CN117467682A - 一种基于n端编码序列增强l-色氨酸合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于N端编码序列增强L‑色氨酸合成的方法，属于基因工程技术领域。本发明在L‑色氨酸合成关键限速酶邻氨基苯甲酸合酶TrpE的N端编码序列前随机添加10个氨基酸的核苷酸序列，并与绿色荧光蛋白进行融合，构建TrpE‑NCS随机突变文库，最终筛选得到表达强度最高的N端编码序列序列比对照菌株约高出6.2倍。最后，将筛选得到的最优N端编码序列***到基因trpE的N端，明显增强了ANTA合酶的表达，构建得到的工程菌株TRP08的L‑色氨酸产量在5L发酵罐中可达16.28g/L，约比对照菌株提高18.06％。综上，N端编码序列可作为合成生物学元件用于代谢途径的基因表达调控。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于N端编码序列增强L-色氨酸合成的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
在期望水平上精确调节基因表达对于代谢工程和合成生物学，尤其是对于微调代谢途径和优化遗传回路具有重要意义。因此，现已通过实验表征或计算设计建立了一系列用于转录，翻译和蛋白质降解水平上控制基因表达的合成或工程化的遗传调控元件，包括启动子、终止子、RBS序列、小调控RNA和蛋白质水解标签等。除此之外，N端编码序列通过影响核糖体与mRNA结合效率和翻译初始阶段的核糖体延伸，在翻译水平上强烈影响基因表达，这也是微调细菌中内源基因表达的重要机制。
L-色氨酸是人类和动物必需的一种芳香族氨基酸，广泛用于动物饲料，食品添加剂和药物的生产中。由于对化石资源枯竭，气候变化及环境可持续制造等需求的日益关注，通过微生物细胞工厂将可再生原料发酵转化为L-色氨酸的方法也变得越来越有吸引力。其中，由于大肠杆菌生长速度快，易于培养，代谢可塑性强及可适用多种遗传和基因工程工具等优势，已被广泛应用于L-色氨酸的生产中。目前，研究人员已尝试了多种代谢工程策略改善L-色氨酸的生产且已取得了较大进步。然而，仅仅通过代谢工程策略仍然难以达到理想产量。并且静态调控也会导致多种问题的出现。如难以平衡细胞生长与产物积累；细胞代谢通量和能量之间的不平衡以及毒性中间产物的积累，从而限制了满足工业需求的生产能力。因此，采用新型合成生物学工具动态调控及优化L-色氨酸的合成已成为一种非常有前景的选择。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是进一步优化L-色氨酸的合成，提高L-色氨酸的产量。
技术方案：
为解决上述技术问题，本发明通过在L-色氨酸合成关键限速酶TrpE的N端***10个随机氨基酸的核苷酸序列，并与绿色荧光蛋白(GFP)融合以构建TrpE-NCS随机突变文库。再结合流式细胞仪进行高通量分选，经初筛和复筛后选取荧光强度最高的突变子进行测序鉴定。最后将鉴定出的最优序列***至基因trpE的N端实现L-色氨酸产量的提高。
本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是在L-色氨酸合成关键限速酶TrpE的N端连接核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任一所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述TrpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌表达上述融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌整合表达上述融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌在ycgH位点整合表达上述融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌工程菌株TRP07为宿主。
在本发明的一种实施方法中，所述的大肠杆菌工程菌株TRP07是通过常压室温等离子体诱变及优化L-色氨酸合成操纵子的表达后得到的菌株，5L发酵罐发酵产L-色氨酸产量为13.79g/L，记载于文献：Multidimensional engineering of Escherichia coli forefficient synthesis of L-tryptophan，doi:10.1016/j.biortech.2023.129475。
在本发明的一种实施方法中，所述大肠杆菌工程菌株是ANTA合酶经过N端序列优化后于5L发酵罐中生产L-色氨酸产量可达16.28g/L。
本发明的第三个目的是提供一种增强L-色氨酸合成的方法，所述方法为向宿主细胞中引入所述融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白在宿主细胞中整合表达或游离表达。
在本发明的一种实施方式中，所述整合表达的位点为ycgH位点。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌工程菌株TRP07。
本发明还提供了利用所述大肠杆菌工程菌发酵生产L-色氨酸的方法，将所述大肠杆菌工程菌接种于含有碳源的反应体系中进行L-色氨酸的发酵生产。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源选自葡萄糖、甘油、蔗糖、淀粉或玉米糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件设定为温度37℃，转速为600-700rpm，pH为7.0-7.2。
在本发明的一种实施方法中，所述反应体系包括20～40g/L葡萄糖、1～5g/L酵母膏、1～5g/L柠檬酸、1～5g/L硫酸铵、5～10g/L磷酸氢二钾、1～2g/L氯化钠、1～2g/L七水硫酸镁、20～40mg/L七水硫酸亚铁、5～15mg/L一水硫酸锰、1～5mg/L VB1、1～5mg/L VH及1～2mL/L的微量元素混合液。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素混合液包括二水氯化钙5～15g/L，二水硫酸铜0.5～1g/L，六水氯化钴1～5g/L，二水硫酸锌5～10g/L。
本发明还提供了所述融合蛋白或所述大肠杆菌工程菌株或所述方法在生产L-色氨酸或含有L-色氨酸的产品中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种基于N端编码序列优化增强L-色氨酸合成的方法，通过在L-色氨酸合成关键限速酶TrpE的N端***10个随机氨基酸的核苷酸序列，并与绿色荧光蛋白(GFP)融合以构建TrpE-NCS随机突变文库。结合流式细胞仪初筛和孔板复筛后得到的表达强度最高的NCS序列比对照菌株约高出6.2倍。最后，将筛选得到的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的NCS序列***到基因trpE的N端，构建得到的工程菌株TRP08的L-色氨酸产量在5L发酵罐中可达16.28g/L，约比对照菌株提高18.06％。
附图说明
图1：TrpE-NCS随机突变文库的构建示意图。
图2：96孔板复筛鉴定突变子的荧光强度。
图3：5-L发酵罐发酵分析工程菌株TRP07与TRP08产L-色氨酸的能力。
具体实施方式
下述实施例中涉及到的大肠杆菌W3110和JM109及质粒pREDCas9和pGRB均为实验室所保藏的菌株和质粒；pUC19质粒购自淼灵生物。
下述实施例中涉及的培养基：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。
感受态培养基：蛋白胨16g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L。
复苏培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
种子培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸2g/L、硫酸铵2.5g/L、磷酸氢二钾4g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁2.8mg/L、一水硫酸锰1.2mg/L、VB1 1mg/L、VH 1mg/L及微量元素混合液1mL/L；微量元素混合液：二水氯化钙10g/L，二水硫酸铜0.6g/L，六水氯化钴4.9g/L，二水硫酸锌6.4g/L。
发酵培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏3g/L、柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、磷酸氢二钾7g/L、氯化钠1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁30mg/L、一水硫酸锰10mg/L、VB1 1mg/L、VH1mg/L及微量元素混合液1mL/L；微量元素混合液：二水氯化钙10g/L，二水硫酸铜0.6g/L，六水氯化钴4.9g/L，二水硫酸锌6.4g/L。
下述实施例中涉及的L-色氨酸检测方法：
发酵液中L-色氨酸的检测方法采用的是高效液相色谱HPLC法(Agilent1260series,CA,USA)。采用紫外检测器进行测定。流动相为乙腈/水(10：90v/v)，流速设定为1ml/min，以及检测波长为278nm。
下述实施例中涉及到的引物：
p19-NNGFP-F1：5’-CGCTCTAGAGGGTACCTTTCTCCTCTTTAATGAATTCGC-3’；
p19-NNGFP-R1：5’-CGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC-3’；
p19-NNGFP-F2：5’-CGCAAGCTTCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3’；
p19-NNGFP-R2：
5’-CGCTCTAGAATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAACACAAAAACCGACTCTCGAACTG-3’；
p19-GFP-F1：5’-GACTGAGCTAGCCATAAAGGATCCCCGGGTACCGAG-3’；
p19-GFP-R1：5’-GATGAACTATACAAATAGAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC-3’；
p19-GFP-F2：5’-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCC-3’；
p19-GFP-R2：5’-ATGCACAGGAGACTTTCTGAAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTG-3’；p19-GFP-F3：5’-AAAAGTTCTTCTCCTTTACTTCAGAAAGTCTCCTGTGCATGATGCG-3’；
p19-GFP-R3：
5’-TTTATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGCGAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCCAT
GCAAACACAAAAACCGACTCTCG-3’；
sgRNA-F：
5’-AGTCCTAGGTATAATACTAGTGATAATAATCCGATAAGTAAGTTTTAGAGCTAGAA-3’；
sgRNA-R：
5’-TTCTAGCTCTAAAACGTAAATCCTGACCGAATTCGACTAGTATTATACCTAGGACT-3’；
ZH-F1：5’-CACCCTCCTGGTCATCCTTATTGC-3’；
ZH-R1：
5’-CTCCTCTTTAATGAATTCCATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAGATTAACCATCCATTCATTG GATTAACAAACATTCC-3’；
ZH-F2：
5’-TAATCATCCGGCTCGTATAATGGAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCCATGAATTATCAGAACGA CGATTTACGCATC-3’；
ZH-R2：5’-TTGAAGCCGACCGGACAGAAAAGCCCTGATGCCAGTTCG-3’；
ZH-F3：5’-GCGAACTGGCATCAGGGCTTTTCTGTCCGGTCGGCTTCAAAAATGG-3’；
ZH-R3：5’-TTTTTTAGCTAACGGCGGGATTACCCGCGACGCGCTTTTAC-3’；
ZH-F4：5’-TAAAAGCGCGTCGCGGGTAATCCCGCCGTTAGCTAAAAAACCG-3’；
ZH-R4：5’-AAGGCCGCGACGGTAAAAATG-3’。
实施例1：TrpE-NCS突变子文库的构建
利用引物p19-NNGFP-F2/R2在L-色氨酸合成关键限速酶TrpE的N端前***10个随机氨基酸的核苷酸序列，随后与绿色荧光蛋白GFP进行融合，再利用引物p19-NNGFP-F1/R1将其克隆至载体pUC19的多克隆位点处构建得到质粒pUC19-NNtrpEgfp(图1)。随后将构建成功的质粒转化进大肠杆菌JM109中，过夜培养后长出大量的转化子，将LB平板上长出的转化子冲洗下来后于甘油中保存，获得突变子文库，即混合突变菌株组成的文库。
通过引物p19-GFP-F2/R2和p19-GFP-F3/R3分别扩增得到GFP和TrpE，然后利用引物p19-GFP-F3/R2将TrpE和GFP进行融合。再利用引物p19-GFP-F1/R1对载体pUC19进行反向PCR获得线性化载体pUC19。随后通过同源重组的方式将TrpE-GFP融合片段与线性化载体pUC19进行连接，构建得到质粒pUC19-trpEgfp，最后将构建成功的质粒转化进大肠杆菌JM109中获得重组菌JM109/pUC19-trpEgfp。
实施例2：高荧光强度突变子的分选
将实施例1构建成功的TrpE-NCS突变子文库用PBS缓冲液反复洗涤三遍后将混合突变菌株的OD600稀释至0.3左右。以实施例1构建得到的重组菌JM109/pUC19-trpEgfp为对照菌株，采用流式细胞仪对突变子文库中的高荧光强度的突变子进行分选，分选荧光强度明显高于对照菌的突变株。将分选得到的菌株涂布于LB平板上过夜培养。将平板上长出的单菌落重新接种于96孔板中，于37℃，200rpm培养12h(图1)。测定每个突变子的相对荧光强度发现大约90％突变体的荧光值均高于对照菌株。其中荧光强度最高的突变子比对照菌株(荧光强度为1104)约提高6.2倍(图2)。选取几株荧光强度高于对照菌株的菌株进行测序，获得N端编码序列(表2)。
表2N端编码序列
| 编号 | 序列 | 荧光强度(a.u.) | |
| N1 | GCCCTGATGCCCCCGCGCCGGAGTGCG | 6845 | SEQ ID NO.1 |
| N2 | CTATATGTCAGCTCACTACCATCATTA | 6675 | SEQ ID NO.2 |
| N3 | ACAGATACCCGAAGTTTTGTTAGTATG | 6521 | SEQ ID NO.3 |
| N4 | ATGCCCCATCGACCTATGCAATGCCTGCCA | 4251 | SEQ ID NO.4 |
实施例3：大肠杆菌工程菌株TRP08的构建
将实施例2中筛选出的N端编码序列N1***到基因trpES40F的N端。根据需***假基因位点ycgH的核苷酸序列设计靶向基因ycgH的sgRNA。通过同源重组的方式将利用sgRNA-F/sgRNA-R扩增得到的ycgH的sgRNA连接在质粒pGRB(Addgene#71539)上以构建质粒pGRB-ycgH-sgRNA。再以大肠杆菌工程菌株TRP07的基因组为模板，利用引物ZH-F1/R1,ZH-F2/R2,ZH-F3/R3,ZH-F4/R4，扩增假基因位点ycgH的上下游同源臂(～500bp)，随后利用引物ZH-F1和ZH-R4通过融合PCR进行融合形成完整的同源臂DNA片段。然后将质粒pREDCas9(Addgene#71541)和pGRB-ycgH-sgRNA以及同源臂DNA片段通过电击转化的方式将其转化入菌株TRP07中。
具体操作为：携带有质粒pREDCas9的菌株TRP07培养在含50μg/mL壮观霉素的感受态培养基中于30℃培养至OD600约为0.1-0.2，然后添加0.1mM的IPTG诱导Cas9蛋白的表达。当OD600升高至0.6-0.7时离心收集细胞并反复洗涤三次制成感受态细胞，然后将相应的同源臂DNA片段和质粒pGRB-ycgH-sgRNA用1.85kV的电压同时电转进感受态细胞中，电转结束后立即加入1mL复苏培养基并于30℃培养2小时。最后将转化子涂布于含有50μg/mL氨苄霉素和壮观霉素的LB固体平板上，于30℃过夜培养后，随机挑选长出的转化子进行菌落PCR验证以及DNA测序。DNA测序验证成功后即构建得到工程菌株TRP08。
实施例4：工程菌株TRP08的5-L发酵罐发酵实验
首先将实施例3构建的菌株TRP08于37℃在LB固体培养基上培养12小时进行活化，将活化后的菌株接种于含3-L种子培养基的5-L发酵罐中。通过自动添加氨水使种子培养基的pH维持在7.0，以及保持温度维持在37℃，通过改变搅拌器速度和通气速率将溶解氧维持在30％以上。当OD600达到10-12时，将多余发酵液排出只留下450mL用于分批发酵。分批发酵过程中，同样将pH维持在7.0，温度维持在37℃以及溶氧维持在30％以上。在初始糖消耗完后，发酵液的葡萄糖浓度控制在2g/L以下，后续发酵过程中向发酵罐中添加浓度为80％的葡萄糖溶液以维持菌体生长及产物合成。经过48小时发酵培养后，工程菌株TRP08的产量达到16.28g/L，比对照菌株TRP07产量提高18.06％(图3)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是在L-色氨酸合成关键限速酶TrpE的N端连接核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3任一所示的序列，所述TrpE的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
2.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌整合表达权利要求1所述融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在ycgH位点整合表达权利要求1所述融合蛋白。
5.根据权利要求2～4任一所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌工程菌株TRP07为宿主。
6.一种增强L-色氨酸合成的方法，其特征在于，所述方法为向宿主细胞中引入权利要求1所述融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白在宿主细胞中整合表达或游离表达。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌工程菌株TRP07。
9.一种发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于，将权利要求2～4任一所述大肠杆菌工程菌接种于含有碳源的反应体系中进行L-色氨酸的发酵生产。
10.权利要求1所述融合蛋白，或权利要求2～4任一所述所述大肠杆菌工程菌株，或权利要求9所述方法在生产L-色氨酸或含有L-色氨酸的产品中的应用。
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