JP5015668B2 - アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物及びその製造方法 - Google Patents
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Description
項1. 酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び/又は糠にセルラーゼを作用させる第1工程と、第1工程により得られる混合物から液体画分を除去する第2工程と、第2工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び/又は酸性プロテアーゼを作用させる第3工程とを含むことを特徴とする、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物の製造方法。
項2. 第1工程において、セルラーゼに加えて、アミラーゼを作用させる項1に記載の方法。
項3. アミラーゼがβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及び/又はα−グルコシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一種である項2に記載の方法。
項4. 中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼである項1〜3のいずれかに記載の方法。
項5. さらに、第3工程により得られる混合物から固形分を除去する第4工程を含む項1〜4のいずれかに記載の方法。
項6. 項1〜5のいずれかに記載の方法により得られるアンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物。
項7. Phe−Trp及び/又はその塩を1重量部、Arg−Trp及び/又はその塩を4〜12重量部、Ser−Trp及び/又はその塩を2〜5重量部、Gln−Trp及び/又はその塩を0.1〜0.4重量部含む、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物。
項8. 項1〜5のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項7に記載のペプチド混合物を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
項9. 項1〜5のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項7に記載のペプチド混合物を含む血圧降下剤。
項10. 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
(1)Phe−Trp
(2)Arg−Trp
(3)Ser−Trp
(4)Gln−Trp
項11. 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む血圧降下剤。
(1)Phe−Trp
(2)Arg−Trp
(3)Ser−Trp
(4)Gln−Trp
項12. 項1〜5のいずれかに記載の方法により得られるペプチド混合物、又は項7に記載のペプチド混合物を含む下記 (a)、(b)、又は(c)の食品。
(a)上記ペプチド混合物を0.1〜1重量%含む固形又はゲル状食品
(b)上記ペプチド混合物を0.1〜1w/v%含む液体状又は流動状食品
(c)上記ペプチド混合物を20〜80重量%含む食品製剤
項13. 下記(1)〜(4)のペプチド、及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種のペプチド成分を含む下記(a)、(b)、又は(c)の食品。
(1)Phe−Trp
(2)Arg−Trp
(3)Ser−Trp
(4)Gln−Trp
(a)上記ペプチド成分を0.1〜1重量%含む固形又はゲル状食品
(b)上記ペプチド成分を0.1〜1w/v%含む液体状又は流動状食品
(c)上記ペプチド成分を20〜80重量%含む食品製剤
詳述すれば、本発明方法では、出発原料として、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び/又は糠を用いる。酒粕や米焼酎粕は夾雑物である糖質がある程度分解されているため、また、加熱米は加熱により米がアルファ化し酵素の作用効率が上がるため、さらに、糠は夾雑物となる糖質が少なく、タンパク質が多く含まれるため、その後の工程で、その中に含まれるACE阻害ペプチドを効率よく濃縮することができる。
また、本発明方法では、第1工程でセルラーゼを使用することによりセルロースを分解する。分解されたセルロースが後の第2工程で除去されることで、原料の粘性が低下し、作業効率が向上するとともに、後に添加するプロテアーゼなどの酵素の作用効果が高まる。第1工程で、セルラーゼに加えてα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、及び/又はα−グルコシダーゼなどを使用するときには、これらの効果が一層向上する。
(I)ACE阻害ペプチド混合物の製造方法
本発明のACE阻害ペプチド混合物の製造方法は、酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び/又は糠にセルラーゼを作用させる第1工程と、第1工程により得られる混合物から液体画分を除去する第2工程と、第2工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び/又は酸性プロテアーゼを作用させる第3工程とを含む方法である。
本発明の製造方法で使用する原料としては、米由来のタンパク質加水分解物が用いられる。具体的には酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び/又は精米するときに出る糠が使用される。中でも、夾雑物である糖質が少なくタンパク質が多く含まれる点や、酒類製造の副産物であり入手し易い点で、酒粕及び米焼酎粕が好ましく、酒粕がより好ましい。酒粕は、蒸米、米麹から醸造した場合の酒粕でも、液化した米、米麹を用いる液化仕込みによって醸造した場合の酒粕でもどちらでもよい。
第1工程は、上記原料にセルラーゼを作用させる工程である。
セルラーゼ
セルラーゼは公知のセルラーゼを制限なく使用できる。セルラーゼには、セルロース鎖をランダムに切断するエンドグルカナーゼと、セルロースの還元末端から切断してセルビオースを生成するセロビオヒドロラーゼとが含まれる。いずれを使用してもよいが両者を併用することにより、効率よくセルロースを分解することができる。
また、セルラーゼの由来は特に限定されないが、本発明方法の原料に対して機能し易い点で、トリコデルマ属菌由来のセルラーゼが好ましい。
セルラーゼの使用量は、原料(酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び/又は糠)に対して約0.005〜0.2重量%が好ましく、約0.05〜0.2重量%がより好ましく、約0.05〜0.1重量%がさらにより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内にセルロースが十分に分解されて液体画分に可溶化される。また、反応温度と反応時間は使用する原料とセルラーゼの種類によって異なるが、反応温度は約40〜60℃が好ましく、反応時間は約2〜20時間が好ましい。また、反応時のpHは酵素が機能し易い約3.5〜6が好ましい。上記範囲であれば、セルラーゼが失活することなく、かつその機能を十分に発揮できる。セルラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を例えば約80〜90℃で約30〜60分間加熱することにより停止させることができる。
第1工程では夾雑物である糖質を除去するために、さらにアミラーゼを使用することができる。アミラーゼとはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどが挙げられる。アミラーゼは、1種を単独で、または2種以上を組み合わせて使用できる。中でも、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼが好ましく、β−アミラーゼがより好ましく、小麦由来のβ−アミラーゼがさらにより好ましい。
アミラーゼの使用量は、原料(酒粕、米焼酎粕、加熱米、及び/又は糠)に対して約0.005〜0.2重量%が好ましく、約0.05〜0.1重量%がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に糖質が十分に可溶化される。反応温度と反応時間は使用する原料及び酵素の種類によって異なるが、反応温度は約50〜60℃が好ましく、反応時間は約5〜20時間が好ましい。アミラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を例えば約80〜90℃で約30〜60分間加熱することにより停止させることができる。反応時のpHは酵素が機能し易い約5〜6が好ましい。
第2工程は、上記第1工程により得られる混合物から液体画分を除去する工程である。この工程により低分子化された糖質をはじめ、主に水溶性成分が除去される。固液分離の方法としては、圧搾、ろ過、遠心分離などが挙げられるが、ある程度の水分が除去できればよい。この工程により米由来のタンパク質を多く含む固形分が得られる。
第3工程は、上記第2工程で得られた固形分にプロテアーゼを作用させる工程である。この工程では、原料中のタンパク質から有効成分となるペプチドを得るためにプロテアーゼを使用する。この工程により米由来のタンパク質からACE阻害活性を有するペプチド混合物が生成する。
本発明方法では、プロテアーゼとして、中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼを単独で使用、又は併用する。各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼとアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼが好ましい。本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。中性プロテアーゼは1種を単独で使用しても良いし、2種以上を組み合わせて使用しても良い。酸性プロテアーゼも同様に1種を単独で使用しても良いし、2種以上を組み合わせて使用しても良い。
プロテアーゼの使用量は、中性プロテアーゼも酸性プロテアーゼも、それぞれ第2工程後に得られる混合物、即ち糖質分解後の圧搾物に対して約0.1〜1重量%が好ましく、約0.1〜0.8重量%がより好ましく、約0.3〜0.6重量%がさらにより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に原料中のタンパク質を、ACE阻害活性を有するペプチドにまで分解できる。
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、中性プロテアーゼの場合は、反応温度は約40〜60℃が好ましく、反応時間は約5〜20時間が好ましい。また、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約50〜60℃が好ましく、反応時間は約5〜20時間が好ましい。各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約80〜100℃で約10〜30分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出されたACE阻害活性ペプチドがさらに分解されて、阻害活性が低下することが回避される。または、ACE阻害活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、ACE阻害活性ペプチドの純度の低下を防止できる。
反応時のpHは、中性プロテアーゼの場合、約6〜9が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約3〜5が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。
中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼは、それぞれ単独で作用させてもよく、併用しても良い。併用する場合は、いずれを先に反応させてもよいが、より活性の強いペプチド混合物を得ることができる点で、中性プロテアーゼを先に反応させるのが好ましい。また、両プロテアーゼが機能するpHが重複する場合は、同時に反応させてもよい。
第3工程により得られる混合物は、ACE阻害活性を有するペプチドを高濃度に含むため、そのまま食品に添加する、あるいは医薬品の有効成分として用いることができる。
本発明方法では、さらに、上記第3工程で得られた混合物から固形分を除去する第4工程を含んでいてもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、ACE阻害活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分は、そのまま食品に添加する、あるいは医薬品の有効成分として用いることができる。
さらに、この液体画分を濃縮したり、乾燥させて粉末化したりすることも出来る。これにより、より長期間保存が可能で、加工しやすいペプチド混合物を得ることができる。
本発明の第1のACE阻害ペプチド混合物は、上記の各工程によって得られたペプチド混合物である。また、本発明の第2のACE阻害ペプチド混合物は、Phe−Trp及び/又はその塩を1重量部含むのに対して、Arg−Trp及び/又はその塩を4〜12重量部、Ser−Trp及び/又はその塩を2〜5重量部、Gln−Trp及び/又はその塩を0.1〜0.4重量部含むペプチド成分混合物である。第2のペプチド混合物中のペプチドはジペプチドであるため、腸管内で吸収されやすく、摂取後、速やかな作用効果が期待できる。
本発明の第1及び第2のペプチド混合物は、高いACE阻害作用を有し、夾雑物が少ないため、ACE阻害剤、又は血圧降下剤の有効成分として好適に使用できる。ACE阻害剤、及び血圧降下剤は医薬品(ACE阻害用医薬組成物又は血圧降下用医薬組成物)であってもよく、それぞれの効果を有する食品又は食品添加物であってもよい。
医薬品である場合は、本発明の第1及び第2のペプチド混合物は、ヒトを含む哺乳動物の高血圧症の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。また、うっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善作用(延命効果)を有することから、うっ血性心不全や心不全等の治療剤としても期待できる。本発明でいう予防とは、疾患の発症を完全に抑えることのほか、疾患の進行を抑制することを含み、治療とは、疾患が完快することのほか、疾患が改善することを含む。本発明の第1及び第2のペプチド混合物が含まれる食品は、特定保健用食品や栄養機能食品として好適である。
また、本発明は、Phe−Trp、Arg−Trp、Ser−Trp、Gln−Trp及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種(以下、「第3のACE阻害ペプチド又はペプチド混合物」ということもある。)を含むACE阻害剤及び血圧降下剤も提供する。これらのペプチドはジペプチドであるため、腸管内で吸収されやすく、摂取後、速やかな作用効果が期待できる。
ACE阻害効果、又は血圧降下効果を有する食品である場合、食品の種類は特に限定されない。例えば、飴、ガム、ケーキ、パイ、クッキー、クラッカー、ゼリー、チョコレート、プディング、ポテトチップス、羊羹、煎餅、饅頭、中華饅頭のような菓子;酒類、茶類、コーヒー類、スポーツドリンク類、清涼飲料水、スープ、乳飲料のような飲料または粉末飲料;米飯、粥、麺類のような穀類加工品などが挙げられる。また、錠剤やカプセルなどのいわゆるサプリメント (食品製剤)であってもよい。
食品中の第1〜第3のペプチド又はペプチド混合物の含有量は、固形またはゲル状食品の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、0.1〜1重量%程度が好ましく、0.25〜0.5重量%程度がより好ましい。液体状又は流動状食品の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、0.1〜1w/v%程度が好ましく、0.25〜0.5w/v%程度がより好ましい。サプリメント(食品製剤)の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、20〜80重量%程度が好ましく、30〜60重量%程度がより好ましい。
ACE阻害剤又は血圧降下剤が医薬品の場合、製剤形態は特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、点滴や注射剤等の非経口剤が挙げられる。本発明の第1〜第3のペプチド混合物中のペプチドは、消化管から吸収されるため、使用が簡単な経口剤が好ましい。
これらの製剤には、ペプチド混合物の他に医薬の分野で通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤などが含まれていても良い。これら添加剤の種類は、特に限定されず、通常の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤等に用いられるものを使用することができる。具体的には、賦形剤としては、例えば結晶セルロースなどの糖類、マンニトールなどの糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えばデンプン類、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸およびその塩、タルク、ワックスなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えばカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類などが挙げられる。
医薬製剤中の第1〜3のペプチド又はペプチド混合物の含有量は、固形またはゲル状経口剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、20〜80重量%程度が好ましく、30〜60重量%程度がより好ましい。液体状又は流動状経口剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、1〜10w/v%程度が好ましく、2.5〜5w/v%程度がより好ましい。また、注射剤の場合は、ペプチドの乾燥重量に換算して、20〜50w/v%程度が好ましく、30〜40w/v%程度がより好ましい。
医薬品としてのACE阻害成分を含むペプチド混合物も、米由来であるため、食品の場合と同様に、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。
本発明のACE阻害剤又は血圧降下剤は、正常高値(収縮期血圧130〜139mmHg、拡張期血圧85〜89mmHg)、軽症高血圧(収縮期血圧140〜159mmHg、拡張期血圧90〜99mmHg)のヒトが好適な対象となる。また、これに相当する血圧を示す哺乳動物も好適な対象となる。
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
<酒粕の糖質除去(第1〜2工程)>
図1に示したフローチャートに従って酒粕に含まれる糖質を除去した。具体的には以下の手順で行なった。
(1)酒粕60kg(湿重量、固形分58.4%)に水120Lを添加し十分に攪拌した。この混合物を50℃に保温した状態でセルラーゼ(セルロイシンT2;エイチビィアイ社製)30gとβ−アミラーゼ(ビオザイムM;天野エンザイム社製)30gを添加し、50℃で16時間分解した(第1工程)。
(2)分解終了後、90℃で10分間加熱して反応を停止した。
(3)圧搾機(NSKエンジニアリング(株) ONS自動圧濾圧搾機 500型)にて5kg/cm2で3時間圧搾し、タンパク高含有酒粕41.9kg(湿重量、固形分56.8%)を得た(第2工程)。
<タンパク高含有酒粕の分解(第3〜4工程)>
図2に示したフローチャートに従って、前述の図1に示す工程で得られたタンパク高含有酒粕の分解を行なった。具体的には以下の手順で行なった。
(1)図1に示す工程で得られたタンパク高含有酒粕41.9kg(湿重量、56.8%)に水180Lを加え、KOHでpH6.8に調製し、よく攪拌した。
(2)50℃に保温した状態で、中性プロテアーゼ(バチルス属細菌由来、プロテアーゼNアマノG;天野エンザイム社製)210gを添加し、50℃で16時間分解した。さらに、HClでpH4.2に調製し、よく攪拌した後、酸性プロテアーゼ(アスペルギルス属菌由来、スミチームAP;新日本化学工業社製)250gを添加して60℃で22時間さらに分解した(第3工程)。
(3)分解終了後、90℃で10分間加熱して反応を停止した。
(4)圧搾機(NSKエンジニアリング(株) ONS自動圧濾圧搾機 500型)にて5kg/cm2で3時間圧搾し、ACE阻害作用を有するペプチド混合液200Lを得た(第4工程)。
(6)得られたペプチド混合物を減圧濃縮法で濃縮し、さらにフリーズドライ法で粉末化した。減圧濃縮はロータリーエバポレーター(日本ビュッヒ株式会社製 RE121 Rotavapor:湯浴温度50℃、100rpm)とアスピレーター(ヤマト科学製 Neocool Aspirator BP-51:冷却温度5℃)を用いて行なった。フリーズドライは凍結乾燥機(EYELA 東京理化器械株式会社製 FDU-2100)を用いてマイナス80℃、真空度0.4Paで粉末になるまで除湿乾燥させることにより行った。
酒粕の糖質を除去するために使用する酵素の種類を比較検討した。上記(A)の手順において、セルラーゼ及びβ−アミラーゼを糖質分解酵素として使用するのに代えて、以下の表1に示す酵素を用いた他は、(A)と同様にしてペプチド混合物を得た。結果を表1に示す。表1中、総活性は固形分比率にACE阻害活性の値を乗じたものの相対値である。
タンパク質分解酵素の種類を比較検討した。上記(A)の手順において、プロテアーゼとして中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼとを併用するのに代えて、以下の表2に示す酵素を用いて、ペプチド混合物を得た。結果を表2に示す。
ACE阻害活性測定方法
ACE阻害活性は、JOURNAL of Chromatography,233(1982)123−130に記載の方法に準じて測定した。具体的には以下の手順で測定した。
<試薬>
(1)基質溶液
6.5mM Hip−His−Leu(ペプチド研究所製)、520mM NaCl、を0.2M ホウ酸緩衝液(pH8.3)に溶解したものを使用した。
(2)酵素液
ウサギ肺由来ACE酵素(SIGMA製)1U/mlを0.2M ホウ酸緩衝液(pH8.3)に溶解したもの(最終濃度0.1U/ml)を使用した。
(3)反応停止液
3%w/vメタ燐酸溶液を使用した。
<測定手順>
(1)250〜1000ppmに調製したテストサンプル(コントロールの場合は蒸留水)60μlと酵素液30μlを37℃で保温した。
(2)3分後に基質溶液300μlを添加して37℃で30分間反応させた。
(3)30分後、反応停止液500μlを添加して反応を停止させた。
(4)HPLCにて馬尿酸濃度を測定した。測定条件を以下に示す。
使用機種 SHIMADZU LC10AVP
カラム Waters SunFire C18 4.6mm×150mm
移動層 A液:20mM リン酸バッファーpH3.0、B液:メタノール A:B=55:45
注入量 20μl 流速 1ml/分
カラム温度 40℃
(5)以下の式に従い、ACE阻害活性を算出した。
ACE阻害活性=[(コントロールの馬尿酸濃度−テストサンプルの馬尿酸濃度)/コントロールの馬尿酸濃度]×100(%)
(6)また、ACE阻害活性が50%となるときのサンプル濃度(IC50)を算出した。
上記(A)により得られたペプチド混合物中に含まれるACE阻害ペプチドをLC/MS分析法により定量した。分析条件を以下に示す。
<ペプチド標準試料の測定>
(1)ペプチド標準溶液の調製
各種ペプチド(Phe−Trp、Arg−Trp、Ser−Trp、Gln−Trp;国産化学社製)10mgを量り取り、水または塩酸水溶液を加え完全に溶解させ、1mLに定容した。
(2)内部標準物質溶液の調製
N−carbamyl−L−Arg(シグマ社製)10mgを量り取り、0.06N塩酸水溶液1mLで完全に溶解させ、内部標準溶液原液とした。
(3)標準溶液の調製
ペプチド標準溶液と内部標準原液を混合し、各種ペプチドと内部標準物質が各0.01mg/ml、0.1mg/mlになるよう標準溶液を調製した。下記のLC/MS分析条件により、各ペプチドのMSピーク面積を測定した。
装置:Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器)
カラム: Imtakt UK-C18 75×4.6mm
移動相:A液:0.05% HCOOH/水、B液:アセトニトリル(0-25%/0-7.5分、100%/7.5-8.5分)
注入量:10 μL
流速:1mL/分
カラム温度:35℃
検出条件:UV 190-300 nm
MS エレクトロスプレーイオン(ESI)法 positive SIRモード
(1)上記(A)により得られたペプチド混合物10mgを純水1mLに溶解し、ペプチド混合物水溶液とした。
(2)ペプチド混合物水溶液と内部標準原液と混合し、ペプチド混合物と内部標準物質が各0.002g/mL、0.1mg/mLになるよう試料溶液を調製し、標準溶液の場合と同様に各ペプチドのMSピーク面積を測定した。
(3)得られたペプチドのMSピーク面積より、以下の式に従って各々のペプチド含有量を算出した。
試料のペプチド含有量(mg/g)=標準溶液のペプチド濃度(mg/ml)×{(試料溶液のペプチドピーク面積/試料のISピーク面積)/(標準溶液のペプチドピーク面積/標準溶液のISピーク面積)}/試料のペプチド濃度(g/ml)
<結果>
結果を表4に示す。
なお、上記(A)により得られたペプチド混合物のACE阻害活性を、従来の製法により得られるACE阻害ペプチド混合物のACE阻害活性と比較したものを以下の表5に示す。従来製法によるペプチド混合物のACE阻害活性は表中に記載した公報から引用した値である。
Claims (5)
- 酒粕、及び/又は米焼酎粕にセルラーゼ、及びβ−アミラーゼを作用させる第1工程と、第1工程により得られる混合物から液体画分を除去する第2工程と、第2工程により得られる固形分に中性プロテアーゼ及び/又は酸性プロテアーゼを作用させる第3工程とを含むことを特徴とする、アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物の製造方法。
- 中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼである請求項1に記載の方法。
- 酸性プロテアーゼがアスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼである請求項1又は2に記載の方法。
- さらに、第3工程により得られる混合物から固形分を除去する第4工程を含む請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド混合物が、Phe−Trp及び/又はその塩、Arg−Trp及び/又はその塩、Ser−Trp及び/又はその塩、並びにGln−Trp及び/又はその塩を含むものである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
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