JP5067986B2 - ヘッジホッグシグナリング経路の阻害剤としてのステロイドアルカロイド誘導体の使用 - Google Patents
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Description
(発明の背景)
パターン形成は、それによって胚細胞が分化した組織の秩序立った空間的配置を形成する活性である。高等生物の物理的複雑性は、細胞固有の系列および細胞外因性シグナリングの内部役割を介して胚発生の間に生起する。誘導的相互作用は、身体プランの最も初期の確立からの脊椎動物発生における胚パターンニングに、器官系のパターンニングに、組織分化の間の発散細胞タイプの発生に必須である(Davidson, E.(1990)Development 108:365−389;Gurdon,J.B.(1992) Cell 68:185−199;Jessell,T.M.ら(1992) Cell 68:257−270)。発生細胞相互作用の効果は変化する。典型的には、応答細胞は、応答細胞の未誘導および誘導状態双方とは異なる細胞を誘導することによって細胞分化の1つの経路からもう1つの経路に転換する(誘導)。時々、細胞はその隣接細胞がそれ自体のように分化するように誘導する(ホメオジェネティック誘導);他の場合において、細胞はその隣接細胞をそれ自体のように分化するのを阻害する。初期発生における細胞相互作用は順次のものであり得、従って、2つの細胞タイプの間の初期誘導は、多様性の進行的増幅に至る。さらに、誘導的相互作用は胚においてのみならず、成体細胞においても起こり、形態形成パターンを確立し維持し、ならびに分化を誘導するように作用することができる(J.B.Gurdon (1992) Cell 68:185−199)。
【0002】
シグナリング分子のヘッジホッグ(hedgehog)ファミリーのメンバーは、非脊椎動物および脊椎動物発生の間に多くの重要な短いおよび長い範囲パターンニングプロセスを媒介する。ハエにおいては、単一ヘッジホッグ遺伝子はセグメントおよびイメージのディスクパターンニングを調節する。対照的に、脊椎動物においては、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーは左−右対象性、CNSにおける極性、体節および四肢、器官形成、軟骨形成および***形成の制御に関与している。
【0003】
最初のヘッジホッグ遺伝子は果実ハエであるDrosophila melanogasterにおける遺伝子スクリーニングによって同定された(Nusslein−Volhard, C.およびWieschaus,E.(1980) Nature 287,795−801)。このスクリーニングは、胚および幼虫発生に影響する多数の突然変異を同定した。1992年および1993年において、Drosophila ヘッジホッグ(hh)遺伝子の分子性質が報告され(C.F.,Leeら(1992) Cell 71,33−50)、それ以来、いくつかのヘッジホッグ相同体が種々の脊椎動物種から単離された。1つのヘッジホッグ遺伝子がDrosophilaおよび他の非脊椎動物で見いだされ、複数のヘッジホッグ遺伝子が脊椎動物に存在する。
【0004】
種々のヘッジホッグ蛋白質はシグナルペプチド、高度に保存されたN−末端領域、およびより発散したC−末端ドメインよりなる。分泌経路におけるシグナル配列切断(Lee,J.J.ら(1992)Cell 71:33−50;Tabata,T.ら(1992) Genes Dev.2635−2645;Chang,D.E.ら(1994) Development 120:3339−3353)に加えて、ヘッジホッグ前駆体蛋白質は、C−末端蛋白質における保存された配列に依存する内部自己蛋白質分解切断を受ける(Leeら(1994) Science 266:1528−1537;Porterら(1995) Nature 374:363−366)。この自己切断は19kDのN−末端ペプチドおよび26−28kDのC−末端ペプチドに導く(Leeら(1992)、前掲:Tabataら(1992)前掲;Changら(1994)前掲;Leeら(1994)、前掲;Bumcrot,D.A.ら(1995) Mol. Cell.Biol.15:2294−2303;Porterら(1995)前掲;Ekker,S.C.ら(1995) Curr.Biol.5:944−955;Lai,C.J.ら(1995)Development 121:2349−2360)。N−末端ペプチドは、それが合成された細胞の表面に密接に会合しており、他方、C−末端ペプチドはイン・ビトロおよびイン・ビボ双方において自由に拡散できる(Porterら(1995) Nature 374:363;Leeら(1994)前掲;Bumcrotら(1995)前掲;Mart’,E.ら(1995) Development 121:2537−2547;Roelink,H.ら(1995) Cell 81:445−455)。興味深いことには、N−末端ペプチドの細胞表面保持は、イン・ビトロで(Porterら(1995)前掲)およびイン・ビボで(Porter,J.A.ら(1996) Cell 86,21−34)拡散可能である内部切断の正常位置で正確に終止するRNAによってコードされたHHの切形形態として、自己切断に依存する。生化学研究は、HH前駆体蛋白質の自己蛋白質分解切断が、求核置換で引き続いて切断される内部チオエステル中間体を介して進行することが示されている。求核はN−ペブチドのC−末端の末端に共有結合する小さい求核分子であり(Porterら(1996)前掲)、それを細胞表面に連結するであろう。生物学的重要性は深遠である。連結の結果として、ヘッジホッグ生産細胞の表面に、高い局所濃度のN−末端ヘッジホッグペプチドが生成する。ショウジョウバエおよび脊椎動物において短いおよび長い範囲のヘッジホッグシグナリング活性に必要かつ十分であるのがこのN−末端ペプチドである(Porterら(1995)前掲;Ekkerら(1995)前掲;Laiら(1995)前掲;Roelink,H.ら(1995)Cell 81:445−455;Porterら(1996)前掲;Fietz,M.J.ら(1995) Curr.Biol. 5:643−651;Fan,C.−M.ら(1995) Cell 81:457−465;Mart’,E.ら(1995) Nature 375:322−325;Lopez−Martinezら(1995) Curr. Biol 5:791−795;Ekker,S.C.ら(1995) Development 121:2337−2347;Forbes,A.J.ら(1996) Development 122:1125−1135)。
【0005】
HHはショウジョウバエ発生の間に種々の部位における短いおよび長い範囲のパターンニングプロセスに関係付けられてきた。初期胚におけるセグメント極性の確立において、それは直接的に媒介されるように見える短い範囲の効果を有し、他方、イメージディスクのパターンニングにおいては、それは二次シグナルの誘導を介して長い範囲の効果を誘導する。
【0006】
脊椎動物においては、いくつかのヘッジホッグ遺伝子が過去数年間でクローン化されている。隣接組織をパターン化するシグナルの源である異なる組織中心でそれが発現されるごとく、これらの遺伝子のうち、Shhは実験の注意のほとんどを受容した。最近の証拠は、Shhがその相互作用に関与することを示す。
【0007】
Shhの発現は、推定中胚葉、マウス(Changら(1994)前掲;Echelard,Y.ら(1993) Cell 75:1417−1430)、ラット(Roelink,H.ら(1994) Cell 76:761−775)およびニワトリ(Riddle,R.D.ら(1993) Cell 75:1401−1416)、およびゼブラフィッシュにおける保護物(Ekkerら(1995)前掲;Krauss,S.ら(1993) Cell 75:1431−1444)における節での原腸形成の開始後まもなく開始する。ニワトリ胚において、節でのShh発現パターンは左右不対称を生じ、これは心臓の左右位置の原因であるようである(Levin,M.ら(1995) Cell 82:803−814)。
【0008】
CNSにおいて、脊索およびフロールプレートからのShhは腹側細胞の運命を誘導するようである。 異所的に発現されると、Shhはマウス(Echelardら(1993) 前掲;Goodrich,L.V.ら(1996)Genes Dev.10:301−312),ツメガエル(Roelink,H.ら(1994) 前掲;Ruizi Altaba,A.ら(1995) Mol.Cell.Neurosci.6:106−121)、ゼブラフィッシュ(Ekkerら(1995)前掲;Krausら(1993)前掲;Hammerschmidt,M.ら(1996)Genes Dev. 19:647−658)において中央および裏側脳の大きな領域の腹形成に導く。脊髄レベルにおいて中間神経外胚葉の外植体において、Shh蛋白質は、区別される濃度閾値を持つフロールプレートおよび運動ニューロン発生、低濃度の高い運動ニューロンにおけるフロールプレートを誘導する(Roelinkら(1995)前掲;Mart’ら(1995)前掲;Tanabe,Y.ら(1995) Curr.Biol. 5:651−658)。さらに、抗体ブロッキングは、脊索によって生産されたShhが運動ニューロン運命の脊索媒介誘導で必要である(Mart’ら(1995)前掲)。かくして、Shh−生産中線細胞の表面上のShhの高濃度はイン・ビトロで観察されたフロールプレートの接触−媒介誘導を説明するようであり(Placzek,M.ら(1993) Development 117:205−218)、該中線はイン・ビボで脊索の直ぐに上方のフロールプレートに位置する。脊索およびフロールプレートから放出されたより低濃度のShhは、恐らくは、イン・ビトロで接触−独立性であることが示されているプロセスにおいて、より遠位腹側外側領域で運動ニューロンを誘導する(Yamada,T.ら(1993) Cell 73:673−686)。中脳および前脳レベルで採取した外植体において、Shhは、各々、ドーパミン作動性(Heynes,M.ら(1995) Neuron 15:35−44;Wang,M.Z.ら(1995) Nature Med. 1:1184−1188)およびコリン作動性(Ericson,J.ら(1995) Cell 81:747−756)前駆体の、適当な腹側外側ニューロン細胞タイプを誘導し、これは、ShhがCNSの全長さを超える腹側明細の共通のインデューサーであることを示す。これらの観察は、Shhに対する異なる応答が特定の前後位置でいかにして調製されるかに関して疑問を生じる。
【0009】
中線からのShhは、脊椎動物胚、体幹における体節(Fanら(1995)前掲)および体節の頭部間葉吻側(Hammerschmidtら(1996)前掲)の軸傍領域をパターン化する。ニワトリおよびマウス軸傍中胚葉外植体において、Shhは、皮膚筋板マーカーPax3を犠牲にして、Pax1およびTwist様硬節特異的マーカーの発現を促進する。さらに、フィルターバリアー実験は、Shhが二次シグナリングメカニズムの活性化によるよりもむしろ直接的に硬節の誘導を媒介することを示唆する(Fan,C.−M.およびTessier−Lavigne,M.(1994) Cell 79,1175−1186)。
【0010】
また、Shhは筋板遺伝子発現を誘導するが(Hammerschmidtら(1996)前掲;Johnson,R.L.ら(1994) Cell 79:1165−1173;Munsterberg,A.E.ら(1995) Genes Dev. 9:2911−2922;Weinberg,E.S.ら(1996) Development 122:271−280)、最近の実験は、WNTファミリーのメンバー、Drosophila winglessの脊椎動物ホモログが協働的に必要であることを示唆する(Munsterbergら(1995)前掲)。当惑することには、ニワトリにおける筋板誘導は硬節マーカーの誘導より高いShh濃度を要する(Munsterbergら(1995)前掲)が、筋板は脊索よりもかなり近く位置した体節細胞に由来する。同様の結果がゼブラフィッシュで得られており、ここに、高濃度のヘッジホッグが筋板を誘導し、硬節マーカー遺伝子発現を抑制する(Hammerschmidtら(1996)前掲)。しかしながら、有羊膜類とは対称的に、これらの観察は魚類胚の構築と合致し、ここでは、筋板は体節の支配的かつより軸方向の構成要素である。かくして、Shhシグナリングの変調および新しいシグナリング因子の獲得は、脊椎動物進化の間の体節構造を修飾してきた。
【0011】
脊椎動物四肢芽において、後間葉細胞のサブセット、「極性活性のゾーン」(ZPA)は前後指同一性を調節する(Honig,L.S.(1981)Nature291:72−73にレビューされている)。Shhの異所性発現またはShhペプチドに浸漬したビーズの適用は前方ZPAグラフトの影響を模倣し、指の鏡像複製を生成する(Changら(1994)前掲;Lopez−Martinezら(1995)前掲;Riddleら(1993)前掲)(図2)。かくして、指の同一性は、主としてShh濃度に依存するように見えるが、他のシグナルがこの情報をAPパターンニングに要するようである実質的距離にわたって中継し得るのは可能である(100−150μm)。ショウジョウバエイメージディスクにおけるHHおよびDPPの相互作用と同様に、脊椎動物四肢芽におけるShhはBamp2(Fancis,P.H.ら(1994) Development 120:209−218)、dppホモログの発現を活性化する。しかしながら、ショウジョウバエとは異なり、BMP2はニワトリ四肢芽における異所性適用に際してShhの極性効果を模倣しない(Francisら(1994)前掲)。前後パターンニングに加えて、Shhは、後方先端外胚葉***における繊維芽細胞成長因子FGF4の合成を誘導することによって、四肢の近位遠位派生物の調節に関与するようである(Laufer,E.ら(1994) Cell 79:993−1003;Niswander,L.ら(1994) Nature 371:609−612)。
【0012】
ヘッジホッグ蛋白質およびBMPの間の密接な関係は脊椎動物ヘッジホッグ発現の多くの、しかし恐らくは全てではない部位で保存されているようである。例えば、ニワトリ後腸において、ShhはBmp4、もう1つの脊椎動物dppホモログを誘導することが示されている(Roberts,D.J.ら(1995) Development 121:3163−3174)。さらに、ShhおよびBmp2、4または6は胃の上皮および間葉細胞、尿生殖系、肺、歯芽および毛嚢でのそれらの発現において驚くべき関係を示す(Bitgood,M.J.およびMcMahon,A.P.(1995) Dev.Biol.172:126−138)。さらに、Ihh、2つの他のマウスヘッジホッグ遺伝子のうちの1つは、腸および発生する軟骨におけるBmp発現細胞に隣接して発現される(BitgoodおよびMcMahon(1995)前掲)。
【0013】
最近の証拠は、Ihhが軟膏形成発生の調節で非常に重要な役割を演じるモデルを示唆する(Robertsら(1995)前掲)。軟骨形成の間に、軟骨細胞は中間のプレ肥大性状態を介して増殖状態から分化した肥大性軟骨細胞まで進行する。Ihhはプレ肥大性軟骨細胞で発現され、軟骨細胞分化のブロックに至るシグナリングカスケードを開始する。その直接的標的はIhh発現ドメインの回りの軟骨膜であり、これは、GliおよびPatched (Ptc)、ヘッジホッグシグナルの保存された転写標識(後記参照)の発現によって応答する。最もありそうには、これは関節周囲軟骨膜における上皮小体ホルモン−関連蛋白質(PTHrP)の合成の結果となる二次シグナリングに至る。PTHrP自体はプレ肥大性軟骨細胞に信号を戻し、そのさらなる分化をブロックする。同時に、PTHrPはIhhの発現を抑制し、それにより、軟骨細胞の分化の速度を変調する陰性フィードバックを形成する。
【0014】
(発明の概要)
本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路を阻害する方法および試薬に関する。例えば、本発明は、ヘッジホッグ蛋白質に感受性の細胞を、ヘッジホッグ蛋白質に対する該細胞の感受性を減少させるのに十分な量のステロイドアルカロイド、または他の小分子に接触させることを含むヘッジホッグ蛋白質によって生産されたパラクリンおよび/またはオートクリンシグナルを阻害する方法および試薬を利用する。他の態様において、本発明は、細胞を、成長状態を調節する、例えば、正常ptc経路に作動するまたはsmoothened活性に拮抗するのに十分な量の、ステロイドアルカロイドまたは他の小分子のごときptcアゴニストと接触させることを含む、ptc機能喪失またはsmoothened機能獲得から得られた異常成長状態を阻害する方法および試薬を利用する。
【0015】
(図面の簡単な説明)
図1. 植物ステロイドアルカロイドジェルビン、シクロパミンおよびトマチジンの、およびコレステロールの合成化合物AY9944およびトリパラノールの構造。
【0016】
図2. ジェルビン(4)に暴露されたニワトリ胚で誘導された全前脳。(A)未処理胚の外部面特徴ののSEM。(B、C、DおよびE)中線組織の可変喪失を持つ10μMジェルビンに暴露された胚および対となって、側方嗅覚突起(olf)、光学小胞(Opt)および上顎(Mx)および下顎(Mn)突起の得られた融合。光学小胞(E)の完全な融合は真の単眼症に至った。
【0017】
図3. 合成および植物由来テトラジェンは外植ニワトリ組織における外因性Shhシグナリングをブロックする(41)。中線組織をHensen節に対して丁度吻のレベルの段階9−10ラワトリ胚から摘出し(白色ダッシュ線)、さらに切開して(黒色ダッシュ線)して、Shhシグナルの外因性源(脊索)および応答性組織(神経板外胚葉)を含有する外植体を得た。コラーゲンゲルマトリックスにおける培養の2日後、神経外胚葉は、未処理対照外植体(B)および非奇形発生アルカロイドトマチジン(50μM、C)で培養した外植体においてロールプレート細胞(HNF3β、ローダミン)および運動ニューロン(Isl−1、FITC)のマーカーを発現する。奇形発生化合物AY9944(0.5μM、D)、トリパラノール(0.25μM、E)、ジェルビン(0.5μM、F)およびシクロパミン(0.25μM、G)の媒介物用量は、低レベルのShh経路活性化(1.0μM、I)を要するIsl−Iの誘導を可能としつつ、高レベルのShh経路活性化を要するHNF3βの誘導をブロックする(テキスト参照)。高用量の奇形発生化合物AY9944(4.0μM、H)、トリパラノール(1.0μM、I)、ジェルビン(4.0μM、J)およびシクロパミン(1.0μM、K)はHNF3βおよびIsl−I誘導を十分に阻害する。
【0018】
図4. 奇形発生化合物はイン・ビボでShh自己プロセッシングを阻害しない(47)。エクジソン−誘導性対照(レーン1、2、3)下でShh蛋白質を発現する安定にトランスフェクトされたHK293細胞をジェルビン(レーン4、5)、シクロパミン(レーン6,7)、トマチジン(レーン10、1)、AY 9944(レーン12、13)で処理し、細胞溶解物免疫ブロットして自己プロセッシングの有効性を評価した。未処理対照で見られるように(レーン3)、処理細胞におけるShhは効果的にプロセッシングされ、前駆体の検出可能蓄積はほとんどまたは全くなかった(M、45kD)。プロセッシングされたアミノ−末端生成物(Shh−Np)は細胞会合し、Gly198後に切形したオープンリーディングフレームを担う構築体でトランスフェクトされた培養細胞の培地からShh−N蛋白質よりも早く移動する(レーン8;共にレーン9および17に負荷されたShh−NpおよびShh−N)。より速い移動および培養培地における検出可能な蛋白質の欠如(示さず)は、処理された細胞からのShh−Npがステロールアダクトを担うようであることを示す。トマチジン処理から得られたより遅く移動する種は〜1.9kD大きく、シグナル配列切断の従たる阻害を示唆する(星印;レーン10、11参照)。各レーンの免疫ブロットしたアクチンは負荷対照として示される。
【0019】
図5. 植物ステロイドアルカロイドはイン・ビトロにおいてHh自己プロセッシングを阻害またはそれに参画しない(5)。(A)〜25kD Hh−C産物(レーン2−27)および〜5kD NH2−末端産物(このゲルでは解像されず)を生じさせるためにステロールを添加せず(レーン1)または12μMコレステロールを添加して30℃で3時間インキュベートしたバテリカリに発現されたHis6Hh−C蛋白質(〜29kD)のイン・ビトロ自己プロセッシング反応を示すクーマシーブルー染色SDS−ポリアクリルアミドゲル。ジェルビン(レーン3−6)、シクロパミン(レーン8−11)およびトマチジン(レーン13−16)は、27倍過剰にコレステロールに添加した場合でさえ(レーン6、11および16)、自己プロセッシングに干渉しない。(B)ステロールの不存在下で行う場合(レーン1)、またはこれらのステロイドアルカロイドの324μM濃度においてさえ(レーン5、9および13)、ジェルビン(レーン2−5)、シクロパミン(レーン6−9)およびトマチジン(レーン10−13)の存在下で、His6Hh−C自己切断反応が進行しないことを示すクーマシーブルー染色したSDS−ポリアクリルアミドゲル。(C)50mMジチオスレイトール(レーン2)、12μMコレステロール(レーン3)、12μM 7デヒドロコレステロール(レーン4)、12μMデスモステロール(レーン5)、12μMムリステロン(レーン9、10)にて、ステロールの不存在下で(レーン1)行ったHis6Hh−C自己切断反応のクーマシーブルー染色SDS0ポリアクリルアミドゲル。27−炭素コレステロール前駆体(レーン4−6)は、50mMジチオスレイトール(レーン2)、12μMコレステロール(レーン3)、12μM 7デヒドロコレステロール(レーン4)、12μMラソステロール(レーン6)、12および350μMラノステロール(7、8)および12および350μMムリステロン(レーン9、10)にて、ステロールの不存在下で(レーン1)で行ったHis6Hh−C自己切断反応を刺激する。27−炭素コレステロール前駆体(レーン4−6)はコレステロール(レーン3)と同程度効果的にHis6Hh−C自己プロセッシングを刺激する。アミノ−末端産物は50mMジチオスレイトールの存在下で生じた場合〜7kD種(レーン2)として移動し、ステロールアダクトと共に〜5kD種として移動する(レーン3−6)。ラノステロール(レーン7および8)およびムリステロン(レーン9および10)はバックグラウンドを超えて自己プロセッシングを刺激しない(レーン1)。
【0020】
図6. 奇形形成化合物は外因性Shh−N蛋白質に対する神経外胚葉応答を阻害する(41)。(A)脊索および他の組織のない中間神経板外胚葉を、Hensen節に対して丁度吻側のレベルの段階9−10ニワトリ胚からの示されたごとく(ダッシュ線)切開した(図3A参照)。(B)コラーゲンゲルマトリックス中で20時間培養した外植された中間神経板組織は背面マーカーPax7(FITC)を発現し、フロールプレートマーカーHNF3βを発現しない(ローダミン)。(C)組換え精製Shh−Nの2nMでの添加はPax7発現を抑制する。運動ニューロン(Isl−1、FITC)および底板細胞(HNF3β、ローダミン)運命は6.25nM Shh−Nの存在下で40時間の外植体培養に際して誘導された。(E)25nM Shh−Nにおいて、HNF3β発現は、失われるIsl−1発現を犠牲にして拡大される。2nM Shh−NによるPax7発現の抑制は(F)0.5μM AY 9944、(G)0.25μMトリパラノール、(H)0.125μMジェルビンおよび(I)0.0625μMシクロパミンによって阻害されるが、(J)50μMトマチジンによっては阻害されない。HNF3βの誘導はブロックされ、他方、25nM Shh−NにおけるIsl−1の誘導は中間レベルのAY 9949(1.0μM、K)、トリパラノール(0.25μM、L)、ジェルビン(0.25μM、M)およびシクロパミン(0.125μM、N)で維持されまたは拡大される。25nMのトマチジンはHNF3β発現の減少および番号Isl−1発現細胞の増加でもってわずかな阻害効果を呈する。HNF3βおよびIsl−1誘導は、阻害剤AY9944(2.0μM、P)、トリパラノール(0.5μM、Q)、ジェルビン(0.5μM、R)およびシクロパミン(0.25μM、S)の2倍高い用量で完全にブロックされる。50μM(T)のトマチジンはHNF3β誘導を顕著に減少させ、Isl−1誘導を増強する。各奇形形成化合物については、2nM Shh−N(F−I)に対する完全な応答をブロックするのに要する濃度は25nM Shh−N(P−S)に対する応答を完全にブロックするのに必要なものよりも低いことに注意されたし。また、25nM Shh−Nに対する応答は、この応答を完全にブロックするのに必要なものよりも2倍低いテラトゲンの濃度で部分的にのみ阻害した(K−N)ことに注意されたし。さらなるコメントについてはテスキト参照。
【0021】
図7. ジェルビンはBMP7に対する神経外胚葉を阻害しない(41)。(A)腹側神経板外胚葉をHensen節に対して丁度吻側のレベルの段階9−10ニワトリ胚から示されたごとく(ダッシュ線)切開した(図3A参照)。(B)コラーゲンゲルマトリックス中で24時間培養した腹側神経板外植体は、HNK−1抗原につき免疫染色することによって可視化することができるいずれかの移動性細胞を生起しない。(C)100ng/mlのBMP7の添加は、外植体から移動する多数のHNK−1陽性細胞の形成を誘導する(白色ダッシュ線によって描かれた境界)。(D)100ng/mlのBMP7による移動性HNK−1陽性細胞の誘導は、10μMジェルビンの存在によって阻害されず、他の植物−由来化合物の添加によって阻害されない(10μMシクロパミン、50μMトマチジン、データは示さず)。
【0022】
図8. 対照およびShh−/−初代毛髪胚芽の形態学および遺伝子発現パターン。(A、B)上皮プラコードおよび隣接間葉濃縮物(矢印)よりなる正常出現毛髪膝は対照(A)およびShh−/−(B)摂取の15.5日における胚双方の皮膚で検出された(H&E染色)。(C−H)Shh−/−マウス皮膚における毛髪膝中でのShh標的遺伝子の変化した豊富さ。Glil(C、D)、Ptcl(E、F)、およびBMP−4(G、H)転写体を、ジゴキシゲニン−標識cRNAプローブを用いてE 15.5マウス皮膚で調べた。突然変異体毛髪胚芽の上皮および間葉成分双方におけるGlilの実質的不存在は、Shh−/−皮膚における間葉Ptc1発現を減少させたことに注意されたい。
【0023】
図9. Shh−/−マウス皮膚における、毛包形態発生の阻害、しかし生化学的分化ではない。(A、B)摂取の17.5日における対照からの(A)(しかしShh−/−(B)胚ではない)皮膚における進行した毛包(H&E染色)。最大毛包の上皮球によって囲まれた皮膚乳頭(矢印)、およびより未成熟の嵌入先端に隣接する組織化間葉凝集体(矢印頭部)(A)。顕著に対照的に、皮膚乳頭はShh突然変異体皮膚では検出されない(B)。(C−F)対照およびShh−欠陥嚢におけるケラチン発現の同様のパターンを明らかとする免疫組織化学。対照(C)およびShh−/−(D)毛包(矢印)双方におけるケラチノサイトの亜群におけるケラチンK14免疫染色の不存在。対照(E)およびShh突然変異体(F)皮膚における毛包ケラチノサイトでの非表皮ケラチンK17の誘導。
【0024】
図10. ヌードマウスに移植したShh突然変異体皮膚における損傷した毛包発育。(A)移植後6週間のヌードマウス移植部位の大きな出現。無毛であるが着色したShh−/−皮膚グラフトと比較した対照グラフトにおけるかなりの毛髪成長に注意されたし。(B、C)H&E染色。対照グラフトにおける組織学的に正常に出現する皮膚(B)は、関連する皮脂線および皮下脂肪組織と共に成熟した毛包を含有する。表皮の基底におけるケラチノサイト凝集体(矢印)を含有する厚化表皮によって特徴付けられるShh−/−グラフトにおける異常皮膚発育(C)。(D−F)免疫組織化学。隣接する表皮細胞とは異なり、Shh−/−ケラチノサイト凝集体はK5(D、矢印)を発現しないが、核に局所化されたLef−1につき陽性である(E)。また、右側のケラチノサイト凝集体と会合したLef−1陽性間葉細胞の小クラスターの存在に注意されたし(E)。Shh突然変異体皮膚における嚢分化の進行した段階を明らかとする、毛髪−特異的ケラチン抗体AE13(F)での流産毛髪シャフトの免疫染色。
【0025】
図11. シクロパミンは外植体において鼻毛嚢形態発生を損なう。(A)培養中の第1日および第8日における核孔膜で成長する鼻毛パッド外植体(暗視野)。(B)毛髪−特異的マーカーMHKAIおよびHac−1をコードする転写体の発現、および表皮分化マーカーフィラッゲンを調べるFC−PCR分析(profio. 最初に単離された(0日)およびI〜Mシクロパミンの存在下または不存在下で外植体として成長させた後(7日)、胚鼻毛パッドからRNAを単離した。各レーンは個々の鼻毛パッドから単離したRNAについての反応生成物を含有する。C)鼻毛嚢の形態発生はシクロパミン、Shhシグナリングの阻害剤によってブロックされる。シクロパミンは実験の持続のために培地中に存在させた。
【0026】
図12. ShhNpと共に5日間インキュベートしたPtc+/−MEF。
【0027】
図13. シクロパミンで3日間培養したPtc−/−MEFs23−1。
【0028】
図14. シクロパミンで16時間培養したPtc−/−MEFs23−4。
【0029】
図15. トマチジンで16時間培養したPtc−/−MEFs21−4。
【0030】
(発明の詳細な説明)
ヘッジホッグ蛋白質は、動物胚形成において種々の構造のパターニングに必須の分泌されたシグナリング分子のファミリーよりなり、細胞増殖を調節し、成体における発散系における細胞同一性を特定するにおいて役割を演じる。
【0031】
生合成の間に、ヘッジホッグは、全ての公知のヘッジホッグシグナリング活性を担う脂質−修飾アミノ末端断片を生産するそのカルボキシル−末端ドメインによって媒介される、自己切断反応を受ける。ペプチド結合切断に加えて、ヘッジホッグ自己プロセッシングはN−末端ヘッジホッグ断片のCOOH−末端への脂溶性アダクトの共有結合を引き起こす。この修飾はヘッジホッグシグナルの空間的に制限された組織位置で非常に重要である;その不存在において、シグナリングドメインは発現のその部位を超えて不適当な影響を発揮する。最近、コレステロールが自己プロセッシングの間にアミノ−末端シグナリングドメインに共有結合した脂溶性部位であり、カルボキシル−末端ドメインは分子内コレステロールトランスフェラーゼとして作用することが報告されている(Porterら(1996) Science 274:255)。ヘッジホッグシグナリング蛋白質を修飾するためのコレステロールのこの使用は、乱れたコレステロール生合成は動物発育を有し得るという何らかの効果と一致する。また、Volhardら(1998) Nature 287 795;Mohleretら(1988) Genetics 120:1061;Leeら(1992) Cell 71:33;Tabataら(1992) Genes Dev 6:2635;Tashiroら(1993) Genel 24:183;P.W.Ingham,Nature 366:560(1993);Mohlerら Development 115:957(1992);Maら Cell 75:927(1993);Heberleinら, 前掲,913頁;Echelardら, 前掲,1417頁;Riddleら,前掲,1401頁;Kraussら,前掲,1431頁;Roelinkら,前掲76,761(1994);Changら,Development 120:3339(1994);Baslerら, Nature 368:208(1994);Tabataら Cell 76:89(1994);Heemskerkら,前掲,449頁;Fanら, 前掲 79:1175(1994);Johnsonら,前掲,1165頁;Hynesら, Neuron 15:35(1995);Ekkerら,Development 121:2337(1995);Macdonaldら,前掲,3267頁;Ekkerら,Curr.Biol 5:944(1995);Laiら, Development 121,2349(1995);Ericsonら, Cell 81:747(1995), Chiangら,Nature 83:407(1996);Bitgoodら, Curr. Biol. 6:298(1996);Vortkampら, Science 273:613(1996);Leeら, 前掲 266:1528(1994);Porterら, Nature 374:363(1995);Porterら Cell 86:21(1996)参照。
【0032】
I.総括
本発明は、ヘッジホッグ蛋白質によって誘導されたシグナル伝達経路が、少なくとも部分的には、ヘッジホッグ蛋白質のコレステロール修飾を破壊するおよび/またはヘッジホッグ蛋白質の生物活性を阻害する化合物によって阻害することができるという発見に関する。特に、出願人は、例えば、2500amu未満の分子量を有する小分子が、ヘッジホッグシグナル伝達経路によって誘導された生物学的活性の少なくともいくらかを阻害できることを証明した最初のものであると信じる。例えば、主題の阻害剤を用いて、ヘッジホッグ−依存性シグナル伝達、ならびにptclof−およびsmogof−媒介シグナリングを阻害することができる。
【0033】
本発明の1つの態様は、ヘッジホッグ蛋白質、特に該蛋白質のコレステロール−修飾(CM)形態によって生じたパラクリンおよび/またはオートクラインシグナル、ならびにptcの機能喪失突然変異またはsmoの機能獲得突然変異によって引き起こされた構成的シグナリングと干渉するためのステロイドアルカロイド、およびそのアナログの使用に関する。後記にて記載されるごとく、我々は、Veratrum−由来化合物ジェルビンのごときステロイドアルカロイドクラスの化合物のメンバーがかかるシグナルおよび細胞の同時生物学的応答を破壊することを観察した。
【0034】
いずれかの特定の理論に拘束させるつもりはないが、ヘッジホッグシグナリングを阻害するジェルビンおよび他のステロイドアルカロイドの能力は、patchedまたはsmoothened−媒介シグナル伝達経路と相互作用する、あるいはptcおよび/またはsmoothened−媒介シグナル伝達経路を活性化する蛋白質の能力に干渉するかかる分子の能力によるものであり得る。例えば、主題の阻害剤は、patchedヘッジホッグ受容体のステロール感知ドメインと相互作用でき、あるいはヘッジホッグ蛋白質、例えば、コレステロール−修飾蛋白質の能力に少なくとも干渉でき、その受容体、または受容体に会合した他の分子、またはヘッジホッグ−媒介シグナル伝達に関与する蛋白質と相互作用することができる。
【0035】
別法として、あるいはかかる作用メカニズムに加えて、ヘッジホッグシグナリングに対するジェルビンの効果は、ヘッジホッグ蛋白質のコレステロール−媒介自己プロセッシングおよび/または蛋白質の活性または安定性に影響するコレステロールホメオスタシスの乱れの結果であり得る。特に、添付の実施例に記載されたごとく、ジェルビンおよび他のステロイドアルカロイドはコレステロール生合成のいわゆる「クラス2」阻害剤である、すなわち、それらはステロールの内向きフラックスを阻害する。LangeおよびSteck(1994)J. Biol. Chem. 269:29371−4によって記載されているごとく、これらの阻害剤は原形質膜コレステロールのエステル化を直ちに阻害し、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル補酵素リダクターゼ活性およびステロール生合成を暫時に誘導する。相対的コレステロールレベルの変化は、例えば、ptcの活性および/または安定性に影響し得る。本発明によると、主題の方法は、ジェルビンと同様にして、コレステロールホメオスタシスを乱す他の剤を利用して行うことができる。
【0036】
従って、ptc活性のコレステロール依存性態様に同様に干渉する、構造において他の小分子、ステロイドおよび非ステロイドが同様にヘッジホッグ−媒介シグナルを破壊することができると特に考えられる。好ましい具体例において、主題の阻害剤は、2500amu未満、より好ましくは1500amu未満、なおさらに好ましくは750amu未満の分子量を有する有機分子であり、ヘッジホッグ蛋白質の生物学的活性の少なくともいくつかを阻害することができる。
【0037】
かくして、本発明の方法は、例えば、広い範囲の細胞、組織および器官の修復および/または機能的効率の調節において、シグナル経路のsmoothenedまたは下流成分の活性化を阻害することによるごとくして、ヘッジホッグシグナル経路に拮抗するステロイドアルカロイド、および他の小分子の使用を含み、神経組織の調節、骨および軟骨形成および修復、***形成の調節、平滑筋の調節、原始腸に由来する肺、肝臓および他の器官の調節、ホメオスタシス機能の調節、皮膚および毛髪成長の調節の範囲の治療および化粧適用を有する。従って、本発明の方法および組成物は、主題の阻害剤の使用を含み、全てのかかる使用につき、ヘッジホッグ蛋白質のアンタゴニストを含むことができる。さらに、主題の方法は、培養で供される細胞(イン・ビトロ)、または全動物における細胞(イン・ビボ)で行うことができる。例えば、PCT出願WO 95/18856およびWO 96/17924(その明細書を出典明示して本明細書の一部とみなす)に対して行うことができる。
【0038】
好ましい具体例において、主題の方法は、ヘッジホッグの機能獲得、ptc機能喪失またはsmoothened機能獲得の表現型を有する上皮細胞を治療するためのものであり得る。例えば、主題の方法は基底細胞癌または他の増殖性障害を治療または予防するのに使用することができる。
【0039】
1つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるごとく、有効成分として、ヘッジホッグシグナル経路の阻害剤を含む医薬製剤を提供する。
【0040】
本発明の阻害剤を用いる主題の治療はヒトおよび動物対象双方に対して有効であり得る。本発明が適用できる動物対象はペットまたは商業目的で生育された、家畜動物または愛玩動物双方に拡大される。その例はイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギである。
【0041】
II.定義
便宜のために、明細書、実施例および添付の請求の範囲で使用されるある用語をここに集める。
【0042】
用語「ヘッジホッグポリペプチド」は、ヘッジホッグ蛋白質およびそのペプチジル断片の調製物を含み、特別の意味としてアゴニストおよびアンタゴニスト双方は明瞭となる。
【0043】
用語「ヘッジホッグ機能獲得」とは、野生型蛋白質よりも、ptc−依存性活性に関して、より活性である蛋白質の形態を生起するヘッジホッグコーディング配列の突然変異をいう。ヘッジホッグ機能喪失は野生型蛋白質の異常発現を含み、例えば、ここに該蛋白質は異常に高いレベルで発現され、あるいは増大した寿命を有し、あるいは(翻訳後プロセスによって)正しくなく修飾され、あるいは誤った時点で発現される(異所性発現)。
【0044】
用語「ptc機能喪失」とは、ptc遺伝子の異常修飾または突然変異、または該遺伝子の発現のレベルの減少(または喪失)をいい、その結果、細胞とヘッジホッグ蛋白質との接触、例えば、ヘッジホッグ経路の異常活性化に似た表現型となる。機能喪失はCi遺伝子、例えば、Gli1、Gli2およびGli3の発現のレベルを調節するptc遺伝子の能力の喪失を誘導し得る。
【0045】
用語「smoothened機能獲得」とは、ptc遺伝子の異常修飾または突然変異、または遺伝子の増大したレベルをいい、その結果、細胞とヘッジホッグ蛋白質との接触、例えば、ヘッジホッグ経路の異常活性化に似た表現型となる。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、ptcは細胞に直接的にシグナル付与できず、むしろヘッジホッグシグナリングにおいてptcの下流に位置したもう1つの膜結合蛋白質であるsmoothenedと相互作用する(Marigoら(1996) Nature 384:177−179)。遺伝子smoはショウジョウバエにおける各セグメントの正しいパターンニングに必要なセグメント−極性遺伝子である(Alcedoら, (1996) Cell 86:221−232)。smoのヒトホモログが同定されている。例えば、Stoneら(1996) Nature 384:129−134およびGenBank受託番号U84401参照。smoothened遺伝子はヘテロトリマーG蛋白質がカップリングされた受容体;すなわち、7−膜貫通領域の特徴を持つ一体化膜蛋白質をコードする。この蛋白質はDrosophila Frizzled (Fz)蛋白質、無翼経路のメンバーに対する相同性を示す。smoはHhシグナルの受容体をコードすると元来考えられている。しかしながら、この示唆は、ptcにつきHh受容体が得られた証拠として引き続いて否認された。かくして、Smoを発現する細胞はHhに結合せず、SmoはHhと直接相互作用しないことを示す(Nusse(1996) Nature 384:119−120)。むしろ、その受容体PTCHに対するSonic ヘッジホッグ(SHH)の結合は、smoothened(SMO)7−スパン膜貫通蛋白質のPTCHによって正常阻害を妨げると考えられる。
【0046】
最近、smoothened突然変異の活性化が散在性基底細胞癌(Xieら(1998) Nature 391:90−2)および中枢神経系の原始神経外胚葉(Reifenbergerら(1998) Cancer Res 58:1798−803)で起こることが報告されている。
【0047】
フレーズ遺伝子の「異常修飾または突然変異」とは、例えば、遺伝子に対するヌクレオチドの欠失、置換または付加、ならびに遺伝子の大きな染色体再配置および/または遺伝子の異常メチル化のごとき遺伝子病巣をいう。同様に、遺伝子の誤発現とは、同様の条件下での正常細胞におけるレベルに対する遺伝子の転写の異常レベル、ならびに遺伝子から転写されたmRNAの非野生型スプライシングをいう。
【0048】
用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」とは、ヘッジホッグシグナリング経路に拮抗する化合物をいう。かくして、該用語はヘッジホッグ−媒介シグナル伝達、ならびにptclofまたはsmogof突然変異に由来するもののごときヘッジホッグ−独立性シグナルの阻害剤を含む。本発明の意味において、かかるアンタゴニストは、ステロール輸送の阻害を介するごときコレステロールホメオスタシスを破壊する能力(例えば、クラス2阻害剤)、ヘッジホッグ受容体部位に結合し、ヘッジホッグの受容体への同時結合を阻害する、あるいは非競合的および/またはアロステリック効果によって、結合するヘッジホッグに対する細胞の応答を阻害する、あるいはptclofまたはsmogofの効果を阻害する、例えば、野生型表現型に似た表現型に逆行する能力のような特徴を有するジェルビンの能力を模倣する化合物を含むことができる。かくして、該用語はptcアゴニストおよびsmoothenedアンタゴニストを含む。
【0049】
用語「ptcアゴニスト」とは、標的遺伝子の抑制転写に対するごときptcの生物活性を増強しまたは再降伏する剤をいう。好ましいptcアゴニストを用いて、ptc機能喪失および/またはsmoothened機能獲得を克服することができ、後者はsmoothenedアンタゴニストという。
【0050】
用語「競合的アンタゴニスト」とは、受容体部位に結合する化合物をいい;その効果はアゴニストの増大した濃度によって克服することができるる
主題の治療方法に関する、例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの「有効量」とは、所望の投与法の一部として適用された場合に、例えば、細胞増殖の速度の変化および/または細胞の分化の状態および/または治療されるべき障害についての臨床的に許容される標準に従うまたは化粧目的の細胞の生存の率の変化を引き起こす調製物におけるアンタゴニストの量をいう。
【0051】
主題の方法によって治療されるべき「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味することができる。
【0052】
細胞の「成長状態」とは、細胞の増殖速度および/または細胞の分化の状態をいう。
【0053】
用語「ステロイド」および「ステロイド−様」とはここでは相互交換的に使用され、シクロペンタノフェナントレンの骨格または1以上の結合***または環拡大または収縮によってそれから由来する骨格を保有する多環化合物の一般的クラスをいう。該環は1以上の位置で置換することができて、メチルまたは他の低級アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基等によるごとき、原子価および安定性の規則に従う誘導体を創製することができる。
【0054】
用語「上皮」、「上皮の」および「上皮細胞」とは、腺およびそれから誘導される他の構造、例えば、角膜、食道、表皮、および毛嚢上皮細胞を含めた、内部および外部身体表面(皮膚、粘膜および漿液)の細胞被覆をいう。他の例示的上皮組織は、鼻孔の嗅覚領域をライニングする偽層化上皮細胞であり、臭いの感覚のための受容体を含有する嗅覚上皮細胞;分泌細胞よりなる上皮細胞;平滑化板−様細胞よりなる上皮細胞をいう偏平上皮細胞を含む。また、用語上皮細胞は、収縮および膨張による大きな機械的変化に付される特徴的に見いだされるライニング中空器官のような転移上皮細胞、例えば、層化偏平および柱状上皮細胞の間の転移を表す組織をいう。
【0055】
用語「上皮化」とは、剥がれた表面の上皮細胞の増殖による治癒をいう。
【0056】
用語「皮膚」とは、真皮および表皮よりなる、体の外側保護被覆をいい、汗腺および皮脂腺、ならびに毛嚢構造を含むと理解される。本出願を通じて、形容詞「皮膚」を用いることができ、それが使用される意味で適した、皮膚の属性を一般的にいうと理解される。
【0057】
用語「表皮細胞」とは、胚性外胚葉に由来する皮膚の最も外側の非血管層をいい、厚みは0.07−1.4mmで変化する。平面および平面表面において、それは、外側内から、5つの層:垂直に配置された柱状細胞よりなる基底層;短い突起またはとげ状突起を持つ平坦化された多角形よりなるとげ細胞またはとげ状層;平坦化細胞よりなる顆粒層;核が区別されずまたは存在しない透明な薄い細胞のいくつかの層よりなる透明層;および平坦化され角化された非有核細胞よりなるつの状層よりなる。一般的身体表面の表皮細胞において、透明な層は通常は存在しない。
【0058】
「真皮」とは、血管結合組織の密なベッドよりなり、神経および感覚の末端器官を含有する表皮細胞までの深い皮膚の層をいう。毛髪根および皮脂線および汗腺は真皮に深く包埋された表皮細胞の構造である。
【0059】
用語「爪」とは、指または足の指の末端の背面表面のつの状皮膚板をいう。
【0060】
用語「表皮腺」とは、表皮細胞に関連し、その通常の代謝必要性に関連しない物質を分泌しまたは排出するように特殊化された細胞の集合をいう。例えば、「皮脂線」は、油状物質および皮脂を分泌する真皮中の全分泌腺である。用語「汗腺」とは、汗を分泌し、真皮または皮下組織に位置し、体表面の管によって開口される腺をいう。
【0061】
用語「毛髪」とは、糸状構造、特にケラチンよりなり、真皮中の乳頭から発生し、哺乳動物によってのみ生産され、動物のその群に特徴的な特殊化された上皮構造をいう。また、かかる毛髪の集合体。「毛嚢」とは、毛髪を包み、それから毛髪が成長する上皮の管状−陥入の1つをいい;「毛嚢上皮細胞」とは、毛嚢中の皮膚乳頭を囲む上皮細胞、例えば、幹細胞、外側根保護細胞、マトリックス細胞、および内方根保護細胞をいう。かかる細胞は正常非悪性細胞、または形質転換/不滅化細胞であり得る。
【0062】
用語「鼻上皮組織」とは鼻および嗅覚上皮細胞をいう。
【0063】
「切除創傷」とは、皮膚の上皮細胞における裂け、擦過傷、切り傷、刺し傷または破傷を含み、皮膚層まで拡大することができ、皮下脂肪およびそれを超えて拡大することができる。切除創傷は外科的手法または皮膚の事故による貫通から起こり得る。
【0064】
「火傷創傷」とは、皮膚の大きな表面積が加熱および/または化学剤により個体から除去されまたは喪失された場合をいう。
【0065】
「皮膚潰瘍」とは、通常は炎症を伴う組織の表層の喪失によって生じる皮膚上の病巣をいう。本発明の方法によって治療することができる皮膚潰瘍は、臥位潰瘍、糖尿病潰瘍、毒液静止潰瘍および動脈潰瘍を含む。臥位潰瘍とは、長時間皮膚の領域に適用された圧力に由来する慢性潰瘍をいう。この種類の潰瘍はしばしばとこずれといわれる。毒液静止潰瘍は欠陥静脈からの血液または他の流体の滞留に由来する。動脈潰瘍とは、貧弱な血流を有する動脈の回りの領域における壊死皮膚をいう。
【0066】
「歯科組織」とは、上皮組織と同様の口中の組織、例えば、歯肉組織をいう。本発明の方法は歯周疾患を治療するのに有用である。
【0067】
「内部上皮組織」とは、皮膚における上皮層と同様の特徴を有する身体の内部の組織をいう。その例は腸のライニングを含む。本発明の方法は、ある種の内部創傷、例えば、外科手術に由来する創傷の治癒を促進するのに有用である。
【0068】
「目の組織に対する創傷」とは、ひどい乾燥目症候群、角膜潰瘍および擦過および目の外科的創傷をいう。
【0069】
本出願を通じて、用語「増殖皮膚障害」とは、皮膚組織の望まないまたは異常な増殖によって特徴付けられる皮膚のいずれの病気/障害もいう。これらの疾患は、典型的には、上皮細胞増殖または不完全な細胞分化によって特徴付けられ、例えば、X−結合魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離過剰ケラトーシス、および脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮形成異常は表皮の誤った発生の形態である。もう1つの例は「表皮剥離」であり、これは自然発生のまたは外傷の部位におけるブレブおよび水泡の形成を伴う表皮の緩んだ状態をいう。
【0070】
用語「癌」とは、周囲組織に侵潤し、転移を生起する傾向にある上皮細胞よりなる悪性の新しい増殖をいう。例示的癌は稀に転移しつつ、局所侵害および破壊についての可能性を有する皮膚の上皮腫瘍である「基底細胞癌」;偏平上皮細胞から生起し、立方体様細胞を有する癌をいう「偏平細胞癌」;癌性および肉腫性組織よりなる悪性腫瘍を含む「癌性肉腫」;「腺癌」、小上皮細胞の巣または索によって分離されたまたは囲まれた硝子質またはムチン質の円筒またはバンドによって特徴付けられ、乳腺および唾液腺、および呼吸器管の粘膜腺で起こる癌;表皮細胞のものと同様に分化する傾向にある癌性細胞をいう「表皮性癌」;すなわち、それらは、とげ細胞を形成し、角化を受ける傾向にある;鼻の後の空間の上皮ライニングに生起する悪性腫瘍をいう「鼻咽頭癌」;および変化する配置の管状細胞よりなる腎臓実質の癌に関する「腎臓細胞癌」を含む。もう1つの癌性上皮細胞増殖は、上皮細胞に由来し、原因剤としてパピローマウイルスを有する良性腫瘍をいう「乳頭腫」;および神経溝の閉鎖の時点に外胚葉要素を含めることによって形成された大脳または髄膜腫瘍をいう「類表皮腫」である。
【0071】
「基底細胞癌」は、小節−潰瘍性、表層性、着色性、限局性強皮症様の、線維上皮腫および母斑様症候群のごとき種々の臨床的および組織学的形態で存在する。基底細胞癌はヒトで見いだされる最も普通の皮膚新形成である。非メラノーマ皮膚癌の500,000の新しい場合の大部分。
【0072】
本明細書で用いられる用語「乾癬」とは、皮膚の調節メカニズムを改変する過剰増殖皮膚障害をいう。特に、表皮増殖、皮膚の炎症性応答、およびリンホカインおよび炎症性因子のごとき調節分子発現における一次および二次改変を含む病巣が形成される。乾癬皮膚は、表皮細胞の増大した代謝回転、厚化表皮、異常ケラチン化、皮膚層への炎症細胞の侵潤および基底細胞周期の増加をもたらす表皮層への多形核白血球侵潤によって形態学的に特徴付けられる。加えて、過剰角化性およびパラ角化性細胞が存在する。
【0073】
用語「ケラトーシス」とは、表皮細胞のつの状層の過形成によって特徴付けられる増殖性皮膚障害をいう。例示的角化性障害は毛包性角化症、掌蹠角皮症、咽頭角化症、毛髪角化症、および光線性角化症を含む。
【0074】
本明細書で用いる「増殖性」および「増殖」とは有糸***を受ける細胞をいう。
【0075】
本明細書で用いる「形質転換細胞」とは、非拘束増殖の状態に自然発生的に変換された細胞をいい、すなわち、それらは培養中の無限数の***を通じて増殖する能力を獲得している。形質転換細胞は、増殖制御のその喪失に関して、新形成、形成外科および/または過形成のごとき項目によって特徴付けることができる。
【0076】
本明細書で用いる「不滅化細胞」とは、該細胞が培養中の無限数の***を通じて増殖する能力を有するように、化学的および/または組換え手段を介して改変された細胞をいう。
【0077】
用語「プロドラッグ」とは、生理学的条件下で、本発明の治療的に活性な剤に変換される化合物を含むことを意図する。プロドラッグを作成するための通常の方法は、生理学的条件下で加水分解されて所望のものを生じる部位を選択することである。他の具体例において、プロドラッグは宿主動物の酵素活性によって変換される。
【0078】
本明細書で用いる用語「ヘテロ原子」とは炭素または水素以外のいずれかの元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子はホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄およびセレンである。
【0079】
ここに、「脂肪族基」とは、直鎖、分岐鎖、または環状脂肪族炭化水素基をいい、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基のごとき飽和および不飽和脂肪族基を含む。
【0080】
用語「アルキル」とは、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル(非環)基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含めた飽和脂肪族基の基をいう。好ましい具体例において、直鎖または分岐鎖アルキルはその骨格に30以下の炭素原子(例えば、直鎖ではC1−C30、分岐鎖ではC3−C30)、より好ましくは20以下を有する。同様に、好ましいシクロアルキルはその構造に3−10個の炭素原子、より好ましくは環構造中に5、6または7個の炭素を有する。
【0081】
さらに、明細書、実施例および請求の範囲を通じて使用される用語「アルキル」(または「低級アルキル」)は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」を共に含める意図であり、その後者は炭化水素骨格の1以上の炭素上に水素を置き換える置換基を有するアルキル部位をいう。かかる置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、(カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルのごとき)カルボニル、(チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートのごとき)チオカルボニル、アルコキシ、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロサイクル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部位を含むことができる。炭化水素鎖上で置換された基はそれ自体置換され得ることは当業者によって理解されるべきである。例えば、置換アルキルの置換基はアミノ、アジド、イミノ、アミド、(ホスホネートおよびホスフィネートを含めた)ホスホリル、(スルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含めた)スルホニル、シリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、(ケトン、アルデヒド、カルボキシレートおよびエステルを含めた)カルボニル、−CF3−、−CN等の置換または非置換形態を含むことができる。例示的置換アルキルは後記する。シクロアルキルは、さらに、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル−置換アルキル、−CF3、−CN等で置換することができる。
【0082】
本明細書で使用される用語「アラルキル」とは、アリール基で置換されたアルキル基(例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基)をいう。
【0083】
用語「アルケニル」および「アルキニル」とは、前記アルキルに対して長さおよび可能な置換が類似した不飽和脂肪族基をいうが、それは、各々、少なくとも1つの二重結合または三重結合を含有する。
【0084】
炭素の数を特定しない限り、本明細書で使用する「低級アルキル」とは前記したが、その骨格構造中に1ないし10個の、より好ましくは1ないし6個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は同様の鎖長さを有する。出願を通じ、好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい具体例において、ここにアルキルとして指名した置換基は低級アルキルである。
【0085】
本明細書で用いる用語「アリール」は、0ないし4個のヘテロ原子、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジン等を含むことができる5−、6−および7−員の単一環芳香族を含む。環構造中にヘテロ原子を有するアリール基は「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」をいうことができる。芳香族環は前記したごとき置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族またはヘテロ芳香族部位、−CF3、−CN等で1以上の環位置で置換することができる。また、用語「アリール」は、2以上の炭素が2つの隣接する環に共通し(該環は「縮合環」である)、ここに、環の少なくとも1つが芳香族であり、例えば、他の環状環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび/または複素環であり得る、2以上の環状環を有する多環系を含む。
【0086】
略語Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Msは、各々、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ナノフルオロブタンスルホニル、p−トルエンスルホニルおよびメタンスルホニルを表す。当業者の有機化学によって利用された略語のより包括的リストは、Journal of Organic Chemistryの各巻の最初の論点に出現し、このリストは典型的にはStandard List of Abbreviationsと題された表に提示される。該リストに含まれた略語、および当業者の有機化学によって利用される全ての略語は引用して一体化させる。
【0087】
用語「複素環」または「複素環基」とは、その環構造が1ないし4個のヘテロ原子を含む3−ないし10−員の環構造、より好ましくは3−ないし7−員の環をいう。複素環はまた多環でありうる。複素環基は、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、インダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルザリン、フェノトリアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキサラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンおよびピロリジノンのごときラクタム、スルタン等を含む。複素環は前記したごとき置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホラン、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族もしくはヘテロ芳香族部位、−CF3、−CN等で1以上の位置で置換することができる。
【0088】
用語「多環」または「多環基」とは、2以上の炭素は2つの隣接する環に共通の、例えば、該環は「縮合した環」である2以上の環(例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび/または複素環)をいう。非隣接原子を通じて接合した環は「架橋」環という。多環の環の各々は前記したごとき置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族もしくはヘテロ芳香族部位、−CF3、−CN等のごとき置換基で置換することができる。
【0089】
本明細書で用いる用語「炭素環」とは、環の各原子が炭素である芳香族または非芳香族環をいう。
【0090】
本明細書で用いる用語「ニトロ」とは、−NO2を意味し、用語「ハロゲン」とは−F、−Cl、−Brまたは−Iをいい;用語「スルフヒドリル」は−SHを意味する;用語「ヒドロキシル」は−OHを意味する;および用語「スルホニル」は−SO2−を意味する。
【0091】
用語「アミン」および「アミノ」とは当該分野で認められており、非置換および置換アミン、例えば、一般式:
【化9】
[式中、R9、R10およびR’10は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、−(CH2)m−R8、あるいはR9およびR10はそれらが結合しているN原子と一緒になって環構造中に4ないし8個の原子を有する複素環を完成し;R8はシクロアルキル、シクロアルケニル、複素環または多環を表し;mは0または1ないし8の整数である]
によって表すことができる部位を共にいう。好ましい具体例において、R9およびR10の1つはカルボニルであり、例えば、R9、R10および窒素は一緒になってイミドを形成しない。より好ましい具体例において、R9およびR10(および所望によりR’10)は、各々、独立して、水素、アルキル、アルケニル、または−(CH2)m−R8を表す。かくして、本明細書で用いる用語「アルキルアミン」とは、それに結合した置換または非置換アルキルを有する前記定義のアミン基を意味し、すなわち、R9およびR10の少なくとも1つはアルキル基である。
【0092】
用語「アシルアミノ」とは当該分野で認識されており、一般式:
【化10】
[式中、R9は前記定義に同じであり、R’11は水素、アルキル、アルケニルまたは−(CH2)m−R8を表し、ここに、R8は前記定義に同じである]
によって表すことができる部位をいう。
【0093】
用語「アミド」とはアミノ−置換カルボニルとして認識されており、一般式:
【化11】
[式中、R9、R10は前記定義に同じである]
によって表すことができる部位を含む。
【0094】
アミドの好ましい具体例は不安定であり得るイミドは含まない。
【0095】
用語「アルキルチオ」とは、それに結合した硫黄基を有する前記定義のアルキル基をいう。好ましい具体例において、「アルキルチオ」部位は−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、および−S−(CH2)m−R8のうちの1つによって表され、mおよびR8は前記定義に同じである。代表的なアルキルチオ基はメチルチオ、エチルチオ等を含む。
【0096】
用語「カルボニル」とは当該分野で認められており、一般式:
【化12】
[式中、Xは結合であるか、あるいは酸素または硫黄を表し、R11は水素、アルキル、アルケニル、−(CH2)m−R8またはその医薬上許容される塩を表し、R’11は水素、アルキル、アルケニルまたは−(CH2)m−R8を表し、ここに、mおよびR8は前記定義に同じである]
によって表すことができる部位を含む。Xが酸素であって、R11またはR’11が水素ではない場合、該式は「エステル」を表す。Xが酸素であって、R11が前記定義に同じである場合、該部位はここではカルボキシル基として表され、特にR11が水素である場合、該式は「カルボン酸」を表す。Xが酸素であってR’11が水素である場合、該式は「ホルマート」を表す。一般に、前記式の酸素原子が硫黄によって置き換えられる場合、該式は「チオールカルボニル」基を表す。Xが硫黄であって、R11またはR’11が水素でない場合、該式は「チオエステル」を表す。Xが硫黄であってR11が水素である場合、該式は「チオカルボン酸」を表す。Xが硫黄であってR11’が水素である場合、該式は「チオホルメート」を表す。他方、Xが結合であってR11が水素ではない場合、前記式は「ケトン」基を表す。Xが結合であって、R11が水素である場合、前記式は「アルデヒド」基を表す。
【0097】
本明細書で用いる用語「アルコキシル」または「アルコキシ」とは、それに結合した酸素基を有する、前記定義の、アルキル基をいう。代表的なアルコキシル基はメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、tert−ブトキシ等を含む。「エーテル」は酸素によって共有結合した2つの炭化水素である。従って、そのアルキルをエーテルとするアルキルの置換基は、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、−O−(CH2)m−R8のうちの1つによって表すことができ、mおよびR8は前記記載の通りである。
【0098】
用語「スルホネート」は当該分野で認められており、一般式:
【化13】
[式中、R41は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル、またはアリールである]
によって表すことができる部位を含む。
【0099】
用語トリフリル、トシル、メシル、およびノナフリルは当該分野で認められており、各々、トリフルオロメタンスルホニル、p−トルエンスルホニル、メタンスルホニル、およびノナフルオロブタンスルホニル基をいう。用語トリフレート、トシレート、メシレートおよびノナフレートは当該分野で認められており、各々、トリフルオロメタンスルホネートエステル、p−トルエンスルホネートエステル、メタンスルホネートエステル、およびノナフルオロブタンスルホネートエステル官能基および該基を含有する分子をいう。
【0100】
用語「スルフェート」は当該分野で認められており、一般式:
【化14】
[式中、R41は前記定義に同じである]
によって表すことができる部位を含む。
【0101】
用語「スルホンアミド」は当該分野で認められており、一般式:
【化15】
[式中、R9およびR’11は前記定義に同じである]
によって表すことができる部位を含む。
【0102】
用語「スルファモイル」は当該分野で認められており、一般式:
【化16】
[式中、R9およびR10は前記定義に同じである]
によって表すことができる部位を含む。
【0103】
本明細書で用いる用語「スルホキシド」または「スルフィニル」は当該分野で認められており、一般式:
【化17】
[式中、R44は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環、アラルキル、またはアリールよりなる群から選択される]
によって表すことができる部位を含む。
【0104】
「ホスホリル」は、一般式:
【化18】
[式中、Q1はSまたはOを表し、R46は水素、低級アルキルまたはアリールを表す]
によって表すことができる。例えば、アルキルを置換するのに使用する場合、ホスホリルアルキルのホスホリル基は一般式:
【化19】
[式中、Q1はSまたはOを表し、各R46は、独立して、水素、低級アルキルまたはアリールを表し、Q2はO、SまたはNを表す。Q1がSである場合、ホスホリル基は「ホスホロチオエート」である]によって表すことができる。
【0105】
「ホスホルアミダイト」は一般式:
【化20】
[式中、R9およびR10は前記定義に同じであり、Q2はO、SまたはNを表す]
によって表すことができる。
【0106】
「ホスホルアミダイト」は一般式:
【化21】
[式中、R9およびR10は前記定義に同じであり、Q2はO、SまたはNを表し、R48は低級アルキルまたはアリールを表し、Q2はO、SまたはNを表す]
によって表すことができる。
【0107】
「セレノアルキル」とはそれに結合した置換されたセレノ基を有するアルキル基をいう。アルキル上で置換することができる例示的「セレノエーテル」は、−Se−アルキル、−Se−アルケニル、−Se−アルキニル、および−Se−(CH2)m−R8のうちの1つから選択され、mおよびR8は前記定義に同じである。
【0108】
類似の置換をアルケニルおよびアルキニル基になして、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル−置換アルケニルまたはアルキニルを生じさせることができる。
【0109】
本明細書で用いるごとく、各表現、例えば、アルキル、m、n等の定義は、それがいずれかの構造において一回を超えて起こる場合、同一構造の他の箇所におけるその定義とは独立することを意図する。
【0110】
本発明のある種の化合物は特定の幾何学的または立体異性体形態で存在することができる。本発明で、本発明の範囲内に入るシス−およびトランス−異性体、R−およびS−エナンチオマー、ジアステレオマー、(D)−異性体、(L)−異性体、そのラセミ混合物、およびその他の混合物を含めた全てのかかる化合物が考えられる。さらなる不斉炭素原子がアルキル基のごとき置換基に存在することができる。全てのかかる異性体、ならびにその混合物は、本発明に含まれることを意図する。
【0111】
もし、例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望ならば、それは、不斉合成によって、あるいはキラル補助体での誘導によって調製することができ、ここに、得られたジアステレオマー混合物は分離され、補助基を切断して純粋な所望のエナンチオマーを供することができる。別法として、分子がアミノのごとき塩基性官能基、またはカルボキシルのごとき酸性官能基を含有する場合、ジアステレオマー塩は適当な光学活性酸もしくは塩基とで形成され、続いて、当該分野でよく知られた分別結晶化またはクロマトグラフィー手段、および純粋なエナンチオマーの引き続いての回収によってかく形成されたジアステレオマーを分解する。
【0112】
前記した化合物の考えられる同等物は、それに対応し、その同一一般的特性(例えば、ヘッジホッグシグナリングを阻害する能力)を有する化合物を含み、ここに、置換基の1以上の単純な変形がなされ、これは、化合物の効率に悪影響しない。一般に、本発明の化合物は、容易に入手できる出発物質、試薬および通常の合成手法を用い、例えば、後記するごとき一般的反応スキームで説明されている方法によって、あるいはその修飾法によって調製することができる。これらの反応において、自体公知であるが、ここに言及しない変異体を利用することも可能である。
【0113】
「置換」または「で置換された」は、かかる置換が置換された原子の許容される原子価に従っていること、および置換の結果、例えば、転位、環化、脱離等のごとき変換を同時に受けない安定な化合物がもたらされる黙示的但し書きを含む。
【0114】
本明細書で用いるごとく、用語「置換された」とは、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが考えられる。広い態様において、許容される置換基は有機化合物の非環状および環状の、分岐状および非分岐状の、炭素環および複素環、芳香族および非芳香族置換基を含む。例示的置換基は、例えば、前記されているものを含む。許容される置換基は適当な有機化合物につき1以上であり、同一または異なり得る。本発明の目的では、窒素のごときヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満足するここに記載された有機化合物の水素置換基および/またはいずれかの許容される置換基を有し得る。本発明は、有機化合物の許容される置換基によっていずれかの様式で限定されることを意図しない。
【0115】
本発明の目的では、化学元素は元素の周期律表、CASバージョン、Handbook of Chemistry and Physics, 67版, 1986−87、内表紙と同一である。また、本発明の目的では、用語「炭化水素」とは、少なくとも1つの水素および1つの炭素原子を有する全ての許容される化合物を含むと考えられる。広い態様において、許容される炭化水素は、置換されたまたは非置換であり得る非環状および環状の、分岐状および非分岐状の、炭素環および複素環の、芳香族および非芳香族化合物を含む。
【0116】
本明細書で用いるフレーズ「保護基」は、望まない化学的変換からの潜在的反応性官能基を保護する一時的置換基を意味する。かかる保護基の例は、各々、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、およびアルテヒドおよびケトンのアセタールおよびケタールを含む。保護基化学の分野はレビューされている(Greene, T.W; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Syntheis, 第2版;Wiley:New York,1991)。
【0117】
当業者の有機化学によって利用された略語の多くのリストはJournal of Organic Chemistryの各巻の最初の論点に出現し;このリストはStandard List of Abbreviationsと題された表に典型的には提示されている。該リストに含まれた略語、および当業者の有機化学によって利用される全ての略語はここに引用して一体化させる。
【0118】
用語「ED50」とは、その最大応答または効果の50%を生じる薬物の用量を意味する。あるいは、テスト主題または調製物の50%において予備決定された応答を生じる用量。
【0119】
用語「LD50」はテスト主題の50%で致死的である薬物の用量を意味する。
【0120】
用語「治療指標」とは、LD50/ED50として定義される薬物の治療指標をいう。
【0121】
本明細書で用いるごとく、「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー」とは、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、プロゲステロン、エステロゲン、エステロゲン−関連の、ビタミンD3、チロイド、v−erb−A、レチノイン酸およびE75(ショウジョウバエ)受容体よりなる関連受容体のクラスをいう。本明細書で用いるごとく、「ステロイドホルモン受容体」とは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー内のメンバーをいう。高等生物において、核ホルモン受容体スーパーファミリーは、その各々がステロイド、チロイドホルモン(T3)またはレチノイン酸(RA)のごときリガンドに結合することによって活性化される亜鉛フィンガー転写因子をコードするほぼ1ダースの区別される遺伝子を含む。
【0122】
III.本発明の例示的化合物
さらに後記するごとく、主題の方法は種々の異なるステロイドアルカロイド、ならびに、例えば、本明細書に記載されるかかる薬物スクリーニングアッセイによって容易に同定できる、非ステロイド小分子を用いて行うことができる。前記にも拘わらず、好ましい具体例においては、本発明の方法および組成物は、ステロイドアルカロイド環系を有する化合物を利用する。ステロイドアルカロイドはかなり複雑な窒素含有核を有する。主題の方法で使用されるステロイドアルカロイドの2つの例示的クラスはソラナム(Solanum)タイプおよびベラトラム(Veratrum)タイプである。
【0123】
Veraturm spp.の植物中で生じるベラトラミン、シクロパミン、シクロポジン、ジェルビン、およびムルダミンを含めた50を超える天然に生じるベラトラムアルカロイドがある。Zigadenus spp.のdeath camas(リシリソウ)もまたジガシンを含めたステロイドアルカロイドのいくつかのベラトラム−タイプを生じる。一般に、ベラトラムアルカロイドの多く(例えば、ジェルビン、シクロパミンおよびシクロポジン)はフランピペリジンにスピロ結合した修飾されたステロイド骨格よりなる。典型的なベラトラム−タイプのアルカロイドは:
【化22】
によって表すことができる。
【0124】
ソラナムタイプの例はソラニジンである。ステロイドアルカロイドは、ジャガイモで見いだされる2つの重要なグリコアルカロイド、ソラニンおよびチャコニンのための核(例えば、アグリコン)である。種々のナス、フユサンゴおよびトマトを含めたナス科における他の植物もまたソラナム−タイプのグリコアルカロイドを含有する。グリコアルカロイドはアルカロイドのグリコシドである。典型的なソラナム−タイプのアルカロイドは:
【化23】
によって表すことができる。
【0125】
これらの構造、および構造のいくつかの操作によってある種の望まない副作用が減少することができる可能性に基づいて、広い範囲のステロイドアルカロイドが主題の方法で使用される可能なヘッジホッグアンタゴニストとして考えられる。例えば、主題の方法で有用な化合物は、一般式(I)またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化24】
式中、原子価および安定性が許容するごとく、
R2、R3、R4およびR5は、各々が結合した環に対する1以上の置換基を表し、各出現につき、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキシル、=O、=S、アルコキシ、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、アンヒドリド、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または−(CH2)m−R8を表し;
R6、R7およびR’7は存在しないか、あるいは独立して、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、ヒドロキシル、=O、=S、アルコキシ、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、アンヒドリド、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または−(CH2)m−R8を表し、
R6およびR7、またはR7およびR’7は一緒になって、例えば、置換されているまたは置換されていない環または多環を形成し、
但し、R6、R7、またはR’7のうちの少なくとも1つは存在し、第一級もしくは第二級アミンを含み、
R8はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環を表し、および
mは包括的に0ないし8の範囲の整数である
によって表されるステロイドアルカロイドを含む。
【0126】
好ましい具体例において、
R2およびR3は、各出現につき、−OH、アルキル、−O−アルキル、−C(O)−アルキル、または−C(O)−R8であり;
R4は、各出現につき、存在しないか、あるいは−OH、=O、アルキル、−O−アルキル、−C(O)−アルキル、または−C(O)−R8を表し;
R6、R7、およびR’7は、各々、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミン、イミン、アミド、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、エーテル、チオエーテル、エステル、または−(CH2)m−R8を表し、または
R7およびR’7は一緒になってペルヒドロフロ[3,2−b]ピリジン、ピラノピペリジン、キノリン、インドール、ピラノピロール、ナフチリジン、チオフラノピペリジン、またはチオピラノピペリジンのごときフラノピペリジンを形成し、
但し、R6、R7、またはR’7のうち少なくとも1つは存在し、第一級アミンまたは第二級アミンを含み、
R8はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環であり、好ましくは、R8はピペリジン、ピリミジン、モルホリン、チオモルホリン、ピリダジンを表す。
【0127】
ある好ましい具体例において、前記で概説した定義は、および主題の化合物は一般式Iaまたはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化25】
によって表される。
【0128】
好ましい具体例において、主題のヘッジホッグアンタゴニストは以下の一般式(II)のうちの1つで表されるステロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体によって表すことができる。
【0129】
【化26】
[式中、R2、R3、R4、R5、R6、R7、およびR’7は前記定義に同じであって、XはOまたはSを表すが、好ましくはOを表す]
ある好ましい具体例において、前記で概説した定義が適用され、主題の化合物は、一般式(IIa)、またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体によって表される。
【0130】
【化27】
ある具体例において、主題のヘッジホッグアンタゴニストは、一般式(III)またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化28】
[式中、R2、R3、R4、R5およびR8は前記定義に同じであり;
AおよびBは単環または多環基を表し;
Tは1−10結合長さのアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、エステル、アミド、エーテルまたはアミン結合を表し;
T’は存在しないか、あるいは1−3結合長さのアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、エステル、アミド、エーテルまたはアミド結合を表し、ここにもしTおよびT’が一緒に存在すれば、TおよびT’は環AまたはBと一緒になって5−8環原子の共有結合閉環を形成し;
R9は環AまたはBに対する1以上の置換基を表し、これは、各出現につき、独立して、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキシル、=O、=S、アルコキシ、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、アルデヒド、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または−(CH2)m−R8を表し;および
nおよびmは、独立して、0、1または2を表し;
但し、AおよびR9、またはT、T’、BおよびR9は一緒になって少なくとも1個の第一級または第二級アミンを含む]
によって表される。
【0131】
ある好ましい具体例において、前記で概説した定義が適用され、主題の化合物は一般式IIIaまたはその不飽和形態および/またはセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化29】
によって表される。
【0132】
例えば、主題の方法は、例えば、一般式(IV)またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化30】
[式中、R2、R3、R4、R5およびR6は前記定義に同じであり、
R22は存在しないか、あるいはアルキル、アルコキシルまたは−OHを表す]
によって表すことができる、ベラトラム−タイプのステロイドアルカロイドのジェルビン、シクロパミン、シクロポジン、ムキアミンまたはベラトラミンに基づいてヘッジホッグアンタゴニストを利用することができる。
【0133】
ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は、一般式IVaまたはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化31】
によって表される。
【0134】
なおより好ましい具体例において、主題のアンタゴニストは、一般式(V)またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化32】
[式中、R2、R3、R4、R6およびR9は前記定義に同じである]
によって表される。
【0135】
ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は、一般式Vaまたはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化33】
によって表される。
【0136】
もう1つのクラスのヘッジホッグアンタゴニストは、例えば、一般式(VI)またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化34】
[式中、R2、R3、R4、R5およびR9は前記定義に同じ]
で表されるベルティシンおよびジガシンに似たベラトラム−タイプのステロイドアルカロイドに基づくことができる。
【0137】
ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は一般式VIaまたはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化35】
によって表される。
【0138】
さらにもう1つのクラスの可能なヘッジホッグアンタゴニストは、一般式(VII)またはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化36】
[式中、R2、R3、R4、R5およびR9は前記定義に同じ]
で表さすことができるソラナム−タイプのステロイドアルカロイド、例えば、ソラニジンに基づくことができる。
【0139】
ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は一般式VIIaまたはその不飽和形態および/またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体:
【化37】
によって表される。
【0140】
ある具体例において、主題のアンタゴニストはヘッジホッグ経路についてのその選択性に基づいて選択することができる。この選択性は、(テストステロンまたはエストロゲン媒介活性のごとき)ヘッジホッグ経路−対−他のステロイド−媒介経路のためであり得、ならびに特定のヘッジホッグ経路のための選択性、例えばヘッジホッグ(例えば、Shh、Ihh、Dhh)またはpatched受容体(例えば、ptc−1、ptc−2)に特異的なそのイソタイプであり得る。例えば、主題の方法は、それらの活性がptc関連シグナリングと無関係である限り、アルドステロン、アンドロスタン、アンドロステン、アンドロステンジオン、アンドロステロン、コレカルシフェロール、コレスタン、コール酸、コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾール酢酸、コルチゾン、コルチゾン酢酸、デオキシコルチコステロン、ジギトキシゲニン、エゴカルシフェロール、エルゴステロール、エストラジオール−17−α、エストラジオール−17−β、エストリオール、エストラン、エストロン、ヒドロコルチゾン、ラノステロール、リソコール酸、メストラノール、β−メタゾン、プロドニソン、プレグナン、プレゲノロン、プロゲステロン、スピロノラクトン、テストステロン、トリアムシノロンおよびその誘導体のごときステロイドの生物活性と実質的に干渉しないステロイドアルカロイドを使用することができる。
【0141】
1つの具体例において、本発明で使用される主題のステロイドアルカロイドは、1μMより大の、より好ましくは1μMより大の核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーについてのkdを有し、例えば、それはエストロゲン、テストステロン受容体等に結合しない。好ましくは、主題のヘッジホッグアンタゴニストは(例えば、1ng−1g/kgの範囲の)生理学的濃度のエストロゲン活性、例えば、1mMを超えるED50を有しない。
【0142】
このようにして、ステロイドアルカロイドのある種のメンバーと関連し得る不都合な副作用を減少させることができる。例えば、本明細書に記載された薬物スクリーニングアッセイを用い、ステロイドアルカロイドに対する組合せおよび医学化学の適用は、個人変化、短縮された寿命、心血管病および血管閉塞、器官毒性、高血糖症および糖尿病、クッシュノイド特徴、「消耗性」症候群、ステロイド緑内障、高血圧、消化性潰瘍、および感染に対する増大した罹患性を含めた望まない陰性副作用を減少させるための手段を提供する。ある具体例では、例えば、***形成を選択的に阻害するための主題の方法の使用において、ジェルビンに対して奇形発生活性を低下させるのが便宜であろう。
【0143】
好ましい具体例において、主題のアンタゴニストはスピロソラン、トマチジン、ジェルビン等以外のステロイドアルカロイドである。
【0144】
ある好ましい具体例において、主題の阻害剤は1mM以下の、より好ましくは1μM以下の、なおより好ましくは1nM以下のED50でもってヘッジホッグシグナル伝達経路を阻害する。
【0145】
ある具体例において、主題の阻害剤は1mM以下の、より好ましくは1μM以下の、なおより好ましくは1nM以下のED50でもってヘッジホッグシグナル伝達経路を阻害する。
【0146】
特別の具体例において、ステロイドアルカロイドは、それが次のものよりも1つのヘッジホッグイソ形態につきより選択的である、例えば、もう1つのものよりも1つのヘッジホッグ経路(Shh、Ihh、Dhh)につき10倍、より好ましくは少なくとも100または1000倍選択的であるゆえに選択される。同様に、ステロイドアルカロイドは、それが次のものよりも1つのpatchedイソ形態につきより選択的である、例えば、もう1つのものよりも1つのpatched経路(ptc−1、ptc−2)につき10倍、より好ましくは少なくとも100倍または1000倍より選択的であるゆえに選択することができる。
【0147】
IV.方法および組成物の例示的適用
本発明のもう1つの態様は、ヘッジホッグ蛋白質に応答する、あるいは主題の方法に従ってヘッジホッグアンタゴニストと細胞とを接触させることによってヘッジホッグシグナリング経路の異常活性化を含む表現型を有し、状況が許すことができる細胞の分化状態、生存および/または増殖を変調する方法に関する。例えば、脊椎動物における分化した組織の秩序立った空間的配置の形成におけるヘッジホッグ蛋白質の見かけ上広い関与の本知見に照らして、主題の方法はイン・ビトロおよびイン・ビボ双方で異なる脊椎動物組織のアレイを発生する。および/または維持するプロセスの一部として使用することができる。所与の組織の増殖または分化に関して誘導性であるかまたは抗−誘導性であるかを問わず、ヘッジホッグアンタゴニストは、適当には、ベラトラム−タイプのアルカロイドおよびソラヌム−タイプのアルカロイドを含めた、前記調製物のいずれかであり得る。
【0148】
例えば、本発明の方法は、細胞培養技術に適用することができる。イン・ビトロニューロン培養系は神経発生の研究、ならびに神経成長因子(NGF)、線毛栄養因子(CNTF)、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のごとき神経栄養因子の同定のための基本的かつ必須のツールであることが判明した。一旦ニューロン細胞が末端まで分化すれば、それは、典型的には、もう1つの末端まで分化した細胞タイプまで変化しないであろう。しかしながら、ニューロン細胞はそれにも拘わらずその分化状態を容易に喪失できる。これは、それらが成体組織から培養中で増殖した場合、およびそれらが再生の間に芽体を形成する場合に通常に観察される。本発明の方法は、分化の種々の段階にニューロン細胞を維持するための適当に制限された環境を確保するための手段を提供し、例えば、他の栄養因子の特異的活性をテストするように設計された細胞培養で使用することができる。主題の方法のかかる具体例において、培養された細胞は本発明のヘッジホッグアゴニストと接触させて、培養中のニューロン幹細胞の増殖速度を変化させおよび/または分化の速度を変化させることができ、あるいは分化の喪失を防止することによって末端まで分化したニューロン細胞の培養の一体性を維持することができる。例示的具体例において、主題の方法を用いて、例えば、感覚ニューロン、あるいは運動ニューロンを培養することができる。かかるニューロン培養は便宜なアッセイ系として、ならびに治療的処置について移植可能な細胞の源として使用することができる。例えば、ヘッジホッグポリペプチドは米国特許第5,318,907号等に記載された嗅覚ニューロン培養を確立し維持するのに有用である。
【0149】
本発明によると、非常に多数の非腫瘍形成神経原細胞はイン・ビトロで永続させることができ、増殖および/または分化の速度は本発明のヘッジホッグアンタゴニストとの接触によって変化させられる。一般に、動物から神経原細胞を単離し、好ましくは成長因子の存在下でそれらの細胞をイン・ビトロまたはイン・ビボで永続させ、該細胞をヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによってこれらの細胞の特定の神経表現型、例えば、ニューロンおよび膠細胞への分化を調製する工程を含む方法が提供される。
【0150】
原細胞は、分子が要求されるまで、先祖を抑制された状態に維持する緊張性阻害性影響の下にあると考えられる。しかしながら、末端まで分化し、従って、非***性であるニューロンとは異なり、これらの細胞が増殖するのを可能とする最近の技術が提供された。それらは無制限に生産でき、神経変性病を持つ異種および自己宿主への移植に高度に適している。
【0151】
「先祖」とは、制限なくして特定の条件下で***することができるオリゴ能および多能性幹細胞を意味し、ニューロンおよび膠細胞へのごとき末端まで分化する娘細胞を生産することができる。これらの細胞は異種および自己宿主への移植に使用することができる。異種とは、原細胞が元来由来した動物以外の宿主を意味する。自己とは、細胞が元来由来する同一の宿主を意味する。
【0152】
細胞はいずれかの動物からの胚性、誕生後、若いまたは成体神経組織から得ることができる。動物とは、神経組織を含有する多細胞動物を意味する。より詳細には、それは魚類、爬虫類、鳥類、両生類または哺乳動物等を意味する。最も好ましいドナーは哺乳動物、特にマウスおよびヒトである。
【0153】
異種ドナー細胞の場合において、動物を安楽死させ、滅菌手法を用いて脳および注目する特異的領域を摘出する。特に注目する脳領域は、宿主の脳の変性領域に対する機能を回復するように働く原細胞が得ることができるいずれの領域も含む。これらの領域は、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、脊髄および心室組織を含めた中枢神経系(CNS)の領域、頸動脈小体および副腎髄質を含めた末梢神経系(PNS)の領域を含む。より詳細には、これらの領域は基底核における領域、好ましくは尾状核および被殻よりなる線条、または淡蒼球のごとき種々の細胞群、視床下部核、アルツハイマー病患者において変性していることが見いだされた基底核、またはパーキンソン病患者で変性していることが見いだされた黒質緻密部を含む。
【0154】
ヒト異種神経原細胞は堕胎から得られた胎児組織、または誕生後、若年または成体器官ドナーに由来することができる。自己神経組織はバイオプシーによって、または特に癲癇外科手術の間に、より特別には一時的ロベクトミーおよび海馬切開の間に神経組織が摘出される神経手術を受ける患者から得ることができる。
【0155】
細胞は組織の結合する細胞外マトリックスからの個々の細胞の解離によってドナー組織から得ることができる。解離は、トリプシン、コラゲナーゼ等のごとき酵素での処理を含めたいずれかの公知の手法を用いて、または平滑器具でのごとき解離の物理的方法を用いることによって得ることができる。胎児細胞の解離は組織培養培地で行うことができ、他方、若年および成体細胞の解離用の好ましい培地は人工大脳脊髄流体(aCSF)である。正規aCSFは124mM NaCl、5mM KCl、1.3mM MgCl2、2mM CaCl2、26mM NaHCO3、および10mM D−グルコースを含有する。低Ca2+ aCSFは3.2mMの濃度のMgCl2および0.1mMの濃度のCaCl2を除いて同一成分を含有する。
【0156】
解離した細胞は、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルおよびトランスフェリンのごとき有用な蛋白質のような細胞代謝に必要な補足物を含有する、MEM、DMEM、RPMI、F−12等を含めた細胞増殖を支持することができるいずれかの公知の培養培地に入れることができる。培地は、酵母、細菌およびペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等のごとき菌類での汚染を防ぐための抗生物質を含有することができる。いくつかの場合において、培地はウシ、ウマ、ニワトリ等に由来する血清を含有することができる。特に好ましい細胞用培地はDMEMおよびF−12の混合物である。
【0157】
培養条件は生理学的条件に近くあるべきである。培養培地のpHは生理学的pH、好ましくはpH6−8、より好ましくはpH7近く、なおさらに特別には約pH7.4であるべきである。細胞は生理学的温度、好ましくは30℃−40℃の間、より好ましくは32℃−38℃の間、最も好ましくは35℃−37℃の間近くの温度で培養すべきである。
【0158】
細胞は懸濁液または固定化基質の上で増殖することができるが、先祖の増殖が懸濁液中で好ましくは行って、「神経球」の形成によって非常に多数の細胞を生じる(例えば、Reynoldsら(1992) Science 255:1070−1709;およびPCT公開 WO93/01275、WO94/09119、WO94/10292、およびWO94/6718参照)。懸濁液細胞の増殖(または***)の場合において、フラスコをよく震盪し、神経球をフラスコの底部中央に沈降させる。次いで、球を50ml遠心管に移し、低速で遠心する。培地を吸引し、細胞を少量の成長因子を含む培地に再懸濁させ、細胞を機械的に解離させ、培地の別のアリコットに再懸濁させた。
【0159】
培養培地中の細胞懸濁液に、先祖の増殖を可能とするいずれかの成長因子を補足し、好ましくは培養フラスコまたはローラーボトル中で前記したが細胞を維持できるいずれかの容器に接種する。細胞は、典型的には、37℃のインキュベーター中で3−4日間増殖し、増殖は、細胞の解離および成長因子を含有する新鮮な培地中への再懸濁によってその後のいずれかの時点で再開することができる。
【0160】
培養基の不存在下で、細胞はフラスコの床から浮き上がり、懸濁液中で増殖を続け、未分化細胞の中空球を形成する。イン・ビトロでのほぼ3−10日後、ゆるやかな遠心および成長因子を含有する培地への再懸濁によって、増殖クラスター(神経球)を2−7日毎に、より特別には2−4日毎に養分を供給される。
【0161】
イン・ビトロでの6−7日後、神経球中の個々の細胞を、平滑器具での神経球の物理的解離によって、より特別には神経球をピペットでトリチュレートすることによって分離することができる。解離された神経球からの単細胞を成長因子を含有する培養培地に懸濁させ、細胞の分化を、ヘッジホッグアンタゴニストの不存在下で細胞を平板培養(または再懸濁)させることによって培養中で制御することができる。
【0162】
主題のヘッジホッグアンタゴニストの他の使用を説明するためには、大脳内グラフティングが中枢神経系療法へのさらなるアプローチとして出現した。例えば、損傷した脳組織を修復する1つのアプローチは、胎児または新生児動物からの細胞の成体脳への移植を含む(Dunnettら(1987) J. Exp. Biol. 123:265−289;およびFrendら(1985) J. Neurosci. 5:603−616)。種々の脳領域からの胎児ニューロンは成体脳に首尾よく取り込むことができ、かかるグラフトは行動学的障害を軽減することができる。例えば、基底神経節へのドーパミン発射の病巣によって誘導された運動障害は、胚ドーパミン作動性ニューロンのグラフトによって予防できる。新皮質の病巣後に損傷した複雑な認識機能もまた胚皮質細胞のグラフトによって部分的に修復することができる。主題の方法を用いて、培養中の増殖状態を調節したり、あるいは胎児組織を用いる場合、特に新生児幹細胞を用いて幹細胞の分化の速度を調節することができる。
【0163】
本発明で有用な幹細胞は一般的に知られている。例えば、いくつかの神経稜細胞が同定されており、それらのいくつかは万能でおそらく神経稜細胞のかわりをしていると思われる、その他のものは感覚ニューロンのごとき細胞の1つのタイプのみを生じさせることができ、同様に明確な原細胞を表す。幹細胞のごとき培養に対する本発明で使用されるヘッジホッグアンタゴニストの役割は、中立原細胞の分化を調節し、あるいは末端まで分化したニューロン細胞となることに向けられた明確な原細胞の発育運命のさらなる制限を調節することができる。例えば、本発明の方法を用いてイン・ビトロで神経稜細胞の神経膠細胞、シュワン細胞、クロム親和性細胞、コリン作動***感神経または副交感神経ニューロン、ならびにペプチド作動性およびセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節することができる。ヘッジホッグアンタゴニストは単独で用いることができるか、あるいはニューロン原細胞の特別の分化運命をより特別に増強することができる他の神経栄養因子と組み合わせて用いることができる。
【0164】
主題のヘッジホッグアンタゴニストの存在下で培養した細胞の移植に加えて、本発明のさらにもう1つの態様は、中枢神経系および末梢神経系双方におけるニューロンおよび他のニューロン細胞の成長状態を調節するためのヘッジホッグアンタゴニストの治療的適用に関する。神経系の発生の間の、およびおそらくは成体状態におけるニューロン分化を調節するためのヘッジホッグ蛋白質の能力は、ある場合には、主題のヘッジホッグアンタゴニストが正常細胞の維持、機能的実行、および老化;化学的または機械的に傷つけられた細胞における修復および再生プロセス;およびある種の病理学的状態における変性の治療に関して成体ニューロンの制御を容易とすることが予測できる。この理解に照らして、本発明では、特に、(i)感染性/炎症性および腫瘍−誘導損傷と共に外傷損傷、化学的損傷、血管損傷および(発作に由来する虚血症のごとき)欠乏を含めた神経系に対する急性、亜急性、または慢性負傷;(ii)アルツハイマー病を含めた神経系の老化;(iii)パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮側索硬化症等、ならびに旧小脳変性などの神経系の慢性神経変性疾患;および(iv)多発性硬化症を含めた神経系の影響に由来する神経系の慢性免疫学的疾患(の重症度の予防および/または低下)の治療プロトコルへの主題の方法の適用が考えられる。主題のアンタゴニストは、ヘッジホッグアゴニストを含む療法と組み合わせて使用して、患部ニューロン細胞の増殖および/または分化のタイミングおよび速度を制御することができる。
【0165】
適当には、主題の方法は、中枢および末梢神経損傷の修復のための神経補綴を得るのに使用することもできる。特に、破砕されたまたは切断された軸索が補綴デバイスの使用によって挿管され、ヘッジホッグアゴニストおよびアンタゴニストを補綴デバイスに添加して樹状突起の成長および再生の速度を調節することができる。例示的神経ガイダンスチャンネルは米国特許第5,092,871号および第4,955,892号に記載されている。
【0166】
もう1つの具体例において、主題の方法は、中枢神経系で起こり得るように、新形成または過形成形質転換の治療で使用することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを利用してかかる形質転換細胞が***後またはアポトーシスとすることができる。従って、本発明の方法は、例えば、悪性神経膠腫、髄芽腫、神経外胚葉腫瘍、および上衣腫のための治療の一部として使用することができる。
【0167】
好ましい具体例において、主題の方法は髄芽腫および他の主要CNS悪性神経外胚葉腫瘍のための治療法の一部として使用することができる。
【0168】
ある具体例において、主題の方法は、髄芽腫のための治療プログラムの一部として使用される。主要脳腫瘍である髄芽腫は子供において最も普通の脳腫瘍である。神経外胚葉腫は後頭窩で生起する原始的神経外胚葉腫瘍である。それらは全ての小児科脳腫瘍のほぼ25%を占める(Miller)。組織学的には、それらは真のロゼットに通常配置された小さな丸い細胞腫瘍であるが、神経膠星状細胞、上衣細胞またはニューロンへのいくつかの分化を呈することができる(Rorke;Kleihues)。PNETは松果線(松果体芽腫)および大脳を含めた脳の他の領域で生起することもある。テント上の領域で生起するものは、一般に、そのPFカウンターパートよりも悪くなる。
【0169】
髄芽腫/PNETは切除後のCNSにおいて再発することが知られており、骨に転移することができる。予備処理評価は、従って、脊髄の調査を含み、「降下した転移」の可能性を排除するべきである。ガドリニウム−増強MRIはこの目的でミエログラフィーにかわって使われ、CSFサイトロジーはルーチン的手法として手術後に行われる。
【0170】
他の具体例においては、主題の方法は上衣腫のための治療プログラムの一部として使用される。上衣腫は子供における小児科脳腫瘍のほぼ10%を占める。全体的に、それらは、心室の上衣腫ライニングから生起する腫瘍であり、顕微鏡的にはロゼット、管および脈管周囲ロゼットを形成する。上衣腫で報告された51人の子供のCHOPシリーズにおいて、3/4が組織学的に良性である。第4心室の領域からほぼ2/3が生起した。1/3はテント上領域で発現した。SEERデータならびにCHOPからのデータによって示されるごとく、発現の年齢は、0才および4才の間がピークとなる。メジアン年齢は約5才である。この病気を持つかなり多くの子供は赤ん坊で、かつしばしば複数モード療法を要するからである。
【0171】
本発明のさらにもう1つの態様は、ヘッジホッグ蛋白質は、他の皮膚内パターンニング、ならびに中胚葉および内胚葉分化プロセス双方において見掛けの役割を有する、前記したごときニューロン分化に加えて、他の脊椎器官形成経路に関与する形態発生シグナルであるという当該分野における観察に関する。かくして、ヘッジホッグアンタゴニストを含む組成物は、非ニューロン組織の発生および維持に関する細胞培養および治療方法双方で利用することができることが本発明で考えられる。
【0172】
1つの具体例において、本発明は、Sonic ヘッジホッグのごときヘッジホッグ蛋白質が、原腸に由来する消化管、肝臓、肺および他の器官の形成の原因である幹細胞の発生を制御することに見かけ上関与しているという発見を利用する。Shhは皮膚内から中胚葉への誘導性シグナルとして働き、これは腸形態発生に非常に重要である。従って、例えば、本方法のヘッジホッグアンタゴニストは、正常肝臓の複数代謝機能を有することができる人工肝臓の発生および維持を調製するのに使用することができる。例示的具体例において、主題の方法を用いて、消化管幹細胞の増殖および分化を調節して肝臓細胞培養を形成することができ、これは細胞外マトリックスを集団形成させるのに使用できるか、あるいは生体適合性ポリマー中にカプセル化して、移植可能および体外人工肝臓双方を形成することができる。
【0173】
もう1つの具体例において、ヘッジホッグアゴニストの治療組成物は、かかる人工肝臓、ならびに胚肝臓構造の移植と組み合わせて利用して、腹腔内移植の摂取、血管形成、およびグラフト化肝臓組織のイン・ビボ分化および維持を調節することができる。
【0174】
さらにもう1つの具体例において、主題の方法は、物理的、化学的または病理学的傷害後にかかる器官を調節するのに治療的に使用することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを含む治療組成物は部分的肝臓切開に引き続いて肝臓修復で利用することができる。
【0175】
胚腸からの膵臓および小腸の発生は、腸の皮膚内および中胚葉の間の細胞内シグナリングに依存する。特に、腸中胚葉から平滑筋への分化は、隣接内胚葉細胞からのシグナルに依存することが提案されている。胚後腸における内胚葉に由来するシグナルの1つの候補メディエーターはSonic ヘッジホッグである。例えば、Apelqvistら(1977) Curr Biol 7:801−4参照。Shh遺伝子は胚腸内胚葉を通じて発現され、例外は、膵臓芽内胚葉であり、これはその代わりに高レベルのホメオドメイン蛋白質1pf1/Pdx1(インスリンプロモーター因子1/膵臓および十二指腸ホメオボックス1)、初期膵臓発育の必須レギュレーターを発現する。Apelqvistら、前掲、は胚腸管中のShhの分化発現が、小腸および膵臓の特殊化された中胚葉誘導体への周囲中胚葉の分化を制御するか否かを調べた。これをテストするために、彼らはIpf1/Pdx1−Shh遺伝子のプロモーターを用いて、発生する膵臓上皮細胞においてShhを選択的に発現させた。Ipf1/Pdx1−Shhトランスジェニックマウスにおいて、膵臓中胚葉は膵臓間葉および脾臓へではなく、腸に特徴的な、平滑筋およびCajalの腸細胞に発育した。また、Shhに暴露された膵臓外植片は腸分化の同様のプログラムを受けた。これらの結果は、内胚葉的に由来するShhの異なる発現が腸管の異なる領域において隣接する中胚葉の運命を制御する証拠を提供する。
【0176】
本発明の意味において、従って、主題のヘッジホッグ阻害剤を用いて、イン・ビボおよびイン・ビトロ双方において膵臓組織の増殖および/または分化を制御し調節することができる。
【0177】
本発明の阻害剤が、例えば、異常インスリン発現、または分化の変調である一般的戦略でもって、治療利点を提供することができる非常に種々の病理学的細胞増殖および分化の条件がある。しかしながら、より一般的には、本発明は細胞を主題の阻害剤に接触させることによって、分化状態を誘導しおよび/または維持し、生存を増強しおよび/または膵臓細胞の増殖に影響する方法に関する。例えば、膵臓組織の秩序だった空間的配置の形成においてヘッジホッグ蛋白質の適当な関与に徴して、主題の方法は、かかる組織をイン・ビトロおよびイン・ビボ双方で創製しおよび/または維持する技術の一部として使用することができることが本発明によって考えられる。例えば、ptcの機能の変調は、β−細胞の発生および維持に関与する細胞培養および治療方法双方において、消化管、脾臓、肺、および原腸から由来する他の器官からの組織の発育および維持を制御するにおけるごとく、恐らくは非膵臓組織のために使用することができる。
【0178】
例示的具体例において、本方法は、膵臓組織に影響する過形成および新形成障害、特に膵臓細胞の異常増殖によって特徴付けられるものの治療で使用することができる。例えば、膵臓癌は、膵臓のインスリン分泌の改変の結果となり得る膵臓細胞の異常増殖によって特徴付けられる。例えば、膵臓癌のごときある膵臓過形成はβ−細胞または減少した膵臓細胞塊の機能不全による過小インスリン血症の結果となり得る。異常ヘッジホッグシグナリングが病気進行で示され得る程度に、主題の阻害剤を用いて、抗−腫瘍治療後に組織の再生を増強することができる。
【0179】
さらに、PTCシグナルの操作の異なる時点において、イン・ビボおよびイン・ビトロ双方において膵臓組織を再形成/修復するための戦略の一部として有用であり得る。1つの具体例において、本発明は膵臓組織の発育を調節するにおいてヘッジホッグの見掛けの関与を利用する。一般的に、主題の方法は治療的に使用して、物理的、化学的または病理学的損傷後に膵臓を調節するのに治療的に使用することができる。さらにもう1つの具体例において、主題の方法は細胞培養技術に適用することができ、特に、補綴膵臓組織デバイスの初期発生を増強するのに使用することができる。例えば、ptc活性を改変することによる、膵臓組織の増殖および分化の操作は培養された組織の特徴をより注意深く制御する手段を提供することができる。例示的具体例において、主題の方法は、例えば、Aebischerらの米国特許第4,892,538号、Aebischerらの米国特許第5,106,627号、Limの米国特許第4,391,909号およびSeftonの米国特許第4,353,888号に記載されたカプセル化デバイスで使用できるごとく、β−島細胞を要する補綴デバイスの増加生産で使用することができる。膵臓島に対する初期原細胞は多機能的であり、それらが最初に出現する時点から島−特異的遺伝子の全ては見掛け上共活性である。発生が進行するにつれて、インスリンのごとき島−特異的ホルモンの発現は成熟島細胞に特徴的な発現のパターンに制限されるようになる。しかしながら、成熟島細胞の表現型は、成熟β−細胞における胚特性の再出現が観察できるごとく、培養で安定ではない。ptcシグナル伝達を改変する剤を利用することによって、分化経路に対する内因性ヘッジホッグ蛋白質の作用および細胞の増殖指標を調節することができる。
【0180】
さらに、膵臓組織の分化状態の操作は、移植、脈管形成、およびグラフト化組織のイン・ビボ分化および維持を促進するために、人工膵臓の移植と組み合わせて利用することができる。例えば、組織分化に影響するptc機能の操作はグラフト生存性を維持する手段として利用することができる。
【0181】
Bellusciら(1997) Development 125:53は、Sonic ヘッジホッグがイン・ビボで肺間葉細胞増殖を調節することを報告している。つまりこの方法は、肺組織の再生を調節する
Fujitaら(1997)(Biochem. Biophys Res Commun 238:658)は、Sonic ヘッジホッグがヒト肺偏平細胞癌および腺癌細胞で発現されることを報告した。Sonic ヘッジホッグの発現はヒト肺偏平細胞癌組織でも検出されたが、同一患者の正常肺組織では検出されなかった。また、彼らはSonic ヘッジホッグがBrduの癌細胞への取り込みを刺激し、それらの細胞増殖を刺激し、他方、抗−Shh−Nはそれらの細胞増殖を阻害したことを観察した。これらの結果は、Sonic ヘッジホッグシグナルがかかる形質転換肺組織の細胞増殖に関与し、従って、主題の方法が肺癌および腺癌、および肺上皮細胞を含む他の増殖性疾患の治療の一部として使用することができることを示す。
【0182】
本発明のさらにもう1つの具体例において、ヘッジホッグアンタゴニストを含む組成物は、骨格形成性幹細胞からのごとき骨格組織のイン・ビトロ発生、ならびに骨格組織欠陥のイン・ビボ治療で使用することができる。本発明では、特に、軟骨形成および/または骨形成の速度を調節するためのヘッジホッグアンタゴニストの使用が考えられる。「骨格組織欠陥」とは、どのように欠陥が由来しようとも、例えば、外科的介入、腫瘍の除去、潰瘍、インプラント、骨折、または他の外傷または変性疾患の結果としてを問わず、骨または結合組織を回復するのが望ましいいずれかの部位における骨または他の骨格結合組織における欠陥を意味する。
【0183】
例えば、本発明の方法は軟骨機能を結合組織に回復するための方法の一部として用いることができる。かかる方法は、例えば、関節炎の結果となるもののごとき変性疲労の結果である軟骨組織における欠陥または病巣の修復、裂かれた半月組織の置換、半月切開、裂かれた靭帯、関節の悪性による、または遺伝病による関節のゆるみのごとき、組織に対する外傷によって引き起こされ得る他の機械的障害で有用である。また、本発明の回復方法は、プラスチックまたは再構成外科手術、ならびに歯周外科手術におけるごとき軟骨マトリックスを再形成するのに有用である。本発明は、例えば、半月、靭帯、または軟骨の外科的修復に続き、従前の回復手法の改良にも適用することができる。さらに、それは、もし外傷後十分に早く適用すれば、変性病の開始または昂進を妨げることができる。
【0184】
本発明の1つの具体例において、主題の方法は、治療上十分量のヘッジホッグアンタゴニスト、特に、インディアンヘッジホッグにつき選択的なアンタゴニストで罹患結合組織を処置して、組織に埋没した軟骨細胞の分化および/または増殖の速度を管理することによって結合組織における軟骨修復応答を調節することを含む。関節軟骨、関節内軟骨(半月)、(真の肋骨および胸骨を結合する)肋骨軟骨、靭帯、および腱のごとき結合組織は、主題の方法を用いる再構成および/または再生療法における治療に特に適合する。本明細書で用いるごとく、再生療法は、組織の損傷が明白に発現される地点まで進行した変性状態の治療、ならびに変性がその最も早期段階または危急にある組織の予防的治療を含む。
【0185】
例示的具体例において、主題の方法は、臑、踝、肘、尻、手首、指または足指の中手節関節、または下顎関節のごとき、二関節の軟骨の治療での治療的介入の一部として用いることができる。該治療は関節の半月、関節の関節軟骨、または双方に向けることができる。さらに説明すると、主題の方法を用いて、外傷負傷(例えば、スポーツ負傷または過剰疲労)または骨関節炎の結果であり得るもののごとき、膝の変性障害を治療することができる。主題のアンタゴニストは、例えば、関節鏡検査針での関節への注射として投与することができる。いくつかの場合において、注射された剤は前記したヒドロゲルまたは他の徐放ビヒクルの形態として、治療された組織と剤とのより延長されたおよび正規の接触を可能とすることができる。
【0186】
本発明では、さらに、軟骨移植および補綴デバイス療法の分野での主題の方法の使用が考えられる。しかしながら、例えば、軟骨および線維軟骨の特徴は関節、半月軟骨、靭帯、および腱のごとき異なる組織の間で、同一靭帯または腱の2つの端部の間で、および組織の表層および深層部分の間で変化するゆえに問題が生じる。これらの組織の帯状配置は機械的特性における漸次の変化を反映することができ、それらの条件下で分化しなかった移植組織が適切に応答する能力を欠く場合に失敗が起こる。例えば、半月軟骨を用いて前方十字形靭帯を修復する場合、組織は純粋な繊維状組織に対する化生を受ける。軟骨形成の速度を調節することによって、主題の方法を用いて、新しい環境において移植細胞を適切に制御し、組織のより早期の発生段階の肥大性軟骨細胞に効果的に似せることを助けることによって、この問題に特別に立ち向かうことができる。
【0187】
同様に、主題の方法を、補綴軟骨デバイスの生成の増強およびその移植に適用することができる。改良された治療の必要性は、コラーゲン−グリコサミノグリカン鋳型(Stoneら(1990) Clin. Orthop Relat Red 252:129)、単離された軟骨細胞(Grandeら(1989) J. Orthop Res 7:208;およびTakigawaら(1987) Bone Miner 2:449)、および天然または合成ポリマーに付着した軟骨細胞(Walitaniら(1989) J. Bone Jt. Surg 71B:74;Vacantiら(1991) Plast Reconstr Surg 88:753;von Schroederら(1991) J. Biomed. Mater. Res. 25:329;Freed(1993) J. Biomed. Mater. Res. 27:11;およびVacantiらの米国特許第5,041,138号)に基づく新しい軟骨の創製を狙った研究を動機づけてきた。例えば、軟骨細胞はポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル、またはポリマー骨格の無害モノマーへの加水分解の関数として経時的に分解する他のポリマーのごときポリマーから形成された生分解性、生体適合性の高度に多孔性スカフォールド上での培養で増殖することができる。マトリックスは、グラフト化が起こるまで、細胞に対する適切な栄養素およびガス交換を可能とするように設計される。細胞は、適切な細胞容量および密度が移植されるべき細胞のための開発されるまでイン・ビトロで培養することができる。マトリックスの1つの利点は、最終生成物が患者自身の(例えば)耳または鼻と非常に似るか、あるいは関節におけるごとく、移植の時点における操作を可能とする柔軟なマトリックスを用いることができるように、それは個々に基づいて所望の計上に注型または成形することができる。
【0188】
主題の方法の1つの具体例において、インプラントを培養プロセスのある段階の間にヘッジホッグアンタゴニストと接触させて、培養中の軟骨細胞の分化の速度および肥大性軟骨細胞の形成を管理する。
【0189】
もう1つの具体例において、移植されたデバイスはヘッジホッグアンタゴニストで処理して、移植されたマトリックスを能動的に再形成させ、それをその意図された機能により適したものとする。組織移植に関して前記したごとく、人工移植は、マトリックスが移植された現実の機械的環境に匹敵する状況において誘導されない同一欠陥に悩む。主題の方法によってマトリックス中の軟骨細胞を調節する能力は、置き換えることが意図される組織と同様の特徴をインプラントが獲得するのを可能とすることができる。
【0190】
さらにもう1つの具体例において、主題の方法を用いて、補綴デバイスの付着を増強させる。説明すると、主題の方法を歯周補綴の移植で用いることができ、ここに、周囲の結合組織の治療は補綴の回りの歯周靭帯の形成を刺激する。
【0191】
なおさらなる具体例において、主題の方法を、動物における部位の骨の発生(骨形成)のための方法の一部として使用することができる。インディアンヘッジホッグは、骨芽細胞によって最後には置き換えられる肥大性軟骨細胞と特に会合する。例えば、本発明のヘッジホッグアンタゴニストの投与は、対象において骨喪失の速度を調節する方法の一部として使用することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを含む製剤を使用して、例えば、骨化のための「モデル」の形成で軟骨細胞の骨化を制御することができる。
【0192】
本発明のさらにもう1つの具体例において、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて***形成を調節することができる。ヘッジホッグ蛋白質、特にDhhは、睾丸生殖細胞の分化および/または増殖および維持に関与することが示されている。Dhh発現は、Sryの活性化後まもなくSertoli細胞前駆体で開始し、成体中の睾丸に執拗に存在する。成熟***の完全な不存在のため、男性は生存するが不妊である。異なる遺伝的バックグラウンドでの発生する睾丸の調査は、Dhhが***形成の初期および後期段階双方を調節することを示唆する。Bitgoodら(1996) Curr. Biol. 6:298。主題の方法は天然に生じるヘッジホッグ蛋白質の作用をブロックすることができる。好ましい具体例において、ヘッジホッグアンタゴニストは***形成に関して砂漠ヘッジホッグの生物学的活性を阻害し、避妊薬として使用することができる。同様にして、主題の方法のヘッジホッグアンタゴニストは正常卵巣機能を変調するのに有用である。
【0193】
また、主題の方法は、障害を受ける上皮組織の治療または予防に対する、ならびに化粧品用途における広い適用性を有する。一般に、該方法は、治療した上皮組織の成長状態を改変するのに効果的な量のヘッジホッグアンタゴニストを動物に投与する工程を含めることに特徴がある。投与様式および投与法は治療すべき上皮組織に依存して変化するであろう。例えば、治療された組織が皮膚または粘膜組織のごとき上皮組織である局所処方が好ましいであろう。
【0194】
「創傷治癒を促進する」方法により、類似の創傷が治療しないで治癒するよりも治療を行ったほうが早く創傷は治癒する。「創傷治癒の促進」はまた、本方法が特にケラチノサイトの増殖および/または成長を制御するか、または創傷が、瘢痕、創傷、およびコラーゲン沈着を減少させ、より広い表皮領域を治癒することを意味する。特定の例において、「創傷治癒の促進」はまた、本発明の方法と共に用いた場合、創傷治癒の特定の方法が成功率(例えば、皮膚移植片の獲得率)を改善することも意味する。
【0195】
再建外科技術の顕著な進歩にもかかわらず、瘢痕は正常な機能を回復し、治癒された皮膚が出現する上で、非常に重要な障壁であり得る。手および顔のケロイドまたは過形成性瘢痕などの病理学的瘢痕が機能的能力障害または身体の変形を引き起こした場合、これは特に当てはまる。最も重篤な環境では、このような瘢痕は心理社会的ストレスおよび経済的困窮を起こし得る。創傷治癒には、止血、炎症、増殖、およびリモデリング段階が含まれる。増殖段階には、線維芽細胞ならびに内皮細胞および上皮細胞の増殖が含まれる。本方法の使用によって、創傷内および創傷に近位の上皮細胞の増殖速度が調節され、創傷の閉鎖および/または瘢痕細胞形成の最小化が促進される。
【0196】
本発明はまた、例えば、放射線および/または化学療法による経口および口腔傍の潰瘍治療のための養生法の一部として有効であり得る。このような潰瘍は、一般に、化学療法および放射線治療後数日以内に発症する。これらの潰瘍は、通常、繊細な灰色の壊死膜に覆われ、炎症組織を取り囲んでいる小さな、有痛性の不規則な形の病変から始まる。多くの例では、治療の欠如が、炎症の基となる病変の周囲を取り囲む組織の増殖をもたらす。例えば、潰瘍に接する上皮は、通常増殖活性を示し、上皮表面の連続性の欠如をもたらす。これらの損傷は、そのサイズおよび上皮の完全性の欠如のために、身体に潜在的な二次感染を起こす傾向がある。食物および水の通常の経口接種で非常に痛みを伴い、潰瘍が消化管全体に増殖している場合、通常、下痢やその他の合併症がおこる。本発明によれば、ヘッジホッグアンタゴニストの適用を含むこのような潰瘍の治療により、患部上皮の異常な増殖および分化を減少させ、その後の炎症の重篤度の減少の一助となり得る。
【0197】
本発明の方法および組成物を使用して、皮膚病(乾癬などの自己免疫疾患由来の病変など)の原因となる創傷も治療することができる。アトピー性皮膚炎とは、花粉、食物、鱗屑、昆虫毒および植物毒などのアレルゲンを原因とする免疫応答に関与するアレルギー由来の皮膚の外傷をいう。
【0198】
他の実施形態では、ヘッジホッグアンタゴニストの抗増殖性調製物を使用して、外嚢白内障摘出手術後の合併症を防止するために水晶体上皮細胞増殖を阻害することもできる。白内障は難治性の眼病であり、白内障治療に関する種々の研究が行われている。しかし、現在、白内障治療は、外科手術によって達成されている。白内障の手術は長い間行われており、種々の手術法が試験されている。水晶体外嚢摘出法が、白内障を取り除くために選択される方法となりつつある。水晶体内嚢摘出術に対するこの技術の主な医学的利点は、無水晶体類嚢胞様黄斑浮腫および網膜剥離の発症率が低いことである。水晶体外嚢摘出術はまた、現在ほとんどの症例で選択される後眼房タイプの眼内レンズの移植にも必要とされる。
【0199】
しかし、水晶体外嚢摘出術の欠点は、後嚢混濁(しばしば続発性白内障と呼ばれる)の発症率が高いことであり、これは手術後3年以内に50%の症例で起こり得る。続発性白内障は、水晶体外嚢摘出術後に残存した水晶体の赤道部分および前部の上皮細胞の増殖により引き起こされる。これらの細胞が増殖して、ゼンメリング輪(Sommerling ring)を生じ、後嚢上に蓄積および出現する線維芽細胞とともに後嚢の混濁化を起こし、視覚を妨害する。続発性白内障の予防治療を行うことが好ましい。続発性白内障の形成を阻害するために、本発明の方法は、残存した水晶体上皮細胞の増殖を阻害する手段を提供する。例えば、このような細胞は、水晶体の除去後の前眼房にヘッジホッグのアンタゴニスト調製物を含む溶液を注入することによって静止状態の維持を誘導することができる。さらに、その溶液は、眼の前眼房に注入するとき最小有効量を得るために浸透圧のバランスを取っていくらか特異的に嚢下上皮細胞増殖を阻害することができる。
【0200】
本発明の方法は、角膜上皮細胞増殖によって特徴づけられる角膜疾患(例えば、眼表面の上皮の下方成長または扁平上皮癌などの眼上皮疾患)の治療に使用することができる。
【0201】
Levine et al.、1997、J. Neurosci.、17:6277には、ヘッジホッグタンパク質が脊椎動物の網膜における有糸***誘発および光受容体の分化を調節することができ、Ihhが網膜前駆細胞の増殖および光受容体の分化を促進するための色素上皮由来の候補因子であることが示されている。同様に、Jensen et al、1997、Development、124:363は、ソニック・ヘッジホッグタンパク質のアミノ末端フラグメントを用いた周産期のマウスの網膜細胞培養物の処理により、全細胞数ならびに杆状光受容体、アマクリン細胞、およびMullerグリア細胞におけるブロモデオキシウリジンを組み込んだ細胞の割合が増加し、これは、ソニック・ヘッジホッグが網膜前駆細胞の増殖を促進していることが示唆されるということを示した。従って、本発明の方法は、網膜細胞の増殖疾患の治療に使用して、光受容体の分化を調節することができる。
【0202】
本発明のさらに別の態様は、発毛を調節するための本発明の方法の使用に関する。毛髪は、基本的には、丈夫で不溶なタンパク質であるケラチンからなり、その強さは主にシスチンのジスルフィド結合による。各々の毛髪は、円柱状の毛幹および毛根からなり、フラスコのような皮膚の窪みである毛包を含む。毛包の下には、毛乳頭と呼ばれる指様突起物を含み、この毛乳頭はそこから発毛し、細胞に栄養分を供給する血管が通っている結合組織からなる。毛幹は、表皮から外側へ伸長している部分であるのに対して、毛根は、毛髪の埋もれた部分であると説明されている。毛根の基底には毛球が伸びており、毛乳頭の上に存在する。毛髪が産生されている細胞は、毛乳頭の毛球で成長する。細胞は、毛乳頭で増殖するにつれて繊維状に伸長する。毛髪の「成長」とは、***細胞によって毛髪線維が形成されて伸長することをいう。
【0203】
当該分野で周知のように、一般的な毛周期は、3つの段階:成長期、退行期、および休止期に分類される。活発な段階(成長期)の間、毛乳頭細胞の上皮幹細胞は迅速に***する。娘細胞が上方へ移動し、分化して毛髪自体の同心状の層を形成する。移行期である退行期は、毛乳頭中の幹細胞の有糸***の休止によって特徴付けられる。休止している段階は休止期として公知であるが、新毛がその下に出現する前の数週間頭皮内に毛髪が保持されているが、その毛包から休止期の毛幹が発毛する前段階である。このモデルから、毛髪細胞に分化する分化幹細胞のプールが大きいほどより大量の発毛が起こることが明らかになっている。従って、発毛を増加または減少させる方法は、これらの幹細胞の増殖をそれぞれ増強するか阻害することによって達成することができる。
【0204】
特定の実施形態では、本方法は、カット、シェービング、脱毛による従来の毛髪の除去とはまったく異なるヒトの毛髪の発毛を抑制する方法として使用することができる。例えば、本方法は、異常に急速で密度の高い発毛として特徴付けられる毛髪症(例えば、多毛症)の治療に使用することができる。実施形態の例として、ヘッジホッグアンタゴニストを使用して、異常な多毛で特徴づけられる男性型多毛症を取扱うことができる。本方法はまた、脱毛の継続時間を延長する方法を提供する。
【0205】
さらに、ヘッジホッグアンタゴニストは、しばしば上皮細胞に細胞傷害的というよりもむしろ細胞増殖抑制性であるので、このような因子を使用して細胞周期のS期への進行を必要とする細胞傷害性因子(例えば放射線で誘導された毛髪の死)から毛包細胞を保護する効果をねらうことができる。本方法による治療は、例えばS期に入る細胞を阻害して毛包細胞を静止させて保護することによって、毛包細胞の有糸***の失敗およびプログラム細胞死を防止することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストは、通常脱毛を起こす化学療法および放射線療法を受けた患者に使用することができる。このような治療の間の細胞周期の進行を阻害することによって、本発明の治療は細胞死プログラムの活性化の原因であるかもしれない死から毛包細胞を保護することができる。治療が完了した後、本方法も終了され、毛包細胞増殖の阻害も軽減される。
【0206】
本方法はまた、脱毛性毛包炎、網状瘢痕性紅斑性毛包炎、またはケロイド毛包炎などの毛包炎の治療に使用することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの化粧品調製物を、偽毛包炎(首の顎下領域に最も頻繁に起こる髭剃りによる慢性疾患で、埋没毛を含んだ紅斑性丘疹および膿疱病変を特徴とする)の治療に局所的に適用することができる。
【0207】
本発明の別の態様では、本方法を使用して上皮由来の組織の分化を誘導することができる。これらの分子の形態は、上皮組織を含む過形成性および/または腫瘍性疾患の治療のための分化治療の基礎を提供することができる。例えば、このような調製物は皮膚細胞の異常な増殖または成長を有する皮膚病の治療に使用することができる。
【0208】
例えば、本発明の薬学的調製物は、角化症などの過形成上皮疾患の治療ならびに種々の皮膚癌の急速な増殖によって特徴づけられる腫瘍性上皮疾患(例えば、基底細胞癌または扁平細胞癌)への治療が意図される。本方法はまた、皮膚に発症する自己免疫疾患(特に、例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎によって生じる、表皮の病的な増殖および/または角質化を含む皮膚科学的疾患)の治療に使用することができる。
【0209】
乾癬、扁平細胞癌、ケラトアカントーマ、および光線性角化症などの一般的な皮膚疾患の多くは、異常な局所的増殖および成長によって特徴づけられる。例えば、乾癬は皮膚上に増殖した鱗状で赤色のもりあがった斑であり、ケラチノサイトは正常な細胞より急速に増殖するが分化が不完全であることが公知である。
【0210】
1つの実施形態では、本発明の調製物は、炎症性成分および非炎症性成分のいずれかによって特徴づけられる皮膚細胞の異常増殖を引き起こす角化症に関連する皮膚科学的軽症の治療に適切である。例証として、静止および分化を促進するヘッジホッグアンタゴニストの治療調整物を使用して、乾癬の種々の形態(皮膚状、粘膜状、および爪状)を治療することができる。上記のように、乾癬は、典型的には、「再生」経路に従った顕著な増殖活性化および分化を示す上皮のケラチノサイトによって特徴づけられる。本方法の抗増殖的な実施形態による治療を用いて、病理学的な上皮の活性化を後退させ、疾患を継続的に軽減させるための基礎を提供することができる。
【0211】
種々の他の角化性病変もまた、本発明の方法を用いた治療の候補である。例えば、光線性の角質は、太陽光線に曝され、照射された皮膚上に生じる表皮の炎症性前悪性腫瘍である。その病変は、紅斑から種々の大きさの剥離をともなう茶色斑に変化する。現在の治療には、切除術および冷凍手術が含まれる。しかし、これらの治療には痛みを伴い、しばしば美容的に受け入れられない傷跡を残す。従って、光線性角化症などの角化症の治療には、病変の上皮/類上皮細胞の過剰増殖を阻害するのに十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト組成物の、好ましくは局所的適用が含まれ得る。
【0212】
座瘡は、本発明の方法によって治療することができるさらに別の皮膚科学的軽症の代表である。例えば、尋常性座瘡は、十代および若年成人の間で発症する最も頻繁な多因子疾患であり、顔および体幹上部の炎症性および非炎症性病変の出現として特徴づけられる。尋常性座瘡を引き起こす基本的な欠点は、極度に活発な皮脂腺の過剰な角質化である。過剰な角質化は、皮膚および毛包微生物の正常な移動を妨げ、それにより、座瘡Propinobacterium および、細菌Staphylococcus epidermidisならびに、酵母Pitrosporum ovaleによるリパーゼの放出が刺激される。抗増殖性ヘッジホッグアンタゴニストの、特に局所的調製物を用いた治療は、病変形成を誘導する管の移行性の症状(例えば、過剰な角質化)の予防に有用であり得る。本発明の治療には、例えば、抗生物質、レチノイド、および抗アンドロゲンをさらに含むことができる。
【0213】
本発明はまた、種々の形態の皮膚炎の治療法を提供する。皮膚炎は、掻痒性、紅斑性、鱗状、水疱状、啼泣性の、亀裂性、または塊状のいずれかである明確に区別することができない病変をいう用語である。これらの病変は、任意の種々の原因から生じる。最も一般的な皮膚炎のタイプは、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎およびオムツ皮膚炎である。例えば、脂漏性皮膚炎は、慢性で、通常掻痒性の、紅班性、乾燥性、湿潤性、または脂肪性の剥離および種々の領域(特に、頭皮)に過剰量の乾燥剥脱物の剥脱を伴う黄色い塊のパッチを伴う皮膚炎である。本発明の方法はまた、鬱滞性皮膚炎(しばしば慢性で、通常湿疹性の皮膚炎)の治療に使用することができる。光線性皮膚炎は、太陽光線、紫外線またはX線もしくはγ線照射などの光線照射への暴露に由来する皮膚炎である。本発明によれば、本方法は、上皮細胞の所望でない増殖から生じる特定の皮膚炎の症状の治療および/または予防に使用することができる。これらの種々の形態の皮膚炎に対する治療法には、局所的および全身的コルチコステロイド、プリン拮抗薬、および抗生物質を含むことができる。
【0214】
本発明の方法によって治療することができる軽症は、非ヒトに特異的な疾患(例えば、疥癬)も含まれる。
【0215】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ヒト癌(特に、基底細胞癌および皮膚などの上皮組織の他の癌)の治療に使用することができる。例えば、本方法において、基底細胞母班性症候群(BCNS)ならびに他のヒト癌、腺癌、肉腫などに対する治療の一部として、ヘッジホッグアンタゴニストを使用することができる。
【0216】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、基底細胞癌の治療(または予防)のための予防的養生法の治療の一部として使用される。ptcシグナル経路の調節解除は、ptc変異によって発症する基底細胞癌の一般的な特徴であり得る。ヒトptc mRNAの一貫した過剰発現は、インサイツハイブリッド形成法によって同定した、家族性および散発性BCCの腫瘍において記載されている。ptcを不活化する変異体は、ptcがネガティブな自己制御を示すので、変異体Ptcの過剰発現を起こすと予想することができる。以前の研究では、ヘッジホッグタンパク質の過剰発現が腫瘍形成も誘導し得ることが示されている。マウスの腫瘍形成に役割を果たすこのソニック・ヘッジホッグ(Shh)は、皮膚の形成のわずか2、3日後、トランスジェニックマウスの皮膚における過剰発現ShhがBCNSの特徴(皮膚表面全体にわたる多発性のBCC様上皮増殖が含まれる)を発症していることが本発明者らの研究によって示唆されている。BCC由来のヒトShh遺伝子における変異もまた記載されており、それには、ヒトにおけるShhまたは他のHh遺伝子がヒトにおいて優性な癌遺伝子として作用し得ることが示唆されていた。散発性ptc変異はまた、その他の正常な固体由来のBCCについて記載されており、そのいくつかはUV識別変異である。散発性BCCの最近の研究では、ptc変異を含むと同定された15個の腫瘍のうち、CTまたはCCTTのいずれかが変化した5つのUV識別変異が見出された。BCCおよび神経外胚葉性腫瘍における散発性ptc変異における最近の別の分析は、BCCで見出された3つのptc変異のうちの1つが1つのCT変化を示していた。例えば、Goodrich et al.、1997、Science、277:1109〜13、Xie et al.、1997、Cancer Res.、57:2369〜72、Oro et al.、1997、Science、276:817〜21、Xie et al.、1997、Genes Chromosomes Cancer、18:305〜9、Stone et al.、1996、Nature、384:129〜34、およびJohnson et al.、1996、Science、272:1668〜71を参照のこと。
【0217】
本発明の方法はまた、例えば、ptc機能の欠損または滑化機能の獲得の結果であり得る疾患のBCCまたは他の影響を予防するための、BCNSを有する患者を治療するために使用することができる。基底細胞母斑症候群は、若年で発症する多発性BCCによって特徴づけられる稀な常染色体優性疾患である。BCNS患者は、これらの腫瘍を発症しやすく、出生後20年間で主に皮膚の太陽光線に曝された領域で腫瘍が多数認められている。この疾患はまた、多数の発達異常(肋骨、頭部および顔の変形ならびにしばしば多指症、合指症、および脊髄破裂が含まれる)を起こす。それらはまた、BCCに加えて多数の腫瘍型(卵巣および心臓の線維腫、皮膚および顎の嚢胞、ならびに中枢神経系においては髄芽細胞腫および髄膜腫)を発症する。本発明の方法を用いて、このような腫瘍型を予防または治療することができる。BCNS患者の研究によって、患者がptc遺伝子における遺伝性および散発性変異の両方を有することが示されており、これらの変異がこの疾患の決定的な原因であることが示唆される。
【0218】
1つの態様では、本発明は、巨核球由来の細胞の形成および/または巨核球由来の細胞の機能パフォーマンスを調節するための薬学的調製物および方法を提供する。例えば、種々の過形成性疾患または新生物形成疾患を起こす血小板の治療または予防に本明細書中で開示の特定の組成物を適用することができる。
【0219】
本発明の方法において使用するためのヘッジホッグアンタゴニストは、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)またはそれらの適切な混合物などの生物学的に受容可能な媒体を用いた投与用に便利に処方することができる。選択した培地における至適な有効成分の濃度は、医化学者に周知の手順に従って経験的に決定することができる。本明細書中で使用される用語「生物学的に受容可能な媒体」には、薬学的調製物の所望の投与経路に適切であり得る任意および全ての溶媒および分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質用のこの媒体の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体および薬剤の範囲外ではヘッジホッグアンタゴニストの活性と適合しないので、本発明の薬学的調製物において使用する際は熟考すべきである。適切な賦形剤、および、他のタンパク質を含んだ処方物は、例えば、書籍、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington’s Pharmaceuical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、USA、1985)に記載されている。これらの賦形剤には、注射可能な「沈殿処方物」が含まれる。
【0220】
本発明の薬学的処方物には、獣医学的組成物(家畜または家庭内の、例えば、イヌなどの動物の治療用など、獣医学的用途に適切なヘッジホッグアンタゴニストの薬学的調製物)も含むことができる。
【0221】
移入法には、再装填可能なデバイスまたは生分解性デバイスもある。近年、薬物送達を調製するための種々の低速放出重合デバイスを開発してin vivoで試験されており、それには、タンパク質様生物薬剤が含まれる。生分解性および非分解性ポリマーの両方を含む生体適合性ポリマー(ヒドロゲルを含む)を使用して、特定の標的部位でヘッジホッグアンタゴニストを持続的に放出させるための移植片を形成することができる。
【0222】
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、または直腸投与ができる。勿論、調製物は各投与経路に適切な形態で投与される。例えば、調製物は、錠剤またはカプセル形態、注射、吸入、点眼液、軟膏、座薬など(例えば、注射、注入または吸入による投与、ローションまたは軟膏による局所投与、および座薬による直腸投与)で投与される。経口投与および局所投与が好ましい。
【0223】
本明細書中で使用される用語「非経口投与」および「非経口で投与された」とは、通常注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管支内、皮下、皮内、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内注射ならびに注入が含まれるがそれらに限定されない。
【0224】
本明細書中で使用される用語「全身投与」、「全身に投与された」、「末梢投与」および「末梢に投与された」とは、患者の系に入って代謝および他の同様のプロセス(例えば、非経口投与)を受けやすくなるような中枢神経系への直接投与以外の化合物、薬物、または他の物質の投与を意味する。
【0225】
これらの化合物は、治療のために任意の適切な投与経路(経口、経鼻(例えば、スプレー)、直腸、膣内、非経口、嚢内、および頬側および舌下を含む局所(例えば、粉末、軟膏、またはドロップ)、)によってヒトおよび他の動物に投与することができる。
【0226】
選択された投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用できる本発明の化合物および/または本発明の組成物は、以下の記載または当業者に公知の従来の方法によって薬学的に受容可能な剤形に処方される。
【0227】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式によって患者に毒性をもたらすことなく所望の治療的反応を達成するための有効成分の有効量を得るために変化させることができる。
【0228】
選択された投薬レベルは、以下の種々の因子に依存する;本発明で使用した特定の化合物もしくはそのエステル、塩、またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用した特定の化合物の***率、治療の持続時間、特定のヘッジホッグアンタゴニストと組み合わせて使用した他の薬物、化合物および/または物質、年齢、性、体重、病状、身体全体の健康、および治療する患者の以前の病歴、ならびに医学分野で公知の類似の因子。
【0229】
当該分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、要求される薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、薬学的組成物中で使用する本発明の化合物の用量を所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、その後所望の効果が達成されるまで段階的に投薬量を増加させることができるであろう。
【0230】
一般に、本発明の適切な化合物の一日量は、治療効果を得るのに有効な最低化合物量である。このような有効化合物量は、一般に上記の因子に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳室内、および非経口投与量は、約0.0001〜約100mg/kg体重/日の範囲である。
【0231】
所望であるならば、有効成分の有効な一日量は、適切な間隔を置いて、1日あたり2回、3回、4回、5回、6回またはそれ以上の回数のサブ用量に分け、必要に応じた単位投薬形態で投与することができる。
【0232】
用語「治療」は、予防、治療、および治癒を含むことが意図される。
【0233】
この治療を受ける患者は、治療が必要な以下の任意の動物が含まれる;霊長類(特に、ヒト)ならびにウマ、ウシ、ブタおよびヒツジなど哺乳類、家禽類および一般的なペットなど。
【0234】
本発明の化合物は、単独で、あるいは薬学的に受容可能なキャリアと混合して投与することができ、さらに、ペニシリン類、セファロスポリン類、アミノグリコシド類およびグリコペプチド類などの他の抗菌剤と一緒に投与することができる。従って、混合療法には、最初に投与された化合物の治療効果が完全に消失していないうちに次の化合物が投与される方法で、活性化合物を、連続的に、同時に、そして個別に投与することが含まれる。
【0235】
V.薬学的組成物
本発明の化合物は単独で投与することができるが、薬学的配合物(組成物)として本発明の化合物を投与することが好ましい。本発明によるヘッジホッグアンタゴニストは、ヒトまたは動物の医療において使用される任意の都合のよい方法で投与するために配合することができる。
【0236】
従って、本発明の別の局面により、1つまたは複数の薬学的に受容可能なキャリア(添加剤)および/または希釈剤とともに配合された1つまたは複数の上記化合物の治療有効量を含む薬学的に受容可能な組成物が提供される。下記に詳しく記載されているように、本発明の薬学的組成物は固体形態または液体形態で投与するために特別に配合することができる。これには下記に適した組成物が含まれる:(1)経口投与、例えば、水剤(水性または非水性の溶液または懸濁物)、錠剤、ボーラス剤、粉剤、顆粒、舌に投与されるペースト;(2)例えば、無菌の溶液または懸濁物として、例えば、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射による非経口投与;(3)例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏またはスプレー剤としての局所的適用;または(4)例えば、膣坐剤、クリームまたはフォームとしての膣内用または直腸内。しかし、特定の実施形態においては、本発明の化合物を無菌水に単に溶解または懸濁することができる。
【0237】
本明細書中で使用されている用語「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益/リスク比で、動物体内の細胞の少なくとも部分集団におけるヘッジホッグのシグナル伝達経路を阻害し、それによって、処置細胞におけるそのような経路の生物学的結果を阻止することによって何らかの所望する治療効果が得られるのに効果的な、本発明の化合物を含む化合物、物質または組成物の量を意味する。
【0238】
用語「薬学的に受容可能な」は、本明細書中では、妥当な医学的判断の範囲内において、合理的な利益/リスク比に対応して過度な毒性、刺激、アレルギー応答あるいは他の問題または合併症を伴うことなくヒトおよび動物の組織と接触した使用に適するそのような化合物、物質、組成物および/または剤形を示すために用いられている。
【0239】
本明細書中で使用されている用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本発明のアンタゴニストを特定の器官または身体部分から別の器官または身体部分運搬または輸送させること関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化物質などの薬学的に受容可能な物質、組成物または賦形剤を意味する。それぞれのキャリアは、配合物のそれ以外の成分と配合可能であるという意味で「受容可能」でなければならず、そして患者に有害であってはならない。薬学的に受容可能なキャリアとして使用できる物質のいくつかの例には下記が含まれる:(1)ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類;(2)トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類;(3)カルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体;(4)粉末化トラガント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)タルク;(8)ココアバターおよび坐薬用ワックスなどの賦形剤;(9)ピーナッツオイル、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などのオイル;(10)プロピレングリコールなどのグリコール類;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類;(13)寒天;(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンを含まない水;(17)等張生理食塩水;(18)リンゲル液;(19)エチルアルコール;(20)リン酸緩衝化溶液;および(21)薬学的配合物において用いられる他の非毒性の配合可能な物質。
【0240】
上記に示されているように、本発明のヘッジホッグアンタゴニストの特定の実施形態はアミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含み、従って、薬学的に受容可能な酸との薬学的に受容可能な塩を形成することができる。これに関連して、用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合物の比較的毒性のない無機酸付加塩または有機酸付加塩をいう。このような塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製を行っている途中のその場で、あるいはその遊離塩基形態で精製された本発明の化合物を適切な有機酸または無機酸と個々に反応させて、そのようにして得られた塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる(例えば、Berge他(1977)「薬学的塩」、J.Pharm.Sci.66:1〜19を参照のこと)。
【0241】
本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩には、例えば、非毒性の有機酸または無機酸に由来する本発明の化合物の従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など無機酸から誘導される塩;および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製される塩が含まれる。
【0242】
別の場合には、本発明の化合物は、1つまたは複数の酸性官能基を含むことができ、従って、薬学的に受容可能な塩基との薬学的に受容可能な塩を形成することができる。この場合における用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合物の比較的毒性のない無機塩基付加塩および有機塩基付加塩をいう。このような塩は、同様に、本発明の化合物の最終的な単離および精製を行っている途中のその場で、あるいはその遊離酸形態で精製された本発明の化合物を、薬学的に受容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩などの適切な塩基と、またはアンモニアと、または薬学的に受容可能な有機の第一級アミン、第二級アミンもしくは第三級アミンと個々に反応させることによって調製することができる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる。(例えば、Berge他(上記)を参照のこと)。
【0243】
湿潤化剤、乳化剤および滑剤(ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど)もまた、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤と同様に、組成物中に含有させることができる。
【0244】
薬学的に受容可能な抗酸化剤の例には下記が含まれる:(1)アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤;(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤;および(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤。
【0245】
本発明の配合物には、経口投与、鼻腔投与、局所投与(口内および舌下を含む)、直腸投与、膣内投与および/または非経口投与に適した配合物が含まれる。そのような配合物は、都合よいことに単位投薬形態物で提供することができ、製薬分野でよく知られている任意の方法で調製することができる。単回投薬形態物を作製するためにキャリア物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置されている宿主、特定の投与様式に依存して変化する。単回投薬形態物を作製するためにキャリア物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般には、治療効果が得られる化合物のそのような量である。一般には、100パーセントの内、この量は、有効成分が約1パーセント〜約99パーセントの範囲であり、好ましくは約5パーセント〜約70パーセントの範囲であり、最も好ましくは約10パーセント〜約30パーセントの範囲である。
【0246】
このような配合物または組成物の調製方法には、キャリアおよび必要に応じて使用される1つまたは複数の補助成分を用いて本発明の化合物を一緒にする工程が含まれる。一般に、配合物は、液体キャリア、または細かく分割された固体キャリア、またはその両方を用いて本発明の化合物を均一かつ十分に一緒にし、その後、必要な場合には製品の形状にすることによって調製される。
【0247】
経口投与に好適な本発明の配合物は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、トローチ剤(好ましい基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントが使用される)、粉剤、顆粒の形態であり、あるいは水性液体または非水性液体での溶液または懸濁物として、あるいは水中油型または油中水型の液体乳剤として、あるいはエリキシル剤またはシロップとして、あるいは香剤(ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤が使用される)として、かつ/または口内洗浄剤などとして存在し得る。これらはそれぞれ、有効成分として、所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の化合物はまた、ボーラス剤、舐剤またはペーストとして投与することができる。
【0248】
経口投与される本発明の固体投薬形態物(カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉剤、顆粒など)において、有効成分は1つまたは複数の薬学的に受容可能なキャリアと混合されるが、このようなキャリアは、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウムおよび/または下記のいずれかである:(1)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび/またはケイ酸などの充填剤または増量剤;(2)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび/またはアラビアゴムなどの結合剤;(3)グリセロールなどの保湿剤;(4)寒天、炭酸カルシウム、トウモロコシデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤;(5)パラフィンなどの溶液遅延剤;(6)第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤;(7)例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアラートなどの湿潤化剤;(8)カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤;(9)タルク、ステアリン酸化カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの滑剤;および(10)着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合、薬学的組成物は緩衝化剤をも含むことができる。類似したタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖類ならびに高分子量ポリエチレングリコールのような賦形剤を使用する軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いることができる。
【0249】
錠剤は、必要に応じて1つまたは複数の補助成分を用いて圧縮成形または成型を行うことによって作製することができる。圧縮成形された錠剤は、結合剤(例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、ナトリウムデンプングリコラートまたは架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散剤を使用して調製することができる。成型された錠剤は、適切な装置において、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成型することによって作製することができる。
【0250】
本発明の薬学的組成物の錠剤および他の固体投薬形態物(糖衣剤、カプセル、ピルおよび顆粒など)は、必要に応じて、刻み目を付けたり、薬剤配合分野でよく知られている腸溶性コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよび外皮を用いて調製することができる。本発明のそのような配合物はまた、例えば、所望する放出特性が得られるような様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび/またはマイクロスフェアを使用してその中の有効成分の遅い放出または制御された放出が得られるように配合することができる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通すろ過によって、あるいは使用直前に無菌水あるいは何らかの他の無菌の注射可能な媒体に溶解することができる無菌の固体組成物の形態で殺菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。これらの組成物はまた、必要に応じて不透明化剤を含有することができ、そして有効成分のみが、好ましくは胃腸管の特定部分において、必要に応じて遅延様式で放出される組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。有効成分はまた、適する場合には1つまたは複数の上記賦形剤を用いてマイクロカプセル化された形態にすることができる。
【0251】
本発明の化合物が経口投与される液体投薬形態物には、薬学的に受容可能な乳剤、マイクロ乳剤、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。有効成分に加えて、液体投薬形態物は、例えば、水または他の溶媒、溶解剤および乳化剤などのこの分野で広く使用されている不活性な希釈剤を含有することができる。このような希釈剤は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、オイル(特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物などである。
【0252】
不活性な希釈剤に加えて、経口用組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤、着色剤、芳香剤および保存剤などの補助剤を含むことができる。
【0253】
懸濁物は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物などの懸濁剤を含有することができる。
【0254】
コレステロールなどのステロール類はシクロデキストリン類との複合体を形成することが知られている。従って、阻害剤がステロイダルアルカロイドである好ましい実施形態において、阻害剤は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリンならびに2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン類と配合することができる。
【0255】
直腸投与または膣内投与される本発明の薬学的組成物の配合物は坐薬として提供され得る。このような坐薬は、1つまたは複数の本発明の化合物を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐薬用ワックスまたはサリチル酸塩を含む1つまたは複数の好適な非刺激性の賦形剤またはキャリアと混合することによって調製することができる。このような坐薬は、室温では固体であるが、体温で液体になり、従って、直腸腔または膣腔の中で溶解して、活性なヘッジホッグアンタゴニストを放出する。
【0256】
膣投与に好適な本発明の配合物には、適切であることがこの分野で知られているそのようなキャリアを含有する膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー配合物もまた含まれる。
【0257】
本発明の化合物が局所的または経皮的に投与される投薬形態物には、粉剤、スプレー剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下において、薬学的に受容可能なキャリアと、そして必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤または噴射剤と混合することができる。
【0258】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物脂肪および植物脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有することができる。
【0259】
粉剤およびスプレー剤は、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム類およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレー剤は、クロロフルオロ炭化水素類および揮発性の非置換炭化水素(ブタンおよびプロパンなど)などの通常の噴射剤をさらに含有することができる。
【0260】
経皮用パッチは、身体への本発明の化合物の制御された送達をもたらすというさらなる利点を有する。そのような投薬形態物は、ヘッジホッグアンタゴニストを適切な媒体に溶解または分散させることによって作製することができる。吸収強化剤もまた、皮膚を通過するヘッジホッグアンタゴニストの流束を増加させるために使用することができる。そのような流束の速度は、速度調節用メンブランを提供するか、あるいはポリマーマトリックスまたはゲルに化合物を分散させることによって調節することができる。
【0261】
眼用配合物、眼軟膏、粉剤、溶液などもまた、本発明の範囲内であるとして包含される。
【0262】
非経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的に受容可能な滅菌された等張の水性または非水性の溶液、分散物、懸濁物または乳化物、あるいは無菌粉末と組み合わさった1つまたは複数の本発明の化合物を含む。これらは、使用直前に無菌の注射可能な溶液または分散物に再構成することができ、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、目的とする受容者の血液に関して配合物を等張性にする溶質、懸濁剤または増粘剤を含有することができる。
【0263】
本発明の薬学的配合物において用いることができる好適な水性キャリアおよび非水性キャリアの例には、水、エタノール、ポリオール類(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物オイル、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【0264】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含有することができる。微生物活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など)を含めることによって確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に加えることもまた望ましいことであり得る。さらに、注射可能な薬学的形態物の持続した吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによって得ることができる。
【0265】
場合により、薬物の作用を持続させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が良好でない結晶性物質または非晶質物質の液体懸濁物を使用することによって達成することができる。その場合、薬物の吸収速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得るその溶解速度に依存する。あるいは、非経口的に投与された薬物形態物の遅延吸収は、薬物をオイル賦形剤に溶解または懸濁させることによって達成され得る。
【0266】
注射可能なデポ剤を、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーで本発明の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製することができる。薬物対ポリマー比、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して薬物の放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。デポ剤の注射可能な配合物はまた、身体組織と適合し得るリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を包み込むことによって調製される。
【0267】
本発明の化合物が医薬品としてヒトまたは動物に投与される場合、本発明の化合物は、単独で、あるいは薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせで、例えば、0.1〜99.5%(より好ましくは、0.5〜90%)の有効成分を含有する薬学的組成物として投与することができる。
【0268】
本発明の活性化合物の動物飼料への添加は、好ましくは、有効量の活性化合物を含有する適切な飼料予備混合物を調製して、この予備混合物を混合して完全な混合物にすることによって達成される。
【0269】
あるいは、有効成分を含有する中間濃縮物または飼料強化物を飼料に混合することができる。そのような飼料予備混合物および完全混合物を調製し、そしてそれらが投与され得る方法は参考書籍に記載されている(例えば、「添加される動物栄養物」、W.H.Freedman and CO.、San Francisco、米国、1969;あるいは「家畜用飼料および給餌」、O and B books、Corvallis、Ore、米国、1977)。
【0270】
VI.活性なアンタゴニストの合成スキームおよび同定
本発明のステロイダルアルカロイド類およびその同類物は、Suzuki、Stilleなどのクロスカップリング技術を用いることによって容易に調製することができる。このようなカップリング反応は比較的穏和な条件のもとで行われ、広範囲の「スペクテイター」官能基性に耐える。
【0271】
a.コンビナトリアルライブラリー
本発明の化合物、特に、様々な代表的な種類の置換基を有する変化体のライブラリーはコンビナトリアル化学および他の平行的な合成スキームに適する(例えば、PCT国際特許出願公開WO94/08051を参照のこと)。その結果は、潜在的なヘッジホッグアンタゴニストのリード化合物を同定して、リード化合物の特異性、毒性および/または細胞傷害的動態特性を改善するために、関連化合物の大きなライブラリー(例えば、上記に示される化合物の多様なライブラリー)を大きな処理速度のアッセイで迅速にスクリーニングできるということである。例えば、上記のヘッジホッグの生物活性アッセイは、すべてのヘッジホッグまたは特定のヘッジホッグのイソ型または活性に対するアンタゴニスト活性を有する化合物について本発明の化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
【0272】
単に例示のためにではあるが、本発明のためのコンビナトリアルライブラリーは、所望する特性について一緒にスクリーニングされ得る化学的に関連する化合物の混合物である。1回の反応で多くの関連する化合物を調製することにより、実施するのに必要とされるスクリーニング操作の回数が大きく減り単純になる。適切な物理的特性に関するスクリーニングを従来の方法で行うことができる。
【0273】
ライブラリーにおける多様性を様々な相違レベルで得ることができる。例えば、コンビナトリアル反応において使用される基質のアリール基は、中心のアリール部分に関して異なり得るし、例えば、環構造に関して多様であり、かつ/またはそれ以外の置換基に関して変化させることができる。
【0274】
様々な技術を、本発明のヘッジホッグアンタゴニストなどの小さな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを作製するためにこの分野で用いることができる。例えば、Blondelle他(1995)、Trends Anal.Chem.14:83;Affymaxの米国特許第5,359,115号および同第5,362,899号;Ellmanの米国特許第5,288,514号;Still他のPCT国際特許出願公開WO94/08051;Chen他(1994)、JACS、116:2661;Kerr他(1993)、JACS、115:252;PCT国際特許出願公開WO92/10092、同WO93/09668および同WO91/07087;ならびにLerner他のPCT国際特許出願公開WO93/20242を参照のこと。従って、本発明のヘッジホッグアンタゴニストのおよそ100〜1,000,000以上の変化体の様々なライブラリーを合成して、特定の活性または特性についてスクリーニングすることができる。
【0275】
例示的な実施形態において、候補となるヘッジホッグアンタゴニスト変化体のライブラリーは、Still他のPCT国際特許出願公開WO94/08051に記載される技術に適合したスキームを利用して、例えば、候補のアンタゴニストまたは合成中間体の置換基の位置の1つに位置する、例えば、加水分解可能な基または光分解可能な基によってポリマービーズに結合させて合成することができる。Still他の技術に従って、ライブラリーが1組のビーズの表面で合成される。この場合、各ビーズは、そのようなビーズ上の特定の変化体を同定する1組の標識を含む。次いで、このビーズライブラリーを、阻害剤が探し出されるヘッジホッグ感受性細胞の層に「播種」することができる。変化体は、例えば、加水分解によってビーズから遊離させることができる。(例えば、外部から加えられたヘッジホッグタンパク質に対して)ヘッジホッグ感受性がないか、またはヘッジホッグ感受性が弱い領域によって囲まれたビーズ、例えば、「ハロー」を選択することができ、そしてその標識を「読み取り」、特定の変化体の正体を明かすことができる。
【0276】
b.スクリーニングアッセイ
様々なアッセイが、ヘッジホッグにより媒介されるシグナル伝達を阻害する化合物の能力を測定するために利用することができる。その多くは、処理速度が大きな形式で処理することができる。化合物および天然抽出物のライブラリーが調べられる多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、一定の期間で調べられる化合物の数を最大にするためには、大きな処理速度のアッセイが望ましい。従って、合成物および天然産物のライブラリーを、ヘッジホッグシグナルを阻害することに関してジェルビン(jervine)と類似する活性を有する他のステロイダル化合物および非ステロイダル化合物のためにサンプリングすることができる。
【0277】
精製されたヘッジホッグポリペプチドおよび組換えヘッジホッグポリペプチドが利用できることによって、ヘッジホッグの正常な細胞機能のアンタゴニストである小さな有機分子などの薬物について、特に、細胞の増殖および/または分化の病理発生におけるその役割についてスクリーニングするために使用することができるアッセイシステムの作製が容易になる。1つの実施形態において、そのようなアッセイにより、ヘッジホッグポリペプチドとpatchedなどのヘッジホッグレセプターとの結合を調節する化合物の能力が評価される。別の実施形態では、アッセイにより、ヘッジホッグが媒介するシグナル伝達を変化させる試験化合物の能力が単に評価されるだけである。このようにして様々なアンタゴニストを同定することができる。様々なアッセイ形式が可能であり、そして本開示を考慮すれば、それらは当業者により理解される。
【0278】
無細胞系で行われるアッセイ、例えば、精製タンパク質または半精製タンパク質によって得ることができるようなアッセイが、多くの場合、「一次」スクリーニングとして好まれる。そのようなアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変化の迅速な発現および比較的容易な検出を可能にするように作製され得るからである。さらに、試験化合物の細胞毒性および/または生物利用性の作用は、一般にイン・ビトロ系では無視され得る。その代わり、アッセイは、主として、レセプタータンパク質との結合親和性の変化が明らかであり得る薬物の分子標的に対する作用に集中している。
【0279】
何らかの特定の理論によりとらわれるつもりはないが、ジェルビンおよび他のステロイダルアルカロイドは、例えば、patchedのステロール感知ドメインとの相互作用を介してコレステロール由来のヘッジホッグと干渉することによってヘッジホッグシグナル経路においてその活性を示すはずである(例えば、Loftus他(1997)、Science、277:232を参照のこと)。ヘッジホッグアンタゴニストに関する例示的なスクリーニングアッセイは、レセプターがヘッジホッグタンパク質または少なくともジェルビンと通常結合し得る条件下で、目的の化合物を、ヘッジホッグレセプタータンパク質(例えば、patchedレセプターを発現する細胞)およびヘッジホッグタンパク質を含む混合物と接触させることを含む。次いで、この混合物に、試験化合物を含有する組成物が加えられる。レセプター/ヘッジホッグ複合体および/またはレセプター/ジェルビン複合体の検出および定量によって、レセプタータンパク質とヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビンアンタゴニストとの複合体形成を阻害する(または高める)ことにおける試験化合物の効き目を決定するための手段が提供される。化合物の効き目は、様々な濃度の試験化合物を使用して得られたデータから用量応答曲線を作製して、その結果をジェルビンで得られた結果と比較することによって評価することができる。さらに、コントロールアッセイもまた、比較用の基準を得るために行うことができる。コントロールアッセイにおいて、単離または精製されたヘッジホッグポリペプチドがレセプタータンパク質に加えられ、レセプター/ヘッジホッグ複合体の形成が試験化合物の非存在下で定量される。
【0280】
例示的な実施形態において、ヘッジホッグレセプターとして利用されるポリペプチドはpatchedタンパク質から作製することができ、特にステロイド感知ドメイン、例えば、機能的なステロイド感知ドメインを含むタンパク質の可溶性部分を含む。従って、例示的なスクリーニングアッセイは、例えば、ヒトのpatched遺伝子(GenBank U43148)または他の脊椎動物源(ニワトリpatchedに関するGenBankアクセション番号U40074およびマウスpatchedに関するU46155)ならびにショウジョウバエ(GenBankアクセション番号M28999)または他の非脊椎動物源から得ることができるpatchedタンパク質のすべての部分または適切な部分を含む。patchedタンパク質は、(好ましくは、細胞表面に発現させた)完全なタンパク質として、あるいは、例えば、ステロイド感知ドメインを含む全長タンパク質のフラグメントとして、および/または、少なくとも、ヘッジホッグポリペプチドに結合する部分として、例えば、ヒトのpatchedタンパク質の残基Asn120−Ser438および/またはArg770−Trp1027に対応する実質的な細胞外ドメインの一方または両方としてスクリーニングアッセイにおいて提供され得る。例えば、patchedタンパク質は、可溶性形態で、例えば、一方の細胞外ドメインの調製物として、あるいは非構造的なリンカーで共有結合された両方の細胞外ドメインの調製物として提供され得る(例えば、Huston他(1988)、PNAS、85:4879;および米国特許第5,091,513号を参照のこと)。他の実施形態において、タンパク質はリポソーム調製物の一部として提供され得るか、あるいは細胞表面で発現させることができる。patchedタンパク質は組換え遺伝子から得ることができ、例えば、異種の細胞で異所的に発現させることができる。例えば、タンパク質は、卵母細胞、哺乳動物細胞(例えば、COS、CHOまたは3T3など)または酵母細胞において標準的な組換えDNA技術により発現させることができる。これらの組換え細胞は、レセプター結合アッセイ、シグナル伝達アッセイまたは遺伝子発現アッセイに使用することができる。Stone他(1996)、Nature、384:129〜34;およびMarigo他(1996)、Nature、384:176〜9は、アフリカツメガエル卵母細胞で異所的に発現させたニワトリのpatchedタンパク質などのpatchedに対するヒトヘッジホッグの結合アッセイを例示している。Marigo他のアッセイ系は、例えば、本発明の薬物スクリーニングアッセイに適合させることができる。その参考文献に例示されているように、Shhは、patchedタンパク質に選択的で飽和した用量依存的な様式で結合する。従って、このことは、patchedがShhのレセプターであることを示している。
【0281】
ヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビンとヘッジホッグレセプターとの複合体の形成は様々な技術で検出することができる。例えば、複合体形成の変化を、例えば、放射能標識、蛍光標識または酵素標識されたヘッジホッグポリペプチドなどの検出可能に標識されたタンパク質を使用して、免疫アッセイあるいはクロマトグラフィー的検出により定量することができる。
【0282】
典型的には、無細胞アッセイの場合、レセプター複合体を1つのタンパク質の非複合体形態から分離することを容易にし、さらにアッセイを自動化させるために、ヘッジホッグレセプターまたはヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビン分子のいずれかを固定化することが望ましい。1つの実施形態において、タンパク質をマトリックスに結合させるドメインが付加された融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/レセプター(GST/レセプター)融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical、St.Louis、MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができる。次いで、これらは、ジェルビンまたはヘッジホッグポリペプチド(例えば、35S標識ヘッジホッグポリペプチド)および試験化合物と一緒にされて、複合体が形成される条件のもとで、例えば、塩およびpHに関して生理学的条件のもとでインキュベーションされる。しかし、それよりもわずかにストリンジェントな条件が望ましいことがある。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、結合していないリガンドを除き、そしてマトリックスに結合した放射能標識が直接測定され(例えば、シンチラントに入れたビーズ)、あるいは複合体を解離させた後の上清において測定される。あるいは、複合体をビーズから解離させ、SDS−PAGEゲルにより分離して、ビーズ画分に見出されるヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビンのレベルを、標準的な技術(HPLC、ゲル電気泳動など)を使用してゲルから定量することができる。
【0283】
ヘッジホッグレセプター(または他のヘッジホッグ結合分子)の所望する部分が可溶性形態で提供され得ない場合、リポソームベシクルを使用して、レセプターの操作可能で単離可能な供給源を得ることができる。例えば、patchedタンパク質の確認された形態および組換え形態はともに、人工的な脂質ベシクル(例えば、ホスファチジルコリンリポソーム)または細胞膜由来ベシクルで再構成することができる(例えば、Bear他(1992)、Cell、68:809〜818;Newton他(1983)、Biochemistry、22:6110〜6117;およびReber他(1987)、J Biol Chem、262:11369〜11374を参照のこと)。
【0284】
上記のような無細胞アッセイに加えて、本発明の化合物はまた、細胞系アッセイにより試験することができる。1つの実施形態において、ヘッジホッグの誘導に対して感受性の細胞、例えば、patchedを発現する細胞、またはヘッジホッグの誘導に対する感受性を有する他の細胞をヘッジホッグタンパク質および目的の試験薬剤と接触させることができ、そしてアッセイによって、試験薬剤の存在下または非存在下での標的細胞によるヘッジホッグ誘導に応答した阻害に対する、細胞への単なる結合に由来する何かが評価される。
【0285】
patchedタンパク質を自ら発現する細胞を評価づけることに加えて、patchedを異所的に発現するように操作された細胞を薬物スクリーニングアッセイに利用することができる。一例として、patchedタンパク質の発現が低レベルであるか、またはpatchedタンパク質を発現しない細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、COS細胞または酵母細胞を、patchedタンパク質を異所的に発現させるために、標準的な技術を使用して遺伝子操作することができる(Marigo他(上記)を参照のこと)。
【0286】
例えば、機能的なpatchedレセプターを発現する得られた組換え細胞を、ヘッジホッグ結合のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためにレセプター結合アッセイにおいて利用することができる。結合アッセイは細胞全体を使用して行うことができる。さらに、本発明の組換え細胞は、ヘッジホッグに依存するシグナル経路に関与するタンパク質をコードする他の異種遺伝子を含むように操作することができる。例えば、smoothened、costal−2、fused、および/またはsuppressor of fusedの1つまたは複数の遺伝子産物を試薬細胞においてpatchedと一緒に同時に発現させることができる。このアッセイは、ヘッジホッグシグナル伝達カスケードの機能的な再構成に敏感である。
【0287】
あるいは、再構成されたpatchedタンパク質を使用するリポソーム調製物を利用することができる。本来の起源および組換え起源の両方から得られる界面活性剤抽出物から精製されたpatchedタンパク質は人工的な脂質ベシクル(例えば、ホスファチジルコリンリポソーム)または細胞膜由来ベシクルにおいて再構成することができる(例えば、Bear他(1992)、Cell、68:809〜818;Newton他(1983)、Biochemistry、22:6110〜6117;およびReber他(1987)、J Biol Chem、262:11369〜11374を参照のこと)。得られたリポソームのラメラ構造およびサイズを、電子顕微鏡を使用して特徴づけることができる。再構成された膜におけるpatchedタンパク質の外向きの配向を、例えば、免疫電子顕微鏡によって明らかにすることができる。候補薬剤の存在下におけるpatched含有リポソームおよびタンパク質非含有リポソームのヘッジホッグタンパク質結合活性を、ヘッジホッグ−patched相互作用の潜在的な調節因子を同定するために比較することができる。
【0288】
これらの細胞系アッセイにおいて使用されるヘッジホッグタンパク質は、精製された供給源(起源が天然または組換え)として提供され得るか、あるいはタンパク質を発現し、標的細胞と一緒に培養されている細胞/組織の形態で提供され得るが、好ましくは、コレステロールに由来する形態である。結合研究に加えて、試験薬剤と接触したpatched発現細胞における第2のメッセンジャーまたは遺伝子発現の変化などの細胞内シグナルの変化を検出することによって、候補となるヘッジホッグアンタゴニストを同定することができる。
【0289】
多数の遺伝子産物がpatched媒介のシグナル伝達に関与している。これには、patched、転写因子のcubitus interruptus(ci)、セリン/トレオニンキナーゼのfused(fu)、ならびにcostal−2、smoothenedおよびsuppressor of fusedの遺伝子産物が含まれる。
【0290】
ヘッジホッグタンパク質による細胞の誘導は下流のエフェクターの活性化および阻害を含むカスケードを開始させ、その最終的な結果は、場合により、遺伝子の転写または翻訳における検出可能な変化である。ヘッジホッグにより媒介されるシグナル伝達の潜在的な転写標的は、patched遺伝子(HidalgoおよびIngham、1990、Development、110、291〜301;Marigo他、1996)であり、ショウジョウバエのcubitus interruptus遺伝子の脊椎動物ホモログであるGLI遺伝子(Hui他(1994)、Dev Biol、162:402〜413)である。patched遺伝子の発現は、Shhに応答する肢芽および神経板の細胞で誘導されることが明らかにされている(Marigo他(1996)、PNAS、93:9346〜51;Marigo他(1996)、Development、122:1225〜1233)。GLI遺伝子は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインを有する仮想的な転写因子をコードしている(Orenic他(1990)、Gene&Dev、4:1053〜1067;Kinzler他(1990)、Mol Cell Biol、10:634〜642)。GLI遺伝子の転写は、肢芽においてヘッジホッグに応答してアップレギュレーションされることが報告されているが、その一方で、GLI3遺伝子の転写はヘッジホッグ誘導に応答してダウンレギュレーションされる(Marigo他(1996)、Development、122:1225〜1233)。そのような標的遺伝子から、例えば、patched遺伝子またはGLI遺伝子から、ヘッジホッグシグナル伝達に応答するこれらの遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをつかさどる転写調節配列を選択して、そのようなプロモーターをレポーター遺伝子に機能的に結合させることによって、ヘッジホッグが媒介するシグナル伝達経路を変化させる特異的な試験化合物の能力に敏感な転写系アッセイを得ることができる。従って、レポーター遺伝子の発現は、ヘッジホッグのアンタゴニストとして作用する化合物の開発に対する有用なスクリーニング手段を提供する。
【0291】
本発明のレポーター遺伝子型アッセイは、上記の事象カスケードの最終段階(例えば、転写による調節)を測定する。従って、アッセイの1つの実施形態を実施する際には、レポーター遺伝子構築物が、ヘッジホッグシグナル伝達に依存した検出シグナルを発生させるために試薬細胞に挿入される。標的遺伝子の転写調節配列内に存在するヘッジホッグシグナル伝達に応答する潜在的な調節エレメントを同定するために、標的遺伝子のゲノムクローンの内部欠失物を、標準的な技術を使用して構築することができる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel,F.M.他(編)、Greene Publishing Associates(1989);米国特許第5,266,488号;Sato他(1995)、J Biol Chem、270:10314〜10322;およびKube他(1995)、Cytokine、7:1〜7を参照のこと)。遺伝子の5’隣接領域に由来する1組の内部欠失DNAフラグメントをルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子の上流に配置して、patched発現細胞におけるレポーター遺伝子の発現を行わせるそれらの能力がアッセイされる。レポーター遺伝子構築物で一過性にトランスフェクションされた宿主細胞を、patchedに依存したシグナル伝達に応答し得る調節配列を決定するためにヘッジホッグの存在下および非存在下でレポーター遺伝子の発現調節について評価することができる。
【0292】
アッセイの1つの実施形態を実施する際に、レポーター遺伝子構築物が、ヘッジホッグタンパク質による誘導で生じる第2のメッセンジャーに依存した検出シグナルを発生させるために試薬細胞に導入される。典型的には、レポーター遺伝子構築物は、ヘッジホッグ活性に応答し得る1つまたは複数の転写調節エレメントと機能的に連結されたレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子の発現レベルによってヘッジホッグに依存する検出シグナルが得られる。レポーター遺伝子からの転写量は、好適であることが当業者に知られている任意の方法を使用して測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのmRNA発現を、RNAse保護PCRまたはRNA系PCRを使用して検出することができ、あるいはレポーター遺伝子のタンパク質産物を特徴的な染色または固有の活性によって同定することができる。次いで、レポーター遺伝子からの発現量は、試験化合物(またはヘッジホッグ)の非存在下での同じ細胞における発現量と比較されるか、あるいは標的のレセプタータンパク質を有さない実質的に同一の細胞における転写量と比較することができる。転写量における何らかの統計学的な差またはそれ以外の大きな差は、試験化合物が何らかの方法でヘッジホッグタンパク質のシグナル伝達活性を変化させていること、例えば、試験化合物が潜在的なヘッジホッグアンタゴニストであることを示している。
【0293】
下記にさらに詳しく記載されているように、好ましい実施形態において、レポーターの遺伝子産物は、その生成物に伴う固有の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性によって、色、蛍光または発光に基づく検出シグナルをもたらす遺伝子産物をコードすることができる。他の好ましい実施形態において、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子は選択的な生育を有利にする。例えば、レポーター遺伝子は細胞の生存性を高め、細胞の栄養要求性を和らげ、かつ/または薬物抵抗性をもたらし得る。
【0294】
好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出できるものである。レポーター遺伝子はまた、所望する転写調節配列を含むか、または他の望ましい特性を示す遺伝子との融合遺伝子の形態で構築物に組み入れることができる。レポーター遺伝子の例には下記が含まれるが、それらに限定されない:CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(AltonおよびVapnek(1979)、Nature、282:864〜869)、ルシフェラーゼ、および他の酵素検出システム、例えば、β−ガラクトシダーゼ;ホタルルシフェラーゼ(deWet他(1987)、Mol.Cell.Biol.7:725〜737);細菌ルシフェラーゼ(EngebrechtおよびSilverman(1984)、PNAS、1:4154〜4158;Baldwin他(1984)、Biochemistry、23:3663〜3667);アルカリホスファターゼ(Toh他(1989)、Eur.J.Biochem.182:231〜238、Hall他(1983)、J.Mol.Appl.Gen.2:101)、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ(CullenおよびMalim(1992)、Methods in Enzymol.216:362〜368)。
【0295】
レポーター遺伝子構築物に含むことができる転写制御エレメントには、プロモーター、エンハンサーならびにリプレッサー結合部位およびアクチベーター結合部位が含まれるが、これらに限定されない。好適な転写調節エレメントは、ヘッジホッグシグナル伝達経路が調節された後にその発現が誘導される遺伝子の転写調節領域に由来し得る。転写制御エレメントが得られる好ましい遺伝子の特徴には下記が含まれるが、それらに限定されない:静止細胞における低い発現または検出できないほどの発現、細胞外刺激の数分以内に生じる転写レベルでの迅速な誘導、一過性または新しいタンパク質合成に依存しない誘導、転写のその後の遮断により新しいタンパク質合成が必要とされること、およびこれらの遺伝子から転写されるmRNAは半減期が短いこと。これらの特性のすべてが存在することは必ずしも必要ではない。
【0296】
さらに、多数のアッセイが、この分野ではコレステロール生合成の阻害剤を検出するために知られており、これらは、本発明のヘッジホッグアンタゴニストが、例えば、ステロール類の生合成および/または輸送を阻害することによってコレステロールホメオスタシスを破壊するかどうかを明らかにするために容易に適応させることができる。
【0297】
例示すると、ステロール類とポリエン抗生物質であるアンホテリシンBとの複合体によって動物細胞の膜に形成された孔により、細胞は効率的に殺傷され得る。従って、コレステロールの外部供給源が存在しない場合、コレステロール生合成経路における酵素の阻害剤は細胞をアンホテリシンB抵抗性にする。しかし、2型阻害剤の場合、コレステロールが原形質膜で増大することにより、実際には、細胞はアンホテリシンBによる殺傷を受けやすくなるはずである。チャイニーズハムスター卵巣細胞を、試験ステロイダルアルカロイドなどのジェルビンと類似する様式で、コレステロールホメオスタシスを破壊する試験化合物と予備インキュベーションすることによって、細胞はアンホテリシンBによる殺傷に感じやすくなる。従って、これは、試験化合物をアッセイするために使用することができ、そして大きな処理速度のスクリーニングに適する。細胞を潜在的な阻害剤と(15〜24時間)予備インキュベーションし、次いでアンホテリシンBで(3〜6時間)処理する簡便な2工程プロトコルが、Krieger(1983)(Anal Biochem、135:383〜391)によって記載されている。これは、コレステロール生合成の直接的(例えば、拮抗的)な阻害剤および調節性阻害剤を検出するための高感度方法である。このプロトコルは、潜在的なヘッジホッグアンタゴニストの検出において有用であることが明らかにされ得る。
【0298】
SREBP切断−活性化タンパク質(SCAP)は、膜に結合したSREBP類のタンパク質分解的切断を刺激し、それによって、細胞膜からのNH2末端フラグメントを放出させる。放出されたフラグメントは核に進入して、コレステロールおよび脂肪酸の合成および取り込みに関与する遺伝子の転写を刺激する。ステロール類は、明らかにSCAPの膜結合ドメインと相互作用することによってSREBP類の切断を抑制する。1つの実施形態において、ジェルビンに類似する様式でステロール輸送を妨げる試験薬剤の能力を、活性化されたSCAPタンパク質またはSREBPタンパク質の生成によってアッセイすることができる。例えば、特に望ましい実施形態は、大きな処理速度のスクリーニングにおいて使用できるために、SREBPに依存する遺伝子転写を検出するレポーター遺伝子型アッセイである。様々な遺伝子が、SREBP応答エレメントを含むとしてこの分野で記載されており、これらはレポーター遺伝子構築物を生成させる候補である。例えば、Bist他(1997)(PNAS、94(20):10693〜8)はカベオリン遺伝子におけるSREBP応答エレメントの存在を記載している;Wang他(1997)(J Biol Chem、272:26367〜74)はFAS遺伝子におけるそのようなエレメントを記載している;Magana他(1996)(J Biol Chem、271:32689〜94)は脂肪酸シンターゼ遺伝子におけるSREBP−REの存在を記載している;そして、Ericsson他(1996)(PNAS、93:945〜50)はファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子におけるSREBP結合部位を記載している。従って、Wang他(上記)によって記載されたFASプロモーター−ルシフェラーゼレポーター、またはGuan他(1997)(J Biol Chem、272:10295〜302)によって記載されたスクワレンシンターゼプロモーター−ルシフェラーゼレポーターのようなレポーター遺伝子構築物を、ジェルビンと潜在的に同等なものを検出するアッセイにおいて利用することができる。簡単に記載すると、2型阻害剤の非存在下において、ステロール輸送がいくらかの程度で生じ、そしてSREBPに依存する転写がある速度で生じる。ジェルビンなどによるステロール移動の阻害は、原形質膜におけるステロール前駆体の増大をもたらし、そして小胞体におけるそのような前駆体の減少をもたらす。後者は、SCAP媒介によるSREBPの切断を活性化し、そしてSREBP−REレポーター遺伝子の発現を同時に増大させる。レポーター遺伝子の発現の検出は、この分野で知られている広範囲の技術のいずれかにより行うことができる。例えば、レポーター遺伝子は、ゼオシンまたはハイグロマイシンなどの薬剤耐性を付与するものであり得る。ジェルビン、または類似する様式でコレステロールホメオスタシスを阻害し得る別の化合物は、レポーター遺伝子の発現を増大させるのでそのような薬剤に対する大きな抵抗性をもたらす。
【0299】
さらに別の実施形態において、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル補酵素A(HMG−CoA)レダクターゼの活性をもたらす試験化合物の能力は、ジェルビンのようにコレステロールホメオスタシスに影響する化合物を検出するために使用することができる。ジェルビンのような2型阻害剤に引き起こされる小胞体におけるコレステロールまたは他のステロール類の低い条件により、HMG−CoAレダクターゼは活性化される。この活性化は、例えば、HMG−CoAの増大した発現を検出することによって(Chambers他(1997)、Am J Med Genet、68:322〜7)、あるいは基質[14C]HMG−CoAのHMG−CoAレダクターゼによる還元の場合(米国特許第5,753,675号を参照のこと)のように酵素活性の増大を検出することによって検出することができる。
【0300】
実施例
本発明をこれまで一般的に記載してきたが、本発明は、下記の実施例を参照することによってより容易に理解される。下記の実施例は、本発明の特定の局面および実施形態を単に例示するためにのみ示され、本発明を限定することを目的としていない。
【0301】
実施例1:ステロイダルアルカロイドはヘッジホッグのシグナル伝達を破壊し得る。
【0302】
Shhシグナル伝達に対する作用を明らかにするために、本発明者らは、催奇物質によって誘導されるHPEが主として研究されている齧歯類、ヒツジおよび他の哺乳動物(14、15、16、29、39)よりも扱いやすい実験系としてヒヨコ(38)を選んだ。ヒヨコの胚は容易に培養および操作され、そして図2に示されているように、明らかな線状状態(40)への中間段階でこれらの胚をジェルビンに曝すことによって、HPEに特徴的な外面の奇形が誘導された(同様の結果がシクロパミンで得られた;結果を示さず)。これらの欠陥の重症度は、処置した胚の中で変化した。これらは、中線構造の喪失および対になった側面構造の接近の程度によるパネルB〜Eで認められる。従って、このような中線欠陥は、眼胞および嗅神経プロセスと同様に下顎骨プロセスおよび上顎骨プロセスの融合をもたらし、結果的には、最もひどく影響した胚において、単眼症、および融合鼻室からなる吻様構造の形成が伴う(図2E)。
【0303】
図2に示されているように、卵処理において、様々な欠陥が生じたが、いくつかの胚は、その最大試験濃度においてさえ、正常な形態を示した(50μM、ジェルビン5/10およびシクロパミン2/10、結果を示さず)。これらの作用の変動性は、不正確な胚段階化およびこれらの疎水性化合物を均一に加えることの困難さによると考えられる。このような変動性を減らして、催奇性化合物のShhシグナル伝達に対する潜在的な作用をより良好に評価するために、本発明者らは、正確な組織段階化を可能にし、そして催奇物質のより均一な添加を可能にする外植片アッセイを確立した(41)。図3Aに示されているように、脊索を伴った内側神経板を、ヘンセン節のすぐ口部側の領域から取り出した。この段階で、内側神経板は、床板細胞(HNF3β)または運動ニューロン(Isl−1)のマーカーをまだ発現していない(42、43、データを示さず)。しかし、脊索はShhを発現している(44、45、データを示さず)。図3Bに示されているように、40時間のインキュベーションを行った後、神経板はHNF3βおよびIsl−1を発現する。これらのマーカーの発現は、イン・ビボおよびイン・ビトロの両方でShhシグナル伝達に依存していることが示されている(2、45)。従って、これらの中線外植片は、誘導組織および標的組織の両方を含むShhシグナル伝達の一体型アッセイを構成する。
【0304】
合成催奇物質および植物由来の催奇物質がShhシグナル伝達を阻止するかどうかを明らかにするために、本発明らは、中線外植片を、様々な濃度の薬物AY9944およびトリパラノールならびにステロイダルアルカロイドのシクロパミンおよびジェルビンに曝した。図3D〜3Kに示され得るように、これらの化合物はすべて、Shhシグナル伝達に影響を及ぼし、HNF3発現およびIsl−1発現の完全な喪失が十分な高濃度によって一貫して生じた(図3E、G、J、K)。完全な阻害に必要とされる濃度に達しない数倍の濃度で、これらの催奇性化合物はすべて、HNF3βの発現を阻止し得るが、Isl−1の発現を保持し、多くの場合、増大させる(図3D、F、H、H)。これらの作用はShhシグナル伝達の阻害と十分に一致している(下記参照)。これに対して、構造的には関連しているが、非催奇性のステロイダルアルカロイドのトマチジン(図1、参考文献46を参照のこと、データを示さず)は、ジェルビンおよびシクロパミンの阻害濃度よりも2桁高い濃度においてさえHNF3βおよびIsl−1の発現を阻止することができない(図3C)。
【0305】
阻害化合物はShhプロセシングを阻止しない。
【0306】
中線外植片は誘導組織および応答組織の両方を含有するので、本発明らは、これらの阻害化号物のシグナル産生に対する可能な作用を、シグナル応答に対する可能な作用に対して区別することを計画した。Shhタンパク質は、内部切断を含み、アミノ末端産物(すべての知られているシグナル伝達活性に関与するShh−Np)をもたらす分子内プロセシング反応を受ける。この自己プロセシング反応の最初の段階は、前駆体内のカルボキシ末端配列によって媒介されるが、切断部位における内部再配置を引き起こして、切れやすいペプチド結合を、Cys側鎖を含むチオエステルにより置換する。第2段階において、コレステロールが、チオエステル中間体を攻撃する求核種(その3β−OH)を提供し、そしてShh−Npに対する付加物として共有結合したままにする(11、13)。従って、自己プロセシングは、活性なシグナルを放出するために必要とされ、そしてコレステロール付加物は、それを細胞表面に結合させることによってシグナルの組織分布を制限する(12、13)。
【0307】
ヘッジホッグタンパク質のジオゲネシス(giogenesis)におけるコレステロールのこの役割を考えた場合、これらの化合物のShh−Np産生に対する作用は特に興味のある可能性である。なぜなら、ジェルビンおよびシクロパミンは構造的にコレステロールと類似し(図1)、そしてAY9944およびトリパラノールは特異的に後期に作用するコレステロール生合成酵素を阻害する(17、18、19、22)。これらの化合物のShhプロセシングに対する潜在的な作用を調べるために、本発明らは、脂質欠乏血清で培養され、そしてエクジソンで誘導可能な制御のもとでのShhを発現させる安定な組込型構築物を有するHK293細胞を利用した(47)。このような細胞におけるShhタンパク質の発現は、エクジソンアナログであるムリステロンAを投与することによって誘導され得る。胚で認められるように、このタンパク質は効率的にプロセシングされ(図4A、レーン1および2)、前駆体(Mr45kD)の蓄積はほとんど検出できないほどである。24時間の誘導期間中におけるジェルビン、シクロパミン、トマチジン、AY9944またはトリパラノールの添加は、Shhシグナル伝達を完全に阻害するのに必要とされる投与量よりも5倍高い投与量においてさえ、Shh−Np産生を損なわず、プロセシングされない前駆体の蓄積を誘導しなかった(図4A、レーン4〜13)。これらの化合物の存在下で生成したアミノ末端切断産物のすべてが、培養培地ではなく、細胞溶解物において検出されたが(データを示さず)、コレステロール修飾Shh−Npと同じ電気泳動移動度を有する。これらの観測は、アミノ末端切断産物におけるステロール付加物の存在と一致する。なぜなら、そのような付加物が存在しないことは、培地への放出と関連し、そして低下した電気泳動移動度と関連するからである(プロセシングされていないアミノ末端フラグメントはShh−Nと示され、プロセシングされたShh−Npと区別される;レーン8、9、17を参照のこと)。さらに、本発明者らもまた、これらの化合物で処理された一過性トランスフェクションCOS−7細胞またはQT6細胞において、Shhプロセシングの効率またはShh−NPの挙動における変化を認めることができなかった(48)。本発明者らはまた、床板誘導後にジェルビンで処理されたヒヨコ胚が床板細胞内でのShhタンパク質の正常な先端局在化を示していることを認めた(49)。
【0308】
コレステロールとのそれらの構造的類似性により、本発明者らはまた、植物化合物のイン・ビトロ自己プロセシング反応に対する潜在的な作用を、精製した成分を利用して調べた。この反応で利用されたタンパク質は、ショウジョウバエShhのアミノ末端コード領域の6個のコドンを除くすべてが、ヘキサヒスチジン精製標識をコードする配列で置換されることによって得られる(10)。得られた29kDaのタンパク質(His6Hh−C)は、精製された形態で、コレステロールに依存する様式で自己プロセシングを受け、25kDの産物をもたらす(50)。図5Aに示されているように、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチジンはいずれも、コレステロールの濃度よりも27倍高い濃度においてさえ、コレステロールによって刺激されるこの自己プロセシング反応を阻害しない。これらの各植物化合物に3β−OHが存在する場合(図1)、本発明者らはまた、プロセシング中に求核性基を提供する際におけるコレステロールの置換がそれらにより可能であるかを調べた。図5Bに示されているように、認められるほどの切断は、コレステロールの非存在下でこれらの化合物を添加することによって刺激されない。
【0309】
AY9944およびトリパラノールなどのコレステロール合成阻害剤はプロセシングを阻害しないという観測は、処置した細胞に蓄積するコレステロール生合成前駆体(下記参照)はこの反応に関与し得る可能性をもたらす。図5Cは、イン・ビトロ反応は、コレステロールの効率と類似する効率で、デスモステロール、7−デヒドロコレステロール(7DHC)およびラトステロールにより進行し得ることを示している。デスモステロールおよび7DHCは、トリパラノールおよびAY9944でそれぞれ処置された細胞に蓄積することが報告されている主要な前駆体である。その一方で、炭素が30個のコレステロール前駆体であるラノステロールは、おそらくは3−ヒドロキシルに近いC4炭素に結合した2つのメチル基による立体的障害のためにこの反応に関与することができない。このイン・ビトロ反応の他の研究において、本発明者らは、立体障害のないヒドロキシルがステロール核での3β位に要求されることを認めたが、ステロール核における8位炭素の側鎖あるいは二重結合の数または位置は効率に大きく影響していないと考えられる(51)。これらの観測から、生合成経路における炭素が27個の中間体はすべて、自己プロセシング反応における潜在的な付加物であり、そして末端の合成阻害剤の存在下でのプロセシングの弱められていない効率を説明できることが示唆される。従って、培養細胞におけるShhプロセシングの程度およびイン・ビボでのその局在化はこれらの阻害化合物によって影響を受けていない(図4)と考えられるが、本発明者らは、ステロール付加物が異なり得る可能性および異常に改変されたそのようなシグナルが異なる生物学的特性を有し得る可能性を除外することができない。
【0310】
阻害化合物はShhシグナル伝達に対する応答に選択的に影響する。
【0311】
プロセシングの本発明者らの研究によって、これらの化合物のShhシグナル産生に対する阻害作用に関する証拠が得られるので、本発明者らは、これらの化合物が標的組織の応答に影響を及ぼすもう一方の可能性を調べた。この研究のために、本発明者らは、誘導シグナルの何らかの内因性供給源を有さない中間段階の神経板外植片を利用した(41、図6Aを参照のこと)。ステロール付加物を有さない組換えShh−Nタンパク質(45、52、53、54)は、背側細胞タイプで通常発現しているPax7などの分子マーカー抑制し(55、図6B、Cを参照のこと)、そして運動ニューロンおよび床板細胞で通常発現しているIsl−1およびHNF3βなどの腹側マーカーを誘導する(図6D、E)。これらの細胞応答は濃度依存的様式で高められ、Pax7の抑制が、HNF38の誘導に不十分なShh−Nの濃度(参考文献55、2nM、図6B、C)で認められ、Isl−1およびIsl−1を犠牲にして生じるHNF3βの誘導に不十分な濃度(図6Dにおける6.25nMのShh−NではIsl−1の誘導は6Eでの25nMで押さえられていることに注意すること)で認められる。
【0312】
催奇性化合物は、Pax7の抑制(2nMのShh−Nで;図6F〜I)ならびにIsl−1およびHNF3βの誘導(25nMのShh−Nで;図6)〜S)を完全に阻止することができる。さらに、トマチジンは、ジェルビンおよびシクロパミンによる完全な阻害に必要とされる濃度よりも100200倍高い濃度の場合のみを除いて部分的な阻害をもたらす(図6T)。Shh−Nに対する24nMでの応答を完全に阻害することには、2nMでの応答を完全に阻止するために必要とされる用量よりも2〜4倍高い用量の催奇性化合物が必要である;Shh−Nに対する応答の阻害には、Shhの濃度が高いほど、大きな薬物濃度が必要である。別の用量依存的作用が図6K〜Nに認めることができる。この場合、25nMでの応答(HNF3βの誘導)を完全に阻害するために必要とされる閾値に達しない2倍の薬物濃度によりIsl−1発現の保持または拡大が生じている。中間的な薬物濃度でのIsl−1の類似した拡大が、中線外植片の場合に認められた(図3D〜G)。このことは、Shh−Nによる一定レベルの刺激において、異なる度合いの経路の活性化が異なる阻害剤濃度で生じ得ることを示している。
【0313】
これらの化合物の特異性をさらに調べるために、本発明者らは、BMP7による神経堤様表現型の誘導に対するそれらの作用を調べた。BMP7シグナル伝達タンパク質は神経板に隣接する外胚様細胞で発現し、神経堤の誘導および背側神経管細胞の運命において機能しているようである956)。内因性の横からのシグナルの混入を避けるために、この研究に使用された外植片は腹側神経板から採取され、脊索および中線を除いた(図7A)。BMP7タンパク質を添加すると、神経堤細胞に特徴的な特徴(56)であるHNK−1表面抗原を発現する遊走性細胞の形成を誘導した(図7B、Cを比較のこと)。細胞遊走およびHNK−1の発現はいずれも、10μMのジェルビンの添加によって阻止されなかった(図7D)。この濃度は、Shh−Nシグナル伝達を完全にするために必要とされる濃度を越えている。類似する結果がトマチジンおよびシクロパミンを用いて得られた。これらの化合物はまた、背側神経板を含有する外植片、およびBMP活性の内因性供給源(56)として作用する連続する上皮性外胚様からの遊走性HNK−1陽性細胞の形成を阻害しなかった(49)。
【0314】
コレステロールホメオスタシスに対する薬物の作用。
【0315】
これまでの報告により、トリパラノールおよびAY9944は、コレステロール前駆体(主として、デスモステロールおよび7−デヒコレステロール(7DHC))の蓄積が、コレステロール生合成の後期で作用する酵素(それぞれ、デスモステロールΔ24レダクターゼおよび7DHCΔ7レダクターゼ;17、18、19、22)を特異的に阻害することによって生じることが示されている。さらに、ジェルビンの予備的な分析によって、コレステロール生合成に対する作用もまた明らかにされた(30)。これらの化合物のヒト初代リンパ芽球培養物に対する作用を直接比較すること(57)によって、トマチジンを含むこれらはすべて、コレステロールレベルの相対的な減少を引き起こし、そして他のステロール類のレベルを増大させていることが明らかにされた(表I、参考文献58)。
【0316】
表I。催奇性化合物は培養細胞でのコレステロールホメオスタシスを破壊する。コレステロール生合成は、催奇性化合物およびトマチジンの存在下で培養された初代ヒトリンパ芽球において阻害される(58)。これらの培養物から得られるステロール特性(57)によって、コレステロールの、炭素が27個、28個および29個の多数のステロール前駆体が蓄積していることが明らかにされる(59、60)。肝ガン細胞でのPM標識された[3H]コレステロールのエステル化もまた、これらの化合物のすべてによって阻害される(63)。
【0317】
【表1】
ステロール類の蓄積には、主として、コレステロール生合成経路の明らかにされた中間体、またはジオシンセティック(giosynthetic)酵素のこれらの中間体に対する作用により生成し得る非常に関連する化学種が含まれる(59)。トマチジンは、比較的高レベルの異常なステロール類が蓄積するとともに(60)、この一般則に対する例外であると考えられる。
【0318】
コレステロール生合成前駆体の蓄積と共役したコレステロールレベルの減少は、コレステロール生合成の2型阻害剤と呼ばれている一群の化合物について認められる作用である(61、62)。このような化合物は、原形質膜(PM)と小胞体(ER)との間でのステロール流束を阻害することによって作用していることが考えられる。コレステロール生合成酵素はERに局在化し、コレステロールのステロール前駆体はPMにおいて非常に濃縮されているので、輸送におけるそのような阻止はコレステロールレベルの全体的な減少をもたらす。本発明者らは、外部から加えられた3H標識コレステロールのエステル化(PMコレステロールのERへの輸送を必要とするプロセス)に対する合成化合物および植物化合物の作用を測定した(63)。本発明者らは、これらの化合物について25〜75%の範囲にわたるレベルのエステル化の阻害を認めた。AY9944のステロール輸送に対する作用が以前に報告されている(23)。しかし、これは、本発明者らがエステル化の阻害において調べた化合物の最も小さな活性である。従って、本発明者らのデータは、多数のコレステロール生合成前駆体の一般的な蓄積と一致して、輸送の阻害はステロール特性に対するこれらのすべての化合物の作用における1つの要因であり得ることを示唆している。しかし、さらに、AY9944およびトリパラノールは、7DHCΔ7レダクターゼ酵素およびデスモステロールΔ24レダクターゼ酵素に対するこれらの化合物のよく知られた作用と一致して、それぞれ、7DHCおよびデスモステロールの高レベルの蓄積を引き起こす。
【0319】
考察
コレステロール生合成の末端阻害剤の催奇性作用は知られており、30年以上にわたって研究されている(14、15)。同様に、シクロパミンおよびジェルビンは、ある種の植物Veratrum californicumの催奇性作用に関与する植物化合物として約30年前に同定された(28、29)。これらの化合物の最も劇的な催奇性作用は、単眼症および重篤な全前脳症(HPE)の他の特徴の誘導である;HPEはネズミおよびヒトの遺伝子座での変異によっても生じるという最近の発見によって、これらの化合物がShhシグナル伝達経路を阻止するように作用し得る可能性が示唆された。本発明者らの研究により、ヒヨコの胚におけるこれらの化合部のHPE誘導性が確認された。本発明者らは、これらの催奇性作用の初期の分子的相関をさらに調べ、これらの化合物がヒヨコの神経板外植片における腹側細胞タイプのShhタンパク質による誘導を阻止することを明らかにした。
【0320】
コレステロール生合成に対するこれらの催奇物質の阻害作用(17、18、19、22、30、上記参照)にもかかわらず、本発明者らは、これらの化合物はいずれも、培養細胞におけるShhプロセシングを妨げないようであり、そしてこれらの植物アルカロイドは、精製した成分を利用するイン・ビトロでのHhタンパク質の自己プロセシング反応に関与もせず、阻害もしないことを見出した。その代わり、外部から加えられたShh−Nが催奇性化合物の存在下で腹側細胞タイプを誘導しないことによって示されているように、影響を及ぼすのはShhシグナル伝達に対する応答である。さらに、外部から加えられたShh−Nタンパク質は神経板外植片における内因性Shhの遺伝子発現を誘導し得る(64、65)が、本発明者らは、床板細胞の誘導が起こらず、従って、内因性Shhの発現をもたらさない濃度である2nMのShh−Nにおいて、これらの催奇物質による応答の完全な阻害を明らかにした。これらの化合物の阻害作用は、下記から明らかなように用量依存的である:(1)Isl−1中間体の運命は、完全な阻害に必要とされる濃度よりも低い中間の阻害剤濃度で維持され、または拡大さえされること;および(2)従って、Shh−Nタンパク質の増大したレベルに対する応答を阻害するためには、より高濃度の催奇性化合物が必要とされること。これらの作用の特異性によってさらに示されることは、これらの化合物は、遊走、Pax7またはHNK−1の発現、あるいはShhシグナル伝達に対する応答を完全に阻止する濃度でのBMP7などの他の誘導シグナルに対する応答などの細胞挙動を阻止できないことである。
【0321】
ステロール合成およびステロール輸送の本発明者らの研究は、これらの化合物はコレステロール生合成の2型阻害剤として作用していることを示唆している(61)。しかし、いくつかの理由により、コレステロールレベルの単純な減少は、これらの化合物のShhシグナル伝達に対する作用を説明することができないようである。最初に、非催奇性化合物であるトマチジンもまた、コレステロール生合成に対する強力な阻害作用を示す。第2に、外植片におけるShhシグナル伝達は、デノボでのコレステロール生合成を阻害するヒドロキシステロールである25−ヒドロキシコレステロールによって阻害されない(66)。本発明者らはまた、薬物処理した細胞内に蓄積し得る特異的なステロール前駆体に対する阻害的役割を除外し得る。なぜなら、25−ヒドロキシコレステロールを阻害化合物とともに添加することによって、ステロール前駆体の合成がなくなるはずであり、Shhシグナル伝達に対する応答能が依然として回復しないからである(67)。コレステロールの単純な減少に対する別の機構は、細胞内輸送の破壊であると考えられる。
【0322】
本発明者らは、トリパラノール、ジェルビンおよびシクロパミンが、2型阻害剤としてそれらが分類されることと一致して、PMコレステロールのエステル化の強力な阻害剤であることもまた明らかにした。Shhシグナル伝達を阻害する際の薬物作用の機構としての輸送破壊と一致して、本発明者らは、いくつかの他の以前に特徴づけられた2型化合物もまた外植片におけるShhシグナル伝達に対する応答を阻害し得ることを見出した(68)。しかし、トマチジンもまたエステル化を阻止する。このことは、この輸送経路の一般的な阻害はShh応答に対する阻害作用にとって十分でないことを示している。本発明者らは、現在、この経路が、トマチジンおよび催奇性化合物によって示差的に影響を受ける多数の工程を含む可能性、およびShh応答に必須でないそのような工程のみがトマチジンによる影響を受ける可能性を検討している。トマチジンで処理された細胞に蓄積する異常なステロール類は、細胞内ステロール輸送に対するトマチジンのそのような示差的な作用と一致して、ペルオキシソームのステロール代謝と関連している(60)。
【0323】
コレステロールホメオスタシスに対するこれらの薬物作用を考慮すれば、Shhシグナル伝達経路の重要な調節因子であるPtcにおけるステロール感知ドメイン(SSD)の存在に注目することは興味深いことである(33)。PtcのSSDは、最初に、C型ニーマン−ピック病(NP−C)遺伝子に対する類似性領域として検出された(31、32)。PtcとNP−Cタンパク質との類似性は、Ptcの12個の提案されている膜貫通領域のすべてを含むように、SSDの5つの膜貫通領域にまたがって広がっている。この配列相同性の意味は不明であり、NP−CにおけるSSDの役割は明らかにされていないが、このタンパク質は、細胞内移動を調節することが提案されており、その機能喪失はリソソームのコレステロール蓄積をもたらす(69)。他のタンパク質のSSDは、高レベルおよび低レベルの細胞内ステロールに対して示唆的な応答をもたらす。従って、HMGCoAレダクターゼ酵素は、ステロール濃度の増加とともに、安定性を3倍〜5倍低下させる。この挙動はSSDの存在に依存している。SCAP調節因子タンパク質は、(高濃度ではなく)低いステロール濃度で、S2Pメタロプロテアーゼの活性を刺激し、SREBP転写因子の切断および活性化をもたらす。
【0324】
2型コレステロール合成阻害剤の調べられた阻害剤は、HMGCoAレダクターゼの活性を増大させて、SREBPの切断を刺激することが考えられる。これらの2つのタンパク質がERに局在化していることを考えれば、この作用に対して考えられる機構は、2型化合物によるPMからERへのステロール輸送の破壊により、全体的な細胞ステロール類のより高い濃度にもかかわらず、これらのERタンパク質における「低コレステロール」状態が誘導されることである。この場合、研究された催奇性化合物はすべて、コレステロール合成およびコレステロール輸送に影響を及ぼしている。従って、そのような化合物は、細胞内画分におけるステロールの正常な分布を変化させていることが考えられる。Ptcの機能が特定の画分におけるステロール濃度に大きく依存している場合、そのような画分における歪んだステロール分布は、Ptcの機能を、そのSSDを介して乱すように作用し得る。もう1つの可能性は、Shhシグナル伝達におけるPtcの機能は、関連するNP−Cタンパク質について提唱されているように、細胞内輸送の調節を含むことである。これが正しいとすれば、これらの催奇性化合物によって生じる輸送の乱れは、Shhシグナル伝達を阻害するような様式でPtcの輸送機能に影響を及ぼし得る。
【0325】
実施例1の参考文献
1.M.Hammerschmidt、A.Brook、A.P.McMahon、Trends Genet.13、14〜21(1997)。
【0326】
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【0364】
40.ヒヨコ受精卵(白色レグホン)を回転トレーに入れて、37.5℃の加湿孵卵器に14時間置いた。卵の気室部に穴を開けて、250μlの超音波処理した1mg/mlジェルビン溶液(ライボビッツL15培地、Gibco BRL)を殻膜下に加えた。穴にテープを貼り、さらに4日間、卵をインキュベーションした。胚をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、pH7.2)中で解剖した。頭部を胴から心臓の上部境界部で除き、3%グルタルアルデヒド(EMグレード、Polysciences,Inc.)を含む0.1Mカコジル酸ナトリウム(Polysciences,Inc.)、3mMのCaCl2(pH7.4)中、4℃で一晩固定した。0.1Mカコジル酸ナトリウム(pH7.4)で洗浄して、2%四酸化オスミウム(Polysciences,Inc.)、0.1Mカコジル酸ナトリウム(pH7.4)中に2時間置き、水で洗浄した。次いで、サンプルを、50%、70%、90%および100%のエタノールで順次脱水した。サンプルの液体CO2での臨界点乾燥(CPDモデル10、Polaron)を行い、金−パラジウムでのスパッタリングコーティング(Denton Desk IIユニット)を行い、20kVで操作されたAmray1810SEMで観察した。
【0365】
41.ハンバーガーおよびハミルトン段階9〜10(8〜10体節)の胚をすべての外植片アッセイに使用した。解剖をライボビッツL15培地(Gibco BRL)中で行った。ヘンセン節のすぐ口部側にあり、最終体節の十分な尾部側にある中線組織を細いはさみで取り出した。神経外胚様を側板中胚様から分離して、ジスパーゼ(Boehringer Mannheim、グレードII、2.4U/ml)で内胚様を処理し、次いでL15で洗浄した。中線外植片、中間神経板外植片および背側神経板外植片を、図3A、図6Aおよび図7Aに示されているようにタングステン針でさらに切開した。切開した組織をチャンバー型カバーガラスに移して、1X改変イーグル培地(Gibco BRL)および24mMのNaH2CO3(最終pH7.4〜7.6)を含有する1滴のコラーゲン(ビトロゲン100、Collagen Biomaterials、Palo Alto、CA)に入れ、(CO2の非存在下)37.5℃に30分間加温してゲル化させた。外植片を、N−2補充物(1X、Gibco BRL)ならびに100U/mlのペニシリンおよび100ug/mlのストレプトマイシンを含有する、グルタミン(Gibco BRL)を加えた400μlのF12栄養培地(ハム)において、5%CO2、37℃の加湿インキュベーターで培養した。AY9944、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミンおよびトマチジン(水溶性のAY9944を除き、すべて、95%エタノールの10mMストック溶液からである)、精製されたShh−NおよびBMP7を培養開始時に加えた。すべての外植片を40〜48時間培養したが、Pax7抑制についてアッセイされる中間神経板外植片は20〜22時間培養した。インキュベーション期間が終了したとき、外植片を、4.0%ホルムアルデヒド(EMグレード、Polysciences,Inc.)を含むPBS中、4℃で1時間固定して、PBSで洗浄し、そして二次抗体を用いて室温で2時間染色した。ウサギ抗ラットHNF3β(K2)を1:2000に、マウス抗ISL−1(40.2D6)を1:1000に、マウス抗pax7を1:10に、マウス抗ラットHNK−1/N−CAM(Sigma Biosciences)を1:1000に、FITC結合ロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)を1:100に、そしてLRSC結合ロバ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)を1:300にPBTSで希釈した。外植片を、開口数が1.4のプラナポ対物鏡を使用するオリンパスIX60倒立顕微鏡を用いて調べた。像を、488nmおよび568nmで励起するクリプトン−アルゴンレーザーを有し、450〜550nmおよび550〜650nmでの発光を伴う共焦点レーザー走査顕微鏡により、そしてSilicon Graphics Inc.社製プラットホームでのIntervissionソフトウエアを有するOzを利用することによって得た。
【0366】
42.A.Ruiz I Altaba、M.Placzek、M.Baldassare、J.Dodd、T.M.Jessell、Dev.Biol.170、299〜313(1995)。
【0367】
43.J.Ericson、S.Thor、T.Edlund、T.M.Jessell、T.Yamada、Science、256、1555〜1560(1992)。
【0368】
44.Y.Echelard他、Cell、75、1417〜1430(1993)。
【0369】
45.H.Roelink他、Cell、81、445〜455(1995)。
【0370】
46.W.Gaffield、R.F.Keeler、J.Natural Toxins、5、25〜38(1996)。
【0371】
47.エクジソン誘導の哺乳動物発現システム(Invitrogen)を使用してShhで安定的にトランスフェクションされたHK293細胞を、6ウエル培養プレート(Flacon、ウエル面積9.6cm2)内のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)、10%ウシ胎児血清(FBS)、400μg/mlのゼオシン(Invitrogen)、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、350μg/mlのG418(Invitrogen)に30〜40%のコンフルエンスで置床して37℃で生育させた。翌日、培地を、10%の脱脂質化血清(K.M.Gibson他、J.Lipid Res.31,515(1990))および1%のITS(Sigma)、そしてそれ以外は上記と同じものを含有する培地に変えた。24時間後、細胞を、1μMのムリステロンA(Invitrogen)の添加によりShhを発現するように誘導した。AY9944、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミンおよびトマチジン(水溶性のAY9944を除き、すべて、95%エタノールの10mMストック溶液からである)を誘導時に培養物に加えた。コントロール細胞には、50μMステロイダルアルカロイド処理における最大エタノール濃度に等しい0.475%のエタノールを与えた。さらに24時間後、培養上清を除き、細胞を、プレート内で、3XSDS−PAGE細胞溶解緩衝液(3%SDS)中で溶解し、水で2倍に希釈して煮沸した。溶解物サンプル(および別の実験では、上清サンプル、これに関するデータは示されていない)を分析のためにSDS−12%ポリアクリルアミドゲルに負荷し、Shh−Nおよびアクチンに対する一次抗体(Amersham)および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)で免疫ブロットし、そして発光基質(Pierce)で可視化した。
【0372】
48.一過性トランスフェクション細胞におけるShhプロセシングは非効率であり、50〜80%のShhタンパク質がプロセシングされない前駆体として蓄積する。このような状況のもとでさえ、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチジンのShhプロセシング効率に対する作用は全く認められなかった。
【0373】
49.未発表データ
50.Hh自己プロセシングのイン・ビトロ研究には、ショウジョウバエHhタンパク質の細菌発現誘導体を使用した(Porter 96A)。反応を記載(Porter 96B)に従って行ったが、ステロール類およびステロイダルアルカロイド類をエタノールストックまたはクロロホルムストックから乾燥させ、そして0.2%のトリトンX−100溶液に浴型超音波器で再懸濁して、反応混合物に加えた。
【0374】
51.コレステロールに対して同様な効率で反応に関与する他のステロールは、β−シトステロール、5−アンドロステン−3β−オール、エルゴステロール、4β−ヒドロキシコレステロール、19−ヒドロキシコレステロール、20α−ヒドロキシコレステロール、22(S)−ヒドロキシコレステロール、22(R)−ヒドロキシコレステロールおよび25−ヒドロキシコレステロールである。エピコレステロール、酢酸コレステロール、α−エクジソン、20−OHエクジソンおよびチオコレステロールは反応に関与することができない。
【0375】
52.C.−M.Fan、M.Tessier−Lavigne、Cell、79、1175〜1186(1994)。
【0376】
53.M.Hynes他、Neuron、15、35〜44(1995)。
【0377】
54.A.Lopez−Martinez他、Current Biology、5,791〜796(1995)。
【0378】
55.J.Ericson、S.Morton、A.Kawakami、H.Roelink、T.M.Jessell、Cell、87、661〜673(1996)。
【0379】
56.K.F.Liem、G.Tremml、H.Roelink、T.M.Jessell、Cell、82,969〜979(1995)。
【0380】
57.集めたヒトリンパ芽球を無血清RPMI−1640で洗浄し、次いで35mmマイクロウエル内の15%脱脂質化FBS(Gibson 90)含有RPMI−1640に置床して、37℃、5%CO2加湿雰囲気下で12時間培養した。次いで、AY9944、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチジンを加えて、細胞を5日間インキュベーションした。その後、中性ステロール類を抽出して、R.I.Kelley(Clin.Chim.Acta、236、45(1995))の記載に従って分析した。簡単に記載すると、ペレット化した細胞を、60℃で、4%(w/v)KOHを含み、キャリアとしてエピコプロスタノールを含む90%エタノール中で加水分解し、等量の水と混合して、ヘキサンで3回抽出した。ヘキサン抽出物を窒素下で乾固し、そしてビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミド(BSTFA、Pierce)を用いてピリジン中で誘導体化して、Hewlett Packard(HP)5890Aのスプリットレス注入ポート、0.2mmX25mのHP−1メチルシリコーン(0.33μm液相)キャピラリーカラム、および70eVの電子衝撃モードで操作され、200℃のイオン源温度のHP5970A質量選択的検出器を利用して、選択的なイオンをモニターするガスクロマトグラフィー/質量分析法(SIM−GC/MS)によって分析した。
【0381】
58.ステロール組成に対するそれらの作用を明らかにするために、AY9944およびトリパラノールを0.5μMで使用し、ジェルビン、シクロパミンおよびトマチジンを10μMで使用した。用量がこれらよりも低いほど、正常なステロール特性が得られた;これらよりも大きな用量はコレステロール前駆体の相対的レベルを増大したが、このアッセイの5日間のインキュベーション期間中の細胞生育を低下させた。
【0382】
59.ステロール1a、1c〜1g、2a、2b、3aおよび3bはすべて、正常なコレステロール生合成の中間体であり、1bは1aに由来すると考えられている(G.Salen他、J.Lipid Res.37、1169(19969))。
【0383】
60.ステロール1hは、ペルオキシソームのステロール合成に関与し、トマチジンで処理された細胞において特に顕著である。ステロール4は、トマチジンで処理された正常細胞においてのみ認められるが、ペルオキシソーム類を有さないツェルウェガー症候群患者のトマチジン処理細胞では認められない。ステロール4は、その構造がまだ完全に解明されていないジヒドロキシ−ケトステロールと考えられる。
【0384】
61.Y.Lange、T.L.Steck、J.Biol.Chem.269、29371〜29374(1994)。
【0385】
62.Y.Lange、T.L.Steck、Trends in Cell Biol.6、205〜208(1996)。
【0386】
63.肝ガン細胞における原形質膜[3H]コレステロールのエステル化をLangeおよびSteckに従ってアッセイした。簡単に記載すると、AH22肝ガン細胞を、25cm2フラスコにおいて約89〜90%の混合率にまで、DMEM、10%FBS中、37℃の条件で培養した。細胞をPBSで洗浄し、次いで1.38μCi[3H]コレステロール(3.17x10−5mmolコレステロール)を用いて、PBS中、37℃で10分間標識した。[3H]コレステロールを、2.5%のトリトンWR−1339、2.5mMのNaPi(pH7.5)および0.125Mのスクロースの攪拌した溶液に入れた。次いで、細胞を0.5mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)含有PBSで洗浄して、1.5時間、37℃で、DMEM 10%FBS中、AY9944、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチジンの存在下または非存在下でインキュベーションした。細胞をトリプシンで剥がし、洗浄して、1mlのPBSに懸濁した。次いで、ステロール類を2.5mlのクロロホルム:メタノール(2:1)で抽出して、高速真空濃縮器で乾固し、そして50μlのクロロホルムに再懸濁して、シリカゲルGがコーティングされたTLCプレート(Merck)にスポットした。コレステリルエステル類およびコレステロールをヘプタン:エーテル:酢酸溶媒(20:5:1)で分画化して乾固し、そしてI2蒸気で可視化して、かき取り、水性シンチレーション計数カクテル(Econo−Safe、Research Products International Corp.)中で直接計数した。
【0387】
64.E.Marti、D.A.Bumcrot、R.Takada、A.P.McMahon、Nature、375、322〜325(1995)。
【0388】
65.Thomas M.Jessell、私信
66.2nMまたは25nMのShh−Nによる処置に対する外植片の応答はいずれも、25μMの25−OHコレステロールを加えることによって影響を受けなかった。25−OHコレステロールは、HMG−CoAレダクターゼの強力な阻害剤であり、濃縮状態で、ヒヨコ胚および培養細胞システムにおけるデノボでのコレステロール合成を阻止する(データ不明;S.C.MillerおよびG.Melnykovych、J.Lipid.Res.25、991(1984);J.J.Bell、T.E.SargeantおよびJ.A.Watson、J.Bio.Chem.251、1745(1976)。
【0389】
67.25μMの25−ヒドロキシコレステロールを外植片培養物に加えることによって、どの催奇性化合物の阻害作用も逆転しなかった。
【0390】
68.2型コレステロール合成阻害剤は、投与濃度で、BMP7:U18666A0.25μM、クロロキン50μM、イミプラミン75μM、プロゲステロン20μMによるシグナル伝達を発生することなく、中間神経板外植片の25μMのShh−Nに対する応答を阻止する。
【0391】
69.P.G.Pentchev他、Biochimica et Biophysica Acta、1225、235〜243(1994)。
【0392】
実施例2:毛包形態形成時におけるSonicヘッジホッグの主な役割
毛包は、上皮幹細胞の供給源であり、いくつかのタイプの皮膚腫瘍の発生源である。濾胞が一連の誘導性組織相互作用によって生じることは明らかであるが、このプロセスを司るシグナル伝達分子の同定は依然として皮膚生物学における主要な課題である。本研究において、本発明者らは、毛包発達時における分泌型モルフォゲンSonicヘッジホッグ(Shh)の必須的な役割を報告している。表皮プラコードおよび会合した皮膚縮合体を含む毛胚が、コントールおよびShh−/−の両方の胚で検出されたが、濾胞発達のその後の段階を抜ける進行は変異皮膚では阻止されていた。GlilおよびPtc1の発現はShh−/−の皮膚縮合体において減少しており、それらは毛包乳頭にまで発達しなかった。このことは、隣接する間充織はプラコードを発生源とするShhの重要な標的であることを示している。毛包形態形成の完全な阻害にもかかわらず、後期の濾胞分化マーカーが、Shh−/−の皮膚移植片において、同様にShhシグナル伝達を阻止するためにシクロパミンで処理された培養触毛外植片において検出された。本発明者らの発見により、毛胚期から先の段階に発達が正常に進行するためにShhが必要であるという毛包形態形成時のShhの本質的な役割が明らかにされる。
【0393】
緒言
器官形成の初期段階は、隣接する上皮における間充織縮合体および限局的な細胞塊の出現、すなわち、プラコードの出現によって特徴づけられる。このプロセスは、上皮細胞集団と間充織細胞集団との間を移動する一連の誘導シグナルによって完了するまで続き、最終的には成体構造をもたらす(Gurdon(1992);Thesleff他(1995)における総説)。触毛および毛包などの皮膚付属物において、組織組換えの詳細な研究により、少なくとも3つの形態形成シグナルの存在が明らかにされている:胚の真皮は、上に重なる外胚様にプラコード形成を開始するように指示する;プラコードは、毛包誘発成分によって皮膚縮合体を生じさせるシグナルを発する;次に、縮合体がシグナルを発生期の濾胞ケラチノサイトに送り、その増殖、発達時における真皮への下方成長、および成熟した濾胞を形成するための再組織化を刺激する(Sengel(1976);Hardy(1992)における総説)。濾胞の上皮成分および間充織成分は、成熟した毛球のごく近くに留まり、その場所で、皮膚乳頭は、毛包の毛幹および内部毛根鞘における少なくとも6つの表現型的に異なる上皮細胞タイプを生じさせるマトリックス細胞によって囲まれている。生後、濾胞上皮は、活発な成長(成長期)、その後の退行(退行期)および不活性(休止期)の期間による周期を繰り返す(Cotsarelis(1997)における総説)。休止期から成長期に移行させる形態形成プログラムは、胚発生中の濾胞発達との類似性を有する。このことにより、この機構は、成体動物における器官形成の特定の局面を研究するための独特のモデルになる。非常に多数の遺伝子が毛包発達および毛包周期の様々な段階で関与している(RosenquistおよびMartin(1996);Sterm他(1996);Widelitz他(1997);Millar(1997)における総説)。しかし、濾胞形成をもたらす誘導シグナルの分子的性質はほとんど知られていない。
【0394】
潜在的なモルフォゲンをコードする転写物のインサイチュ局在化によって、表皮のプラコード、および初期の発達段階にあるいくつかの他の上皮におけるSunicヘッジホッグ(Shh)の限局的な発現が明らかにされ、そして仮想的なShhレセプターをコードするPtcl転写物もまた隣接する間充織細胞に存在していた(BitgoodおよびMcMahon、1995;Iseki他、1996;Oro他、1997;Motoyama他、1998)。これらの発見は、様々な発達プロセスにおける分泌型ヘッジホッグタンパク質に対する極めて重要な役割を示す蓄積された証拠(Hammerschmidt他(1997)における総説)と結びつけることによって、本発明者らに、毛包の形態形成におけるこの経路の潜在的な関与を検討させるきっかけとなった。濾胞は皮膚の幹細胞の供給源であり、いくつかの上皮皮膚ガンの発生源と考えられる(Cotsarelis他、1990;Lavker他、1993;Rochat他、1994;HansenおよびTennant、1994)ので、この器官の発生生物学を理解することによって、正常な皮膚機能ならびに傷害治癒および腫瘍形成に関する見通しを得ることができ、そして他の構造体を含む器官形成の基本的な局面も同様に解明することができる。
【0395】
方法
動物および皮膚移植
Shh変異マウスの作製および同定を記載(Chiang他、1996)に従って行った。胚皮膚を、以前に記載された技術(Dlugosz他、1995)の改良型を使用した、保護シリコーンチャンバーの下部で、ヌードマウスの背側筋膜に移植した。移植した11〜12日後にチャンバーを除き、さらに1〜4週間経った後に組織を分析のために採取した。動物の取り扱いはNIHのガイドラインに従った。
【0396】
免疫組織化学
ケラチン類(KI、K10、K5、K14およびK17)、ロリクリンおよびフィラグリンを検出するために、組織をCarnoy液またはBouin液で一晩固定した:中性緩衝化ホルマリンによる固定を、Lef−1抗体、Ki67抗体および毛ケラチン(AE13)抗体で免疫染色される組織に使用した。サンプルをパラフィンに包埋して、8m切片を免疫染色のために切断した。ホルマリン固定切片における抗原の免疫反応性を、沸騰した0.01Mクエン酸緩衝液(pH6)にスライドを10分間浸すことによって回復させた。その後、一次抗体を、免疫染色のために指示された希釈度で使用した:ウサギ抗ケラチンK1、K10、K5およびK14(1:500)(Roop他、1984)、ロリクリンおよびフィラグリン(1:500)(Roop他、1987)、これらはStuart Yuspa博士により提供された;ウサギ抗K17(1:1000)(McGowanおよびCoulombe、1998)、これはPierre Coulombe博士により提供された;ウサギ抗Lef−1(1:200)(Travis他、1991)、これはRudolf Grosschedl博士から贈与された;ウサギ抗Ki67、NCL−Ki67p(Novocastra Laboratories,Ltd.、Newcastle upon Tyne、英国)(1:200);およびI型毛ケラチンを含有するマウスモノクローナルAE13ハイブリドーマ上清(1:5)(Lynch他、1986)、これはTung−Tien Sun博士により提供された)。組織切片を、1%ウシ血清アルブミンを含有するトリス緩衝化生理食塩水で希釈した一次抗体と、通常は1〜2時間、室温でインキュベーションした。その後の免疫染色手順を、製造者の説明書に従い、ペルオキシダーゼVectastain ABCキット(Vector Laboratories,Inc.Burlingame、CA)および基質としての3,3’−ジアミノベンジジン(Sigma、St.Louis、MO)を使用して行った。切片をヘマトキシリンで対比染色し、Permount(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)を使用して固定した。
【0397】
インサイチュハイブリダイゼーション
非放射性RNAインサイチュハイブリダイゼーションを、主には記載(Groves他、1995)に従い、Glil(Walterhouse他、1993)、Ptcl(Goodrich他、1996)およびBMP−4(Jones他、1991)の以前に記載された配列を使用して5m切片で行った。
【0398】
触毛濾包外植片
触毛濾包外植片を、以前に記載されたものに少々改良を加えたプロトコル(Hirai他、1989)に従い、妊娠13.5日目のCD−1マウス胚を使用して成立した。触毛パッドをNucleporeフィルター(13mm、8m孔)に移し、6ウエルプレートに入れた2mlの培地[DMEM(Life Technologies、Gaithersburg、MD)+ハムF12培地上(Life Technologies)(1:1)、1%のFCS(Intergen、Purchase、NY)、ペニシリン(50ユニット/ml)およびストレプトマイシン(50gg/ml)(Life Technologies)]に浮かせた。類似する結果が、DMEM基本培地を使用して、ハムF12を添加することなく得られた。外植片に新鮮な培地を2日毎に与えた。顕微解剖をニコンSMZ−2T立体顕微鏡のもとで行い、顕微鏡写真を、オリンパスOM−4カメラを使用して撮影した。シクロパミンは、−20℃で、95%EtOHの10mMストックとして保存した。
【0399】
RNA単離およびRT−PCR
TriZol(Life Sciences)では、単体の外植片を溶解し、また同社の推奨通り単離する事によってRNAを取得した:cDNAを、ランダムプライマー(Life Technologies)とともにSuperScript II Rnase H逆転写酵素を使用して合成し、RT−PCRを、下記のプライマーを使用して行った:MHKA1(318bpの産物)、(順方向5’−ATCAGAGAATGCCAGGTTGG−3’および逆方向5’−TCATTGAGCACACGGTTCAG−3’);hacl−1(308bpの産物)(順方向5’−TTGTATCTCCACTCCTGCCC−3および逆方向5’−AGACTCCACAGGTTGGTTGG−3’);プロフィラグリン(330bpの産物)(順方向5’−GCTTAAATGCATCTCCAG−3’および逆方向5’−AGTCAGTCCTATTGCAGG−3’)(Bickenbach他、1995);Pアクチン(421bpの産物)(順方向5’−TACCACAGGCATTGTGATGGA−3’および逆方向5’−CAACGTCACACTTCATGATGG−3’)(Walterhouse他、1993)。下記のPCR条件をMHKA1、Hacl−1およびアクチンに対して使用した:95x3分「ホットスタート」;95x50秒、58x30秒および72x60秒、25サイクル(アクチン)または35サイクル(HMKA1およびHacl−1);プロフィラグリンプライマーに対する72x7分のPCR条件は以前の記載(Bickenbach他、1995)の通りであった。反応産物を1.5%アガロースゲルに流し、臭化エチジウムで可視化した。
【0400】
結果および考察
毛包発達の初期段階はコントロールおよびShh−/−の胚で類似していた。皮膚縮合体を伴う発達中の真皮に突き出た円柱状の基底ケラチノサイトのクラスターからなる毛胚が、変異胚および妊娠15.5日目の胚の両方の皮膚で検出された(図8A、B)。コントロール毛胚とShh欠損の毛胚との類似した形態にもかかわらず、遺伝子の発現パターンにおける非常に大きな差が、インサイチュハイブリダイゼーションによって明らかにされた。GlilのmRNAレベルは、Shh−/−の始原毛胚の上皮成分および間充織成分の両方で著しく減少していた(図8C、D)。さらに、いくつかのプラコードはバックグラウンドよりもわずかに大きなレベルを含有していたもののPtclの発現はShh変異毛胚において減少していた(図8E、F)。これらの発見は、ShhがGlilおよびPtclの両方の正の調節因子として同定された以前の報告(MarigoおよびTabin、1996;Marigo他、1996;Lee他、1997;Sasaki他、1997)と一致しており、Shhが発達中の濾胞の上皮細胞および間充織細胞の両方でシグナル伝達していることを示唆している。GlilおよびPtclとは対照的に、BMP−4のmRNAは、変異胚およびコントロール胚の縮合体において明らかに検出可能であった(図8G、H)。これは、BMP−4発現の誘導の際にはShhが必要であることに対する反証である。従って、Shhは毛包発達を開始させるために必要ではなく、Shh変異皮膚において生じる始原毛胚は、少なくともいくつかのShh標的遺伝子が発現していない。
【0401】
コントロールの胚において、E15.5とE17.5との間は、濾胞上皮の塊が7倍増大することおよび異なる細胞画分への再組織化を伴う濾胞の急激な増殖および発達中の真皮への下方成長によって特徴づけられる。大部分の成熟した濾胞において、成熟した濾胞において外側毛根鞘を生じさせる最も末梢側の細胞層におけるケラチノサイトは、発達中の濾胞の長軸に直交する円柱状配置を取っている;中央に位置する細胞は、この段階では一定した配向を有していないが、最終的には、内側毛根鞘細胞の3つの同心的な層、および毛幹を含む3つの細胞タイプによって置換される;濾胞の最深部の上皮細胞、すなわち、将来の毛球は、この段階では、間充織細胞の明瞭なクラスターである皮膚乳頭を囲んでいる(図9A、矢印)。ほとんど成熟していない濾胞でさえ、間充織細胞の組織化された「キャップ」がその陥入端に示されている(図9A、矢じり部)。著しく対照的に、E17.5での変異胚に由来する皮膚の毛包は、E15.5で認められる毛胚期よりも先に発達しなかった(図9B)。濾胞上皮はその成長がないために最も明らかに影響を受けたが、組織化中の皮膚縮合体および皮膚乳頭は変異皮膚には明らかに存在していなかった。これらの結果は、上皮に由来するShh(BitgoodおよびMcMahon、1995;Iseki他、1996;Oro他、1997;Motoyama他、1998)は、毛包の間充織成分の発達を調節するパラクリンシグナルとして機能しているという考えと一致する。濾胞形成の阻害は、皮膚発達の一般的な破壊によるためであるとは考えられない。なぜなら、顆粒状の角質化した細胞層の出現によって特徴づけられる表皮形態形成がコントロール胚および変異胚の両方でE17.5までに生じたからである(図9A、B)。
【0402】
さらなる研究を、Shhが胚皮膚における上皮分化マーカーの発現に影響しているかどうかを明らかにするために行った。発達中の毛包におけるケラチノサイトは、周囲の表皮基底細胞に豊富に存在するケラチン類であるK5およびK14が相対的に欠乏していることによって識別することができる(KopanおよびFuchs、1989;Byrne他、1994)。E17.5胚の免疫組織化学的染色により、コントロールの胚における正常な濾胞を含む細胞の部分集団でのK14レベルは、Shh−/−の胚で認められる原始濾胞と同様に大きく減少しているか、または検出できないほどであることが明らかにされた(図9C、D;矢印)。さらに、濾胞内表皮では通常は検出されず、発達中の毛包および成熟した毛包で発現しているK17(Pantelyev他、1997;McGowanおよびCoulombe、1998)が、コントロールおよび変異の両方の皮膚における濾胞上皮に局在化していた(図9E、F)。従って、Shh−/−の皮膚における毛包の形態形成は毛胚期よりも先に進行しないが、これらの構造体は、発達中の濾胞ケラチノサイトに特徴的な最終の分化プログラムを開始している上皮細胞を含有している。図9Aおよび9Bの形態学的な発見と一致して、Shh−/−皮質表皮に特異的な分化マーカー(ケラチン1および10、ロリクリンならびにフィラグリン)の発現レベルは、免疫組織化学的染色に基づいて、コントロールの表皮に類似しているか、またはそれよりも大きかった(データを示さず)。
【0403】
Shh−/−マウスは生存できないので、変異皮膚の生後分析を、ヌードマウスへの移植後に行った。コントロールマウスから得られた皮膚は大量に色素沈着した毛をもたらしたが、移植されたShh−/−皮膚は、検出できるほどの毛を生成させることができず、ドナーの皮膚の系統と一致して、色素沈着した移植部位が認められた(図10A)。コントロール皮膚移植片の組織学により、無数の毛包および皮脂腺を含む、正常なマウス皮膚に認められる代表的な構造体が明らかにされた(図10B)。驚くべきほど対照的に、変異皮膚では、正常な外観を有する濾胞、毛幹または皮脂腺が得られず、いくつかの場合(全部で7つのShh−/−移植片の内、3つ)において、角質増殖症の限局的な領域を伴う肥厚した表皮が認められた(図10C)。貧弱な細胞質を有する好塩基性細胞の著しい塊がこれらの変異移植片の皮膚−表皮接合部で検出された(図10C、矢印)。注目されることに、Shh欠乏ケラチノサイト塊における細胞の形態は、コントロールの毛球における細胞を連想させるものである。さらなる分析により、生化学的類似性が明らかにされた。これらの塊内の細胞はK5抗体と反応せず(図10D、矢印)、核でのLef−1の多量の発現を示し(図10E)(Zhou他、1995)、そしてKi67の免疫染色によって検出される大きな割合の増殖細胞を含有していた(データを示さず)。注目されることに、発育不全の毛幹に似ている短い円柱状構造体には、Shh変異のケラチノサイト塊のいくつかが伴っていた。さらに、これらの構造体は、毛に特異的なケラチンを発現していた(図10F)。このことは、濾胞分化プログラムの進行した段階が、正常な形態形成が大きく破壊されたにもかかわらず達成されたことを示している。希ではあるが、図10Eに示されているように、間充織細胞の小さなクラスターがケラチノサイト塊の基部を伴って認められた。この場合、これらの細胞はLef−1抗体で免疫染色される。これらの発見は、未発達の皮膚乳頭が、Shh変異移植片において認められる毛胚の少なくともいくつかに存在することを示唆している。
【0404】
濾胞発達中のShhの一時的な要求性をより十分に明らかにするために、組織培養研究を、シクロパミンを使用して行った(GaTieldおよびKeeler、1996)。シクロパミンは、最近、神経板外植片でのShhシグナル伝達を阻止することが明らかにされている(Cooperほか、1998;Incardona他、1998)。外植片を、妊娠13.5日のマウスから得られた触毛パッドを使用して樹立した(Hirai他、1989)。6〜8日間培養して生育させた場合、外植片は活発な形態形成を行い、伸びた極めて正常な外観を有する触毛濾胞が得られた(図11A)。これらの濾胞は毛幹を含有し、マウスの毛ケラチンA1(MHKA1)(Kaytes他、1991)および毛皮質に特異的なマーカーHacl−1(Huh他、1994)をコードする遺伝子を発現していた。これらはRT−PCRで検出された(図11B)。シクロパミンによる外植片の処理によって、形態形成は驚くべきほど阻害された。このことは、Shhシグナル伝達が、触毛の濾胞発達の毛胚期の期間中またはその直後に必要とされることを示している(図11C)。Shh変異皮膚を使用して得られた本発明者らの結果と一致して、毛に特異的な転写物が、シクロパミンで処理された外植片において、その変化した発達にもかかわらず検出された(図11B)。これは、濾胞の生化学的分化はその形態形成と必ずしも連携していないという考えを裏付けるものである。コントロールの外植片およびシクロパミン処理した外植片はともにプロフィラグリンmRNAを蓄積する。このことは、Shhシグナル伝達の破壊によって表皮の分化は阻害されないことを示している。
【0405】
まとめると、本発明者らの結果は、毛包の形態形成が毛胚期の発達よりも先に進行する際のShhに対する必須的な役割を明らかにする。Shh−/−の皮膚縮合体におけるPtc1およびGlilの低下した発現は、認識可能な皮膚乳頭に進化しないことと一緒になって、Shhは毛包の間充織成分の発達を調節することに関与していることを示しているが、濾胞の上皮成分におけるShhシグナル伝達が必要であることを除外することができない。皮膚乳頭の非存在下では、正常な毛包の形態形成は進行しない。このことにより、発達中の濾胞上皮の成長および再構築に対するこれらの細胞が有する重大な影響が強く示される(Jahonda他、1984;Weinberg他、1993)。注目されることに、濾胞の生化学的分化が正常な形態形成の非存在下で生じ得る。このことは、この2つのプロセスがこの器官では独立して調節されていることを意味する。さらなる実験が、発達中の濾胞のどの成分がShh−/−の胚において機能的に弱められているかを明確にするために、そしてShhが、濾胞発達の後期あるいは毛周期中においてさらなる役割を有しているかどうかを決定するために必要である。本発明者らは、これらの研究は、究極的には、ケラチノサイトでのShhシグナル伝達経路の構成的な活性化が基底細胞ガンの形成にどのように寄与しているかを説明するのに役立ち得ると考える(Johnson他、1996;Hahn他1996;Oro他、1997;Fan他、1997;Xie他、1998)。
【0406】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
実施例3:ptcの機能喪失表現型の回復
上記の結果に基づいて、本発明者らは、シクロパミンが作用するShhシグナル伝達経路での部位を決定すること、従って、本発明の化合物で潜在的に処置することができ、Shh経路を活性化する病変によって引き起こされる腫瘍の範囲をよりよく理解することを試みた。
【0407】
この研究には、patched(ptc)+/−の交配から得られたE8.5の胚をトリプシン消化することによって作製されたマウス胚性繊維芽細胞(MEF)の使用が含まれる。マウスのptc遺伝子を、エキソン1の一部およびエキソン2のすべてが細菌のlacZ遺伝子によって置換される相同組換えにより破壊した(Goodrich他(1997)、Science、277:1109)。Ptcタンパク質はShhシグナル伝達を抑制するので、その機能喪失によってShhシグナル伝達経路が活性化される。Shhシグナル伝達は、一連の事象を介して、Gli転写因子により媒介される。Shhシグナル伝達の標的遺伝子の1つはptcであり、ptcプロモーター領域内のGli結合部位を介する。これは、シグナル伝達のダウンレギュレーションに対するフィードバック機構として作用する。従って、このptc−/−胚において、Shhシグナル伝達経路は多くの組織で活性化され、lacZ遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼが経路活性化のレポーターとしてそのような組織のすべてで発現する。
【0408】
本発明者らは、シクロパミンがPtcまたはこのカスケードの別の成分に作用してShhシグナル伝達を阻害するかどうかを明らかにするためにこのようなMEFを得た。シクロパミンの標的がPtcであるならば、Shh経路がptc機能の喪失により活性化されたときに、Shh経路はシクロパミンでもはや阻害され得ないことが予想される。図12は、Shhシグナル伝達経路が細胞培養中のこのような繊維芽細胞で活性化され得ること、およびβ−ガラクトシダーゼの活性レベルが経路活性化の程度を反映していることを示している。MEF株23−4はptc−lacZに関してヘテロ接合型である。従って、経路の抑制された状態を維持し得る1つの機能的なptc対立遺伝子を含有するが、Shhタンパク質の添加によって経路が活性化されたときにlacZを発現する(図12参照)。
【0409】
これに対して、ptc−lacZに関してホモ接合型であるMEF(細胞株23−1)のβ−ガラクトシダーゼ活性は、この細胞の場合、経路が機能的なptc対立遺伝子の喪失により構成的に活性化されているために著しく上昇している(図13)。この細胞をシクロパミンとともに培養すると、β−ガラクトシダーゼ活性は低下する。このことは、Shhシグナル伝達経路がPtc抑制により調節されていない場合、Shhシグナル伝達経路は、シクロパミン阻害に対して依然として感受性であることを示している。β−ガラクトシダーゼ活性の低下は、細胞毒性からではなく、むしろShhシグナル伝達の特異的な阻害から生じていると考えられる。なぜなら、酵素活性はサンプルの総タンパク質含有量に対して規格化されているからである。さらに、β−ガラクトシダーゼ活性の低下を、平均的な細胞周期よりも短い期間にわたってシクロパミンに曝すことによって得ることができる。従って、β−ガラクトシダーゼ活性の低下は細胞増殖の阻害のためだけであるとは考えられない(図14)。
【0410】
本発明がShhシグナル伝達の特異的な阻害を示す最後のものは、Shhシグナル伝達が、阻害性ではないが、構造的に関連する化合物のトマチジンで阻害され得ないことである(図15)。
【0411】
上記に引用された参考文献はすべて、それらにより参考として本明細書中に援用される。
【0412】
均等物
当業者により、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書中に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物が認識されるか、または見出され得る。そのような均等物は、添付した請求項によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、植物ステロイドアルカロイドジェルビン、シクロパミンおよびトマチジンの、およびコレステロールの合成化合物AY9944およびトリパラノールの構造を示す
【図2】 図2は、ジェルビン(4)に暴露されたニワトリ胚で誘導された全前脳を示す
【図3】 図3は、合成および植物由来テトラジェンが外植ニワトリ組織における外因性Shhシグナリングをブロックする(41)ことを示す
【図4】 図4は、奇形発生化合物がイン・ビボでShh自己プロセッシングを阻害しない(47)ことを示す
【図5A】 図5Aは、〜25kD Hh−C産物(レーン2−27)および〜5kD NH2−末端産物(このゲルでは解像されず)を生じさせるためにステロールを添加せず(レーン1)または12μMコレステロールを添加して30℃で3時間インキュベートしたバテリカリに発現されたHis6Hh−C蛋白質(〜29kD)のイン・ビトロ自己プロセッシング反応を示すクーマシーブルー染色SDS−ポリアクリルアミドゲルを示す
【図5B】 図5Bは、ステロールの不存在下で行う場合(レーン1)、またはこれらのステロイドアルカロイドの324μM濃度においてさえ(レーン5、9および13)、ジェルビン(レーン2−5)、シクロパミン(レーン6−9)およびトマチジン(レーン10−13)の存在下で、His6Hh−C自己切断反応が進行しないことを示すクーマシーブルー染色したSDS−ポリアクリルアミドゲルを示す
【図5C】 図5Cは、50mMジチオスレイトール(レーン2)、12μMコレステロール(レーン3)、12μM 7デヒドロコレステロール(レーン4)、12μMデスモステロール(レーン5)、12μMムリステロン(レーン9、10)にて、ステロールの不存在下で(レーン1)行ったHis6Hh−C自己切断反応のクーマシーブルー染色SDS0ポリアクリルアミドゲルを示す
【図6】 図6は、奇形形成化合物が外因性Shh−N蛋白質に対する神経外胚葉応答を阻害する(41)ことを示す
【図7】 図7は、ジェルビンがBMP7に対する神経外胚葉を阻害しない(41)ことを示す
【図8】 図8は、対照およびShh−/−初代毛髪胚芽の形態学および遺伝子発現パターンを示す
【図9】 図9は、Shh−/−マウス皮膚における毛包形態発生の阻害を示す
【図10A】 図10Aは、移植後6週間のヌードマウス移植部位の大きな出現を示す
【図10B】 図10Bは、H&E染色を示す
【図10C】 図10Cは、H&E染色を示す
【図10D】 図10Dは、免疫組織化学を示す
【図10E】 図10Eは、免疫組織化学を示す
【図10F】 図10Fは、免疫組織化学を示す
【図11】 図11は、シクロパミンは外植体において鼻毛嚢形態発生を損なうことを示す
【図12】 図12は、ShhNpと共に5日間インキュベートしたPtc+/−MEFのグラフを示す
【図13】 図13は、シクロパミンで3日間培養したPtc−/−MEFs23−1のグラフを示す
【図14】 図14は、シクロパミンで16時間培養したPtc−/−MEFs23−4のグラフを示す
【図15】 図15は、トマチジンで16時間培養したPtc−/−MEFs21−4のグラフを示す
Claims (18)
- 細胞の過剰な増殖状態を阻害するために使用される請求項1記載の組成物。
- イン・ビトロで細胞に前記化合物を接触させることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- イン・ビボで細胞に前記化合物を接触させることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 治療または化粧適用の一部として投与されることを特徴とする請求項1または2記載の組成物。
- 神経組織の調節、骨および軟骨の形成および修復、***形成の調節、平滑筋の調節、原始腸に由来する肺、肝臓および他の器官の調節、造血機能の調節、または皮膚および毛髪成長の調節のために投与されることを特徴とする請求項1または2記載の組成物。
- 上皮細胞の異常増殖を阻害するために皮膚への局所製剤として適用されることを特徴とする請求項1または2記載の組成物。
- 前記過剰な増殖状態が、ヘッジホッグ経路の異常活性化によるものであることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 前記過剰な増殖状態が癌であることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 前記癌が皮膚癌であることを特徴とする請求項9記載の組成物。
- 前記癌が基底細胞癌であることを特徴とする請求項9記載の組成物。
- 前記癌が髄芽細胞腫であることを特徴とする請求項9記載の組成物。
- 前記癌が膵臓癌であることを特徴とする請求項9記載の組成物。
- 動物において異常な発毛を阻害するために使用される請求項1記載の組成物。
- 局所投与用に製剤化されていることを特徴とする請求項14記載の組成物。
- 前記化合物が、1mM以下のED50でヘッジホッグ媒介シグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項1から15いずれか1項記載の組成物。
- 前記化合物が、1μM以下のED50でヘッジホッグ媒介シグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項1から16いずれか1項記載の組成物。
- 前記化合物が、1nM以下のED50でヘッジホッグ媒介シグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項1から17いずれか1項記載の組成物。
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