JP5012148B2 - 液体クロマトグラフ - Google Patents

Description

本発明は、複数種類の溶媒をミキサで混合し、試料注入部から注入された試料を分離カラムに導くための移動相とする液体クロマトグラフに関するものであり、特に、濃縮カラムを備えて、希薄な試料を濃縮カラムを用いて濃縮して分析することも可能な液体クロマトグラフに関するものである。

通常、高速液体クロマトグラフでは試料は試料注入部から分析流路に注入され、送液ポンプにより送液される移動相によって分析カラムへと搬送され、分析カラムで成分ごとに分離される。その際、試料注入部から注入される試料の量を多くすると、試料溶媒の働きによって分離カラム内で試料のバンドが広がり、分離能が低下して高感度分析ができなくなることがあるため、試料溶液の注入量を多くすることは好ましくない。

しかし、希薄な試料を分析する場合、十分な分析感度を得るために分析における試料の絶対質量を多くする必要があり、そのためには大量の試料を試料注入部から注入しなければならないことがある。そのような場合には、濃縮カラムを用いたオンライン濃縮による分析がよく行なわれる。

オンライン濃縮による分析は、試料注入部から注入された試料を濃縮カラムで捕捉することで濃縮し、濃縮カラムに捕捉されて濃縮された試料を分離カラムで分離分析する。このようなオンライン濃縮による分析では、濃縮カラムの濃縮効率や分離カラムの劣化を検査するために、同じ試料をオンライン濃縮ではない通常の直接分析による手法で分析して比較実験を行ない、回収率の測定を行なっている。この回収率測定では、液体クロマトグラフの流路構成をオンライン濃縮用の流路構成から直接分析用の流路構成に変更する必要があり、そのための配管変更作業は非常に煩雑な作業で時間がかかるばかりか、変更後の移動相の漏れや配管内のデッドボリュームに対する配慮などの問題点があった。そのような問題点を解決するために、本発明者は、流路切替えバルブを切り替えるだけでオンライン濃縮用の流路構成と直接分析用の流路構成とを切り替えられるようにすることを提案している（特許文献１を参照。）。

ところで、液体クロマトグラフによる分析では、２種類以上の溶媒を混合したものを移動相として送液し、その混合比を時間とともに変化させることが行なわれており、それらの溶媒の混合の促進を図るために流路上にミキサが配置されている。そのような分析では、５０μＬ／ｍｉｎ〜１ｍＬ／ｍｉｎ程度のコンベンショナル流量で送液することが好ましい場合もあれば、５０μＬ／ｍｉｎ以下のミクロ流路で送液することが好ましい場合もある。
特開２００５−２１４８９９号公報

例えば直接分析時などは移動相をコンベンショナル流量で送液することが一般的であり、試料濃縮後の濃縮分析などは移動相をミクロ流量で送液することが一般的である。移動相の混合の促進を図るミキサとしては、移動相の流量がコンベンショナル流量である場合には容量が１ｍＬ程度の比較的大きいものを用いることが好ましく、移動相の流量がミクロ流量である場合には容量が５μＬ程度の比較的小さいものを用いることが好ましい。というのは、移動相を５μＬ／ｍｉｎで送液するときに１ｍＬの容量のミキサを用いた場合、ミキサの容量が流量に対して大きすぎるために約２００分もの遅れ時間が生じるからである。逆に、移動相を１ｍＬ／ｍｉｎで送液するときに５μＬの容量のミキサを用いると移動相の混合が不十分になる。したがって、液体クロマトグラフの１つの系でミクロ流量からコンベンショナル流量までの幅広い流量範囲で移動相を送液する必要がある場合には、ミキサとしてどのような容量のものを用いるかが問題となる。

そこで本発明は、複数種類の溶媒を混合したものを移動相とする液体クロマトグラフにおいて、幅広い流量範囲で移動相を送液しても不具合を生じさせることなく分析を行なうことが可能な液体クロマトグラフを提供することを目的とするものである。

本発明の液体クロマトグラフは、それぞれ別々の溶媒が送液される複数の溶媒送液流路からなる移動相送液部の下流側に移動相送液部からの溶媒を混合するための第１混合ミキサ、第１混合ミキサよりも大容量の第２混合ミキサ、試料を注入するための試料注入部、試料を成分ごとに分離するための分離カラム、及び分離カラムで分離された各成分を検出するための検出器が順に接続され、試料注入部から注入された試料を第１混合ミキサ、第２混合ミキサで混合された混合溶媒によって分離カラムに導いて成分ごとに分離し、分離した各成分を検出器で検出するための通常分析流路と、濃縮カラムに濃縮された試料液を送液するための濃縮用溶液を送液するための濃縮用溶液送液部、第２混合ミキサ、試料注入部及び濃縮カラムが順に接続され、試料注入部から注入された試料を濃縮用溶液によって濃縮カラムに導き、濃縮カラムに試料を捕捉させて濃縮するための濃縮流路と、移動相送液部、第１混合ミキサ、濃縮カラム、分離カラム及び検出器が順に接続され、濃縮カラムに捕捉された試料を第１混合ミキサで混合された混合溶媒によって溶出して分離カラムに導いて成分ごとに分離し、分離された各成分を検出器で検出するための濃縮分析流路と、通常分析流路、濃縮流路及び濃縮分析流路のいずれか１つの流路を選択的に構成するように流路を切り替える流路切替え機構と、を備え、移動相送液部は濃縮分析流路が選択されたときは通常分析流路が選択されたときよりも送液流量を小さくするように設定されている。

本発明の液体クロマトグラフにおいて、第１混合ミキサは濃縮分析時に溶媒の混合の促進を図る目的で用いられ、第２混合ミキサは通常分析時に溶媒の混合の促進を図る目的で用いられる。一般に、通常分析では移動相を５０μＬ／ｍｉｎよりも大きいコンベンショナル流量で送液する。逆に、濃縮分析では、移動相を５０μＬ／ｍｉｎ以下のミクロ流量で送液することが好ましい。すなわち、通常分析時に用いる第２混合ミキサの容量は５０μＬ／ｍｉｎよりも大きいコンベンショナル流量で送液される溶媒を混合するのに適した容量、例えば１ｍＬ程度の容量のミキサである。また、濃縮分析時に用いる第１混合ミキサの容量は５０μＬ／ｍｉｎ以下のミクロ流量で送液される溶媒を混合するのに適した容量、例えば５μＬ程度の容量のミキサである。なお、本発明では通常分析流路に第１混合ミキサも含まれているが、通常分析の送液流量に対して容量の小さい第１混合ミキサも移動相が通過しても送液に問題は生じない。逆に、濃縮分析時には小さな流量で送液される移動相が第２混合ミキサを通過すると、第２混合ミキサの容量に対して移動相の送液流量が小さすぎるため、送液に大きな遅れ時間が生じる。そのため、濃縮分析流路には第２混合ミキサを含んでいない。

また、本発明では、通常分析流路における第１混合ミキサの配置は試料注入部と分離カラムの間になるように変更されていてもよい。
通常分析時においては、第１混合ミキサは溶媒の混合の促進を図る役割を担っておらず、第１混合ミキサの位置が分析に影響を与えることはない。

本発明の液体クロマトグラフでは、通常分析時は、移動相送液部、第１混合ミキサ、第２混合ミキサ、試料注入部、分離カラム及び検出器を順に接続して通常分析流路を構成し、試料濃縮時は、濃縮用溶液送液部、試料注入部及び濃縮カラムを接続して濃縮流路を構成し、濃縮分析時は、移動相送液部、第１混合ミキサ、濃縮カラム、分離カラム及び検出器を順に接続して濃縮分析流路を構成するように流路を切り替え、濃縮分析時は通常分析時よりも送液流量を小さくするようになっているので、移動相の送液流量が大きい通常分析における移動相の混合も、移動相の送液流量が小さい濃縮分析における移動相の混合も、その送液流量に適した容量のミキサを用いて溶媒の混合の促進を図ることができる。これにより、移動相の送液流量に関係なく十分な溶媒の混合を行なうことができ、送液の遅れ時間の発生を生じさせることなく、分析の再現性を向上させることができる。

本発明の液体クロマトグラフの一実施例を説明する。図１は液体クロマトグラフの実施例を具体的に示す流路構成図である。
流路切替え機構８として２つの流路切替えバルブ８ａ，８ｂが設けられている。流路切替えバルブ８ａ，８ｂはそれぞれ時計回りにａ〜ｆの符号が付された６個のポートを備えている。流路切替えバルブ８ａ，８ｂはそれぞれ隣接するポートａとｂ、ｃとｄ、ｅとｆの組が同時に接続され、また、別のタイミングで隣接するポートａとｆ、ｂとｃ、ｄとｅの組が同時に接続されるようになっている。

流路切替えバルブ８ａのポートａには移動相送液流路３０が接続されている。移動相送液流路３０は、容器１８ａ，１８ｂに貯留された２種類の溶媒を送液ポンプ２０ａ，２０ｂによって送液する２本の流路の合流部に設けられた第１混合ミキサとしてのミクロミキサ４ａの下流側に接続されている。ミクロミキサ４ａの容量は例えば５μＬである。容器１８ａ，１８ｂ及び送液ポンプ２０ａ，２０ｂは移動相送液部２を実現している。

流路切替えバルブ８ａのポートｂと流路切替えバルブ８ｂのポートａとがポート間接続流路３６によって接続されている。また、流路切替えバルブ８ａのポートｄと流路切替えバルブ８ｂのポートｄとがポート間接続流路３８によって接続されている。

流路切替えバルブ８ａのポートｃ，ｆに試料注入部６が設けられた試料注入流路３４の一端と他端がそれぞれ接続されている。流路構成上、試料流入流路３４は流路切替えバルブ８ａのポートｆに接続されている側が上流側であり、ポートｃに接続されている側が下流側である。試料注入流路３４の試料注入部６よりも上流側に第２混合ミキサとしてのコンベンショナルミキサ４ｂが設けられている。コンベンショナルミキサ４ｂの容量は例えば１ｍＬである。

なお、この液体クロマトグラフでは、ミクロミキサ４ａが移動相送液部２を構成する２本の流路の合流部に配置され、移動相送液部２からの移動相がその流量に関係なくミクロミキサ４ａを通過するようになっているが、移動相送液部２からの移動相の送液流量が大きい場合にはミクロミキサ４ａの容量による送液への影響が小さい。

流路切替えバルブ８ａのポートｅには濃縮カラムに濃縮された試料液を送液するための濃縮用溶液が貯留された容器２２から送液ポンプ２４によって濃縮用溶液を送液するための濃縮用溶液送液流路３２が接続されている。容器２２と送液ポンプ２４は濃縮用溶液送液部１２を実現している。
流路切替えバルブ８ｂのポートｂに分離カラム２６及び検出器２８を備えた分析流路４２が接続されている。
流路切替えバルブ８ｂのポートｃ，ｆに濃縮カラム１４を備えた濃縮カラム流路４０の一端と他端がそれぞれ接続されている。
流路切替えバルブ８ｂのポートｅはドレインに通じている。

この実施例の液体クロマトグラフでは、流路切替えバルブ８ａは通常分析と濃縮分析とを切り替えるのに使用され、流路切替えバルブ８ｂは濃縮分析時の試料濃縮工程と分析工程とを切り替えるのに使用される。以下に、この実施例の液体クロマトグラフを用いた分析方法を説明する。

[通常分析]
濃縮カラムを用いない通常分析時の流路構成を図２に示す。この図において移動相が流れる経路を太線で示している。流路切替えバルブ８ａをポートａとｆ，ｂとｃ，ｄとｅが接続された状態、流路切替えバルブ８ｂをポートａとｂ，ｃとｄ，ｅとｆが接続された状態にする。そうすると、移動相送液流路３０の下流側に、試料注入流路３４、ポート間接続流路３６及び分析流路４２が順に接続され、通常分析流路が構成される。

移動相送液部２により５０μＬ／ｍｉｎよりも大きいコンベンショナル流量で２種類の溶媒からなる移動相を送液する。移動相送液部２により送液される移動相はミクロミキサ４ａとコンベンショナルミキサ４ｂの両方のミキサを通過するが、特にコンベンショナルミキサ４ｂにおいて十分に混合された後、試料注入流路３４を通って試料注入部６から注入された試料を分析部１０へと搬送する。移動相によって分析部１０まで搬送された試料は分離カラム２６によって成分ごとに分離され、分離された各成分はさらに検出器２８まで搬送されて検出される。

この通常分析時には、移動相送液部２からの移動相がコンベンショナル流量で送液される溶媒を混合するのに適した大きな容量をもつコンベンショナルミキサ４ｂを通過するので、移動相の混合を十分に行なうことができる。

[濃縮分析]
濃縮カラムを用いて試料を濃縮し、その濃縮した試料を用いて分析を行なう濃縮分析時の流路構成を図３（Ａ），（Ｂ）に示す。図３（Ａ）は濃縮カラムを用いて試料の濃縮を行なう試料濃縮工程時の流路構成を示しており、そのときの濃縮用溶液が流れる経路を太線で示している。同図（Ｂ）は濃縮された試料の分析を行なう濃縮分析工程時の流路構成を示しており、そのときの移動相が流れる経路を太線で示している。

濃縮分析では、試料濃縮工程及び濃縮分析工程において流路切替えバルブ８ａをポートａとｂ，ｃとｄ，ｅとｆが接続された状態にしておく。
（試料濃縮工程）
試料濃縮工程では、図３（Ａ）に示されているように、流路切替えバルブ８ｂをポートａとｂ，ｃとｄ，ｅとｆが接続された状態にする。そうすると、濃縮用溶液送液流路３２の下流側に試料注入流路３４、ポート間接続流路３８及び濃縮カラム流路４０が順に接続され、濃縮流路が構成される。

濃縮用溶液送液部１２により濃縮用溶液を例えば１００μＬ／ｍｉｎの流量で送液する。濃縮用溶液は試料注入流路３４を通って試料注入部６から注入された試料とともに濃縮カラム１４に到達する。濃縮カラム１４では試料のみが捕捉されることで試料が濃縮され、試料とともに送液されてきた濃縮用溶液はそのまま濃縮カラム１４を通過してドレインへ排出される。なお、濃縮用溶液は単一成分であるためミキサを通過させる必要はないが、流路構成上、コンベンショナルミキサ４ｂを通過している。しかし、濃縮用溶液送液部１２による送液流量の大きさから送液に大きな遅れ時間が生じないため、問題にはならない。

（濃縮分析工程）
次に、図３（Ｂ）に示されているように、流路切替えバルブ８ｂをポートａとｆ，ｃとｄ，ｅとｆが接続された状態に切り替える。そうすると、移動相送液流路３０の下流側に、ポート間接続流路３６、濃縮カラム流路４０及び分析流路４２が順に接続され、濃縮分析流路が構成される。

移動相送液部２により２種類の溶媒からなる移動相を例えば５μＬ／ｍｉｎのミクロ流量で送液する。移動相はミクロミキサ４ａで十分に混合された後、ポート間接続流路３６、濃縮カラム流路４０を流れて分析部１０に到達する。濃縮カラム１４に捕捉されていた試料は濃縮カラム１４を通過する移動相によって溶出され、移動相とともに分析部１０に導入される。分析部１０に導入された試料は分離カラム２６で成分ごとに分離された後、検出器２８まで搬送され、検出される。

この濃縮分析工程では、ミクロ流量で送液される移動相は、その流量に対して容量の大きい第２混合ミキサとしてのコンベンショナルミキサを通過することなくミクロミキサ４ａのみを通過するようになっているので、ミキサの容量による送液の遅れ時間を生じることはない。

図１から図３を用いて説明した実施例では、移動相をコンベンショナル流量で送液する通常分析では、移動相がミクロミキサ（第１混合ミキサ）４ａとコンベンショナルミキサ（第２混合ミキサ）４ｂの両方を通過させ、コンベンショナルミキサ４ｂによって移動相の混合の促進が図られている。他方、移動相をミクロ流量で送液する濃縮分析では、移動相がミクロミキサ４ａを通過するようにして移動相の混合の促進が図られると同時に、移動相がコンベンショナルミキサ４ｂを通過させないことにより移動相送液の遅れ時間の発生を防止している。

また、図１から図３を用いて説明した実施例では、ミクロミキサ４ａが移動相送液部２を構成する２本の流路の合流部に設けられているが、図４に示されているように、ポート間接続流路３６上にミクロミキサ４ａが設けられていてもよい。この構成においても、流路切替えバルブ８ａ，８ｂを上記の実施例と同様に切り替えることで、通常分析流路、濃縮流路、濃縮分析流路を構成することができる。

液体クロマトグラフの一実施例を示す流路構成図である。 同実施例の液体クロマトグラフを用いて行なう通常分析時の流路構成を示す図である。 同実施例の液体クロマトグラフを用いて行なう濃縮分析時の流路構成を示す図であり、（Ａ）は試料濃縮時、（Ｂ）は濃縮分析時である。 液体クロマトグラフの他の実施例を示す流路構成図である。

符号の説明

２ 移動相送液部
４ａ ミクロミキサ
４ｂ コンベンショナルミキサ
６ 試料注入部
８ 流路切替え機構
８ａ，８ｂ 流路切替えバルブ
１２ 濃縮用溶液送液部
１４ 濃縮カラム
１６ ドレイン
１８ａ，１８ｂ 溶媒貯留容器
２０ａ，２０ｂ，２４ 送液ポンプ
２６ 分離カラム
２８ 検出器
３０ 移動相送液流路
３２ 濃縮用溶液送液流路
３４ 試料注入流路
３６，３８ ポート間接続流路
４０ 濃縮カラム流路
４２ 分析流路

Claims (2)

1. それぞれ別々の溶媒が送液される複数の溶媒送液流路からなる移動相送液部の下流側に前記移動相送液部からの溶媒を混合するための第１混合ミキサ、前記第１混合ミキサよりも大容量の第２混合ミキサ、試料を注入するための試料注入部、前記試料を成分ごとに分離するための分離カラム、及び前記分離カラムで分離された各成分を検出するための検出器が順に接続され、前記試料注入部から注入された試料を前記第１混合ミキサ、第２混合ミキサで混合された混合溶媒によって前記分離カラムに導いて成分ごとに分離し、分離した各成分を前記検出器で検出するための通常分析流路と、
   濃縮カラムに濃縮された試料液を送液するための濃縮用溶液を送液するための濃縮用溶液送液部、前記第２混合ミキサ、前記試料注入部及び濃縮カラムが順に接続され、前記試料注入部から注入された試料を前記濃縮用溶液によって濃縮カラムに導き、濃縮カラムに試料を捕捉させて濃縮するための濃縮流路と、
   前記移動相送液部、前記第１混合ミキサ、前記濃縮カラム、前記分離カラム及び前記検出器が順に接続され、前記濃縮カラムに捕捉された試料を前記第１混合ミキサで混合された混合溶媒によって溶出して前記分離カラムに導いて成分ごとに分離し、分離された各成分を前記検出器で検出するための濃縮分析流路と、
   前記通常分析流路、前記濃縮流路及び前記濃縮分析流路のいずれか１つの流路を選択的に構成するように流路を切り替える流路切替え機構と、を備え、
   前記移動相送液部は前記濃縮分析流路が選択されたときは前記通常分析流路が選択されたときよりも送液流量を小さくするように設定されている液体クロマトグラフ。
2. 前記通常分析流路において、前記第１混合ミキサの配置を前記試料注入部と前記分離カラムの間にした請求項１に記載の液体クロマトグラフ。

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