JP5066056B2 - 試料観察方法、及び電子顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は電子顕微鏡の撮像方法に係り、特に広い領域を解像度良く記録するために連続する視野を複数回、撮像して各視野をつなぎ合わせる電子顕微鏡に関するものである。

電子顕微鏡において、広い領域を解像度良く記録するために、所望の解像度となる高倍率で連続する視野を複数回、撮像し各視野をつなぎ合わせて一枚の画像に構成する連続視野撮像（つなぎ写真）を行う手法がある。この連続視野撮像を行うための手法が、特許文献１に開示されている。

特許文献１には、予め、撮像倍率と撮像回数（縦および横方向の撮像枚数）と隣接する視野の重なり量を指定することによって、自動的に視野移動（ステージ移動）と同期して撮像処理を行う方式が提示されている。

また、特許文献２では撮像する連続視野全体の領域の頂点座標を指定することで、自動的に撮像回数を算出するとともに自動的に視野移動（ステージ移動）と同期して撮像処理を行う方式を記載してある。また、特許文献１においては、連続撮像する視野領域を表示する機能についても提示されている。

特開昭６１−１２６７５０号公報 特開平４−１８４８４９号公報

特許文献１，２共に、観察対象を包含する矩形、或いは矩形形状の組み合わせによって形成される領域内を掃引するように、複数の撮像視野を設定すると共に、各視野間を重ね合わせる例が説明されている。しかしながら、このような手法では、上記領域内を漏れなく撮像することになるため、本来含む必要のない領域まで、撮像視野を設定することになり、効率が悪い。

以下に、観察対象となる試料の観察に要する個所に対し、選択的に観察視野を割り当てることを目的とする試料観察方法、及び電子顕微鏡について説明する。

上記目的を達成するために、以下に電子顕微鏡像上にて輪郭線、或いは当該輪郭上に位置する複数の点を設定する行程と、当該輪郭線に沿って電子顕微鏡の複数の視野を配列する行程を備えた試料観察方法、及び当該方法を実現するための装置を提案する。

種々の形状を有する観察対象に対し、必要な輪郭線を設定した上で、視野を配列することで、観察対象の形状に沿った必要な視野設定に基づく電子顕微鏡像を選択的に取得することが可能となる。

上記構成によれば、観察対象の形状に依らず、適切に複数の視野の配列を行うことが可能となるので、必要な視野像を効率良く取得することが可能となる。

以下に、低倍率像（第１の画像）上にて、高倍率像（第２の画像）の視野を設定を行う方法、及びそれを実現するための透過電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope：ＴＥＭ）、及び上記方法を実行するためのコンピュータプログラムについて説明する。

低倍率像上にて、縦方向及び横方向に連続的に視野（Field Of View：ＦＯＶ）を配列する場合、その配列されたＦＯＶの集合は、正方形、或いは長方形の矩形状となり、例えば対象物が細長くて斜め方向に存在している場合や対象としている連続する視野が曲線状に繋がっている場合などは、不必要な視野を撮像してしまうため非効率である。つまり、不必要な撮像処理を行うだけの時間と不必要な撮像結果を記録するフィルムやＣＣＤ素子等を用いて撮像した場合には画像データ用のメモリ容量を充分に確保しなければならなかった。また、連続している視野領域をどのような視野ごとに撮像されているかの表示機能がなく事前に確認することができなかった。さらに繰り返しの撮像処理の進捗を確認することができなかった。

撮像領域が長方形の形状であるために、連続する視野を撮像していく場合には、この撮像領域の縦および横方向に所定の重なり量となるように視野移動を行っていた。すなわち、視野移動の方向が撮像領域の縦および横方向に一致していた。即ち視野が縦横に連続的に配列されているが故に、不要な部分にまで視野を配置してしまうことになり、非効率であった。

本実施例では、低倍率像上にて、輪郭線、或いは当該輪郭に沿って複数の点を設定することで、高倍率像の視野を必要な個所に適切に配列させることが可能となる。更にこの視野移動の方向は、試料ステージ制御による方式や電磁的に電子線を偏向して視野移動を行う方式にしても任意方向で移動可能であるので、視野移動の方向を視野ごとに指定できる手段を設けることで任意の方向で隣接する視野が所定の重なり量を確保して連続した視野を撮像することができる。

視野移動の方向を指定できる手段としては、対象とする全視野領域を表示させて各撮像に必要な領域が含まれるように視野位置を複数点または連続で指定できる入力手段を設けることで可能となる。また、各撮像領域を前記表示と重ね表示する手段を設け、各領域が撮像完了の都度、該表示を異ならせる表示制御とすることで各撮像視野の確認と撮像処理の進捗を可視化することができる。

以上のような構成によれば、対象物の形状に沿って視野の移動方向を変化することができるので、各視野を効率的に連続撮像することができる。すなわち、不必要な撮像処理を行うだけの時間を短縮でき、不必要な撮像結果を記録するフィルムを無くし、ＣＣＤ素子等を用いて撮像した場合には画像データ用のメモリ容量を不必要に確保する必要がなくなる。このために煩雑な画像データをつなぎ合わせる作業も必要最低限のデータだけとなり効率的な作業となる。

また、連続視野の撮像処理の回数，各撮像視野位置，進捗状況が可視化されて認識できることは、操作性向上につながる。

図１は、電子顕微鏡の構成を示した一実施例である。

以下の説明はＴＥＭに関するものであるが、他の電子顕微鏡（走査電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ），走査透過電子顕微鏡（Scanning Transmission Electron Microscope：ＳＴＥＭ)）への適用も可能である。

図１において、電子銃１より放出された電子線は、照射レンズ２によって集束され、試料ステージに保持されている試料３に照射される。該試料３を透過した電子線は、結像レンズ系４によって拡大され、蛍光板５または撮像装置６内にあるシンチレータ上に結像される。シンチレータに結像された拡大像は、該撮像装置内にある光学レンズやファイバープレートを介してＣＣＤなどの撮像素子で撮像されて電気的な信号（画像信号）に変換される。該画像信号は、インターフェース９ｃを介してＰＣ１１で読み込まれて、モニタ１４に画像として表示される。このとき、インターフェース９ｃを介して出力された画像信号は、ＰＣ１１により、メモリ１２に画像データとしても保存することができる。なお、以下の説明では、ＴＥＭの制御主体を単に「制御装置」とすることもある。

ＰＣ１１には、メモリ１２，演算装置１３，条件の指定などに用いるキーボードやマウスのような入力装置１０およびモニタ１４が接続されている。また、試料３を保持し、かつ、移動するための試料ステージ駆動部７は、インターフェース９ａ部を介してＰＣ１１によって制御されている。さらにＰＣ１１は、電子銃１，照射レンズ２，結像レンズ系４なども制御している。

以上のような構成において、具体的な実施形態を以下に説明する。

試料の撮像に際し、試料３の対象とする領域全体が確認できる観察倍率Ｍに設定し、かつ所望の視野領域が撮像範囲になるように、試料ステージ駆動部７を動かす。このとき、試料ステージ駆動部７と同期して、試料ステージ駆動部７の座標位置が、試料ステージ駆動部７に接続されたステージ位置検出器８によって読み込まれ、インターフェース９ｂを介してＰＣ１１に伝送される。ＰＣ１１には、試料ステージの位置情報のほか、試料ステージの移動量，隣接する視野の重なり量，連続視野像の撮像枚数，撮像範囲の指定など、試料ステージの駆動条件を制御するパラメータが格納されている。

図１に示した構成の透過電子顕微鏡において、図２に示したように、対象とする領域全体が確認できる画像をモニタ表示し、該表示画像を用いて対象物の境界（輪郭）をカーソルでトレースする方法、または、図３のように対象物の境界線上の任意の位置を複数点指定し、指定された位置間を補間演算する方法によって、連続視野領域を決定し、該領域の境界のみ、あるいは、領域全体を所定の倍率と重なり量で連続視野となるようステージ制御、または電子線偏向器を制御して撮像する方法について図４のフローチャートを用いて説明する。

本実施の形態では、例えば、モニタ１４上に対象とする領域全体が確認できる任意の視野が図２ａのように得られたとする。図２ｂに示したように任意の対象物の境界線上をトレースすると、図２ｃで示したような連続視野撮像領域がモニタ１４に出力され、境界のみ、あるいは領域全体の連続視野像を撮像する。同様に、モニタ１４上に対象とする領域全体が確認できる任意の視野が図３ａのように得られたとする。図３ｂに示したように、対象物の境界線上の任意の位置を複数点指定すると、図３ｃで示したように、モニタ１４上に連続視野撮像領域が出力され、境界のみ、あるいは領域全体の連続視野像を撮像する。

ステップ１０１において連続視野撮像条件の設定を行う。オペレータは、連続視野像の任意の撮像倍率Ｍ′および視野の重なり量ΔＮ pixelを入力する。このときの操作は、キーボードおよびマウスなどの入力装置１０を用いて行う。次に、ステップ１０２において、対象とする領域全体が確認できる任意の倍率Ｍに設定し、モニタ１４に表示される試料３の画像を見ながら、キーボードあるいはマウスなどの入力装置１０を用いて、対象物の境界（輪郭）をトレースする。あるいは、対象物の境界線上の任意の位置を複数点指定する。このとき、トレースまたは任意に指定した座標を（ｘ₁，ｙ₁），（ｘ₂，ｙ₂），（ｘ₃，ｙ₃），…，（ｘ_m，ｙ_m）（但し、ｘ_j，ｙ_jは整数、画像データ上の座標系で単位はpixelとする）とし、メモリ１２に保存する。ステップ１０３では、撮像視野の全領域をモニタ１４上に出力する。ステップ１０４において、ステップ１０２で指定した複数点から、対象領域の境界を多項式の曲線ｙ＝ｆ（ｘ）で近似する。ただし、対象領域の境界が閉曲線となる場合は、任意の複数に分割した曲線で近似し、ステップ１０４からステップ１１５までを分割した数だけ繰り返し行い、撮像した連続視野像を合わせて一つの画像として出力してもよい。

ここで、ステップ１０４において、指定した複数点を特定の関数ｙ＝ｆ（ｘ）で近似するための最小二乗法の概略を説明する。最小二乗法とは、測定で得られた数値の組を、特定の関数を用いて近似する場合に、想定する関数が測定値に対してよい近似になるように、残差の二乗和を最小とするような係数を決定する方法のことである。今、（ｘ₀，ｙ₀），（ｘ₁，ｙ₁），（ｘ₂，ｙ₂），…，（ｘ_m，ｙ_m）という入力座標の集合があるとする（但し、ｘ_j，ｙ_jは整数、画像データ上の座標系で単位はpixelとする）。これら（ｘ_j，ｙ_j）の分布を、次式（１）のようにｎ次の多項式の曲線で近似する。

各ｘ_jに対しての計算値は、（ｘ₀，ｆ（ｘ₀)），（ｘ₁，ｆ（ｘ₁)），（ｘ₂，ｆ（ｘ₂)），…，（ｘ_m，ｆ（ｘ_m)）となり、実際の測定値ｙ_jとの残差の平方和は、

で与えられるので、Δが最小になるようなＡ_i（ｉ＝０，１，２，３，…，ｎ）を求めればよい。式（２）を変数Ａｉとする関数とみなして、Δを各Ａ_iについて偏微分してゼロとなる場合が、Δの最小値となる条件である。すなわち

となるので、式（２）を代入すると次の条件式が導出できる。

式（３）は、ｎ＋１元の連立方程式となるので、これを解きＡ_iを導出し、近似式ｙ＝ｆ（ｘ）を求める。なお、本実施例においては、最小二乗法を用いる方法について説明したが、この曲線補間の方法は、どのような手法を用いてもよい。ステップ１０５において、指定した複数点（ｘ₁，ｙ₁），（ｘ₂，ｙ₂），（ｘ₃，ｙ₃），…，（ｘ_m，ｙ_m）（但し、ｘ_j，ｙ_jは整数、画像データ上の座標系で単位はpixel）のｘの最小値と最大値を抽出して、それぞれｘ_minとｘ_maxと設定する。ステップ１０６において、連続視野撮像の開始点のｘ座標をｘ_s＝ｘ_minとする。ステップ１０７において、ステップ１０４で求めた近似式ｙ＝ｆ（ｘ）から、連続視野撮像の開始点のｙ座標はｙ_s＝ｆ（ｘ_s）となる。また、連続視野撮像の終点が次の開始点と同じｘ座標（ｘ_e＝ｘ_s）とする。ステップ１０８において、ステージ駆動部７は、連続視野撮像を行うため以下で算出するステージ座標（Ｘ，Ｙ）まで移動する。ここで、ステージ座標（Ｘ，Ｙ）は、ステップ１０２において連続視野像撮像を行う範囲全体を確認するための観察条件として、ステージ座標を（Ｘ₀，Ｙ₀）、撮像倍率をＭ、撮像画素数をＮ×Ｎ pixel、撮像領域（シンチレータサイズ）をＬ×Ｌ pixelとした場合に、

として求められる。

ステップ１０９において、ＰＣ１１は、ステップ１０１で設定した連続視野像の任意の撮像倍率Ｍ′に変更後、撮像を行う。ステップ１１０において、ｘ_e＝ｘ_e＋１とする。ステップ１１１において、ステップ１１０で計算したｘ_eがｘ_maxよりも大きいかどうか判定を行う。大きい場合は、ステップ１１６に移り、撮像が終了する。小さい場合は、ステップ１１２に進む。ステップ１１２において、ｘ_eがｘ_maxと等しいかどうか判定を行う。等しい場合はステップ１０８に戻り、ｘ_s＝ｘ_eとして連続視野撮像を続行する。異なる場合は、ステップ１１３に移る。ステップ１１３において、ステージの移動距離ｄを求める。

ステップ１１４において、ステップ１１３で求めたｄについて

の判定を行う。ｄ≦（Ｎ−ΔＮ）／（Ｍ′／Ｍ）の場合は、ステップ１０８に移る。ｄ＞（Ｎ−ΔＮ）／（Ｍ′／Ｍ）の場合は、ｘ_s＝ｘ_eとしてステップ１０７へ移る。ステップ１０２で入力した撮像範囲全体が撮像されるまで、動作を繰り返す。また、上述のステージ制御によって連続視野像を撮像する方法の代替として、電子線偏向器を制御する方法でも撮像は可能である。

図４のフローチャートでは、連続した視野の次の視野への移動先を撮像終了ごとに計算を行っている。従って、各視野の撮像領域を撮像処理が開始する以前に確認できない。これを可能とするためには、撮像開始の前に各視野への移動先を算出しておけばよい。図５のフローチャートにおいて、（ｘ_(j)′，ｙ_(j)′）の座標位置が視野移動先であり、これをステージ座標系（Ｘ，Ｙ）に換算して視野移動することになる。

なお、図４のＳ１１４では、ｄが演算値を超えている場合は、当該視野位置が適正なものであると判断し、次の視野位置の演算を行う処理を行っている。このように構成することで、過度に視野間の間隔が狭くならないように視野位置の設定が可能となる。また、このような視野位置の調節法に依らず、他の視野位置調整法の適用も可能である。例えば、重なり領域の面積（或いは重なり領域のＸ方向、及びＹ方向の距離）について、上限値と下限値を設けておき、当該範囲に、重なり領域の面積が収まるように、視野位置を調整することも考えられる。当該調整では、例えば、輪郭線に沿って、徐々に視野を移動していき、上記重なり領域の面積が、上記上下限値に収まったときに、その移動を停止することで視野位置の調整を行うことが考えられる。

単にマトリクス状に視野を割り当てる場合と比較すると、曲線を描く輪郭線に沿って、視野を割り当てる必要がある分、重なり領域の面積が曲線の状況等に応じて変化することになるため、上述の手法は非常に有効である。

なお、上述の例では、観察対象物の輪郭線上の任意の複数点を選択し、当該複数点の選択に基づいて、ステージ座標を決定する例を説明したが、観察対象の輪郭線の設定によって、自動的にステージ座標等を決定することもできる。以下にその一例を説明する。

図１４は、自動的にＦＯＶの位置を決定するためのアルゴリズムの他の一例を説明する図である。本例では、１つの視野（Field Of View：ＦＯＶ）から距離ｒ分、離れた個所を次のＦＯＶとして設定する例を説明している。

第１のＦＯＶ１４０１の次の第２のＦＯＶ１４０２の位置を演算するために、観察対象の輪郭を近似した近似式と、第１のＦＯＶ１４０１の中心座標（ｘ_c，ｙ_c）を用いて、式（７），（８）を用いた演算を行う。

式（７）は観察対象の輪郭を近似することによって得られる近似式である。ｒは、第１のＦＯＶの中心座標からの距離に関する値である。第２のＦＯＶの中心座標の位置を演算するために、本例では、式（８）を式（７）に代入することによって、半径ｒの円周と、ｙ＝ｆ（ｘ）を示す線分の交点を求め、当該交点が第２のＦＯＶの中心となるように、ステージ座標等を設定する。

このような処理を観察対象の輪郭線に沿って連続的に実行することによって、自動的に輪郭線全体のＦＯＶ取得のためのステージ座標等を決定することが可能となる。距離ｒは、ＦＯＶ間の重なり領域を形成するために、ＦＯＶの一辺の距離未満に設定することが望ましい。具体的には、（ＦＯＶの一辺の寸法値−所望の重なり領域の寸法値）とすることが望ましい。なお、重なり領域の大きさは観察目的や観察条件等に応じて、任意に設定可能とすることが望ましい。

本例によれば、微生物のような輪郭に多くの曲線等を含み、その視野位置の決定が困難な観察対象であったとしても、適正な位置への視野の設定と、視野間の適正な重なり領域の設定に基づく、連続視野像を取得することが可能となる。

なお、重なり部分は、視野像間の接続を適正に行うために設けられるものであるが、必要以上に大きく設定すると、取得視野像の数が増加し、観察時間の遅延の一因ともなる。そこで、以下に、或る程度以上の重なり領域の大きさを確保しつつも、重なり部分が適正な大きさとなるような設定法について説明する。

上述のようにＦＯＶ間の中心間の距離がｒとなるような連続視野設定を行った場合に、図１５のように、ＦＯＶの角部同士が斜めに接続されるような状態となると、そうでない場合と比較して、重畳領域内の輪郭線の距離が長くなる。このような状況に鑑み、以下に重畳領域の大きさを適正化する手法の一例について、説明する。

角部は重畳距離が長くなるため、方程式の種類、或いは重なり領域の正方形の度合い（縦横比，Ｘ方向の画素、或いはＹ方向の画素数が正方形に近い形状をなしているような値の場合）に応じて、演算のリトライを行い、重なり部分を調整する。より具体的には重なり部分の面積が小さくなるように、ＦＯＶ間の距離を大きくする。例えば、図ｘｘの場合、ΔｘとΔｙの比率に応じて、ＦＯＶ間の距離を調整することが考えられる。例えば、重なり領域内の輪郭線の長さを統一するように、ＦＯＶ間距離の調整を行うと共に、その長さをＦＯＶ同士が横方向、或いは縦方向に直線的に配列された場合と同じ距離Ｄに統一することを考えると、輪郭線の長さＤ１−Ｄ分，ＦＯＶを移動するようにして、ＦＯＶ間の距離を調整することが考えられる。この場合、重なり部分内の輪郭線の長さが所定値を超えたときに、上記調整を行うようにしても良いし、常に重なり領域内の輪郭線の長さが所定値となるように調整するようにしても良い。

また、生体試料を観察する場合においても、重点的に観察したい個所が存在する場合もある。このような場合、生体試料の任意の個所を選択可能とし、それ以外の部分については自動選択を行い得るようにしても良い。より具体的には、所望の個所の選択後、その選択個所間を補間するように、ＦＯＶ位置を均等距離にて割り当てていくことが考えられる。このような場合は、補間距離を求めると共に、所望の観察倍率に基づいて決定されるＦＯＶの大きさに応じて、上記ｒ値を決定するようにすると良い。

また、試料の輪郭の部位ごと（或いは輪郭線を近似する近似曲線の種類ごと）に、異なるｒ値を用いて、ＦＯＶを割り当てるようにしても良い。

なお、求められた位置に対する視野位置の移動は、例えば電子顕微鏡の観察倍率，画像上の画素の座標情報、及び所定信号を供給したときのステージ及び／又は偏向器による視野移動量との関係が予め制御装置に内蔵された記憶媒体に登録されており、当該記憶媒体に登録された情報に基づいて、ステージ、及び／又は偏向器の制御されることによって行われる。

図６に示すように、対象とする領域全体が確認できる任意の倍率Ｍにおいて、任意の対象物の画像を撮像し、該画像を二値化などの画像処理を用いて該対象物の輪郭を抽出し、輪郭線上のみ、あるいは輪郭内の領域を所定の倍率と重なり量で連続視野となるようステージ制御、または電子線偏向器を制御して撮像する方法について図７のフローチャートを用いて説明する。

本実施の形態では、例えば、モニタ１４上に対象とする領域全体が確認できる任意の視野が図６ａのように得られたとする。画像処理を施し、境界（輪郭）の抽出を行うと図６ｂのような形態が得られ、図６ｃで示したような連続視野撮像領域が表示され、該対象物の境界のみ、あるいは領域全体の連続視野像を撮像する。

まず、ステップ２０１において、連続視野像撮像条件の設定を行う。オペレータは、連続視野像の任意の撮像倍率Ｍ′および視野の重なり量ΔＮ pixelを入力する。このときの操作は、キーボードおよびマウスなどの入力装置１０を用いて行う。次に、ステップ２０２において、モニタ１４に表示される試料３の画像を見ながら、対象とする領域全体が確認できる任意の倍率Ｍに設定し、かつ所望の部分が撮像範囲になるように、試料ステージ駆動部７を動かす。このとき、試料ステージ駆動部７と同期して、試料ステージ駆動部７の座標位置が、試料ステージ駆動部７に接続された位置検出器８によって読み込まれ、インターフェース９ｂを介してＰＣ１１に伝送される。撮像装置６を用いて任意の対象物の画像を取得、インターフェース９ｃを介してメモリ１２に保存する。ステップ２０３において、演算装置１３は、ステップ２０２で取得した画像データをメモリ１２から読み出し、シャープネス，エッジの強調，コントラスト調整および二値化処理などの画像処理を行い、ステップ２０４において、境界（輪郭）の抽出を行う。ステップ２０５において、ステップ２０４で抽出した境界（輪郭）の座標位置を（ｘ₁，ｙ₁），（ｘ₂，ｙ₂），（ｘ₃，ｙ₃），…，（ｘ_m，ｙ_m）（ｘ，ｙは整数）とし、メモリ１２に保存する。ステップ２０６では、連続視野像撮像範囲がモニタ１４上で確認できるよう、演算処理装置１３は、ステップ２０１で入力した撮像倍率Ｍ′および視野の重なり量ΔＮ pixelとステップ２０５で読み取った座標から、連続視野像撮像領域を計算し、モニタ１４上に出力する。対象とする領域全体が確認できる画像と重ね合せて表示してもよい。ステップ２０７において、連続視野像の撮像を行う。連続視野像の撮像は、上述した図５のフローチャートと同様の方法を用いて行う。ステップ２０８において、連続視野像の撮像が終了する。また、上述のステージ制御を行い連続視野像を撮像する方法の代替として、電子線偏向器を制御する方法でも撮像は可能である。

図８に示すように、対象とする領域全体が確認できる任意の倍率Ｍにおいて、任意の対象物の画像を撮像し、予め登録したパターンと一致する領域を抽出し、連続視野像撮像領域を決定する。該領域の境界のみ、あるいは領域全体を所定の倍率と重なり量で連続視野像となるよう自動でステージ制御、または電子線偏向器を制御して撮像する方法について図９のフローチャートを用いて説明する。

本実施の形態では、例えば図８ａに示した円をパターンとして登録し、撮像した任意の視野がモニタ１４上に図８ｂのように得られたとすると、パターンとして選択した円と同一パターンを持つ形態が自動的に抽出された後、図８ｃに示したように、連続視野撮像領域が出力され、該形態の境界のみ、あるいは領域全体の連続視野像を撮像する。

まず、ステップ３０１において、連続視野像撮像条件の設定を行う。オペレータは、連続視野像の任意の撮像倍率Ｍ′、視野の重なり量ΔＮ pixelの入力および連続視野像を撮像する任意のパターンを登録する。このときの操作は、キーボードおよびマウスなどの入力装置１０を用いて行う。パターンは、例えば辺のなす角度，楕円率，長軸と短軸の長さの比などの条件によって設定することができる。または、予めメモリ１２に保存しておいた形状を呼び出して設定してもよい。ステップ３０２において、モニタ１４に表示される試料３の画像を見ながら、対象とする領域全体が確認できる任意の倍率Ｍに設定し、かつ所望の部分が撮像範囲になるように、試料ステージ駆動部７を動かす。このとき、試料ステージ駆動部７と同期して、試料ステージ駆動部７の座標位置が、試料ステージ駆動部７に接続された位置検出器８によって読み込まれ、インターフェース９ｂを介してＰＣ１１に伝送される。撮像装置６を用いて任意の箇所の画像を取得、インターフェース９ｃを介してメモリ１２に保存する。ステップ３０３において、演算装置１３は、ステップ３０２で撮像した画像データと、ステップ３０１で予め登録した形状とのパターンマッチングを行う。ステップ３０４において、パターンマッチングで予め登録した形状と同一であると判断された形態を抽出する。ステップ３０５において、演算装置１３は、ステップ３０４で抽出した領域をシャープネス，エッジの強調，コントラスト調整および二値化処理などの画像処理を行う。ステップ３０６において、該当する領域内の境界（輪郭）を抽出する。ステップ３０７において、ステップ３０６で抽出した境界（輪郭）の座標位置を（ｘ₁，ｙ₁），（ｘ₂，ｙ₂），（ｘ₃，ｙ₃），…，（ｘ_m，ｙ_m）（ｘ，ｙは整数）とし、メモリ１２に保存する。ステップ３０８では、連続視野像撮像範囲がモニタ１４上で確認できるよう、ステップ３０１で入力した撮像倍率Ｍ′および視野の重なり量ΔＮ pixelとステップ３０６で読み取った座標から、演算処理装置１３で連続視野像撮像領域を計算し、モニタ１４上に出力する。ステップ３０９において、連続視野像の撮像を行う。連続視野像の撮像は、上述した図５のフローチャートと同様の方法を用いて行う。ステップ３１０において、連続視野像の撮像が終了する。また、上述のステージ制御を行い連続視野像を撮像する方法の代替として、電子線偏向器を制御する方法でも撮像は可能である。

図１０に示すように、連続視野撮像を行うための視野全体が確認できる任意の倍率Ｍにおいて、任意の対象物の画像をモニタ表示し、所定の倍率と重なり量から計算した撮像領域をモニタ上にグリッド表示させる。任意の撮像領域をカーソルまたはマウスで指定し、指定した該領域を所定の倍率と重なり量で連続視野となるようステージ制御、または電子線偏向器を制御して撮像する方法について図１１のフローチャートを用いて説明する。

まず、ステップ４０１において、連続視野像撮像条件の設定を行う。オペレータは、連続視野像の任意の撮像倍率Ｍ′，視野の重なり量ΔＮ pixelを入力する。このときの操作は、キーボードおよびマウスなどの入力装置１０を用いて行う。次に、ステップ４０２において、モニタ１４に表示される試料３の画像を見ながら、対象とする領域全体が確認できる任意の倍率Ｍに設定し、かつ所望の部分が撮像範囲となるように、試料ステージ駆動部７を動かす。このとき、試料ステージ駆動部７と同期して、試料ステージ駆動部７の座標位置が、試料ステージ駆動部７に接続された位置検出器８によって読み込まれ、インターフェース９ｂを介してＰＣ１１に伝送される。撮像装置６を用いて任意の箇所の画像を取得、インターフェース９ｃを介してメモリ１２に保存する。ステップ４０３において、連続視野像撮像領域をモニタ１４上で確認できるよう、ステップ４０１で入力した撮像倍率Ｍ′および視野の重なり量ΔＮ pixelから、演算処理装置１３で連続視野像撮像領域を計算し、モニタ１４上に表示する。図１０ａで示したように撮像領域をグリッド線などで表示してもよい。ステップ４０４において、所望の撮像領域をカーソルまたはマウスで指定する。このときの操作は、キーボードおよびマウスなどの入力装置１０を用いて行う。指定された領域は、指定していない視野と差別化してモニタ１４に表示される。例えば、図１０ｂのように指定した領域は色調などを変えて表示される。ステップ４０５において、ステップ４０４で指定した領域をステップ４０１で入力した所定の倍率と重なり量で連続視野となるよう自動でステージ制御、または電子線偏向器を制御して撮像する。

以上のような実施形態において、照射電子線による試料損傷，試料やステージのドリフト，ステージの振動に対して考慮する場合には、以下のような制御構成とする。連続視野を撮像する過程で撮像する視野を撮像の都度逐次、次の視野へ移動する必要があるが、その際の視野移動時は、試料に対しての電子線照射を少なくするために、電子線を遮断するように電子銃のバイアス電圧を制御、または電子線偏向器により試料に照射しないように偏向制御して、撮像する時間のみ照射するような電子線照射を制御可能とする手段を有する構成とする。次に、撮像する視野位置に移動完了した時点で試料ドリフト抑制のために弱い電子線強度から照射して徐々に所定の撮像する電子線強度に設定していくような制御手段を有する。尚、視野移動の手段においても、試料ドリフトやステージ移動による振動抑制のために撮像倍率や移動量に応じてステージ駆動と電磁的視野移動の組み合わせ、または単独での移動を可能とする。さらに、試料ドリフトやステージ振動による影響が小さくなるように視野移動後、撮像開始する迄に待ち時間を設定する手段と撮像開始を該時間だけ遅延させる手段を有する構成とする。

また、今まで説明した実施形態においては、撮像倍率や撮像条件（カメラ感度，閾値，フォーカスなど）を一定として連続視野の撮像シーケンスを説明していたが、これらの組み合わせを予め設定可能として行うことで、より効率的に種々の画像データを取得することができる。すなわち、連続視野をより解像度高く観察・記録したい場合には、撮像倍率を複数設定可能とする入力手段，倍率可変手段を有する構成とする。該構成において、視野移動は最大撮像倍率を基準に行い、視野位置によって設定された倍率で撮像する要否を判定して、要の場合には撮像を繰り返すシーケンスとすると撮像倍率の異なる連続した視野の画像を得ることが可能である。同様に撮像条件を複数設定可能とする手段と該条件を制御する手段を有した構成として、前述のような撮像シーケンスを行いながら、各視野の撮像の都度、該条件を異ならせて複数の条件で撮像するように制御すれば、異なった画質での連続視野の画像を得ることが可能となる。次に、連続撮像する領域が一箇所の場合を例として前述まで説明してきたが、視野領域を複数設定可能として、一連の連続視野領域を撮像完了して次の設定された視野領域に視野移動して一連の連続視野を撮像していくことを繰り返すように制御できることは、上記手法を用いれば容易に可能である。

ここで、各視野領域での撮像画像データを効率よく整理することについて、図１２を用いて以下に説明する。撮像する全視野領域を確認できる倍率において、一旦撮像を行い、画像データとして取り込む（図１２ａ）。所定の倍率で各視野を撮像したときのシーケンス番号（または記号でもよい）を各視野の撮像画像データまたはファイル名称の一部として記憶しておく。図１２ａの画像データに各視野での撮像領域を示す枠とその枠内に上記シーケンス番号を重ね合わせた画像データを作成（図１２ｂ）してモニタ上に表示させる機能および該画像データを記憶させる手段を有する構成とすると、各視野での画像の再確認や再度、連続視野としてつなぎ合わせる時に効率が良くなる。

以上、説明してきた実施形態においては、撮像する各視野領域の中心となる視野移動先の座標を自動的に算出して視野移動および撮像を行うことを説明したが、撮像する各視野の領域と対象とする視野領域全体が確認できる画像を表示することで、各視野の画像や重なり量などを撮像以前に確認できる。しかしながら、自動的に各視野での撮像位置を決定すると、図１０のように撮像領域がグリッド表示される場合には、図１３ａに示すような淡色の領域は対象とするものが撮像視野内に僅かにしか入っていない。これを防ぐためには撮像する各視野領域の表示領域を選択するマウスのような手段を有し、選択した視野領域をマウス移動とともにモニタ上で移動して、移動後の距離・方向により撮像視野位置を再度算出して、視野移動と撮像を制御することで可能となる。このように自動的に算出された撮像視野位置を再設定できる機能は、図１３ｂに示すように図２，図３，図６，図８の場合においても容易に適用できる。

透過電子顕微鏡の構成の一例を説明する図。 対象物の境界をトレースし連続視野撮像領域を設定する方法を説明する図。 対象物の境界上の任意位置を複数点指定し連続視野撮像領域を設定する方法を説明する図。 連続視野撮像の動作を説明するフローチャート。 連続視野撮像の動作を説明するフローチャート。 対象物の境界を抽出して連続視野撮像領域を設定する方法を説明する図。 対象物の境界を抽出して連続視野撮像を行う方法を説明するフローチャート。 予め登録したパターンと一致する対象物の境界を抽出し連続視野撮像領域を設定する方法を説明する図。 予め登録したパターンと一致する対象物の境界を抽出して連続視野撮像を行う方法を説明するフローチャート。 グリッド表示した連続視野撮像領域から所望の撮像領域を指定し、連続視野撮像を行う方法を説明する図。 グリッド表示した連続視野撮像領域から所望の撮像領域を指定し、連続視野撮像を行う方法を説明するフローチャート。 各視野領域での撮像画像データを効率良く整理する方法について説明する図。 自動的に算出された撮像視野位置を再設定する機能を説明する図。 自動的に連続視野位置を決定する一手法の原理を説明する図。 視野間の重なり領域の大きさを調整する手法の一例を説明する図。

符号の説明

１ 電子銃
２ａ〜２ｂ 照射レンズ
３ 試料
４ａ〜４ｅ 結像レンズ系
５ 蛍光板
６ 撮像装置
７ 試料保持及びステージ駆動部
８ ステージ位置検出器
９ａ〜９ｄ インターフェース
１０ 入力装置
１１ ＰＣ
１２ メモリ
１３ 演算装置
１４ モニタ

Claims (18)

1. 電子顕微鏡にて得られる第１の画像から、当該画像より高い倍率の画像を取得する領域を設定し、当該設定に基づいて得られる第２の画像を用いて試料を観察する試料観察方法において、
   前記第１の画像上にて、観察対象に輪郭線、或いは当該輪郭線上に位置する複数の点を指定する行程と、
   当該輪郭線に沿って、前記第２の画像を取得するための複数の視野を、当該複数の視野の一部間が重なるように配列する行程を備えることを特徴とする試料観察方法。
2. 請求項１において、
   前記電子顕微鏡に設けられた試料ステージ、或いは電子線を偏向する偏向器を用いて、前記複数の視野間の移動を行うことを特徴とする試料観察方法。
3. 請求項２において、
   前記指定された複数点間の補間演算に基づいて、前記複数の視野を取得するときの前記試料ステージの移動量、或いは前記偏向器の偏向信号を求めることを特徴とする試料観察方法。
4. 請求項２において、
   前記視野間の重なり量に応じて、前記視野間の距離を調整することを特徴とする試料観察方法。
5. 請求項４において、
   前記視野間の距離の調整は、当該視野間の距離ｄが、（Ｎ−ΔＮ）／（Ｍ′／Ｍ）以下であるときに、行うことを特徴とする試料観察方法。
   Ｎ：撮像画素数
   ΔＮ：視野の重なり量
   Ｍ′：第２の画像の倍率
   Ｍ：第１の画像の倍率
6. 請求項５において、
   前記視野間の距離の調整は、前記視野間の距離ｄが、（Ｎ−ΔＮ）／（Ｍ′／Ｍ）以下であるときに、視野間の距離がより離間するように行われることを特徴とする試料観察方法。
7. 請求項４において、
   前記視野間の重なり量が、所定範囲に含まれるか否かを判定し、当該所定範囲を逸脱していると判断される場合は、当該所定範囲に含まれるように、前記視野の位置を調整することを特徴とする試料観察方法。
8. 請求項１において、
   前記輪郭線は、前記複数の点間を曲線補間することによって形成されることを特徴とする試料観察方法。
9. 電子源と、
   当該電子源から放出される電子線が照射される試料を移動させる試料ステージ、或いは試料上に照射される電子線を偏向する偏向器を制御する制御装置を備えた電子顕微鏡において、
   前記制御装置は、前記電子顕微鏡によって取得される第１の画像上での輪郭線、或いは当該輪郭線上に位置する複数の点を指定に基づいて、当該輪郭線に沿って第１の画像より高倍率の第２の画像を取得するための複数の視野の位置を、当該複数の視野の一部間が重なるように決定することを特徴とする電子顕微鏡。
10. 請求項９において、
    前記制御装置は、前記第２の画像を取得するための視野を、所定の倍率と、予め設定された重なり量で連続視野となるように、前記試料ステージ、或いは前記偏向器を制御することを特徴とする電子顕微鏡。
11. 請求項９において、
    前記表示画像と同時に各撮像視野領域を重ね表示することを特徴とする電子顕微鏡。
12. 請求項９において、
    撮像が完了した視野領域を前記各撮像視野領域の表示と区別できるように画像の階調及び／又は色調を変えて表示または表示を点滅させることを特徴とする電子顕微鏡。
13. 請求項９において、
    対象とする領域全体が確認できる画像と撮像する各視野領域を重ねてモニタ表示するとともに、該重ね表示した画像を画像データとして記憶・呼出・表示することを特徴とする電子顕微鏡。
14. 請求項９において、
    撮像する各視野領域の画像データを記憶する際に、撮像順番を表わす数字や記号を画像データの一部としてまたは画像データ名称の一部として記憶するとともに該撮像順番を、撮像する各視野領域の表示の近傍に表示させることを特徴とする電子顕微鏡。
15. 請求項９において、
    撮像する各視野領域の表示領域を選択する手段、選択した視野領域を移動する手段、該手段と連動して選択された視野領域の撮像位置を移動するように制御することを特徴とする電子顕微鏡。
16. 電子源と、
    当該電子源から放出される電子線が照射される試料を移動させる試料ステージ、或いは試料上に照射される電子線を偏向する偏向器を制御する制御装置を備えた電子顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記電子顕微鏡によって取得される第１の画像上での複数の点を指定に基づいて、当該複数の点間の補間演算を行い、当該補間演算によって形成される輪郭線に沿って、前記第１の画像より高倍率の第２の画像を取得するための複数の視野の位置を、当該複数の視野の一部間が重なるように決定することを特徴とする電子顕微鏡。
17. 電子源と、
    当該電子源から放出される電子線が照射される試料を移動させる試料ステージ、或いは試料上に照射される電子線を偏向する偏向器を制御する制御装置を備えた電子顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記電子顕微鏡によって取得される第１の画像について、二値化を実施し、当該二値化によって得られる輪郭線に沿って、前記第１の画像より高倍率の第２の画像を取得するための複数の視野の位置を、当該複数の視野の一部間が重なるように決定することを特徴とする電子顕微鏡。
18. 電子源と、当該電子源から放出される電子線が照射される試料を移動させる試料ステージ、或いは試料上に照射される電子線を偏向する偏向器を制御する制御装置を備えた電子顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記電子顕微鏡によって取得される第１の画像について、予め登録したパターンと一致する輪郭を抽出する手段を有し、抽出した輪郭に沿って、前記第１の画像より高倍率の第２の画像を取得するための複数の視野の位置を、当該複数の視野の一部間が重なるように決定することを特徴とする電子顕微鏡。

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