JP2010276358A

JP2010276358A - 高速液体クロマトグラフ

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Publication number: JP2010276358A
Application number: JP2009126453A
Authority: JP
Inventors: Hirosuke Ozaka; 裕輔尾坂
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2009-05-26
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2010-12-09

Abstract

【課題】試料に疎水性成分と親水性成分というような疎水性又は極性の大きく異なる成分が混在している場合でもそれらの成分をそれぞれ捕捉して分離分析を行なうことができる高速液体クロマトグラフを提供する。
【解決手段】試料注入部を備えた試料搬送流路、第１トラップカラムを有する第１捕捉流路、第１トラップカラムとは異なる捕捉特性をもつ第２トラップカラムを有する第２捕捉流路、及びそれらの流路の接続を切り換える流路切換機構が設けられている。流路切換機構は分析の工程に応じたモードの流路構成にすることができる。試料注入部から注入された試料を捕捉するための試料捕捉モードでは、試料搬送流路の下流側に第１捕捉流路と第２捕捉流路とが直列に接続される。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料注入部から注入された試料をトラップカラムに捕捉し、トラップカラムに捕捉した試料を分析カラムに導いて分離分析を行なう方式の高速液体クロマトグラフに関するものである。

図５に従来の一般的な高速液体クロマトグラフの一例を示す。
この高速液体クロマトグラフは、試料搬送流路６４、捕捉流路６６、ドレイン流路７２、溶媒送液流路８０、分析流路８２を備え、各流路が６方バルブ（流路切換機構）７０のポートに接続されている。

試料搬送流路６４は送液ポンプ７６及び試料注入部７８を備え、試料注入部７８から注入された試料を移動相７４とともに搬送する流路であり、下流端が６方バルブ７０の１つのポートに接続されている。６方バルブ７０の試料搬送流路６４が接続されているポートの隣接ポートの１つは、ドレイン流路７２が接続されたドレインポートとなっている。
捕捉流路６６は試料搬送流路６４によって搬送される試料を捕捉するためのトラップカラム６８を備えた流路であり、一端が６方バルブ７０の試料搬送流路６４が接続されているポートの隣接ポートの１つに接続され、他端がドレインポートの隣接ポートに接続されている。

溶媒送液流路８０は、２種類の移動相８４ａ，８４ｂからなる溶媒を送液するための流路であり、上流部に移動相８４ａ，８４ｂを送液するための送液ポンプ８６ａ，８６ｂを備えた２本の流路を備え、その合流部にミキサ８８が設けられている。溶媒送液流路８０の下流端は、６方バルブ７０の捕捉流路６６が接続されたポートの隣接ポートの１つに接続されている。

分析流路８２は、試料を成分ごとに分離する分析カラム９０及び分離された各成分を検出するための検出器９２を備えた流路であり、上流端が６方バルブ７０の捕捉流路６６が接続されたポートの隣接ポートの１つに接続されている。
デガッサ７５は移動相７４，８４ａ，８４ｂ中の気泡を取り除くためにポンプ７６，８６ａ，８６ｂの上流側に配置されている。

上記の流路接続により、６方バルブ７０の切換えで２つのモードに切り換えることができる。１つのモードは、試料搬送流路６４を捕捉流路６６の一端に接続し、捕捉流路６６の他端をドレイン流路７２に接続した試料捕捉モードである。もう１つのモードは、溶媒送液流路８０を捕捉流路６６の一端に接続し、捕捉流路６６の他端を分析流路８２に接続した分析モードである。

分析時は、まず、試料捕捉モードにして、送液ポンプ７６を駆動させて移動相７４を試料搬送流路６４内で流しながら試料注入部７８から試料を注入することで、移動相によって試料を捕捉流路６６へ搬送し、トラップカラム６８で試料成分を捕捉する。トラップカラム６８で試料成分を捕捉した後、分析モードに切り換えて溶媒送液流路８０から捕捉流路６６へ溶媒を送液することにより、トラップカラム６８に捕捉されていた試料成分を溶出させて分析流路８２へ導き、分析カラム９０で成分ごとに分離して各成分を検出器９２によって検出することができる。

特許第４０９３２０１号公報

図５の高速液体クロマトグラフでは、試料注入部７８から注入された試料に例えば疎水性成分と親水性成分とが混在している場合、例えば移動相７４を水系の移動相、トラップカラム６８を逆相モード用のカラムとすると、疎水性成分はトラップカラム６８に捕捉されるが、親水性成分は逆相モード用のトラップカラム６８には捕捉されにくいためにトラップカラム６８を通過し、ドレイン流路７２を介して移動相７４とともに排出されてしまう。したがって、図５に示される構成の高速液体クロマトグラフでは、例えば試料に疎水性成分と親水性成分とが混在しているときに、それらの成分全てを捕捉して分析することができなかった。

そこで、本発明は、試料に疎水性成分と親水性成分というような疎水性や極性の大きく異なる成分が混在している場合でもそれらの成分をそれぞれ捕捉して分離分析を行なうことができる高速液体クロマトグラフを提供することを目的とするものである。

本発明は、試料注入部及び試料注入部から注入された試料を搬送するための移動相を送液する移動相送液部を有し、試料注入部から注入された試料を移動相によって搬送するための試料搬送流路と、第１トラップカラムを有し、試料搬送流路の下流側で試料注入部から注入された試料中の成分を捕捉するための第１捕捉流路と、第１トラップカラムとは捕捉特性の異なる第２トラップカラムを有し、試料注入部から注入された試料のうち第１トラップカラムで捕捉されずに通過した試料成分を第１捕捉流路の下流側で捕捉するための第２捕捉流路と、第１トラップカラムに捕捉された試料成分を溶出させるための溶媒を送液する第１溶媒送液部と、第１トラップカラムに捕捉された試料成分を分離するための第１分析カラム及び第１分析カラムで分離された各成分を検出するための検出器を有する第１分析流路と、第２トラップカラムに捕捉された試料成分を溶出させるための溶媒を送液する第２溶媒送液部と、第２トラップカラムに捕捉された試料成分を分離するための第２分析カラム及び第２分析カラムで分離された各成分を検出するための検出器を有する第２分析流路と、第１捕捉流路の上流側に試料搬送流路を接続すると同時に第１捕捉流路の下流側に第２補足流路を接続する試料捕捉モード、第１捕捉流路の上流側に第１溶媒送液部を接続すると同時に第１捕捉流路の下流側に第１分析流路を接続する第１分析モード、及び第２捕捉流路の上流側に第２溶媒送液部を接続すると同時に第２捕捉流路の下流側に第２分析流路を接続する第２分析モードのいずれか１つのモードに互いに異なるタイミングで切り換えることができる流路切換機構と、を備えた高速液体クロマトグラフである。

上記の高速液体クロマトグラフでは、試料捕捉モードにおいて互いに捕捉特性の異なる第１トラップカラムと第２トラップカラムとが直列に接続されているので、第１トラップカラムで捕捉されない試料成分を第２トラップカラムで捕捉することができる。

なお、従来から複数のトラップカラムを備えた高速液体クロマトグラフは存在する（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１の高速液体クロマトグラフは、切換バルブを介して並列に接続された２つのトラップカラムを備え、注入された試料を分析カラムによって成分ごとに分離し（一次元目分析）、分離された成分ごとにトラップカラムで捕捉して濃縮し、それらの試料成分を順次、分析カラムでさらに分離して検出を行なう（二次元目分析）ものである。このような高速液体クロマトグラフは、１種類の分析カラムによって分離される試料成分を捕捉することを前提としているため、同じ捕捉特性のトラップカラムを並列に接続されており、これらのトラップカラムで捕捉されない成分はやはりトラップカラムを通過して排出されてしまう。このように、従来の高速液体クロマトグラフは試料中の疎水性成分と親水性成分というような疎水性又は極性の大きく異なる両方の成分を分析することは想定していないため、本発明のように捕捉特性の異なるトラップカラムを直列に接続したものは存在しない。

本発明の高速液体クロマトグラフにおいては、第１分析流路の検出器と第２分析流路の検出器は共通の１つの検出器であり、流路切換機構は第１分析カラム及び第２分析カラムと検出器の間にあっていずれかの分析カラムを検出器に接続するように切り換える切換機構を含んでいることが好ましい。そうすれば、第１トラップカラムに捕捉された試料成分を分離分析する工程と第２トラップカラムに捕捉された試料成分を分離分析する工程において１つの検出器を兼用することができるため、第１分析流路と第２分析流路のそれぞれに検出器を設ける場合よりも装置のコストが低減され、装置の大きさを小さくなる。

好ましい実施例は、第１トラップカラムと第２トラップカラムは一方が順相カラム、他方が逆相カラムであり、第１捕捉流路と第２捕捉流路の間には第２トラップカラムでの保持力を高めるための溶媒を供給する希釈液供給流路が接続されている。

本発明にかかる高速液体クロマトグラフは、流路切換機構によって試料捕捉モード、第１分析モード、第２分析モードのいずれかに切り換えられるように構成されており、試料捕捉モードでは試料搬送流路の下流側に、第１トラップカラムを有する第１捕捉流路と第１トラップカラムとは捕捉特性の異なる第２トラップカラムを有する第２捕捉流路とが直列に接続されるので、第１トラップカラムに捕捉されない試料成分を第２トラップカラムで捕捉することができる。そして、第１トラップカラムに捕捉された試料成分は第１分析モードで、第２トラップカラムに捕捉された試料成分は第２分析モードでそれぞれ分離分析されるので、試料に混在する疎水性成分と親水性成分というような疎水性又は極性の大きく異なる両方の成分を分離分析することができる。

一実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路構成図である。同実施例における試料捕捉モードを示す流路構成図である。同実施例における第１分析モードを示す流路構成図である。同実施例における第２分析モードを示す流路構成図である。従来の高速液体クロマトグラフの一例を示す流路構成図である。

以下に、高速液体クロマトグラフの一実施例について説明する。図１は一実施例を示す流路構成図である。
この実施例の高速液体クロマトグラフは、３つの６方バルブ２８，３０，３２が切り換えられることにより、各分析工程に応じた流路が構成される。

６方バルブ２８の１つのポートに試料搬送流路２の下流端が接続され、そのポートに隣接するポートの一方に第１捕捉流路４の一端、他方にバルブ間接続流路６の一端が接続され、さらにバルブ間接続流路６の一端が接続されているポートに隣接するポートに第１捕捉流路４の他端が接続されている。６方バルブ２８の残りの２つのポートには、それぞれ第１溶媒送液流路１２の下流端と第１試料分離流路１４の上流端が接続されている。

６方バルブ２８は、試料搬送流路２と第１捕捉流路４の一端とを接続すると同時に第１捕捉流路４の他端とバルブ間接続流路６の一端とを接続した状態と、第１溶媒送液流路１２と第１捕捉流路４の一端とを接続すると同時に第１捕捉流路４の他端と第１試料分離流路１４とを接続した状態のいずれかの状態に切り換えることができる。

６方バルブ３０のバルブ間接続流路６の他端が接続されているポートに隣接するポートの一方はドレインへ繋がるドレイン流路２２が接続されており、他方のポートには第２捕捉流路８の一端が接続されている。第２捕捉流路８の他端はドレイン流路２２が接続されたポートに隣接するポートに接続されている。６方バルブ３０の残りの２つのポートには、それぞれ第２溶媒送液流路１６の下流端と第２試料分離流路１８の上流端が接続されている。

６方バルブ３０は、バルブ間接続流路６の他端と第２捕捉流路８の一端とを接続すると同時に第２捕捉流路８の他端とドレイン流路２２とを接続した状態と、第２溶媒送液流路１６と第２捕捉流路８の他端を接続すると同時に第２捕捉流路８の一端と第２試料分離流路１８とを接続した状態のいずれかの状態に切り換えることができる。

６方バルブ３２の１つのポートに検出流路２０が接続され、そのポートに隣接する２つのポートに第１試料分離流路１４の下流端、第２試料分離流路１８の下流端がそれぞれ接続されている。６方バルブ３２の第１試料分離流路１４の下流端が接続されているポートに隣接するポートにはドレイン流路２４が接続され、第２試料分離流路１８の下流端が接続されているポートに隣接するポートにはドレイン流路２６が接続されている。これらのドレインポート２４，２６の間のポートにはいずれの流路も接続されていない。

６方バルブ３２は、第１試料分離流路１４と検出流路２０とを接続すると同時に第２試料分離流路１８とドレイン流路２６とを接続した状態と、第２試料分離流路１８と検出流路２０とを接続すると同時に第１試料分離流路１４とドレイン流路２４とを接続した状態のいずれかの状態に切り換えることができる。

試料搬送流路２は送液ポンプ３６及び試料注入部３８を備え、送液ポンプ３６によって移動相３４を送液することにより試料注入部３８から注入された試料を搬送する流路である。この実施例においては、移動相３４は水系の移動相、例えば純水又はリン酸バッファ液などの緩衝溶媒である。
第１捕捉流路４は第１トラップカラム４０を備え、第２捕捉流路８は第２トラップカラム４２を備えている。第１トラップカラム４０としては、例えばＯＤＳ（オクタデシルシリカ）カラムのほか、シリカゲルを基材としてこれをＴＭＳ（トリメチルシリル基）やＣ４（ブチル基）、Ｃ８（オクチル基）などの官能基で修飾した充填剤を充填したカラムなどの逆相カラムが挙げられる。第２トラップカラム４２としては、例えばシリカゲルなどの充填剤が充填された順相カラムが挙げられる。なお、移動相３４が有機溶媒系の移動相である場合には、上記の場合とは逆に、第１トラップカラム４０が順相カラムとなり、第２トラップカラム４２が逆相カラムとなる。

バルブ間接続流路６には希釈液送液流路１０が合流している。希釈液送液流路１０は送液ポンプ４４を備え、希釈液３３を収容する容器から希釈液３３を送液する。希釈液３３は水系の移動相３４を有機溶媒系にするための有機溶媒リッチな移動相、例えばアセトニトリル溶液である。

第１溶媒送液流路１２は、送液ポンプ４８ａ，４８ｂによって移動相４６ａ，４６ｂを汲み上げるための２本の流路を上流側に有し、それらの流路の合流部に移動相４６ａ，４６ｂを混合して溶媒とするミキサ５０を備えている。移動相４６ａ，４６ｂは例えば水とアセトニトリルなどの有機溶媒である。

第２溶媒送液流路１６は、送液ポンプ５６ａ，５６ｂによって移動相５４ａ，５４ｂを汲み上げるための２本の流路を上流側に有し、それらの流路の合流部に移動相５４ａ，５４ｂを混合して溶媒とするミキサ５８を備えている。移動相５４ａ，５４ｂは例えばアセトニトリルなどの有機溶媒と水である。

第１試料分離流路１４は第１分析カラム５２を備え、第２試料分離流路１８は第２分析カラム６０を備えている。第１分析カラム５２は例えばＯＤＳカラムや、シリカゲルを基材としてこれをＴＭＳ、Ｃ４、Ｃ８等の官能基で修飾した充填剤が充填されたカラムなどの逆相系カラムである。第２分析カラム６０は例えばＤＩＯＬ（ジオール）基などが修飾されたカラムやシリカゲルなどのＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Chromatography：親水性相互作用クロマトグラフィ）系カラムである。
希釈液３３、各移動相３４，４６ａ，４６ｂ，５４ａ及び５４ｂを送液するための流路上には、各液から気泡などを取り除くためのデガッサ３５が設けられている。

以上の構成により、６方バルブ２８，３０，３２を所定のポジションにすることで、試料捕捉モード、第１分析モード及び第２分析モードのいずれかのモードに切り換えることができる。試料捕捉モードで試料注入部３８から注入された試料をトラップカラム４０，４２で捕捉する工程（試料捕捉工程）が行われ、第１分析モードで第１トラップカラム４０に捕捉された試料の分離分析を行なう工程（第１分析工程）が行われ、第２分析モードで第２トラップカラム４２に捕捉された試料の分離分析を行なう工程（第２分析工程）が行なわれる。この高速液体クロマトグラフでは、試料注入部３８から注入された試料ごとに、これら３工程が試料捕捉工程−第１分析工程−第２分析工程の順に行なわれる。

試料捕捉モードは、図２に示されているように、上流側から順に、試料搬送流路２−第１捕捉流路４−バルブ間接続流路６−第２捕捉流路８−ドレイン流路２２が接続されるモードである。
第１分析モードは、図３に示されているように、上流側から順に、第１溶媒送液流路１２−第１捕捉流路４−第１試料分離流路１４−検出流路２０が接続されるモードである。直列に接続された第１試料分離流路１４と検出流路２０は第１トラップカラム４０に捕捉された試料成分を分析するための第１分析流路を構成する。
第２分析モードは、図４に示されているように、上流側から順に、第２溶媒送液流路１６−第２捕捉流路８−第２試料分離流路１８−検出流路２０が接続されるモードである。直列に接続された第２試料分離流路１８と検出流路２０は第２トラップカラム４２に捕捉された試料成分を分析するための第２分析流路を構成する。

試料捕捉工程では、図２において太線で示されているように、６方バルブ２８，３０及び３２によって流路構成が試料捕捉モードに切り換えられ、送液ポンプ３６，４４によって移動相３４及び希釈液３３が供給される。試料注入部３８から注入された試料は移動相３４によって第１トラップカラム４０に導かれて捕捉される。試料中の親水性成分は逆相カラムである第１トラップカラム４０には捕捉されず、移動相３４とともに第１トラップカラム４０を通過する。第１トラップカラム４０を通過した親水性成分は、バルブ間接続流路６を通って第２トラップカラム４２に導かれる。バルブ間接続流路６には送液ポンプ４４によって希釈液３３が送液されており、親水性成分を含む移動相３４が希釈液３３によって希釈され、第１トラップカラム４０に捕捉されなかった親水性成分が順相カラムである第２トラップカラム４２に捕捉される。

試料捕捉工程終了後に第１分析工程が行なわれる。第１分析工程では、図３において太線で示されているように、６方バルブ２８，３０及び３２によって流路構成が第１分析モードに切り換えられ、送液ポンプ４８ａ，４８ｂによって移動相４６ａ，４６ｂがミキサ５０へ送液され、ミキサ５０からの混合液が溶媒として第１トラップカラム４０を通過する。溶媒が第１トラップカラム４０を通過することにより、第１トラップカラム４０に捕捉されていた試料成分が溶出し、第１分析カラム５２に導かれて成分ごとに分離された後、検出器６２に導かれて検出される。このとき、第２トラップカラム４２は捕捉した成分を保持した状態で維持される。また、第２分析カラム６０には送液ポンプ５６ａ，５６ｂにより移動相５４ａ，５４ｂの混合液が導入されており、分析前のコンディショニングが行なわれている。

第１分析工程終了後に第２分析工程が行なわれる。第２分析工程では、図４において太線で示されているように、６方バルブ２８，３０及び３２によって流路構成が第２分析モードに切り換えられ、送液ポンプ５６ａ，５６ｂによって移動相５４ａ，５４ｂがミキサ５８へ送液され、ミキサ５８からの混合液が溶媒として第２トラップカラム４２を通過する。溶媒が第２トラップカラム４２を通過することにより、第２トラップカラム４２に捕捉されていた試料成分が溶出し、第２分析カラム６０に導かれて成分ごとに分離された後、検出器６２に導かれて検出される。このとき、第１分析カラム５２には送液ポンプ４８ａ，４８ｂにより移動相４６ａ，４６ｂが導入され、次の試料に対する第１分析カラム５２のコンディショニングが行なわれている。

以上のように、この高速液体クロマトグラフは、試料捕捉モードにおいて互いに捕捉特性の異なる２つのトラップカラム４０と４２が直列に接続され、一方のトラップカラムでは捕捉できない成分を他方のトラップカラムで捕捉することができるので、試料中に含まれる成分が分析されずに排出されることを防止できる。２つのトラップカラム４０，４２で捕捉した試料成分はそれぞれ第１分析モード、第２分析モードで分離分析することができる。

２試料搬送流路
４第１捕捉流路
６バルブ間接続流路
８第２捕捉流路
１０希釈液送液流路
１２第１溶媒送液流路
１４第１試料分離流路
１６第２溶媒送液流路
１８第２試料分離流路
２０検出流路
２２，２４，２６ドレイン流路
２８，３０，３２６方バルブ
３３，３４，４６ａ，４６ｂ，５４ａ，５４ｂ移動相
３５デガッサ
３６，４４，４８ａ，４８ｂ，５６ａ，５６ｂ送液ポンプ
３８試料注入部
４０，４２トラップカラム
５０，５８ミキサ
５２，６０分析カラム
６２検出器

Claims

試料注入部及び試料注入部から注入された試料を搬送するための移動相を送液する移動相送液部を有し、試料注入部から注入された試料を移動相によって搬送するための試料搬送流路と、
第１トラップカラムを有し、試料搬送流路の下流側で試料注入部から注入された試料中の成分を捕捉するための第１捕捉流路と、
第１トラップカラムとは捕捉特性の異なる第２トラップカラムを有し、試料注入部から注入された試料のうち第１トラップカラムで捕捉されずに通過した試料成分を第１捕捉流路の下流側で捕捉するための第２捕捉流路と、
前記第１トラップカラムに捕捉された試料成分を溶出させるための溶媒を送液する第１溶媒送液部と、
前記第１トラップカラムに捕捉された試料成分を分離するための第１分析カラム及び第１分析カラムで分離された各成分を検出するための検出器を有する第１分析流路と、
前記第２トラップカラムに捕捉された試料成分を溶出させるための溶媒を送液する第２溶媒送液部と、
前記第２トラップカラムに捕捉された試料成分を分離するための第２分析カラム及び第２分析カラムで分離された各成分を検出するための検出器を有する第２分析流路と、
第１捕捉流路の上流側に試料搬送流路を接続すると同時に第１捕捉流路の下流側に第２補足流路を接続する試料捕捉モード、第１捕捉流路の上流側に第１溶媒送液部を接続すると同時に第１捕捉流路の下流側に第１分析流路を接続する第１分析モード、及び第２捕捉流路の上流側に第２溶媒送液部を接続すると同時に第２捕捉流路の下流側に第２分析流路を接続する第２分析モードのいずれか１つのモードに互いに異なるタイミングで切り換えることができる流路切換機構と、を備えた高速液体クロマトグラフ。
第１分析流路の検出器と第２分析流路の検出器は共通の１つの検出器であり、前記流路切換機構は第１分析カラム及び第２分析カラムと前記検出器の間にあっていずれかの分析カラムを前記検出器に接続するように切り換える切換機構を含んでいる請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ。
第１トラップカラムと第２トラップカラムは一方が順相カラム、他方が逆相カラムであり、第１捕捉流路と第２捕捉流路の間には第２トラップカラムでの保持力を高めるための溶媒を供給する希釈液供給流路が接続されている請求項１又は２に記載の高速液体クロマトグラフ。