JP5015668B2 - アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、血圧降下作用を持つアンギオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」という。）阻害ペプチド混合物、このペプチド混合物を含むＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤、並びにこのペプチド混合物の製造方法に関する。
高血圧症は高脂血症、糖尿病、肥満とともに動脈硬化を起こしやすい現代成人病のひとつである。高血圧症と診断される人口は、日本でも２０００万人以上と推定され、その予備軍も相当数に上るといわれている。高血圧症を放置しておくと脳卒中や心疾患を引き起こし死をも招く。このように重大な生活習慣病であるにもかかわらず、無症状であるため自覚しにくくサイレントキラーとも呼ばれている。
高血圧症を引き起こすメカニズムはいくつか知られているが、レニン−アンギオテンシン系もそのうちのひとつである。レニン−アンギオテンシン系は血圧や体内の水分量と電解質のバランスを調節している重要な因子である。腎臓から分泌されたレニンは、肝臓で生合成されたアンギオテンシノーゲンに作用してアンギオテンシンIを生成する。次に、アンギオテンシンIはＡＣＥの作用により血圧上昇効果を持つアンギオテンシンIIに変換される。従って、このアンギオテンシンIを作らせないか、ＡＣＥの活性を阻害すれば、アンギオテンシンIIの生成を抑制し血圧の降下が可能となる。
従来から、この高血圧症を改善するために多くの研究機関で降圧剤や血圧調節機能を有する食品成分の研究開発が進められている。天然物由来のＡＣＥ阻害剤としては、大豆タンパク、魚類タンパクなどから得られたペプチドが多く知られている。しかし、天然物由来の大豆タンパクや魚類タンパクからなるＡＣＥ阻害剤は有効ペプチド以外の原料由来成分を多く含むために、経口摂取時の効果が不足していたり、風味が悪く食品として適していない。また、原料由来の不純物を除去しようとすると限外ろ過や吸着除去など、製造工程が煩雑になってしまう。よって、特別な精製工程を要することなく、天然物から高活性のＡＣＥ阻害ペプチド混合物を製造する方法が求められている。
ここで、特許文献１には酒粕を原料とした新規なＡＣＥ阻害剤が開示されている。また特許文献２には米タンパクのタンパク質分解酵素分解物として酒粕を用いたＡＣＥ阻害用経口摂取物が開示されている。しかし、これらの酵素分解物は夾雑物を多く含むペプチド混合物であり、そのＡＣＥ阻害活性は実用的に満足できるものではない。
特許第３０５４４６２号
特許第３４１４７６１号
本発明は、特別な精製工程を要することなく天然物から高活性のＡＣＥ阻害ペプチド混合物を得ることができるＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法、およびＡＣＥ阻害活性が高い、天然物由来のＡＣＥ阻害ペプチド混合物を提供することを主な課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠にセルラーゼを作用させる第１工程と、第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程と、第２工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させる第３工程とを含む方法によれば、特別な精製工程を要することなく、天然物から高活性のＡＣＥ阻害ペプチド混合物が得られることを見出した。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法、ＡＣＥ阻害ペプチド混合物、ＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤を提供する。
項１． 酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠にセルラーゼを作用させる第１工程と、第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程と、第２工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させる第３工程とを含むことを特徴とする、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物の製造方法。
項２． 第１工程において、セルラーゼに加えて、アミラーゼを作用させる項１に記載の方法。
項３． アミラーゼがβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及び／又はα−グルコシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一種である項２に記載の方法。
項４． 中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼである項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５． さらに、第３工程により得られる混合物から固形分を除去する第４工程を含む項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物。
項７． Ｐｈｅ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を１重量部、Ａｒｇ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を４〜１２重量部、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を２〜５重量部、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を０．１〜０．４重量部含む、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物。
項８． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項７に記載のペプチド混合物を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
項９． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項７に記載のペプチド混合物を含む血圧降下剤。
項１０． 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
(1)Ｐｈｅ−Ｔｒｐ
(2)Ａｒｇ−Ｔｒｐ
(3)Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
(4)Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
項１１． 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む血圧降下剤。
(1)Ｐｈｅ−Ｔｒｐ
(2)Ａｒｇ−Ｔｒｐ
(3)Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
(4)Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
項１２． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項７に記載のペプチド混合物を含む下記 (a)、(b)、又は(c)の食品。
(a)上記ペプチド混合物を０．１〜１重量％含む固形又はゲル状食品
(b)上記ペプチド混合物を０．１〜１ｗ／ｖ％含む液体状又は流動状食品
(c)上記ペプチド混合物を２０〜８０重量％含む食品製剤
項１３． 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種のペプチド成分を含む下記(a)、(b)、又は(c)の食品。
(1)Ｐｈｅ−Ｔｒｐ
(2)Ａｒｇ−Ｔｒｐ
(3)Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
(4)Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
(a)上記ペプチド成分を０．１〜１重量％含む固形又はゲル状食品
(b)上記ペプチド成分を０．１〜１ｗ／ｖ％含む液体状又は流動状食品
(c)上記ペプチド成分を２０〜８０重量％含む食品製剤
項１． 酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠にセルラーゼを作用させる第１工程と、第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程と、第２工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させる第３工程とを含むことを特徴とする、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物の製造方法。
項２． 第１工程において、セルラーゼに加えて、アミラーゼを作用させる項１に記載の方法。
項３． アミラーゼがβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及び／又はα−グルコシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一種である項２に記載の方法。
項４． 中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼである項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５． さらに、第３工程により得られる混合物から固形分を除去する第４工程を含む項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物。
項７． Ｐｈｅ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を１重量部、Ａｒｇ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を４〜１２重量部、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を２〜５重量部、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を０．１〜０．４重量部含む、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物。
項８． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項７に記載のペプチド混合物を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
項９． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項７に記載のペプチド混合物を含む血圧降下剤。
項１０． 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
(1)Ｐｈｅ−Ｔｒｐ
(2)Ａｒｇ−Ｔｒｐ
(3)Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
(4)Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
項１１． 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む血圧降下剤。
(1)Ｐｈｅ−Ｔｒｐ
(2)Ａｒｇ−Ｔｒｐ
(3)Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
(4)Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
項１２． 項１〜５のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項７に記載のペプチド混合物を含む下記 (a)、(b)、又は(c)の食品。
(a)上記ペプチド混合物を０．１〜１重量％含む固形又はゲル状食品
(b)上記ペプチド混合物を０．１〜１ｗ／ｖ％含む液体状又は流動状食品
(c)上記ペプチド混合物を２０〜８０重量％含む食品製剤
項１３． 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種のペプチド成分を含む下記(a)、(b)、又は(c)の食品。
(1)Ｐｈｅ−Ｔｒｐ
(2)Ａｒｇ−Ｔｒｐ
(3)Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
(4)Ｇｌｎ−Ｔｒｐ
(a)上記ペプチド成分を０．１〜１重量％含む固形又はゲル状食品
(b)上記ペプチド成分を０．１〜１ｗ／ｖ％含む液体状又は流動状食品
(c)上記ペプチド成分を２０〜８０重量％含む食品製剤
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法によれば、天然物である食品成分を原料として、高いＡＣＥ阻害活性を示すペプチド混合物が得られる。本発明方法は、食品原料に酵素を作用させる工程、及び固液分離工程だけを含む簡単な方法であり、特別な精製工程を含まない。それにもかかわらず、本発明方法によれば、高いＡＣＥ阻害活性を示すペプチド混合物が得られる。
詳述すれば、本発明方法では、出発原料として、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠を用いる。酒粕や米焼酎粕は夾雑物である糖質がある程度分解されているため、また、加熱米は加熱により米がアルファ化し酵素の作用効率が上がるため、さらに、糠は夾雑物となる糖質が少なく、タンパク質が多く含まれるため、その後の工程で、その中に含まれるＡＣＥ阻害ペプチドを効率よく濃縮することができる。
また、本発明方法では、第１工程でセルラーゼを使用することによりセルロースを分解する。分解されたセルロースが後の第２工程で除去されることで、原料の粘性が低下し、作業効率が向上するとともに、後に添加するプロテアーゼなどの酵素の作用効果が高まる。第１工程で、セルラーゼに加えてα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及び／又はα−グルコシダーゼなどを使用するときには、これらの効果が一層向上する。
詳述すれば、本発明方法では、出発原料として、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠を用いる。酒粕や米焼酎粕は夾雑物である糖質がある程度分解されているため、また、加熱米は加熱により米がアルファ化し酵素の作用効率が上がるため、さらに、糠は夾雑物となる糖質が少なく、タンパク質が多く含まれるため、その後の工程で、その中に含まれるＡＣＥ阻害ペプチドを効率よく濃縮することができる。
また、本発明方法では、第１工程でセルラーゼを使用することによりセルロースを分解する。分解されたセルロースが後の第２工程で除去されることで、原料の粘性が低下し、作業効率が向上するとともに、後に添加するプロテアーゼなどの酵素の作用効果が高まる。第１工程で、セルラーゼに加えてα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及び／又はα−グルコシダーゼなどを使用するときには、これらの効果が一層向上する。
また、本発明方法は、第３工程で中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを添加することも特徴としている。これらのプロテアーゼを併用することにより、原料中のタンパク質から高いＡＣＥ阻害活性を有するペプチド混合物を効率よく得ることができる。
本発明方法により得られるＡＣＥ阻害ペプチド混合物は、血圧降下作用を有するため、血圧降下剤として高血圧の予防又は治療に好適に使用できる。このペプチド混合物は米由来であるため、風味が良好で、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。よって、このペプチド混合物は副作用や過剰摂取を気にすることなく安心して長期間服用できる。また、前述したように、本発明方法により得られるＡＣＥ阻害ペプチド混合物は、夾雑物が少なくＡＣＥ阻害活性が高いため、一日の摂取量が少なくて済む。
また、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規なペプチド混合物をも包含する。このペプチド混合物はＡＣＥ阻害作用を有するジペプチドを含み、ＡＣＥ阻害活性が従来品と比較して格段に高く、一日の摂取量が少量で済む。
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法は、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠にセルラーゼを作用させる第１工程と、第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程と、第２工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させる第３工程とを含む方法である。
（Ｉ）ＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法は、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠にセルラーゼを作用させる第１工程と、第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程と、第２工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させる第３工程とを含む方法である。
原料
本発明の製造方法で使用する原料としては、米由来のタンパク質加水分解物が用いられる。具体的には酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は精米するときに出る糠が使用される。中でも、夾雑物である糖質が少なくタンパク質が多く含まれる点や、酒類製造の副産物であり入手し易い点で、酒粕及び米焼酎粕が好ましく、酒粕がより好ましい。酒粕は、蒸米、米麹から醸造した場合の酒粕でも、液化した米、米麹を用いる液化仕込みによって醸造した場合の酒粕でもどちらでもよい。
本発明の製造方法で使用する原料としては、米由来のタンパク質加水分解物が用いられる。具体的には酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は精米するときに出る糠が使用される。中でも、夾雑物である糖質が少なくタンパク質が多く含まれる点や、酒類製造の副産物であり入手し易い点で、酒粕及び米焼酎粕が好ましく、酒粕がより好ましい。酒粕は、蒸米、米麹から醸造した場合の酒粕でも、液化した米、米麹を用いる液化仕込みによって醸造した場合の酒粕でもどちらでもよい。
第１工程
第１工程は、上記原料にセルラーゼを作用させる工程である。
セルラーゼ
セルラーゼは公知のセルラーゼを制限なく使用できる。セルラーゼには、セルロース鎖をランダムに切断するエンドグルカナーゼと、セルロースの還元末端から切断してセルビオースを生成するセロビオヒドロラーゼとが含まれる。いずれを使用してもよいが両者を併用することにより、効率よくセルロースを分解することができる。
また、セルラーゼの由来は特に限定されないが、本発明方法の原料に対して機能し易い点で、トリコデルマ属菌由来のセルラーゼが好ましい。
セルラーゼの使用量は、原料（酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠）に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．２重量％がより好ましく、約０．０５〜０．１重量％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内にセルロースが十分に分解されて液体画分に可溶化される。また、反応温度と反応時間は使用する原料とセルラーゼの種類によって異なるが、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約２〜２０時間が好ましい。また、反応時のｐＨは酵素が機能し易い約３．５〜６が好ましい。上記範囲であれば、セルラーゼが失活することなく、かつその機能を十分に発揮できる。セルラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を例えば約８０〜９０℃で約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。
第１工程は、上記原料にセルラーゼを作用させる工程である。
セルラーゼ
セルラーゼは公知のセルラーゼを制限なく使用できる。セルラーゼには、セルロース鎖をランダムに切断するエンドグルカナーゼと、セルロースの還元末端から切断してセルビオースを生成するセロビオヒドロラーゼとが含まれる。いずれを使用してもよいが両者を併用することにより、効率よくセルロースを分解することができる。
また、セルラーゼの由来は特に限定されないが、本発明方法の原料に対して機能し易い点で、トリコデルマ属菌由来のセルラーゼが好ましい。
セルラーゼの使用量は、原料（酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠）に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．２重量％がより好ましく、約０．０５〜０．１重量％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内にセルロースが十分に分解されて液体画分に可溶化される。また、反応温度と反応時間は使用する原料とセルラーゼの種類によって異なるが、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約２〜２０時間が好ましい。また、反応時のｐＨは酵素が機能し易い約３．５〜６が好ましい。上記範囲であれば、セルラーゼが失活することなく、かつその機能を十分に発揮できる。セルラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を例えば約８０〜９０℃で約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。
アミラーゼ
第１工程では夾雑物である糖質を除去するために、さらにアミラーゼを使用することができる。アミラーゼとはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどが挙げられる。アミラーゼは、１種を単独で、または２種以上を組み合わせて使用できる。中でも、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼが好ましく、β−アミラーゼがより好ましく、小麦由来のβ−アミラーゼがさらにより好ましい。
アミラーゼの使用量は、原料（酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠）に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．１重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に糖質が十分に可溶化される。反応温度と反応時間は使用する原料及び酵素の種類によって異なるが、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。アミラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を例えば約８０〜９０℃で約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。反応時のｐＨは酵素が機能し易い約５〜６が好ましい。
第１工程では夾雑物である糖質を除去するために、さらにアミラーゼを使用することができる。アミラーゼとはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどが挙げられる。アミラーゼは、１種を単独で、または２種以上を組み合わせて使用できる。中でも、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼが好ましく、β−アミラーゼがより好ましく、小麦由来のβ−アミラーゼがさらにより好ましい。
アミラーゼの使用量は、原料（酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び／又は糠）に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．１重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に糖質が十分に可溶化される。反応温度と反応時間は使用する原料及び酵素の種類によって異なるが、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。アミラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を例えば約８０〜９０℃で約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。反応時のｐＨは酵素が機能し易い約５〜６が好ましい。
第２工程
第２工程は、上記第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する工程である。この工程により低分子化された糖質をはじめ、主に水溶性成分が除去される。固液分離の方法としては、圧搾、ろ過、遠心分離などが挙げられるが、ある程度の水分が除去できればよい。この工程により米由来のタンパク質を多く含む固形分が得られる。
第２工程は、上記第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する工程である。この工程により低分子化された糖質をはじめ、主に水溶性成分が除去される。固液分離の方法としては、圧搾、ろ過、遠心分離などが挙げられるが、ある程度の水分が除去できればよい。この工程により米由来のタンパク質を多く含む固形分が得られる。
第３工程
第３工程は、上記第２工程で得られた固形分にプロテアーゼを作用させる工程である。この工程では、原料中のタンパク質から有効成分となるペプチドを得るためにプロテアーゼを使用する。この工程により米由来のタンパク質からＡＣＥ阻害活性を有するペプチド混合物が生成する。
第３工程は、上記第２工程で得られた固形分にプロテアーゼを作用させる工程である。この工程では、原料中のタンパク質から有効成分となるペプチドを得るためにプロテアーゼを使用する。この工程により米由来のタンパク質からＡＣＥ阻害活性を有するペプチド混合物が生成する。
プロテアーゼ
本発明方法では、プロテアーゼとして、中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼを単独で使用、又は併用する。各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼとアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼが好ましい。本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。中性プロテアーゼは１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。酸性プロテアーゼも同様に１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。
プロテアーゼの使用量は、中性プロテアーゼも酸性プロテアーゼも、それぞれ第２工程後に得られる混合物、即ち糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜１重量％が好ましく、約０．1〜０．８重量％がより好ましく、約０．３〜０．６重量％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に原料中のタンパク質を、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドにまで分解できる。
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、中性プロテアーゼの場合は、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。また、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出されたＡＣＥ阻害活性ペプチドがさらに分解されて、阻害活性が低下することが回避される。または、ＡＣＥ阻害活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、ＡＣＥ阻害活性ペプチドの純度の低下を防止できる。
反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。
中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼは、それぞれ単独で作用させてもよく、併用しても良い。併用する場合は、いずれを先に反応させてもよいが、より活性の強いペプチド混合物を得ることができる点で、中性プロテアーゼを先に反応させるのが好ましい。また、両プロテアーゼが機能するｐＨが重複する場合は、同時に反応させてもよい。
本発明方法では、プロテアーゼとして、中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼを単独で使用、又は併用する。各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼとアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼが好ましい。本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。中性プロテアーゼは１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。酸性プロテアーゼも同様に１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。
プロテアーゼの使用量は、中性プロテアーゼも酸性プロテアーゼも、それぞれ第２工程後に得られる混合物、即ち糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜１重量％が好ましく、約０．1〜０．８重量％がより好ましく、約０．３〜０．６重量％がさらにより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に原料中のタンパク質を、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドにまで分解できる。
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、中性プロテアーゼの場合は、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。また、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出されたＡＣＥ阻害活性ペプチドがさらに分解されて、阻害活性が低下することが回避される。または、ＡＣＥ阻害活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、ＡＣＥ阻害活性ペプチドの純度の低下を防止できる。
反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。
中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼは、それぞれ単独で作用させてもよく、併用しても良い。併用する場合は、いずれを先に反応させてもよいが、より活性の強いペプチド混合物を得ることができる点で、中性プロテアーゼを先に反応させるのが好ましい。また、両プロテアーゼが機能するｐＨが重複する場合は、同時に反応させてもよい。
第４工程
第３工程により得られる混合物は、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを高濃度に含むため、そのまま食品に添加する、あるいは医薬品の有効成分として用いることができる。
本発明方法では、さらに、上記第３工程で得られた混合物から固形分を除去する第４工程を含んでいてもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、ＡＣＥ阻害活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分は、そのまま食品に添加する、あるいは医薬品の有効成分として用いることができる。
さらに、この液体画分を濃縮したり、乾燥させて粉末化したりすることも出来る。これにより、より長期間保存が可能で、加工しやすいペプチド混合物を得ることができる。
第３工程により得られる混合物は、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを高濃度に含むため、そのまま食品に添加する、あるいは医薬品の有効成分として用いることができる。
本発明方法では、さらに、上記第３工程で得られた混合物から固形分を除去する第４工程を含んでいてもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、ＡＣＥ阻害活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分は、そのまま食品に添加する、あるいは医薬品の有効成分として用いることができる。
さらに、この液体画分を濃縮したり、乾燥させて粉末化したりすることも出来る。これにより、より長期間保存が可能で、加工しやすいペプチド混合物を得ることができる。
（ＩＩ）ＡＣＥ阻害ペプチド混合物及びその用途
本発明の第１のＡＣＥ阻害ペプチド混合物は、上記の各工程によって得られたペプチド混合物である。また、本発明の第２のＡＣＥ阻害ペプチド混合物は、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を１重量部含むのに対して、Ａｒｇ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を４〜１２重量部、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を２〜５重量部、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を０．１〜０．４重量部含むペプチド成分混合物である。第２のペプチド混合物中のペプチドはジペプチドであるため、腸管内で吸収されやすく、摂取後、速やかな作用効果が期待できる。
本発明の第１及び第２のペプチド混合物は、高いＡＣＥ阻害作用を有し、夾雑物が少ないため、ＡＣＥ阻害剤、又は血圧降下剤の有効成分として好適に使用できる。ＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は医薬品（ＡＣＥ阻害用医薬組成物又は血圧降下用医薬組成物）であってもよく、それぞれの効果を有する食品又は食品添加物であってもよい。
医薬品である場合は、本発明の第１及び第２のペプチド混合物は、ヒトを含む哺乳動物の高血圧症の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。また、うっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善作用（延命効果）を有することから、うっ血性心不全や心不全等の治療剤としても期待できる。本発明でいう予防とは、疾患の発症を完全に抑えることのほか、疾患の進行を抑制することを含み、治療とは、疾患が完快することのほか、疾患が改善することを含む。本発明の第１及び第２のペプチド混合物が含まれる食品は、特定保健用食品や栄養機能食品として好適である。
また、本発明は、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ａｒｇ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種（以下、「第３のＡＣＥ阻害ペプチド又はペプチド混合物」ということもある。)を含むＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤も提供する。これらのペプチドはジペプチドであるため、腸管内で吸収されやすく、摂取後、速やかな作用効果が期待できる。
本発明の第１のＡＣＥ阻害ペプチド混合物は、上記の各工程によって得られたペプチド混合物である。また、本発明の第２のＡＣＥ阻害ペプチド混合物は、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を１重量部含むのに対して、Ａｒｇ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を４〜１２重量部、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を２〜５重量部、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を０．１〜０．４重量部含むペプチド成分混合物である。第２のペプチド混合物中のペプチドはジペプチドであるため、腸管内で吸収されやすく、摂取後、速やかな作用効果が期待できる。
本発明の第１及び第２のペプチド混合物は、高いＡＣＥ阻害作用を有し、夾雑物が少ないため、ＡＣＥ阻害剤、又は血圧降下剤の有効成分として好適に使用できる。ＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は医薬品（ＡＣＥ阻害用医薬組成物又は血圧降下用医薬組成物）であってもよく、それぞれの効果を有する食品又は食品添加物であってもよい。
医薬品である場合は、本発明の第１及び第２のペプチド混合物は、ヒトを含む哺乳動物の高血圧症の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。また、うっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善作用（延命効果）を有することから、うっ血性心不全や心不全等の治療剤としても期待できる。本発明でいう予防とは、疾患の発症を完全に抑えることのほか、疾患の進行を抑制することを含み、治療とは、疾患が完快することのほか、疾患が改善することを含む。本発明の第１及び第２のペプチド混合物が含まれる食品は、特定保健用食品や栄養機能食品として好適である。
また、本発明は、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ａｒｇ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種（以下、「第３のＡＣＥ阻害ペプチド又はペプチド混合物」ということもある。)を含むＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤も提供する。これらのペプチドはジペプチドであるため、腸管内で吸収されやすく、摂取後、速やかな作用効果が期待できる。
食品
ＡＣＥ阻害効果、又は血圧降下効果を有する食品である場合、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子；酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、清涼飲料水、スープ、乳飲料のような飲料または粉末飲料；米飯、粥、麺類のような穀類加工品などが挙げられる。また、錠剤やカプセルなどのいわゆるサプリメント (食品製剤)であってもよい。
食品中の第１〜第３のペプチド又はペプチド混合物の含有量は、固形またはゲル状食品の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、０．１〜１重量％程度が好ましく、０．２５〜０．５重量％程度がより好ましい。液体状又は流動状食品の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、０．１〜１ｗ/ｖ％程度が好ましく、０．２５〜０．５ｗ/ｖ％程度がより好ましい。サプリメント(食品製剤)の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、２０〜８０重量％程度が好ましく、３０〜６０重量％程度がより好ましい。
ＡＣＥ阻害効果、又は血圧降下効果を有する食品である場合、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子；酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、清涼飲料水、スープ、乳飲料のような飲料または粉末飲料；米飯、粥、麺類のような穀類加工品などが挙げられる。また、錠剤やカプセルなどのいわゆるサプリメント (食品製剤)であってもよい。
食品中の第１〜第３のペプチド又はペプチド混合物の含有量は、固形またはゲル状食品の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、０．１〜１重量％程度が好ましく、０．２５〜０．５重量％程度がより好ましい。液体状又は流動状食品の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、０．１〜１ｗ/ｖ％程度が好ましく、０．２５〜０．５ｗ/ｖ％程度がより好ましい。サプリメント(食品製剤)の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、２０〜８０重量％程度が好ましく、３０〜６０重量％程度がより好ましい。
食品としてのＡＣＥ阻害成分を含むペプチド混合物は、米由来であるため摂取された場合、風味が良好で、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。
食品としてのＡＣＥ阻害効果又は血圧降下効果を有するペプチド混合物の摂取量は、対象者の年齢、体重、症状などによって異なるが、成人１日当たりペプチドの合計乾燥重量が約０．３〜２ｇとなる量が好ましく、約０．５〜１ｇとなる量がより好ましい。上記範囲であれば十分にＡＣＥ阻害効果又は血圧降下効果が得られる。
医薬品
ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤が医薬品の場合、製剤形態は特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、点滴や注射剤等の非経口剤が挙げられる。本発明の第１〜第３のペプチド混合物中のペプチドは、消化管から吸収されるため、使用が簡単な経口剤が好ましい。
これらの製剤には、ペプチド混合物の他に医薬の分野で通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤などが含まれていても良い。これら添加剤の種類は、特に限定されず、通常の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤等に用いられるものを使用することができる。具体的には、賦形剤としては、例えば結晶セルロースなどの糖類、マンニトールなどの糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えばデンプン類、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸およびその塩、タルク、ワックスなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えばカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類などが挙げられる。
医薬製剤中の第１〜３のペプチド又はペプチド混合物の含有量は、固形またはゲル状経口剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、２０〜８０重量％程度が好ましく、３０〜６０重量％程度がより好ましい。液体状又は流動状経口剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、１〜１０ｗ/ｖ％程度が好ましく、２．５〜５ｗ/ｖ％程度がより好ましい。また、注射剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、２０〜５０ｗ/ｖ％程度が好ましく、３０〜４０ｗ/ｖ％程度がより好ましい。
ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤が医薬品の場合、製剤形態は特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、点滴や注射剤等の非経口剤が挙げられる。本発明の第１〜第３のペプチド混合物中のペプチドは、消化管から吸収されるため、使用が簡単な経口剤が好ましい。
これらの製剤には、ペプチド混合物の他に医薬の分野で通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤などが含まれていても良い。これら添加剤の種類は、特に限定されず、通常の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤等に用いられるものを使用することができる。具体的には、賦形剤としては、例えば結晶セルロースなどの糖類、マンニトールなどの糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えばデンプン類、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸およびその塩、タルク、ワックスなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えばカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類などが挙げられる。
医薬製剤中の第１〜３のペプチド又はペプチド混合物の含有量は、固形またはゲル状経口剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、２０〜８０重量％程度が好ましく、３０〜６０重量％程度がより好ましい。液体状又は流動状経口剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、１〜１０ｗ/ｖ％程度が好ましく、２．５〜５ｗ/ｖ％程度がより好ましい。また、注射剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、２０〜５０ｗ/ｖ％程度が好ましく、３０〜４０ｗ/ｖ％程度がより好ましい。
医薬品としてのＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤の用法用量は、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、経口摂取の場合は、成人１日当たり、ペプチドの合計乾燥重量が約０．３〜２ｇとなる量が好ましく、約０．５〜１ｇとなる量がより好ましい。また、注射剤の場合は、成人１日当たり、ペプチドの合計乾燥重量が約０．２〜１．５ｇとなる量が好ましく、約０．３〜０．７ｇとなる量がより好ましい。上記範囲内であれば、十分なＡＣＥ阻害作用又は血圧降下作用が得られる。
医薬品としてのＡＣＥ阻害成分を含むペプチド混合物も、米由来であるため、食品の場合と同様に、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。
医薬品としてのＡＣＥ阻害成分を含むペプチド混合物も、米由来であるため、食品の場合と同様に、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。
対象
本発明のＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、正常高値（収縮期血圧１３０〜１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧８５〜８９ｍｍＨｇ）、軽症高血圧（収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇ、拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）のヒトが好適な対象となる。また、これに相当する血圧を示す哺乳動物も好適な対象となる。
本発明のＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、正常高値（収縮期血圧１３０〜１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧８５〜８９ｍｍＨｇ）、軽症高血圧（収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇ、拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）のヒトが好適な対象となる。また、これに相当する血圧を示す哺乳動物も好適な対象となる。
実施例
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（Ａ）ペプチド混合物の製造方法
＜酒粕の糖質除去（第１〜２工程）＞
図１に示したフローチャートに従って酒粕に含まれる糖質を除去した。具体的には以下の手順で行なった。
（１）酒粕６０ｋｇ（湿重量、固形分５８．４％）に水１２０Ｌを添加し十分に攪拌した。この混合物を５０℃に保温した状態でセルラーゼ（セルロイシンＴ２；エイチビィアイ社製）３０ｇとβ−アミラーゼ（ビオザイムＭ；天野エンザイム社製）３０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した（第１工程）。
（２）分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。
（３）圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株） ＯＮＳ自動圧濾圧搾機 500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、タンパク高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、固形分５６．８％）を得た（第２工程）。
＜タンパク高含有酒粕の分解（第３〜４工程）＞
図２に示したフローチャートに従って、前述の図１に示す工程で得られたタンパク高含有酒粕の分解を行なった。具体的には以下の手順で行なった。
（１）図１に示す工程で得られたタンパク高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、５６．８％）に水１８０Ｌを加え、ＫＯＨでｐＨ６．８に調製し、よく攪拌した。
（２）５０℃に保温した状態で、中性プロテアーゼ（バチルス属細菌由来、プロテアーゼＮアマノＧ；天野エンザイム社製）２１０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。さらに、ＨＣｌでｐＨ４．２に調製し、よく攪拌した後、酸性プロテアーゼ（アスペルギルス属菌由来、スミチームＡＰ；新日本化学工業社製）２５０ｇを添加して６０℃で２２時間さらに分解した（第３工程）。
（３）分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。
（４）圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株） ＯＮＳ自動圧濾圧搾機 500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合液２００Ｌを得た（第４工程）。
（６）得られたペプチド混合物を減圧濃縮法で濃縮し、さらにフリーズドライ法で粉末化した。減圧濃縮はロータリーエバポレーター（日本ビュッヒ株式会社製 RE121 Rotavapor：湯浴温度50℃、100rpm）とアスピレーター（ヤマト科学製 Neocool Aspirator BP-51：冷却温度5℃）を用いて行なった。フリーズドライは凍結乾燥機（EYELA 東京理化器械株式会社製 FDU-2100）を用いてマイナス８０℃、真空度０．４Paで粉末になるまで除湿乾燥させることにより行った。
＜酒粕の糖質除去（第１〜２工程）＞
図１に示したフローチャートに従って酒粕に含まれる糖質を除去した。具体的には以下の手順で行なった。
（１）酒粕６０ｋｇ（湿重量、固形分５８．４％）に水１２０Ｌを添加し十分に攪拌した。この混合物を５０℃に保温した状態でセルラーゼ（セルロイシンＴ２；エイチビィアイ社製）３０ｇとβ−アミラーゼ（ビオザイムＭ；天野エンザイム社製）３０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した（第１工程）。
（２）分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。
（３）圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株） ＯＮＳ自動圧濾圧搾機 500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、タンパク高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、固形分５６．８％）を得た（第２工程）。
＜タンパク高含有酒粕の分解（第３〜４工程）＞
図２に示したフローチャートに従って、前述の図１に示す工程で得られたタンパク高含有酒粕の分解を行なった。具体的には以下の手順で行なった。
（１）図１に示す工程で得られたタンパク高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、５６．８％）に水１８０Ｌを加え、ＫＯＨでｐＨ６．８に調製し、よく攪拌した。
（２）５０℃に保温した状態で、中性プロテアーゼ（バチルス属細菌由来、プロテアーゼＮアマノＧ；天野エンザイム社製）２１０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。さらに、ＨＣｌでｐＨ４．２に調製し、よく攪拌した後、酸性プロテアーゼ（アスペルギルス属菌由来、スミチームＡＰ；新日本化学工業社製）２５０ｇを添加して６０℃で２２時間さらに分解した（第３工程）。
（３）分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。
（４）圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株） ＯＮＳ自動圧濾圧搾機 500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合液２００Ｌを得た（第４工程）。
（６）得られたペプチド混合物を減圧濃縮法で濃縮し、さらにフリーズドライ法で粉末化した。減圧濃縮はロータリーエバポレーター（日本ビュッヒ株式会社製 RE121 Rotavapor：湯浴温度50℃、100rpm）とアスピレーター（ヤマト科学製 Neocool Aspirator BP-51：冷却温度5℃）を用いて行なった。フリーズドライは凍結乾燥機（EYELA 東京理化器械株式会社製 FDU-2100）を用いてマイナス８０℃、真空度０．４Paで粉末になるまで除湿乾燥させることにより行った。
（Ｂ）糖質分解酵素の種類の検討
酒粕の糖質を除去するために使用する酵素の種類を比較検討した。上記（Ａ）の手順において、セルラーゼ及びβ−アミラーゼを糖質分解酵素として使用するのに代えて、以下の表１に示す酵素を用いた他は、（Ａ）と同様にしてペプチド混合物を得た。結果を表１に示す。表１中、総活性は固形分比率にＡＣＥ阻害活性の値を乗じたものの相対値である。
表１から、セルラーゼ単独でも実用的な高いＡＣＥ阻害活性が得られるが、さらに、βアミラーゼ、α−アミラーゼ、又はα−グルコシダーゼを併用する場合はさらに高いＡＣＥ阻害活性が得られることが分かる。特に、β−アミラーゼを併用した場合に最も高いＡＣＥ阻害活性が見られた。
酒粕の糖質を除去するために使用する酵素の種類を比較検討した。上記（Ａ）の手順において、セルラーゼ及びβ−アミラーゼを糖質分解酵素として使用するのに代えて、以下の表１に示す酵素を用いた他は、（Ａ）と同様にしてペプチド混合物を得た。結果を表１に示す。表１中、総活性は固形分比率にＡＣＥ阻害活性の値を乗じたものの相対値である。
（Ｃ）プロテアーゼの種類の検討
タンパク質分解酵素の種類を比較検討した。上記（Ａ）の手順において、プロテアーゼとして中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼとを併用するのに代えて、以下の表２に示す酵素を用いて、ペプチド混合物を得た。結果を表２に示す。
表２から、中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼとを併用することにより、ＡＣＥ阻害ペプチドの製造効率に相乗効果が得られたことが分かる。
タンパク質分解酵素の種類を比較検討した。上記（Ａ）の手順において、プロテアーゼとして中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼとを併用するのに代えて、以下の表２に示す酵素を用いて、ペプチド混合物を得た。結果を表２に示す。
本発明実施例において、ＡＣＥ阻害活性は以下の方法で測定した。
ＡＣＥ阻害活性測定方法
ＡＣＥ阻害活性は、ＪＯＵＲＮＡＬ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２３３（１９８２）１２３−１３０に記載の方法に準じて測定した。具体的には以下の手順で測定した。
＜試薬＞
（１）基質溶液
６．５ｍＭ Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所製）、５２０ｍＭ ＮａＣｌ、を０．２Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したものを使用した。
（２）酵素液
ウサギ肺由来ＡＣＥ酵素（ＳＩＧＭＡ製）１Ｕ／ｍｌを０．２Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したもの（最終濃度０．１Ｕ／ｍｌ）を使用した。
（３）反応停止液
３％w/vメタ燐酸溶液を使用した。
＜測定手順＞
（１）２５０〜１０００ｐｐｍに調製したテストサンプル（コントロールの場合は蒸留水）６０μｌと酵素液３０μｌを３７℃で保温した。
（２）３分後に基質溶液３００μｌを添加して３７℃で３０分間反応させた。
（３）３０分後、反応停止液５００μｌを添加して反応を停止させた。
（４）ＨＰＬＣにて馬尿酸濃度を測定した。測定条件を以下に示す。
使用機種 SHIMADZU LC10AVP
カラム Waters SunFire C18 4.6mm×150mm
移動層 A液：20ｍM リン酸バッファーｐH3.0、B液：メタノール A:B=55：45
注入量 20μl 流速 1ml/分
カラム温度 40℃
（５）以下の式に従い、ＡＣＥ阻害活性を算出した。
ＡＣＥ阻害活性＝[(コントロールの馬尿酸濃度−テストサンプルの馬尿酸濃度）/コントロールの馬尿酸濃度]×100（％）
（６）また、ＡＣＥ阻害活性が５０％となるときのサンプル濃度（ＩＣ５０）を算出した。
ＡＣＥ阻害活性測定方法
ＡＣＥ阻害活性は、ＪＯＵＲＮＡＬ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２３３（１９８２）１２３−１３０に記載の方法に準じて測定した。具体的には以下の手順で測定した。
＜試薬＞
（１）基質溶液
６．５ｍＭ Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所製）、５２０ｍＭ ＮａＣｌ、を０．２Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したものを使用した。
（２）酵素液
ウサギ肺由来ＡＣＥ酵素（ＳＩＧＭＡ製）１Ｕ／ｍｌを０．２Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解したもの（最終濃度０．１Ｕ／ｍｌ）を使用した。
（３）反応停止液
３％w/vメタ燐酸溶液を使用した。
＜測定手順＞
（１）２５０〜１０００ｐｐｍに調製したテストサンプル（コントロールの場合は蒸留水）６０μｌと酵素液３０μｌを３７℃で保温した。
（２）３分後に基質溶液３００μｌを添加して３７℃で３０分間反応させた。
（３）３０分後、反応停止液５００μｌを添加して反応を停止させた。
（４）ＨＰＬＣにて馬尿酸濃度を測定した。測定条件を以下に示す。
使用機種 SHIMADZU LC10AVP
カラム Waters SunFire C18 4.6mm×150mm
移動層 A液：20ｍM リン酸バッファーｐH3.0、B液：メタノール A:B=55：45
注入量 20μl 流速 1ml/分
カラム温度 40℃
（５）以下の式に従い、ＡＣＥ阻害活性を算出した。
ＡＣＥ阻害活性＝[(コントロールの馬尿酸濃度−テストサンプルの馬尿酸濃度）/コントロールの馬尿酸濃度]×100（％）
（６）また、ＡＣＥ阻害活性が５０％となるときのサンプル濃度（ＩＣ５０）を算出した。
（Ｄ）ＡＣＥ阻害ペプチドの定量
上記（Ａ）により得られたペプチド混合物中に含まれるＡＣＥ阻害ペプチドをＬＣ／ＭＳ分析法により定量した。分析条件を以下に示す。
＜ペプチド標準試料の測定＞
（１）ペプチド標準溶液の調製
各種ペプチド（Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ａｒｇ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ；国産化学社製）１０ｍｇを量り取り、水または塩酸水溶液を加え完全に溶解させ、１ｍＬに定容した。
（２）内部標準物質溶液の調製
Ｎ−ｃａｒｂａｍｙｌ−Ｌ−Ａｒｇ（シグマ社製）１０ｍｇを量り取り、０．０６Ｎ塩酸水溶液１ｍＬで完全に溶解させ、内部標準溶液原液とした。
（３）標準溶液の調製
ペプチド標準溶液と内部標準原液を混合し、各種ペプチドと内部標準物質が各0.0１ｍｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう標準溶液を調製した。下記のＬＣ／ＭＳ分析条件により、各ペプチドのＭＳピーク面積を測定した。
装置：Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器)
カラム： Imtakt UK-C18 75×4.6mm
移動相：A液：0.05% HCOOH/水、B液：アセトニトリル（0-25%/0-7.5分、100%/7.5-8.5分）
注入量：10 μＬ
流速：1mＬ/分
カラム温度：35℃
検出条件：UV 190-300 nm
MS エレクトロスプレーイオン（ESI）法 positive ＳＩＲモード
＜ペプチド混合物の測定＞
（１）上記（Ａ）により得られたペプチド混合物１０ｍｇを純水1ｍＬに溶解し、ペプチド混合物水溶液とした。
（２）ペプチド混合物水溶液と内部標準原液と混合し、ペプチド混合物と内部標準物質が各0.002ｇ／ｍＬ、0.1ｍｇ／ｍＬになるよう試料溶液を調製し、標準溶液の場合と同様に各ペプチドのMSピーク面積を測定した。
（３）得られたペプチドのMSピーク面積より、以下の式に従って各々のペプチド含有量を算出した。
試料のペプチド含有量（ｍｇ/g）＝標準溶液のペプチド濃度（mｇ/ml）×{（試料溶液のペプチドピーク面積/試料のＩＳピーク面積）/（標準溶液のペプチドピーク面積/標準溶液のＩＳピーク面積）}/試料のペプチド濃度（ｇ/ml）
＜結果＞
結果を表４に示す。
表中の従来法は、特許文献１に記載された方法であり、酒粕からのＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法である。表４より、本発明方法により得られるペプチド混合物には、４種類のＡＣＥ阻害ジペプチドが含まれており、それらの濃度は従来法により酒粕から得られる混合物より高いことが分かる。
なお、上記（Ａ）により得られたペプチド混合物のＡＣＥ阻害活性を、従来の製法により得られるＡＣＥ阻害ペプチド混合物のＡＣＥ阻害活性と比較したものを以下の表５に示す。従来製法によるペプチド混合物のＡＣＥ阻害活性は表中に記載した公報から引用した値である。
本発明方法により、従来の食品由来のＡＣＥ阻害ペプチド混合物に比べて格段に活性の高いＡＣＥ阻害ペプチド混合物が得られることが分かる。
上記（Ａ）により得られたペプチド混合物中に含まれるＡＣＥ阻害ペプチドをＬＣ／ＭＳ分析法により定量した。分析条件を以下に示す。
＜ペプチド標準試料の測定＞
（１）ペプチド標準溶液の調製
各種ペプチド（Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ａｒｇ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ；国産化学社製）１０ｍｇを量り取り、水または塩酸水溶液を加え完全に溶解させ、１ｍＬに定容した。
（２）内部標準物質溶液の調製
Ｎ−ｃａｒｂａｍｙｌ−Ｌ−Ａｒｇ（シグマ社製）１０ｍｇを量り取り、０．０６Ｎ塩酸水溶液１ｍＬで完全に溶解させ、内部標準溶液原液とした。
（３）標準溶液の調製
ペプチド標準溶液と内部標準原液を混合し、各種ペプチドと内部標準物質が各0.0１ｍｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう標準溶液を調製した。下記のＬＣ／ＭＳ分析条件により、各ペプチドのＭＳピーク面積を測定した。
装置：Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器)
カラム： Imtakt UK-C18 75×4.6mm
移動相：A液：0.05% HCOOH/水、B液：アセトニトリル（0-25%/0-7.5分、100%/7.5-8.5分）
注入量：10 μＬ
流速：1mＬ/分
カラム温度：35℃
検出条件：UV 190-300 nm
MS エレクトロスプレーイオン（ESI）法 positive ＳＩＲモード
（１）上記（Ａ）により得られたペプチド混合物１０ｍｇを純水1ｍＬに溶解し、ペプチド混合物水溶液とした。
（２）ペプチド混合物水溶液と内部標準原液と混合し、ペプチド混合物と内部標準物質が各0.002ｇ／ｍＬ、0.1ｍｇ／ｍＬになるよう試料溶液を調製し、標準溶液の場合と同様に各ペプチドのMSピーク面積を測定した。
（３）得られたペプチドのMSピーク面積より、以下の式に従って各々のペプチド含有量を算出した。
試料のペプチド含有量（ｍｇ/g）＝標準溶液のペプチド濃度（mｇ/ml）×{（試料溶液のペプチドピーク面積/試料のＩＳピーク面積）/（標準溶液のペプチドピーク面積/標準溶液のＩＳピーク面積）}/試料のペプチド濃度（ｇ/ml）
＜結果＞
結果を表４に示す。
なお、上記（Ａ）により得られたペプチド混合物のＡＣＥ阻害活性を、従来の製法により得られるＡＣＥ阻害ペプチド混合物のＡＣＥ阻害活性と比較したものを以下の表５に示す。従来製法によるペプチド混合物のＡＣＥ阻害活性は表中に記載した公報から引用した値である。
本発明のＡＣＥ阻害ペプチド混合物の製造方法によれば、特別な精製工程を要することなく、天然物からＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合物が高濃度で得られる。このペプチド混合物は血圧降下作用を持つペプチドを多く含み、長期継続摂取しても人体に有害な副作用がない天然物由来の安全な降圧剤として医薬分野や機能性食品分野において幅広く利用が可能である。
Claims (5)
- 酒粕、及び／又は米焼酎粕にセルラーゼ、及びβ−アミラーゼを作用させる第１工程と、第１工程により得られる混合物から液体画分を除去する第２工程と、第２工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び／又は酸性プロテアーゼを作用させる第３工程とを含むことを特徴とする、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物の製造方法。
- 中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼである請求項１に記載の方法。
- 酸性プロテアーゼがアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼである請求項１又は２に記載の方法。
- さらに、第３工程により得られる混合物から固形分を除去する第４工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物が、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ及び／又はその塩、Ａｒｇ−Ｔｒｐ及び／又はその塩、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ及び／又はその塩、並びにＧｌｎ−Ｔｒｐ及び／又はその塩を含むものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
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