によって)、かつ/または、自然状態で正電荷を有する本抗原がより多くの正電荷を付与される(好ましくはポリリジン尾部の付加によって)場合に達成される。自然状態で負電荷を有する有機担体がより多くの負電荷を付与され、かつ、自然状態で正電荷を有する抗原がより多くの正電荷を付与されることが好ましい。
【0040】
従って、1つの好ましい具体例では、負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が
提供される。
【0041】
もう1つの好ましい具体例では、負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が提供される。
【0042】
最も好ましい具体例では、負電荷を有するアジュバントおよび正電荷を有するタンパク質を含んでなり、負電荷を有するアジュバントが自然状態で負電荷を有するアジュバントであり、その負電荷度を増加させるよう改変されており、かつ、正電荷を有するタンパク質が自然状態で正電荷を有するタンパク質であり、その正電荷度を増加させるよう改変されており、アジュバントとタンパク質が静電気的に結合している免疫原複合体が提供される。
【0043】
アジュバントまたはタンパク質がそれぞれ「自然状態で」負または正電荷を有するとは、分子がその生成時に(自然状態で、組換えによってまたは合成によってに関わらず)保持する電荷と理解されるべきである。
【0044】
電荷度を増加させるための改変は前記で論じられた好適な技術のいずれかによって達成できる。好ましくは、本タンパク質はポリリジン尾部の付加によってより多くの正電荷を付与され、かつ、本アジュバントはカルジオリピンまたはジホスホリル脂質Aの添加によってより多くの負電荷を付与される。
【0045】
「誘導体および同等物」とは天然の、合成または組換え供給源に由来する断片、一部、部分、化学的同等物、変異体、相同体および類似体と理解されるべきである。本抗原または担体がタンパク質である場合には、誘導体はアミノ酸の挿入、欠失または置換に由来し得る。アミノ酸挿入誘導体は1個または複数のアミノ酸のアミノおよび/またはカルボキシ末端融合、ならびに配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列変種は1個以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されているものであるが、得られた産物の好適なスクリーニングをともなうランダム挿入も可能である。欠失変種は配列からの1個以上のアミノ酸の除去を特徴とする。置換アミノ酸変種は配列中のある残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。アミノ酸配列への付加はその他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。「同等物」は本担体または抗原の機能的類似体として作用し得る。化学的同等物は必ずしも本担体または抗原に由来しなくてもよいが、一定のコンフォメーションの類似性を共有し得る。あるいは、化学的同等物は本担体または抗原の一定の生理化学的特性を模倣するよう設計してもよい。同等物は化学合成してもよいし、または例えば、天然産物スクリーニング後に検出してもよい。本明細書において考慮される相同体としては、限定されるものではないが、異なる種に由来する分子が挙げられる。
【0046】
本発明は一部は、好ましくは負電荷を有する有機担体と正電荷を有する抗原の、静電気的結合による免疫原複合体の形成に基づいている。かかる複合体の被験体への投与はアジュバントと抗原が同時にではあるが結合していない形態で投与されて達成されるものよりも有意によりよい免疫応答の誘導を促進する。特に、本発明のアジュバントと結合した抗原の投与は抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球応答の誘導を促進する。しかしながら、体液性およびその他の細胞性応答も増強され得る。
【0047】
本発明をいずれか1種の理論または作用様式に限定するものではないが、アジュバントと抗原の複合は同一抗原提示細胞へのアジュバントと抗原の同時送達を促進し、それによりこれらの分子が同時送達されないと生じないかまたは効果的には生じないのいずれかである免疫応答の誘導を促進するということが考えられる。例えば、いくらかのCD8+細胞傷害性Tリンパ球応答の誘導はアジュバントが抗原提示細胞における抗原のエンドソーム逃避を誘導する場合に生じると考えられる。これは抗原提示細胞への抗原とアジュバントの同時送達を必ず必要とする。
【0048】
従って、本発明のさらなる態様は哺乳類において、限定するものではないが、体液性および/または細胞媒介性免疫応答をはじめとする免疫応答を誘導するための本発明の使用に関する。
【0049】
従って、本発明のもう1つの態様は1種以上の医薬上許容される担体および/または賦形剤とともに、有効成分として荷電有機担体および荷電抗原を含んでなり、有機担体と抗原が静電気的に結合している免疫原複合体を含んでなるワクチン組成物に関する。
【0050】
好ましくは、有機担体はアジュバントであり、いっそうより好ましくは、サポニンまたはサポニン複合体である。好ましくはサポニン複合体はISCOMATRIX(商標)である。
【0051】
いっそうより好ましくは、抗原はタンパク質である。
【0052】
好ましくは、有機担体は負電荷を有し、かつ、抗原は正電荷を有する。
【0053】
注入可能な使用に好適な医薬形態としては滅菌水溶液(水に可溶性である場合には)または分散物および滅菌注射溶液または分散物のの即時調製用滅菌散剤が挙げられ、あるいはクリームの形態または局所塗布に好適なその他の形態であってもよい。製造および保存の条件下で安定でなくてはならず、かつ、細菌および菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。有機担体は例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は例えば、レシチンなどの被膜の使用によって、分散物の場合には所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用からの保護は種々の抗菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射組成物の持続性吸収は組成物への吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって達成することができる。
【0054】
滅菌注射溶液は前記に列挙される種々のその他の成分とともに適当な溶媒中の所望の量の有効成分を組み入れ、必要であれば、それに次いで濾過除菌することによって製造する。一般に、分散物は種々の滅菌有効成分を基剤となる分散媒質および前記に列挙されるものから所望のその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み入れることによって製造する。滅菌注射溶液の調製用滅菌散剤の場合には、好ましい製造方法には有効成分およびその予め滅菌濾過した溶液からのいずれかのさらなる所望の成分の散剤を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術がある。
【0055】
有効成分が好適に保護される場合には、例えば、不活性賦形剤とともにかまたは同化性可食担体とともに経口投与してもよく、あるいはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、あるいは錠剤に打錠してもよいし、あるいは治療食の食物とともに直接取り込んでもよい。経口治療的投与用には、有効成分は賦形剤と混合し、経口摂取可能錠剤、舌下錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で用いてよい。かかる組成物および製剤は少なくとも1重量%の有効成分を含むべきである。組成物および製剤のパーセンテージは当然異なり得、便宜には単位重量の約5〜約80%の間であり得る。かかる治療上有用な組成物中の有効成分の量は好適な用量にできるようなものである。本発明の好ましい組成物または製剤は経口用量単位形が約0.1μgと2000mgの間の有効成分を含むよう製造される。
【0056】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた前記に列挙された成分:アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤;リン酸ニカルシウムなどの賦形剤;コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤;およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤を含んでもよく、またはペパーミント、冬緑油、もしくはチェリー香添加剤などの香料添加剤を加えてもよい。用量単位形がカプセル剤である場合には、上記の種類の物質に加え、液体担体を含んでもよい。種々のその他の物質が用量単位の物理的形態を別途改変するための被膜として存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はシェラック、糖もしくはその双方で被覆してもよい。シロップまたはエリキシルは有効成分、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、着色料およびチェリーまたはオレンジ香などの香料添加剤を含んでもよい。当然、いずれかの用量単位形の製造に用いる物質のいずれも医薬上純粋であり、かつ、用いられる量では実質的に非毒性であるべきである。さらに、有効成分は徐胞性製剤および製剤形態に組み込んでもよい。
【0057】
本発明の実施を何ら限定するものではないが、本発明の免疫原複合体の同時送達は抗原に対する免疫応答、特に、細胞傷害性Tリンパ球応答の誘導に特に有用であり、免疫応答は特異的(T細胞および/もしくはB細胞)および/または非特異的免疫応答であり得る。
【0058】
従って、本発明のさらにもう1つの態様は哺乳類において抗原に対する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【0059】
好ましくは、免疫応答は細胞傷害性Tリンパ球応答である。
【0060】
本細胞傷害性リンパ球応答は単独でまたはヘルパーT細胞応答、体液性応答もしくはその他の特異的もしくは非特異的免疫応答とともにのいずれかで生じ得ると理解されるべきである。
【0061】
本発明のさらなる態様は病状の治療的および/または予防的治療に関する本発明の免疫原複合体の使用に関する。本発明の方法に従って治療され得る病状の例としては、限定されるものではないが、微生物感染または癌に起因するいずれかの病状が挙げられる。例としてはHIV、B型肝炎、C型肝炎、黒色腫、前立腺癌、乳癌、結核および寄生虫による症状が挙げられる。
【0062】
従って、本発明のさらにもう1つの態様は哺乳類において病状を処置する方法であって、哺乳類に有効量の前記の免疫原複合体またはワクチン組成物を投与することを含み、組成物の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する方法に関する。
【0063】
「有効量」とは所望の免疫応答を得るため、すなわち治療される特定の症状の発症を遅延させるか、または進行を阻害するか、または発症もしくは進行を全く停止させるために少なくともいく分かは必要な量を意味する。この量は治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類学的群、個体の免疫系の抗体合成能、所望の保護度、ワクチンの処方、医学上の状況の評価およびその他の関連する因子によって異なる。量は慣例の試験をとおして決定され得る比較的広範囲になると予測される。
【0064】
「哺乳類」としてはヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ)、実験室試験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)、コンパニオン・アニマル(例えば、イヌ、ネコ)および捕らえられた野生動物(例えば、カンガルー、シカ、キツネ)が挙げられる。好ましくは、哺乳類はヒトまたは実験室試験動物である。いっそうより好ましくは、哺乳類はヒトである。
【0065】
処置を受ける哺乳類は病状または潜在的病状の治療的または予防的治療を必要とするヒトまたは動物であってよい。
【0066】
さらにもう1つの態様では本発明は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物の病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する医薬の製造における使用に関する。
【0067】
本発明のさらにもう1つの態様は病状の発症または進行の阻害、停止、遅延または防止に用いる薬剤に関する。この薬剤は前記で定義される免疫原複合体またはワクチン組成物を含んでなる。
【0068】
本発明のさらなる特徴は、限定されるものではないが以下の実施例でより十分に説明載される。
【0069】
「ISCOPREP(商標)703」は50〜90重量%のQuilAの画分Aおよび50重量%〜10重量%のQuilAの画分Cを含んでなるサポニン製剤を指すと理解されるべきである。画分AおよびCはQuilAの親油性画分から製造される。画分「A」および「C」、それらの製造方法および703の製造方法は国際特許公開WO96/11711に記載されており、これは引用することにより本明細書の一部とされる。
【0070】
実施例1
標準および改変ISCOMATRIX TM (商標)の調製
ISCOMATRIX(商標)(抗原を含まない免疫刺激性複合体)は本質的にはMorein et al. (1989)の方法によって製造した。便宜には、1.76mlのPBSpH7.2に0.16mlの10mg/mlのトリチウム化(3H)コレステロールおよび20%のMEGA−10界面活性剤(w/v)中の10mg/mlの脂質を含有する溶液、次いで、0.08mlのPBS中の100mg/mlのISCOPREP(商標)703を含有する溶液を加えた。溶液を穏やかに混合しながら25℃で1時間保持した。その後のPBS/アジ化物に対する透析の際に、コレステロール、DPPCおよびISCOPREP(商標)を含有するISCOMATRIX(商標)が形成された。総てのISCOMATRIX(商標)製剤は電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【0071】
脂質:
標準DPPC ジパルミトイルホスファチジルコリン
改変CDL カルジオリピン
改変DPL ジホスホリル脂質A
改変MPL モノホスホリル脂質A
改変DPA ホスファチジン酸
改変DPPG ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
【0072】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%w/v)で精製し、画分を脂質およびコレステロールについて分析した。コレステロールは1mlシンチラント中の100μlのサンプルの3Hcpmによって検出し、脂質は脂質と結合した場合に蛍光を発するジフェニルヘキサトリエン(DPH)を用いて検出した。便宜には、DPHを1mg/mlでアセトンに溶解し、次いで、PBSpH7.2で50分の1に希釈し、次いで、マイクロタイタープレートにおいて50μlを50μlの各画分と混合した。20〜25℃で150分間インキュベートした後、プレートを励起355nmおよび発光460nmを用いて蛍光計で読み取った。DPHおよび3Hピークは総ての製剤について一致し、改変製剤の勾配プロフィールは標準製剤と同様であり、これは脂質のISCOMATRIX(商標)への組み込みを示した(図1)。
【0073】
実施例2
自然状態で正電荷を有するタンパク質:H.ピロリ (H. pylori) ファミリーEタンパク質(HpE)を用いる、ISCOMATRIX(商標)と結合した抗原の調製
HpEタンパク質のpIは9.24であり、pH8で正電荷を有するタンパク質にさせる。HpEの可溶性は0.5MのTris、0.5MのNaCl、0.1%の1,2−ジヘプタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DHPC)pH8を用いて維持した。ISCOMATRIX(商標)と結合したHpE製剤はISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:5の割合のタンパク質を20〜25℃で60分間混合することによって調製した。用いたISCOMATRIX(商標)製剤はDPPC、CDL、DPLおよびDPPGであった。
【0074】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、HpE、HpEとISCOMATRIX(商標)間の結合およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図2)。HpEはPBSで10分の1に希釈した画分をEIAプレートのウェルに吸着させ、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)が結合したHpEに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのHpEに対するモノクローナル抗体および検出するためのHRPが結合したISCOPREP(商標)に対するモノクローナル抗体を用いてEIAによって測定した。ISCOMATRIX(商標)は3Hコレステロールを検出することによって測定した。
【0075】
HpEタンパク質はISCOMATRIX(商標)と混合されない場合にはEIAによって画分3〜10に認められた(図2E)。DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、HpEは大部分は画分2〜8に認められたが、いくらかはISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致する画分12〜20に認められ、このことは結合が生じたことを示す(図2A)。CDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、HpEは大部分がISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致する画分7〜16に認められ、このことはほとんど完全な結合が生じたということを示す(図2B&C)。画分2〜8に認められた遊離HpEはあったとしても極めて少量であった。DPPG ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、結果はDPPC ISCOMATRIX(商標)と同様であった(図2D)。
【0076】
これらの結果はDPPGおよび標準DPPC ISCOMATRIX(商標)は弱いながらも正電荷を有する抗原と結合し得、CDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)を用いることによって結合能を実質的に高めることができるということを示す。
【0077】
実施例3
自然状態で正電荷を有するタンパク質:NY−ESO−1(ESO)を用いる、 ISCOMATRIX(商標)と結合した抗原の調製
ESOタンパク質のpIは9.1であり、pH7で正電荷を有するタンパク質にさせる。ESOの可溶性は8Mの尿素、50mMのTris、50mMのNaH2PO4・2H2O、0.15MのNaClpH7を用いて維持した。ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したESOはISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:5の割合のタンパク質を20〜25℃で60分間混合することによって調製した。用いたISCOMATRIX(商標)製剤はDPPCおよびDPLであった。
【0078】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、ESO、ESOとISCOMATRIX(商標)間の結合およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図3)。ESOはPBSで10分の1に希釈した画分をEIAプレートのウェルに吸着させ、次いで、HRPが結合したESOに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのESOに対するモノクローナル抗体および検出するためのHRPが結合したISCOPREP(商標)に対するモノクローナル抗体を用いてEIAによって測定した。ISCOMATRIX(商標)は3Hコレステロールを検出することによって測定した。
【0079】
ESOタンパク質はISCOMATRIX(商標)と混合されない場合にはEIAによって画分1〜6に認められた(図3C)。標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、ESOは画分1〜6および12〜16に認められた(図3A)。画分12〜16中の存在はISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致し、このことは結合があることを示すものであったが、画分1〜6中の存在によって示されるように大部分のESOは結合していなかった。DPL ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、ESOは大部分がISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致する画分12〜16に認められ、このことは結合が生じたということを示す(図3B)。
【0080】
これらの結果は標準DPPC ISCOMATRIX(商標)との正電荷を有するタンパク質の結合がいくらかあったが、DPL ISCOMATRIX(商標)の使用により結合能が実質的に高まったということを示す。
【0081】
実施例4
標準ISCOMATRIX(商標)と結合したESOでのマウスの免疫化
抗体応答:
10個体のBALB/cマウスを0日および28日に0.1mlの5μgのタンパク質を含有するESOまたは5μgのタンパク質および5μgのISCOPREP(商標)を含有するISCOMATRIX(商標)が結合したESOで首の首筋で皮下に免疫化した。35日にマウスから採血し、血清を間接EIAによってESOに対する抗体について分析した。便宜には、ESOをPBSpH7.2中でマイクロタイタープレートに吸着させ、次いで、プレートを0.1%のカゼイン溶液でブロッキングし、乾燥させた。血清の希釈液を20〜25℃で1時間インキュベートし、次いで、プレートを洗浄した。HRPが結合したヤギ抗マウスIgG、IgG1またはIgG2aを加え、プレートを20〜25℃で1時間インキュベートし、次いで、洗浄した。TMB基質を加え、20〜25℃で10分間インキュベートし、次いで、0.5MのH2SO4を加えて反応を停止させた。プレートをOD450nmで読み取り、終点力価を算出した。
【0082】
ISCOMATRIX(商標)と結合した場合にはESOに対するIgGおよびIgG1応答は20倍より多く増加し、IgG2a力価は千倍増加した(図4)。
【0083】
細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答:
5個体のHLA A2トランスジェニックHHDマウスを0.1mlの5μgのタンパク質を含有するESOまたは5μgのタンパク質および5μgのISCOPREP(商標)を含有するISCOMATRIX(商標)と結合したESOで尾の付け根で皮下に免疫化した。14日後、脾細胞を回収し、24ウェルプレートにおいてESOペプチド(10μg/ml、37℃で1時間)で感作されたEL4HHD細胞で5×106個の細胞を再刺激し、照射し、2回洗浄した。細胞を10%ウシ胎児血清、2mMのグルタミン、5×10−5Mのβ−メルカプトエタノール、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100IU/mlのペニシリンを添加したRPMI培地で培養し、37℃で6日間5%CO2中でインキュベートした。4日目に1mlの5U/mlの組換えヒトIL−2を含有する培地を加えた。6日目に標準的な6時間51Cr放出アッセイにおいて培養物を再刺激のために感作されたEL4HHD細胞に対するエフェクターとして用いた。
【0084】
ESO単独で免疫化したマウスではCTLは検出されなかったが、ISCOMATRIX(商標)と結合した場合には、総てのマウスでCTLが検出された(図5)。
【0085】
これらの結果は細胞性免疫応答の最適な誘導には結合が必要であるということを示す。
【0086】
実施例5
自然状態で負電荷を有するタンパク質:HPV E6E7(E6E7)を用いる、ISCOMATRIX(商標)と結合した抗原の調製
E6E7タンパク質のpIは5.9であり、pH6.9で負電荷を有するタンパク質にさせる。E6E7の可溶性は8Mの尿素、50mMのTris、50mMのNaH2PO4・2H2O、150mMのNaClpH6.9を用いて維持した。ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したE6E7はISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:5の割合のタンパク質を20〜25℃で60分間混合することによって調製した。用いたISCOMATRIX(商標)製剤はDPPC、CDL、DPL、MPL、DPAおよびDPPGであった。
【0087】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、E6E7、E6E7とISCOMATRIX(商標)間の結合およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図8)。E6E7は2種のE7に対する非競合モノクローナル抗体を用いるEIAによって検出した。結合は捕捉するためのE7に対するモノクローナル抗体および検出するためのHRPが結合したISCOPREP(商標)703に対するモノクローナル抗体を用いてEIAによって測定した。ISCOMATRIX(商標)は3Hコレステロールを検出することによって測定した。
【0088】
E6E7タンパク質単独はEIAによって画分10〜22に認められた(図6G)。標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、ほとんどのE6E7は画分14〜20に認められたが、結合はほとんど検出されなかった(図6A)。CDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、E6E7は大部分は結合およびISCOMATRIX(商標)ピークと一致する画分に認められ、このことはほとんど完全な結合が生じたことを示した(図6B、C、E)。MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、タンパク質は結合およびISCOMATRIX(商標)ピークと一致する画分9〜14に認められ、このことは結合を示すが、画分17〜22では相当な量が結合していないとわかった(図6D、F)。
【0089】
これらの結果は負電荷を有するタンパク質は不十分にしか標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と結合しないが、CDL、DPL、MPL、DPAまたはDPPGを用いることによって結合能が種々の程度に高まるということを示す。
【0090】
実施例6
標準および改変ISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7でのマウスの免疫化
3個体のC57BL/6マウスを0日および21日に0.1mlの10μgのタンパク質および6μgのISCOPREP(商標)を含むISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7で皮下に免疫化した。7日後、脾細胞を回収し、T25組織培養フラスコ中で8mLの20×106個の細胞をE7をトランスフェクトしたマイトマイシン−C処理したEL4細胞(C2)で再刺激し、3回洗浄した。細胞を10%のウシ胎児血清、2mMのグルタミン、5.5×10−5Mのβ−メルカプトエタノール、50μg/mlのゲンタマイシンを添加したRPMI培地で培養し、37℃で5日間5%CO2中でインキュベートした。6日目にC2細胞に対する標準的な4時間の51Cr放出アッセイにおいて培養物をエフェクターとして用いた。
【0091】
DPL ISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7は3個体のうち2個体のマウスでCTL応答を誘導した(図7A)。標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7はいずれのマウスでもCTL応答を誘導できなかった(図7B)。DPL ISCOMATRIX(商標)で陰性のマウス群は最適な読み出しに不十分な細胞を有しており、妥当な応答の基準に応じるものではなかった。他の総てのマウスは妥当な応答の基準を満たしていた。
【0092】
これらの結果は結合が多いほどCTL応答がよりよいものとなるということを示す。
【0093】
実施例7
自然状態で負電荷を有するタンパク質:H.ピロリファミリーCタンパク質(HpC)を用いる、ISCOMATRIX(商標)と結合した抗原の製造
HpCタンパク質は5.05のpIを有し、pH7.2で負電荷を有させる。このタンパク質はPBSpH7.2において可溶性であった。ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したHpCはISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:5の割合のタンパク質を20〜25℃で60分間混合することによって調製した。用いたISCOMATRIX(商標)製剤はDPPCおよびDPLであった。
【0094】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、HpC、HpCとISCOMATRIX(商標)間の結合およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図8)。HpCはPBSで10分の1に希釈した画分をEIAプレートのウェルに吸着させ、次いで、HRPが結合したHpCに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのHpCに対するモノクローナル抗体および検出するためのHRPが結合したISCOPREP(商標)に対するモノクローナル抗体を用いてEIAによって測定した。ISCOMATRIX(商標)は実施例1に記載のように3HコレステロールまたはDPHの検出のいずれかによって測定した。
【0095】
HpC単独は画分1〜5に認められ、標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、HpCは大部分は画分1〜5に認められ、結合していなかった。DPL ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、相当な割合のHpCがISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致する画分11〜17に認められ、このことは結合を示す。
【0096】
これらの結果は負電荷を有するタンパク質は不十分にしか標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と結合しないが、DPL ISCOMATRIX(商標)を用いることによって結合能が高まるということを示す。
【0097】
実施例8
pHを利用して正電荷を与える自然状態で正電荷を有するタンパク質:E6E7を用いる、ISCOMATRIX(商標)と結合した抗原の調製
E6E7タンパク質のpIは5.95であり、pH7.2で負電荷を有するタンパク質にさせる。それはN末端にヘキサヒスチジン配列を含みpH6で正電荷を有する。E6E7の可溶性は8Mの尿素、50mMのBis Tris、0.15MのNaClpH6を用いて維持した。ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したE6E7は等量のE6E7をISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)と20〜25℃で60分間混合し、50mMのBisTris、0.15MのNaClpH6に対して透析して尿素を除去し、次いで、10,000gで5分間遠心分離して沈殿物のいずれをも除去することによって調製した。
【0098】
処方後、調製物をスクロース勾配(50〜10%スクロースw/v)で精製し、タンパク質、E6E7とISCOMATRIX(商標)間の結合およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図9)。タンパク質はE7についてのサンドウィッチEIAを用いて検出した。結合は捕捉するためのE7に対するモノクローナル抗体および検出するためのHRPが結合したISCOPREP(商標)に対するモノクローナル抗体を用いてEIAによって測定した。ISCOMATRIX(商標)は実施例1に記載のように3HコレステロールまたはDPHを検出することによって測定した。
【0099】
E6E7は単独で実施した場合には画分10〜22に認められた(図9C)。pH7.2でDPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、E6E7は大部分は画分16〜22に認められ、結合の証拠がほとんどなかった(図9B)。pH6で標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、E6E7は大部分はISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致する画分12〜16に認められ、このことは結合を示す(図9A)。
【0100】
これらの結果はpHを用いて標準DPPC ISCOMATRIX(商標)の、自然状態で負電荷を有するタンパク質と結合する能力を高めることができるということを示す。
【0101】
実施例9
pH改変したDPPCと結合したE6E7でのマウスの免疫化
6個体のC57BL/6マウスを0日および21日に0.1mlの6μgのISCOPREP(商標)および6μgのE6E7を含むISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7で首の首筋で皮下に免疫化した。
【0102】
抗体応答:
26日にマウスから採血し、血清を間接EIAによってE7に対する抗体について分析した。便宜には、GSTE7を0.1Mの炭酸塩pH9.6中でマイクロタイタープレートに吸着させ、次いで、プレートを0.1%のカゼイン溶液でブロッキングし、乾燥させた。血清の希釈液を20〜25℃で1時間インキュベートし、次いで、プレートを洗浄した。HRPが結合したヤギ抗マウスIgG、を加え、プレートを20〜25℃で1時間インキュベートし、次いで、洗浄した。TMB基質を加え、20〜25℃で10分間インキュベートし、次いで、0.5MのH2SO4を加えて反応を停止させた。プレートをOD450nmで読み取り、終点力価を算出した。
【0103】
ISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7群のGMTは949であった。典型的にはAl(OH)3を含むE6E7は約100のGMTを示す。
【0104】
サイトカイン応答:
27日に3個体のマウス各々から脾細胞を回収し、プールし、48ウェルプレートにおいて1および5μgのGSTE7で、対照としてConAおよびRPM1で2.5×106個の細胞を再刺激した。細胞を10%ウシ胎児血清、2mMのグルタミン、5×10−5Mのβ−メルカプトエタノール、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100IU/mlのペニシリンを添加したRPMI培地で培養し、37℃で2日間5%CO2中でインキュベートした。上清を回収し、Endogenの試薬を用いてEIAによってγIFNおよびIL5を検出した。
ISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7は7.4ng/mlまでγIFNを、および140pg/mlまでIL5を誘導した(表2)。典型的にはAl(OH)3を含むE6E7は検出可能でないγIFN(<30pg/ml)またはIL5(<4pg/ml)を誘導する。
【0105】
これらの結果はpH改変したISCOMATRIX(商標)と結合したE6E7はマウスにおいて免疫原性であり、Th1型応答を誘導したということを示す。
【0106】
実施例10
キレート性(CHL)ISCOMATRIX(商標)の製造
CHL ISCOMATRIX(商標)はMacfarlan and Malliaros, (1998)国際特許公開WO/98/36772の方法によって製造した。便宜には、1.6mlの50mMのTris、150mMのNaCl、0.6mMのCuCl2pH7.2(バッファーA)に0.2mlの20%のMEGA−10界面活性剤(w/v)中に10mg/mlのコレステロール、9mg/mlのDPPC、1.074mg/mlのジパルミトイル−rac−グリセロール−3(8−(3,6−ジオキシ)オクチル−1−アミノ−N,N−ニ酢酸)(DPIDA)を含有する溶液、次いで、0.2mlのバッファーA中に50mg/mlのISCOPREP(商標)703を含有する溶液を加えた。溶液を穏やかに混合しながら25℃で90分間保持した。次いで、透析をまずバッファーAに対してバッファーを2回交換して一晩、次いで50mMのTris、50mMのNaH2PO4・2H2O、150mMのNaClpH6.9に対してバッファーを2回交換して2日間実施した。透析の際に、コレステロール、DPPC、DPIDAおよびISCOPREP(商標)を含むCHL ISCOMATRIX(商標)が形成された。CHL
【0107】
ISCOMATRIX(商標)製剤は電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【0108】
実施例11
ヘキサヒスチジン(6H)±ヘキサリジン(6K)HpCの作製、発現および精製
HpCタンパク質のpIは5.05であり、pH7.2で負電荷を有させる。6Kの付加はpIを7.68に変更し、正電荷を有する尾部を付与するであろう。精製用に、6Kを含むか含まない、HpCおよび6Hを与える2種のクローンを構築した。CSL694DNA(Edwards et al. 1998に記載のベクターpGexStop中のC末端6Hを含むHpC13)をPCR増幅の鋳型として用い、C末端6Kを作製した。PCR産物を発現ベクターpGexStopIVのEcoRI−BglII部位にクローニングし、直列型C末端6Kとそれに続く6Hタグを作製した。これは大腸菌(E.coli)系統ER1793で作製し、CSL1424と呼んだ。
【0109】
1リットルの培養物をA600=2において0.5mMのIPTGで誘導し、誘導の5時間後に回収した。可溶性組換えタンパク質を金属(ニッケル)アフィニティークロマトグラフィーのためにC末端6Hタグを利用して精製した。溶出したタンパク質をPBSに対して透析した。
【0110】
実施例12
6Hおよび6Kタグ:HpCを用いる、ISCOMATRIX(商標)と結合した抗原の調製
6Hを含むHpCタンパク質のpIは5.85であり、pH7.2で負電荷を有させる。このタンパク質への6Kの付加は7.68のpIを与え、pH7.2で正電荷を有させる。両形態のタンパク質ともPBSpH7.2に可溶性である。ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したHpCはISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:5の割合のタンパク質を20〜25℃で60分間混合することによって調製した。用いたISCOMATRIX(商標)製剤はDPPCおよびCHLであった。6Hタンパク質とISCOMATRIX(商標)を結合させるための標準法としてCHL ISCOMATRIX(商標)技術を用いた。
【0111】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、HpC、HpCとISCOMATRIX(商標)間の結合およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図10)。HpCはPBSで10分の1に希釈した画分をEIAプレートのウェルに吸着させ、次いで、HRPが結合したHpCに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。結合は捕捉するためのHpCに対するモノクローナル抗体および検出するためのHRPが結合したISCOPREP(商標)に対するモノクローナル抗体を用いてEIAによって測定した。ISCOMATRIX(商標)は実施例1に記載のようにDPHを検出することによって測定した。
【0112】
標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、6H−HpCは画分1〜6に認められ、結合の証拠はほとんどなかった(図10C)。6K6H−HpCをDPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、相当な量のHpCが結合およびISCOMATRIX(商標)ピークと一致する画分7〜11にあり、このことは結合を示す(図10A)6H−HpCをCHL
【0113】
ISCOMATRIX(商標)と混合した場合には、ほとんどのHpCはISCOMATRIX(商標)および結合ピークと一致する画分7〜14にあり、このことは結合を示す(図10B)。
【0114】
これらの結果は6Kの負電荷を有するタンパク質への付加はその標準DPPC ISCOMATRIX(商標)との結合能を高め、達成された結合はCHL ISCOMATRIX(商標)とともに6Hを用いるものに匹敵したということを示す。
【0115】
実施例13
パルミチン酸(PAL)、6H、6Kを用いる、および製剤タグを用いない、合成ポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)と結合したものの調製
ポリトープはValerio et al.によって記載されたマルチピン(商標)クラウンに対するカイロン技術によりアミノ酸のためのFmocαアミノ保護スキームを用いて合成し、精製した。側鎖を脱保護し、トリフルオロ酢酸/スカベンジャー溶液中で切断した後、ペプチドをエーテルで沈殿させ、乾燥させた。再溶解したペプチドをアセトニトリルの勾配での溶出を用いて分取逆相HPLCにより精製した。イオンスプレー質量分析により求められる、妥当な分子量を有する物質を含有する画分をプールし乾燥させた。
【0116】
ポリトープは以下のとおりであった:
公知のBALB/c制限エピト−プを含むタグ−YPHFMPTNLRPQASGVYMTYQRTRALVSYIPSAEKI−OH(<400>3)、YPHFMPTNL(<400>4)、RPQASGVYM(<400>5)、TYQRTRALV(<400>6)およびSYIPSAEKI(<400>7)。用いたタグはPAL、6H、6KまたはH(タグはない)であった。
【0117】
PALポリトープについてはMorein et al. (1989)の方法に従って、ISCOM(商標)(免疫刺激性複合体)への組み込みにより結合を達成した。便宜には、1.76mlのPBS中の10%のMEGA−10界面活性剤(w/v)、50%のアセトニトリルに可溶化した4mgのポリトープに0.16mlの20%のMEGA−10界面活性剤(w/v)中に10mg/mlのコレステロールおよび10mg/mlのDPPCを含有する溶液、次いで、0.08mlのPBS中に100mg/mlのISCOPREP(商標)703を含有する溶液を加えた。溶液を穏やかに混合しながら25℃にて1時間保持した。続くPBS/アジ化物に対する透析の際に、パルミチル化ポリトープ、コレステロール、DPPCおよびISCOPREP(商標)を含有するISCOM(商標)が形成された。これらのISCOM(商標)は電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【0118】
6Hポリトープを8Mの尿素に可溶化し、次いで、CHL ISCOMATRIX(商標)と混合し、また6Kおよびタグを含まないポリトープをPBSに可溶化し、次いで、標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合した。総ての製剤はISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:8の割合のタンパク質で調製し、20〜25℃で60分間インキュベートした。
【0119】
調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、タンパク質およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した。タンパク質はMolecular ProvesのCBQCA(<400>8)を用い、製造業者の使用説明書に従って、またはBradford (1976)の方法に従ってクマシーによって検出した。便宜には、100μlの各画分をマイクロプレートに加え、次いで100μlのクマシー試薬を加え、次いで、プレートを595nmで読み取った。ISCOMATRIX(商標)は実施例1に記載のようにDPHによって検出した。
【0120】
ポリトープ単独は画分1〜5に認められた(図11E)。PALポリトープISCOM(商標)では、CBQCA(<400>8)によって検出されたタンパク質は大部分はISCOMATRIX(商標)ピークと一致する画分11〜13に認められ、このことは組み込みを示す(図11A)。ISCOMATRIX(商標)と結合した6Kポリトープでは、クマシーによって検出されたタンパク質は大部分は画分1〜5に認められ、これはおそらくはISCOMATRIX(商標)と結合していなかった(図11C)。相当な割合のポリトープがISCOMATRIX(商標)ピークと一致する画分12〜14に認められ、このことは結合を示す。CHL ISCOMATRIX(商標)と結合した6Hポリトープでは、クマシーによって検出されたタンパク質は大部分はISCOMATRIX(商標)ピークと一致する画分4〜10に認められ、このことは結合を示す(図11B)。相当な割合の6Hポリトープが画分1〜3に認められたが、これはおそらく結合していなかった。タグを含まないISCOMATRIX(商標)と結合したものでは、クマシーによって検出されたタンパク質はほとんど総てが画分1〜5に認められたが、これはおそらくはISCOMATRIX(商標)と結合していなかった。
【0121】
これらの結果はタグは調べたポリトープのISCOMATRIX(商標)との結合に必要であり、また標準DPPC ISCOMATRIX(商標)との6Kポリトープ結合はISCOM(商標)への疎水性PALポリトープの組み込みに匹敵するが、CHL ISCOMATRIX(商標)との6Hポリトープ結合ほどは十分でなかったということを示す。
【0122】
実施例14
合成ポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)製剤と結合したものでのマウスの免疫化
3個体のBALB/cマウスをで0.1mlの6μgのISCOPREP(商標)および3.5μg〜5μgの間のタンパク質を含むポリトープISCOM(商標)またはISCOMATRIX(商標)と結合したもので尾の付け根で皮下に免疫化した。
【0123】
CTLアッセイはElliottet al. (1999)の方法に従って実施した。便宜には、各脾臓から脾細胞を14日めに採取し、加湿インキュベーター中で37℃にて24ウェルプレートで1μg/mlの個々のペプチド(4種のペプチド/脾臓)とともに1mlの培地で5×106細胞/mlで培養した。3日目に、1mlの新鮮培地を加え、次いで、さらに7日目に照射(800rad)ペプチドに感作された(10μg/ml、1時間37℃、2回洗浄)P815細胞を刺激物に対する応答物の割合を20:1で加えてin vitro再刺激を実施し、2×106エフェクター/ウェルとした。7日の間隔でこの処置をさらに2回反復し、バルク培養物を6日後に標準の6時間クロム放出アッセイにおいてエフェクターとして用いた。培地は10%のFCS(QIMR)、5×10−5Mの2−メルカプトエタノール、2mMのグルタミンおよびアオカビ属/ストレプトマイセス属抗生物質を添加したRPMI1640を含んでいた。標的細胞は51Cr標識ペプチドに感作されたおよび感作されていない(対照)P815細胞とした。エフェクター:標的の割合は50、10および2対1とした。アッセイは96ウェル丸底プレートで二組で実施した。
【0124】
PALポリトープISCOM(商標)は4種のエピト−プ総てに対して、TYQについては3/3のマウスで、SYIについては1/3で、YPHについでは2/3でおよびRPQについては2/3でCTL応答を誘導した(図12A)。CHL ISCOMATRIX(商標)と結合した6Hポリトープは4種エピト−プ総てについて3/3のマウスに対してCTL応答を誘導した(図12B)。DPPC ISCOMATRIX(商標)と結合した6Kポリトープは4種のエピトープ総てに対して、TYQ、YPHおよびRPQについては3/3で、SYIについては2/3で、CTL応答を誘導した(図12C)。DPPC ISCOMATRIX(商標)と結合したタグを含まないポリトープはRPQについて2/3のマウスで弱いCTL応答を誘導したが、その他のエピトープのいずれかに対してはCTL応答は検出されなかった(図12D)。SYI配列は弱いエピトープであると知られており、これは総ての製剤について事実であった。
【0125】
これらの結果はポリトープのISCOM(商標)またはISCOMATRIX(商標)との結合は最適なCTL誘導に必要であり、6Kを用いる結合はCHL ISCOMATRIX(商標)をともなう6Hまたは従来の疎水性タンパク質の組み込み(PALポリトープISCOM(商標))と同程度に有効であったということを示す。
【0126】
実施例15
組換え(r)6H±ポリトープの作製、発現および精製
pstmpdv DNA(QIMRにより供給された)をマウスポリトープ、YPHFMPTNLTSSGPSNTPPEIFAPGNYPALSYIPSAEKIEEGAIVGEIRPQASGVYM(<400>9)のPCR増幅の鋳型として用い、C末端6Kを含むか含まないで(それぞれ、CSL1430および1426)作製することが可能となった。PCR産物を発現ベクターpET24b(Novagen)のBamHI−XhoI部位にクローニングし、N末端T7タグ(同定用)および直列型C末端6Kとそれに続く6H(精製用)を作製した。
クローンは大腸菌系統ER1793で作製し、次いで発現系統BL21(DE3)に形質転換した。1リットルの培養物をA600=2にて0.5mMのIPTGで誘導し、誘導後4時間で回収した。可溶性組換えタンパク質を金属(ニッケル)アフィニティークロマトグラフィーのためのC末端6Hタグを利用して精製した。溶出したタンパク質をPBSに対して透析した。
【0127】
実施例16
ISCOMATRIX(商標)と結合したrポリトープ6Hおよび6Kの調製
6Hを含むマウスポリトープのpIは5.85であり、pH7.2で負電荷を有させる。これへの6Kの付加は7.68のpIを与え、pH7.2で正電荷を有させる。タンパク質の両形態ともPBSpH7.2で可溶性であった。ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したポリトープはISCOMATRIX(商標)としてのISCOPREP(商標)に対して1:5の割合のタンパク質を20〜25℃にて60分間混合することによって調製した。用いたISCOMATRIX(商標)製剤はDPPC、CDL、DPLおよびCHLであった。配列中に結合を強力に干渉し得るいくつかのEがあるので、pH4.3でグルタミン酸(E)のpI以下である製剤を調べた。
【0128】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、タンパク質およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図13)。タンパク質はPBSで10分の1に希釈した画分をEIAプレートのウェルに吸着させ、次いで、HRPが結合した6Hに対するモノクローナル抗体で検出することによって検出した。ISCOMATRIX(商標)は実施例1に記載のように3HコレステロールまたはDPHを検出することによって測定した。
【0129】
r6H6Kポリトープ単独ではタンパク質は画分1〜6に認められた(図13K)。pH7で標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合したr6K6Hポリトープでは、タンパク質は大部分は画分1〜9に認められたが、結合の証拠はほとんどなかった(図13A)。pH7でCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と混合したr6K6Hポリトープでは、タンパク質は大部分はISCOMATRIX(商標)と一致する画分に認められ、このことは結合を示す(図13C、E)。CDLおよびDPLそれぞれについては相当な割合のタンパク質が画分1〜3および1〜6に認められ、これらはおそらくは結合していない。pH4.3で標準DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合したr6K6Hポリトープでは、タンパク質は大部分は画分1〜9に認められたが、画分10〜12におけるISCOMATRIX(商標)ピークと一致する結合の証拠がいくらかあった(図13B)。pH4.3でCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と混合したr6K6Hポリトープではタンパク質はISCOMATRIX(商標)と一致する画分にほとんど総て認められ、このことはほとんど完全な結合を示した(図13D、F)。DPPC ISCOMATRIX(商標)と混合したr6Hポリトープは大部分が画分1〜7に認められ、結合の証拠はほとんどなかった。CHL ISCOMATRIX(商標)と混合したr6HポリトープはpH7およびpH4.3の双方での標準DPPCおよびCDL ISCOMATRIX(商標)と同様のパターンの結合を示した。タンパク質は結合していない画分1〜4およびISCOMATRIX(商標)ピークと一致する5〜10にほとんど等量で認められ、結合を示した(図13H、I、J)。
【0130】
これらの結果は本明細書で用いたrポリトープは6Kを付加してでさえ標準ISCOMATRIX(商標)と結合しないであろうということを示す。結合は改変ISCOMATRIX(商標)を用いて達成でき、これらの製剤の結合能は低pHを利用することによって高まる。改変ISCOMATRIX(商標)と低pHの組合せは改変ISCOMATRIX(商標)または低pHの使用によって高められていない6H CHL ISCOMATRIX(商標)と同程度によいか、またはよりよい結合をもたらした。
【0131】
実施例17
ISCOMATRIX(商標)製剤と結合したrポリトープでのマウスの免疫化
3個体のBALB/cマウスを0.1mlの6μgのISCOPREP(商標)703および3.5μg〜5μgの間のタンパク質を含むISCOMATRIX(商標)と結合したもので尾の付け根で皮下に免疫化した。
CTLアッセイはElliottet al. (1999)の方法に従って実施した。便宜には、各脾臓から脾細胞を14日めに採取し、加湿インキュベーター中で37℃にて24ウェルプレートで1μg/mlの個々のペプチド(4種のペプチド/脾臓)とともに1mlの培地で5×106細胞/mlで培養した。3日目に、1mlの新鮮培地を加え、次いで、さらに7日目に照射(800rad)ペプチドに感作された(10μg/ml、1時間37℃、2回洗浄)P815細胞を刺激物に対する応答物の割合を20:1で加えてin vitro再刺激を実施し、2×106エフェクター/ウェルとした。7日の間隔でこの処置をさらに2回反復し、バルク培養物を6日後に標準の6時間クロム放出アッセイにおいてエフェクターとして用いた。培地は10%のFCS(QIMR)、5×10−5Mの2−メルカプトエタノール、2mMのグルタミンおよびアオカビ属/ストレプトマイセス属抗生物質を添加したRPMI1640を含んでいた。標的細胞は51Cr標識ペプチドに感作されたおよび感作されていない(対照)P815細胞とした。エフェクター:標的の割合は50、10および2対1とした。アッセイは96ウェル丸底プレートで二組で実施した。
【0132】
CDL ISCOMATRIX(商標)と結合したr6K6HポリトープpH4.3はSYI、YPHおよびRPQエピトープについては3/3のマウスで、およびTYQエピトープについでは1/3でCTL応答を誘導した(図14A)。CHL ISCOMATRIX(商標)と結合したr6H pH7はSYI、YPHおよびRPQエピトープについては3/3のマウスで、およびTYQエピトープについては2/3でCTL応答を誘導した(図14B)。両製剤ともTYQエピトープに対しては極めて低い応答を誘導した。
【0133】
これらの結果はCDL ISCOMATRIX(商標)と結合したr6K6HポリトープpH4.3を用いてCTL応答を誘導でき、これはCHL ISCOMATRIX(商標)と結合したr6H pH7を用いた応答に匹敵するるということを示す。
【0134】
実施例18
自然状態で負電荷を有するタンパク質:E6E7を用いる、DPPCおよびDPLリポソームの製造
リポソームはTalsma and Crommelin (1992)の方法に従って製造した。便宜には、3Hコレステロールをメタノール、クロロホルムに溶解し、次いで、脂質を加え、穏やかに回転させながら回転フラスコ中で溶媒を蒸発させることによってリポソームを形成させた。用いた脂質は標準DPPCおよび負電荷を有するDPLであった。次いで、E6E7をリポソームに加え、混合物を超音波処理し、次いで26G針を通して押し出した。リポソームは電子顕微鏡によれば典型的な外観のものであった。
【0135】
処方後、調製物をスクロース勾配(10〜50%スクロースw/v)で精製し、タンパク質およびISCOMATRIX(商標)について画分を分析した(図15)。タンパク質はモノクローナル抗体を用いるE7についてのサンドウィッチEIAによって検出した。ISCOMATRIX(商標)は3Hコレステロールを検出することによって測定した。
【0136】
DPPCリポソームではE6E7は大部分は画分1〜3に認められたが、ほとんど勾配に存在せず、このことはタンパク質は沈殿していたということを示した。(図15A)。存在したタンパク質は画分2〜4に認められたリポソームとおそらくは結合していなかった。DPLリポソームではE6E7は勾配全体に認められ、これは同様に勾配全体に認められたリポソームと一致した(図15B)。勾配全体への製剤の広がりはおそらくはリポソームの大きさの範囲を示すものであったが、ほとんど総てのタンパク質はリポソームと結合していると考えられる。
【0137】
これらの結果は負電荷を有する脂質をリポソームに用いて標準リポソームとは結合しない負電荷を有するタンパク質と結合させることができるということを示す。
【0138】
当業者ならば本明細書に記載される本発明は具体的に記載されるもの以外の変法および改変の影響を受けやすいということを理解するであろう。本発明は総てのかかる変法および改変を含むと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において、個々にまたは集団的に記載されるか、または示される、総ての工程、特徴、組成物および化合物、ならびにいずれか2種以上の工程または特徴の組合せのいずれかおよび総てを含む。
【0139】
【表1】
文献
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1a】 DPPC(図1a)、CDL(図1b)、DPL(図1c)、MPL(図1d)DPA(図1e)およびDPPG(図1f)を用いて処方されたISCOMATRIXTM(商標)のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および3Hは各脂質のISCOMATRIX(商標)構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図1b】 DPPC(図1a)、CDL(図1b)、DPL(図1c)、MPL(図1d)DPA(図1e)およびDPPG(図1f)を用いて処方されたISCOMATRIXTM(商標)のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および3Hは各脂質のISCOMATRIX(商標)構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図1c】 DPPC(図1a)、CDL(図1b)、DPL(図1c)、MPL(図1d)DPA(図1e)およびDPPG(図1f)を用いて処方されたISCOMATRIXTM(商標)のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および3Hは各脂質のISCOMATRIX(商標)構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図1d】 DPPC(図1a)、CDL(図1b)、DPL(図1c)、MPL(図1d)DPA(図1e)およびDPPG(図1f)を用いて処方されたISCOMATRIXTM(商標)のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および3Hは各脂質のISCOMATRIX(商標)構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図1e】 DPPC(図1a)、CDL(図1b)、DPL(図1c)、MPL(図1d)DPA(図1e)およびDPPG(図1f)を用いて処方されたISCOMATRIXTM(商標)のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および3Hは各脂質のISCOMATRIX(商標)構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図1f】 DPPC(図1a)、CDL(図1b)、DPL(図1c)、MPL(図1d)DPA(図1e)およびDPPG(図1f)を用いて処方されたISCOMATRIXTM(商標)のスクロース勾配分析のグラフである。各場合において、脂質および3Hは各脂質のISCOMATRIX(商標)構造への組み込みを重複して示しているということがわかる。
【図2a】 HpEと混合した後の実施例1の4種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのHpEはCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPCおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図2b】 HpEと混合した後の実施例1の4種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのHpEはCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPCおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図2c】 HpEと混合した後の実施例1の4種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのHpEはCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPCおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図2d】 HpEと混合した後の実施例1の4種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのHpEはCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPCおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図2e】 HpEと混合した後の実施例1の4種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのHpEはCDLおよびDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPCおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図3a】 ESOと混合した後の実施例1の2種のISCOMATRIX(商標)製剤ののスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのESOはDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPC ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図3b】 ESOと混合した後の実施例1の2種のISCOMATRIX(商標)製剤ののスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのESOはDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPC ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図3c】 ESOと混合した後の実施例1の2種のISCOMATRIX(商標)製剤ののスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのESOはDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているが、DPPC ISCOMATRIX(商標)とは一部のみしか結合していないということがわかる。
【図4】 ESO製剤に対する抗体応答のグラフである。ESOが結合したISCOMATRIX(商標)は特にTh1サブタイプIgG2aにおいてESO単独よりも高い抗体応答を含有するということがわかる。
【図5a】 刺激および標的のために、SLLMWITQCFL(<400>1)(図5a、5b)およびSLLMWITQC(<400>2)(図5c、5d)ペプチドを用いるESO(図5a、5c)およびISCOMATRIX(商標)と結合したESO(図5b、5d)で免疫化したマウスのCTL分析のグラフである。ISCOMATRIX(商標)と結合したESOはCTL応答を誘導するが、ESO単独は誘導しないということがわかる。
【図5b】 刺激および標的のために、SLLMWITQCFL(<400>1)(図5a、5b)およびSLLMWITQC(<400>2)(図5c、5d)ペプチドを用いるESO(図5a、5c)およびISCOMATRIX(商標)と結合したESO(図5b、5d)で免疫化したマウスのCTL分析のグラフである。ISCOMATRIX(商標)と結合したESOはCTL応答を誘導するが、ESO単独は誘導しないということがわかる。
【図5c】 刺激および標的のために、SLLMWITQCFL(<400>1)(図5a、5b)およびSLLMWITQC(<400>2)(図5c、5d)ペプチドを用いるESO(図5a、5c)およびISCOMATRIX(商標)と結合したESO(図5b、5d)で免疫化したマウスのCTL分析のグラフである。ISCOMATRIX(商標)と結合したESOはCTL応答を誘導するが、ESO単独は誘導しないということがわかる。
【図5d】 刺激および標的のために、SLLMWITQCFL(<400>1)(図5a、5b)およびSLLMWITQC(<400>2)(図5c、5d)ペプチドを用いるESO(図5a、5c)およびISCOMATRIX(商標)と結合したESO(図5b、5d)で免疫化したマウスのCTL分析のグラフである。ISCOMATRIX(商標)と結合したESOはCTL応答を誘導するが、ESO単独は誘導しないということがわかる。
【図6a】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図6b】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図6c】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図6d】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図6e】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図6f】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図6g】 E6E7と混合した後の実施例1の6種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんどのE6E7はCDL、DPLおよびDPA ISCOMATRIX(商標)と結合しており、MPLおよびDPPG ISCOMATRIX(商標)とはあまり結合しておらず、DPPC ISCOMATRIX(商標)とはやはりさらに結合していないということがわかる。
【図7】 E6E7 DPL ISCOMATRIX(商標)(A)およびE6E7 DPPC ISCOMATRIX(商標)(B)で免疫化したマウスにおけるCTL分析のグラフである。E6E7 DPL ISCOMATRIX(商標)はCTL応答を誘導するがE6E7 DPPC ISCOMATRIX(商標)は誘導しないということがわかる。
【図8a】 HpCと混合した後の実施例1の2種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんど結合していないDPPC ISCOMATRIX(商標)とよりもより多くのHpCがDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているということがわかる。
【図8b】 HpCと混合した後の実施例1の2種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんど結合していないDPPC ISCOMATRIX(商標)とよりもより多くのHpCがDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているということがわかる。
【図8c】 HpCと混合した後の実施例1の2種のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。ほとんど結合していないDPPC ISCOMATRIX(商標)とよりもより多くのHpCがDPL ISCOMATRIX(商標)と結合しているということがわかる。
【図9a】 pH6(図6a)およびpH7.2(図6b)でE6E7と混合した後の2種のDPPC ISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。pH6でpH7.2よりもより多くのE6E7がDPPC ISCOMATRIX(商標)と結合するということがわかる。
【図9b】 pH6(図6a)およびpH7.2(図6b)でE6E7と混合した後の2種のDPPC ISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。pH6でpH7.2よりもより多くのE6E7がDPPC ISCOMATRIX(商標)と結合するということがわかる。
【図9c】 pH6(図6a)およびpH7.2(図6b)でE6E7と混合した後の2種のDPPC ISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。pH6でpH7.2よりもより多くのE6E7がDPPC ISCOMATRIX(商標)と結合するということがわかる。
【図10a】 実施例11の改変HpCと混合した後のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。HpCへの6Kの付加はDPPC ISCOMATRIX(商標)との結合を6HとCHL ISCOMATRIX(商標)製剤とのものに匹敵するレベルにまで増加させるということがわかる。
【図10b】 実施例11の改変HpCと混合した後のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。HpCへの6Kの付加はDPPC ISCOMATRIX(商標)との結合を6HとCHL ISCOMATRIX(商標)製剤とのものに匹敵するレベルにまで増加させるということがわかる。
【図10c】 実施例11の改変HpCと混合した後のISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。HpCへの6Kの付加はDPPC ISCOMATRIX(商標)との結合を6HとCHL ISCOMATRIX(商標)製剤とのものに匹敵するレベルにまで増加させるということがわかる。
【図11a】 実施例13の4種のポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。6KポリトープはISCOMATRIX(商標)といくらか結合しているが、6Kが存在しない場合には結合はないということがわかる。ISCOMATRIX(商標)との6Kポリトープ結合はPALポリトープのISCOM(商標)への疎水性組み込みに匹敵するが、6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)間の結合よりは少ない。
【図11b】 実施例13の4種のポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。6KポリトープはISCOMATRIX(商標)といくらか結合しているが、6Kが存在しない場合には結合はないということがわかる。ISCOMATRIX(商標)との6Kポリトープ結合はPALポリトープのISCOM(商標)への疎水性組み込みに匹敵するが、6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)間の結合よりは少ない。
【図11c】 実施例13の4種のポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。6KポリトープはISCOMATRIX(商標)といくらか結合しているが、6Kが存在しない場合には結合はないということがわかる。ISCOMATRIX(商標)との6Kポリトープ結合はPALポリトープのISCOM(商標)への疎水性組み込みに匹敵するが、6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)間の結合よりは少ない。
【図11d】 実施例13の4種のポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。6KポリトープはISCOMATRIX(商標)といくらか結合しているが、6Kが存在しない場合には結合はないということがわかる。ISCOMATRIX(商標)との6Kポリトープ結合はPALポリトープのISCOM(商標)への疎水性組み込みに匹敵するが、6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)間の結合よりは少ない。
【図11e】 実施例13の4種のポリトープISCOM(商標)およびISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。6KポリトープはISCOMATRIX(商標)といくらか結合しているが、6Kが存在しない場合には結合はないということがわかる。ISCOMATRIX(商標)との6Kポリトープ結合はPALポリトープのISCOM(商標)への疎水性組み込みに匹敵するが、6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)間の結合よりは少ない。
【図12a(i)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12a(ii)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12b(i)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12b(ii)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12c(i)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12c(ii)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12d(i)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図12d(ii)】 実施例13の4種の合成ポリトープISCOMATRIX(商標)製剤のCTL分析のグラフである。6KポリトープISCOMATRIX(商標)はポリトープ中の4種のエピト−プ総てに対してCTL応答を誘導したが(図12c)、タグを含まないポリトープISCOMATRIX(商標)製剤は1種のエピト−プに対する低いCTL応答しか誘導しなかった(図12d)ということがわかる。6KポリトープISCOMATRIX(商標)についてのCTL応答はPAL、ポリトープISCOM(商標)(図12a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図12b)で誘導されたものに匹敵した。
【図13a】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13b】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13c】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13d】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13e】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13f】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13g】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13h】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13i】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13j】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図13k】 実施例16の10種の組換えISCOMATRIX(商標)製剤のスクロース勾配分析のグラフである。付加6KタグとCDLまたはDPL ISCOMATRIX(商標)とを組合せることによって6KとDPPC ISCOMATRIX(商標)に優って結合を増加させ、次いで、これらを低pHと組み合わせると結合能がいっそうさらに増加するということがわかる。6K、CDL、ISCOMATRIX(商標)および低pHを組合せることで達成される結合はポリトープをISCOMATRIX(商標)とほとんど完全に結合させ、この結合は6HポリトープとCHL ISCOMATRIX(商標)で達成され得るものよりもよりも多かった。
【図14a(i)】 6KポリトープCDL ISCOMATRIX(商標)pH4.3(図14a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図14b)製剤のCTL分析のグラフである。CTL応答は両製剤についてポリトープ中の4種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はTYQエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図14a(ii)】 6KポリトープCDL ISCOMATRIX(商標)pH4.3(図14a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図14b)製剤のCTL分析のグラフである。CTL応答は両製剤についてポリトープ中の4種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はTYQエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図14b(i)】 6KポリトープCDL ISCOMATRIX(商標)pH4.3(図14a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図14b)製剤のCTL分析のグラフである。CTL応答は両製剤についてポリトープ中の4種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はTYQエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図14b(ii)】 6KポリトープCDL ISCOMATRIX(商標)pH4.3(図14a)および6HポリトープCHL ISCOMATRIX(商標)(図14b)製剤のCTL分析のグラフである。CTL応答は両製剤についてポリトープ中の4種のエピト−プの総てに対して誘導されたが、この応答はTYQエピト−プに対しては極めて低かったということがわかる。
【図15a】 実施例18のE6E7と混合したリポソームのグラフである。ほとんどのE6E7はDPLリポソームと結合していたが、E6E7はDPPCリポソームとはほとんど結合していなかったということがわかる。
【図15b】 実施例18のE6E7と混合したリポソームのグラフである。ほとんどのE6E7はDPLリポソームと結合していたが、E6E7はDPPCリポソームとはほとんど結合していなかったということがわかる。
【配列表】
Claims (20)
- 負電荷を有する荷電有機複合体および正電荷を有する荷電タンパク質を含んでなり、
(a)前記有機複合体がサポニンを含み、
(b)その有機複合体およびタンパク質が静電気的に結合し、
静電気的相互作用が、前記タンパク質と前記有機複合体との間の引力となる、免疫原複合体。 - 前記タンパク質がペプチドを含む、請求項1に記載の免疫原複合体。
- 前記有機複合体がリン脂質を含んでなる、請求項1又は2に記載の免疫原複合体。
- リン脂質がホスホグリセリドである、請求項3に記載の免疫原複合体。
- ホスホグリセリドがホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸およびカルジオリピンからなる群から選択される、請求項4に記載の免疫原複合体。
- リン脂質が脂質Aである、請求項3に記載の免疫原複合体。
- 脂質Aがジホスホリル脂質Aおよびモノホスホリル脂質Aからなる群から選択される、請求項6に記載の免疫原複合体。
- 複合体が細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導する請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原複合体。
- 1種以上の医薬上許容される担体および/または希釈剤とともに、有効成分として請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原複合体を含んでなる、ワクチン組成物。
- 哺乳類において病状を処置する方法において用いるための、請求項1から8のいずれかに記載の免疫原複合体であって、前記方法が哺乳類に有効量の前記免疫原複合体を投与することを含み、複合体の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する、免疫原複合体。
- 免疫応答が細胞傷害性Tリンパ球応答を含む、請求項10に記載の免疫原複合体。
- 処置が治療的または予防的なものである、請求項10又は11に記載の免疫原複合体。
- 病状が微生物感染または癌に起因する、請求項10又は11に記載の免疫原複合体。
- 微生物感染がHIV、B型肝炎、C型肝炎、結核または寄生虫による症状であり、また癌が黒色腫、前立腺癌または乳癌である、請求項13に記載の免疫原複合体。
- 哺乳類において病状を処置する方法において用いるため、請求項10から14のいずれかに記載の免疫原複合体を含むワクチン組成物であって、病状を処置する方法が哺乳類に有効量の前記ワクチン組成物を投与することを含み、ワクチン組成物の投与が、病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止する免疫応答を誘発、誘導または促進する、ワクチン組成物。
- 病状の発症または進行を阻害、停止、遅延または防止するための医薬の製造における、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原複合体の使用であって、前記病状が微生物感染又は癌に起因する使用。
- 微生物感染がHIV、B型肝炎、C型肝炎、結核または寄生虫感染であり、また癌が黒色腫、前立腺癌または乳癌である、請求項16に記載の使用。
- 治療に用いるための請求項1から8のいずれかに記載の免疫原複合体。
- 負電荷を有する荷電有機複合体及び正電荷を有する荷電タンパク質を含む免疫原複合体を形成する方法であって、
前記方法が、タンパク質を選択する工程、正電荷が増大するようにタンパク質を修飾する工程、及び前記タンパク質を、サポニンを含む有機複合体と反応させる工程を含む方法。 - 前記タンパク質を、有機複合体と反応させる工程の前に、更に、前記有機複合体の負電荷を増大させる工程を含む請求項19の方法。
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