JP5798441B2 - 乳酸生成に効果的な材料および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、米国エネルギー省(Department of Energy)から認可番号(grant number)USDOE-DE FG02-96ER20222を受け、かつ米国農務省(United States Department of Agriculture)との共同でエネルギー省から認可番号USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019を受けて、授与された助成金の下での政府援助によりなされた。また、本発明は、認可番号01-35504-10669および00-52104-9704を受けて、米国農務省からの政府援助によりなされた。同政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明(2)は、不活性化または欠失した抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、本発明(1)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(3)は、クレブシエラ・オキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニア・クリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、本発明(1)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(4)は、クレブシエラ・オキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニア・クリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、本発明(2)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(5)は、代謝的に進化している、本発明(2)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(6)は、代謝的に進化している、本発明(3)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(7)は、代謝的に進化している、本発明(4)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(8)は、抗生物質遺伝子がFLPリコンビナーゼにより欠失される、本発明(1)〜(7)のいずれか一発明の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(9)は、SZ186である、本発明(7)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(10)は、SZ132である、本発明(5)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(11)は、菌株のmgsA遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において不活性化されているかまたは欠失している、本発明(1)〜(5)のいずれか一発明の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(12)は、mgsA遺伝子が不活性化されているかまたは欠失している大腸菌株SZ194(NRRL B30863)を含む、遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(13)は、代謝的に進化している、本発明(12)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(14)は、TG112、TG113、またはTG114である、本発明(13)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(15)は、不活性化または欠失した天然のldhA遺伝子と、組換えによって挿入されたL-特異的乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子とをさらに含む、本発明(11)または(12)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(16)は、L-特異的乳酸デヒドロゲナーゼ異種遺伝子が、ldhL遺伝子(例えば、P.アシディラクチシ(P. acidilactici)から得たldhL遺伝子)である、本発明(15)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(17)は、代謝的に進化している、本発明(15)または(16)の遺伝子改変大腸菌株である。
本発明(18)は、以下からなる群より選択される、遺伝子改変大腸菌株である:SZ132(NRRL B-30861);SZ186(NRRL B-30862);SZ194(NRRL B-30863);TG103(NRRL B-30864);TG102(NRRL B-30921);TG105(NRRL B-30922);TG106(NRRL B-30923);TG107(NRRL B-30924);TG108(NRRL B-30925);TG112(NRRL B-30926);TG113(NRRL B-30927);TG114(NRRLB-30928);TG128(NRRL B-30962);TG129(NRRL B-30963);およびTG130(NRRL B-30964)。
本発明(19)は、本発明(1)〜(18)のいずれか一発明の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培地に播種する段階、および遺伝子改変大腸菌株を培養または増殖する段階を含む、遺伝子改変大腸菌株の培養または増殖方法である。
本発明(20)は、D-(-)-乳酸の生成を可能とし、任意でD-(-)-乳酸を中和してD-(-)-ラクテートを形成することを可能にする条件下で、本発明(1)〜(14)のいずれか一発明の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、D-(-)-ラクテートまたはD-(-)-乳酸の生成方法である。
本発明(21)は、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG112、TG113、TG114、またはSZ194から選択される、本発明(20)の方法である。
本発明(22)は、L-(+)-乳酸の生成を可能とし、任意でL-(+)-乳酸を中和してL-(+)-ラクテートを形成することを可能にする条件下で、本発明(15)〜(17)のいずれか一発明の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、L-(+)-ラクテートまたはL-(+)-乳酸の生成方法である。
本発明(23)は、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG103、TG105、TG106、TG107、またはTG108である、本発明(22)の方法である。
本発明(24)は、遺伝子改変大腸菌株が無機塩培地で培養される、本発明(19)〜(23)のいずれか一発明の方法である。
本発明(25)は、無機塩培地が2%〜20%(w/v)の間の糖を含む、本発明(24)の方法である。
本発明(26)は、無機塩培地が2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、または20%(w/v)の糖を含む、本発明(25)の方法である。
本発明(27)は、糖が、グルコースまたはスクロースまたはグルコースとスクロースの組合せである、本発明(25)または(26)の方法である。
本発明(28)は、本発明(11)の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なD-(-)-ラクテートまたはD-(-)-乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、本発明(20)の方法である。
本発明(29)は、本発明(15)〜(17)のいずれか一発明の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なL-(+)-ラクテートまたはL-(+)-乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、本発明(22)の方法である。
本発明(30)は、キラル的に純粋なD-(-)-ラクテートまたはD-(-)-乳酸を生成する、本発明(21)の方法である。
本発明(31)は、キラル的に純粋なL-(+)-ラクテートまたはL-(+)-乳酸を生成する、本発明(23)の方法である。
本発明(32)は、キラル的に純粋なラクテートを精製する段階をさらに含む、本発明(28)〜(31)のいずれか一発明の方法である。
本発明(33)は、ラクテートが少なくとも0.5Mの濃度で生成される、本発明(20)〜(32)のいずれか一発明の方法である。
本発明(34)は、培地が、化学的に定義された無機塩培地またはNBS無機塩培地である、本発明(33)の方法である。
本発明(35)は、乳酸の収量が少なくとも90%である、本発明(20)〜(34)のいずれか一発明の方法である。
本発明(36)は、収量が少なくとも90%、90.5%、91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、または99%である、本発明(35)の方法である。
本発明(37)は、他の立体異性形態を伴う乳酸もしくはラクテートの立体異性形態の検出可能な混入が1つもないか、または特定の立体異性体のキラル純度が少なくとも99.9%である、本発明(29)〜(36)のいずれか一発明の方法である。
本発明(38)は、本発明(1)〜(18)のいずれか一発明の、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株と、培地とを含む、組成物である。
(a)セロビオース利用のためのクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)(寄託番号ATCC 68564)casAB遺伝子をlacYの終止コドンの後ろへ組み込み、エンドグルカナーゼをコードするエルウィニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)(寄託番号ATCC 55124)celY遺伝子をfrdA遺伝子へ組み込むことによって、大腸菌K011から菌株LY52を構築する段階(Ohta, K. et al. (1991)「Genetic improvement of Escherichia coli for ethanol production by chromosomal integration of Zymomonas mobilis genes encoding pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase II」Appl Environ Microbiol. 57:893-900; Moniruzzaman et al., 1997; Zhou and Ingram, 1999);
(b)菌株SZ63を構築するために用いた大腸菌K-12の特定の突然変異(菌株W3110)をLY52へ順次形質導入する段階(Zhou, S. et al. (2003)「Production of optically pure D-lactic acid in mineral salt medium by metabolically engineered Escherichia coli W3110」Appl Environ Microbiol. 69:399-407);
(c)菌株SZ31(菌株W3110)由来のΔfocA-pflB欠失のP1形質導入により、エタノール生成のためのZ.モビリス(Z. mobilis)遺伝子を排除する段階;
(d)菌株TC20由来のadhE突然変異のP1形質導入によって、天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ生成を不活性化する段階(Zhou et al., 2003);
(e)菌株SZ61由来の突然変異(菌株 W3110)を用いてアセテートキナーゼ(ackA)を欠失させる段階(Zhou et al., 2003);
(f)選択に用いた抗生物質遺伝子をFLPリコンビナーゼによって取り除く段階(Zhou et al., 2003);ならびに
(g)段階(f)の抗生物質遺伝子を取り除く間にcasABの内部セグメントを欠失させる段階(または抗生物質遺伝子を取り除く段階の後にcasAB遺伝子の内部セグメントを欠失させる段階)。
(a)本明細書において記載されるような方法を用いて菌株SZ186を操作する段階;
(b)増殖の増大および/または乳酸生成の増加を選択するために菌株SZ186を連続的な培養に供する段階(選択された菌株は菌株SZ194である);
(c)異種のL-乳酸遺伝子およびカナマイシンマーカーをSZ194の天然のldhA(D-乳酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子へ組み込み、コード領域の中央部分を欠失させてTG101を作製する段階;
(d)抗生物質遺伝子をFLPリコンビナーゼにより取り除いてTG102を作製する段階;ならびに
(e)予め播種しておいた培養物から毎日、1:100に希釈した培養液を用いて菌株TG102を数日間 (例えば約7日〜21日間、好ましくは、13日間)の連続的な植継ぎ(transfer)に供し、増殖の改良および/またはL-乳酸生成の増加を示す菌株を選択する段階(選択された菌株はTG103である)。
(1)大腸菌株KO11(ATCC 55124)に対する以下の遺伝子改変を含む、遺伝子改変大腸菌株:a)クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)casAB遺伝子の、lacYの終止コドンの後への挿入;b)エルウィニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)celY遺伝子の、frdA遺伝子への組み込み;c)focA-Z.mobilis pdc-adhB-pflBの不活性化または欠失;d)天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;およびe)アセテートキナーゼ(ackA)遺伝子の不活性化または欠失;
(2)不活性化または欠失した抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、態様(1)の遺伝子改変大腸菌株;
(3)クレブシエラ・オキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニア・クリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、態様(1)の遺伝子改変大腸菌株;
(4)クレブシエラ・オキシトカcasAB遺伝子およびエルウィニア・クリサンテミcelY遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において挿入後に不活性化されているかまたは欠失している、態様(2)の遺伝子改変大腸菌株;
(5)代謝的に進化している、態様(2)の遺伝子改変大腸菌株;
(6)代謝的に進化している、態様(1)または(3)の遺伝子改変大腸菌株;
(7)代謝的に進化している、態様(4)の遺伝子改変大腸菌株;
(8)抗生物質遺伝子がFLPリコンビナーゼにより欠失される、態様(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、または(7)の遺伝子改変大腸菌株;
(9)SZ186である、態様(7)の遺伝子改変大腸菌株;
(10)SZ132である、態様(5)の遺伝子改変大腸菌株;
(11)菌株のmgsA遺伝子が、遺伝子改変大腸菌株において不活性化されているかまたは欠失している、態様(1)、(2)、(3)、(4)、または(5)の遺伝子改変大腸菌株;
(12)mgsA遺伝子が不活性化されているかまたは欠失している大腸菌株SZ194(NRRL B30863)を含む、遺伝子改変大腸菌株;
(13)代謝的に進化している、態様(12)の遺伝子改変大腸菌株;
(14)TG112、TG113、またはTG114である、態様(13)の遺伝子改変大腸菌株;
(15)不活性化または欠損した天然のldhA遺伝子と、組換えによって挿入されたL-特異的乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子とをさらに含む、態様(11)または(12)の遺伝子改変大腸菌株;
(16)L-特異的乳酸デヒドロゲナーゼ異種遺伝子が、ldhL遺伝子(例えば、P.アシディラクチシ(P. acidilactici)から得たldhL遺伝子)である、態様(15)の遺伝子改変大腸菌株;
(17)代謝的に進化している、態様(15)または(16)の遺伝子改変大腸菌株;
(18)TG112、TG113またはTG114、SZ194、SZ132、SZ186、またはTG103から選択される、遺伝子改変大腸菌株;
(19)態様(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、または(18)の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培地に播種する段階、および遺伝子改変大腸菌株を培養または増殖する段階を含む、遺伝子改変大腸菌株の培養または増殖方法;
(20)D-(-)-乳酸の生成を可能とし、任意でD-(-)-乳酸を中和してD-(-)-ラクテートを形成することを可能にする条件下で、態様(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、または(14)の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、D-(-)-ラクテートまたはD-(-)-乳酸の生成方法;
(21)一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG112、TG113、TG114、またはSZ194から選択される、態様(20)の方法;
(22)L-(+)-乳酸の生成を可能とし、任意でL-(+)-乳酸を中和してL-(+)-ラクテートを形成することを可能にする条件下で、態様(15)、(16)、または(17)の一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株を培養する段階を含む、L-(+)-ラクテートまたはL-(+)-乳酸の生成方法;
(23)一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株がTG103、TG105、TG106、TG107、またはTG108である、態様(22)の方法;
(24)遺伝子改変大腸菌株が無機塩培地で培養される、態様(19)、(20)、(21)、(22)、または(23)の方法;
(25)無機塩培地が2%〜20%(w/v)の間の糖を含む、態様(24)の方法;
(26)無機塩培地が2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、または20%(w/v)の糖を含む、態様(25)の方法;
(27)糖が、グルコースまたはスクロースまたはグルコースとスクロースの組合せである、態様(25)または(26)の方法;
(28)態様(11)の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なD-(-)-ラクテートまたはD-(-)-乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、態様(20)の方法;
(29)態様(15)、(16)、または(17)の遺伝子改変大腸菌株が、キラル的に純粋なL-(+)-ラクテートまたはL-(+)-乳酸の生成を可能とする条件下で培養される、態様(22)の方法;
(30)キラル的に純粋なD-(-)-ラクテートまたはD-(-)-乳酸を生成する、態様(21)の方法;
(31)キラル的に純粋なL-(+)-ラクテートまたはL-(+)-乳酸を生成する、態様(23)の方法;
(32)キラル的に純粋なラクテート(L-(+)-ラクテートまたはD-(-)-ラクテート)を精製する段階をさらに含む、態様(28)、(29)、(30)、または(31)の方法;
(33)ラクテート(例えば、L-(+)-ラクテートまたはD-(-)-ラクテート)が少なくとも0.5Mの濃度で生成される、態様(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、または(32)の方法;
(34)培地が、NBS無機塩培地などの化学的に定義された無機塩培地である、態様(33)の方法;
(35)乳酸(L-(+)-乳酸またはD-(-)-乳酸)の収量が少なくとも90%であるか、または90%を上回る(または90%以上である)、態様(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、または(34)の方法;
(36)収量が少なくとも90%、90.5%、91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、または99%である、態様(35)の方法;
(37)他の立体異性形態を伴う乳酸もしくはラクテートの立体異性形態の検出可能な混入が1つもない(例えば、特定の立体異性体のキラル純度が少なくとも99.9%であるか、99.9%を上回る(または99.9%以上である)、態様(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、(34)、(35)、または(36)の方法;
(38)態様(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、または(18)の、一つまたは複数の遺伝子改変大腸菌株と、培地とを含む、組成物。
大腸菌株SZ132およびSZ186の調製および分析
本実施例で用いられる大腸菌株を表1に列挙する。菌株SZ63は大腸菌K-12(ATCC 27325)の派生物である。KO11(ATCC 55124)は、pflB遺伝子へ組み込まれたザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)エタノール生成遺伝子を含む大腸菌B(ATCC 11303)の派生物である。
セロビオースの利用のためのクレブシエラ・オキシトカcasAB遺伝子(Moniruzzaman et al. 1997)をlacYの終止コドンの後ろへ組み込むこと、およびエンドグルカナーゼ (Zhou and Ingram, 1999)をコードするエルウィニア・クリサンテミcelY遺伝子をfrdA遺伝子へ組み込むことによってKO11から菌株LY52を構築した。ラクテート生成のためのSZ63(Zhou et al., 2003)を構築するために用いた、既に特徴付けられた大腸菌K-12の突然変異(菌株W3110)を順次LY52へ形質導入した。エタノール生成のためのZ.モビリス遺伝子を、SZ31由来のΔfocA-pflB欠失のP1形質導入により排除した。TC20由来のadhE突然変異のP1形質導入により天然の大腸菌アルコールデヒドロゲナーゼを不活性化した。SZ61における突然変異を用いてアセテートキナーゼ(ackA)を欠失させた。選択に用いた抗生物質遺伝子をFLPリコンビナーゼにより取り除いた(Zhou et al., 2003)。FLPリコンビナーゼでの抗生物質遺伝子の除去の際に、casABの内部セグメントも欠失させた。casABおよびプロモーターの配列解析によりFLPリコンビナーゼの認識部位に非常によく似たDNA領域の存在が明らかとなり、この欠失の原因であると推定される。
全ての外来遺伝子を取り除いた、SZ132のさらなる派生物を構築した。K.オキシトカcasABおよびE.クリサンテミcelY遺伝子を、直鎖DNAを用いる相同組換えによって欠失させた。構築の間に、FLPリコンビナーゼを用いて、用いた抗生物質遺伝子を排除した。生じた菌株SZ186は天然の大腸菌遺伝子のみを含む。
類似の遺伝子突然変異体を大腸菌K-12および大腸菌Bの派生物に構築して、それぞれSZ63(Zhou et al., 2003)およびSZ132を作製した。細胞増殖およびラクテート(D異性体)生成に関して、SZ132がSZ63より優れていた(図1A参照)。富栄養培地において、SZ132は10%グルコースの発酵を48時間で完了してラクテート1モル/lを超える発酵培養液を生成し、これは大腸菌K-12に基づく菌株について以前報告されたものの2倍であった。SZ63および10%グルコースを用いる発酵は72時間後に失速し、120時間後にわずかラクテート840ミリモル/lの培養液しか生成しなかった。富栄養培地において、ラクテートの収量は、SZ132(95%)のほうがK-12菌株SZ63(88%)のものより高かった。SZ132の最大容量生産性は75ミリモル/l時間であり、SZ63のものより76%高かった(表2)。
大腸菌株SZ194の調製
菌株SZ194の調製に用いた菌株およびプラスミドを表3に列挙する。培養物を、改変Luria培養液(1リットルあたり:Difcoトリプトン10g、Difco酵母抽出物5g、塩化ナトリウム5g)(Miller, J.H. 1992 A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)において、またはベタイン1mMおよび2%〜14%(w/v)の糖(グルコースまたはスクロース)を補給したNBS無機塩培地(Causey, T.B. et al. 2004, “Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2235-2240)において、37℃にて増殖させた。必要な場合、アンピシリン(50mg/L)およびカナマイシン(50mg/L)を菌株構築に用いた。
保護性のあるオスモライト(osmolyte)であるベタインは、高い糖濃度を含有する無機塩培地におけるSZ132による細胞増殖およびラクテート生成に非常に有益であったが、これはおそらくグルタミン酸塩およびトレハロースなどの天然のオスモライトの生合成への不十分な炭素の分割に起因すると思われる(Purvis, J.E. et al. (2005)「Enhanced trehalose production improves growth of Escherichia coli under osmotic stress」Appl. Environ. Microbiol. 71:3761-3769)。10%スクロースを含有する無機塩培地でSZ132を連続的に植え継ぎし、ベタインの不在下で同等の能力を有する菌株を選択した(図6Aおよび6B)。菌株SZ132における増殖のためのエネルギー生成は、NADH酸化の主要経路としてラクテートを含む解糖流量に依存しているので、増殖を基準とした選択をもたらす。増殖および酸生成(塩基消費量)は連続的な植継ぎの間に着実に改良された。最終の植継ぎにおいて、ベタインを添加せずに10%スクロースを完全に発酵させた。この培養液からクローンを単離し、菌株SZ136と命名した。この菌株は96時間後に、親株SZ132の細胞収量の2倍量の、かつ3倍高力価のラクテートを生成した(図6)。SZ136はまた、SZ132よりも高レベルのスクシネートおよびエタノールを生成し(表5)、ラクテートの収量を低下させた(代謝された糖に基づく)。
a特に定めない限り10%グルコースを含有するNBS無機塩培地(pH7.0)。指示されている場合、1mMベタインも添加された。
b収量は、最大理論収量を六炭糖1モルあたりラクテート2モルと仮定し、代謝された糖に基づく(等量換算)。
材料および方法
菌株、プラスミド、培地および増殖条件
本研究で利用した大腸菌株、プラスミドおよびプライマーを表7に列挙する。菌株SZ194は以前に大腸菌B(ATCC 11303)の派生物から構築され、構築の出発点としての役割を果たした(実施例2およびZhou, S., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P., Grabar, T.B., Ingram, L.O. (2006)「Fermentation of 12% (w/v) glucose to 1.2 M lactate by Escherichia coli B strain SZ194 using mineral salts medium」Biotechnol. Lett. In Press参照)。菌株構築の間、培養物を2%(w/v)グルコースまたはアラビノースを含有するLuria培養液(1リットルあたり:Difcoトリプトン10g、Difco酵母抽出物5g、塩化ナトリウム5g)(Miller 1992)において30℃、37℃、または39℃で好気的に増殖させた。アンピシリン(50mg/L)、テトラサイクリン(12.5または6.25mg/L)、またはカナマイシン(25または50mg/L)を必要に応じて加えた。発酵試験のため、菌株を、1mMベタインおよび2〜12%(w/v)グルコースを補給したNBS無機塩培地(Causey et al., 2004)において抗生物質を用いずに37℃で増殖させた。MOPSバッファー(100mM、pH7.4)を、pH調整を欠く条件下(プレート、試験管、振盪フラスコ)で固体培地または液体培地に加えた。
DNA精製(Qiagen)、制限エンドヌクレアーゼ消化(New England Biolabs)、DNA増幅(Stratagene and Invitrogen)および形質転換については、製造元のプロトコールおよび標準法(Miller 1992, Sambrook and Russell 2001)に従った。染色体欠失および組み込みのための方法は既に記載されている(Causey et al., 2004, Zhou et. al., 2003, Datsenko and Wanner 2000, Martinez-Morales et al., 1999)。mgsA遺伝子の先頭または終端の50ヌクレオチドと相同である配列(斜体)に加えて、FRTに隣接するpKD4のカナマイシンカセットの配列に対応する20ヌクレオチド(下線)を含むハイブリッドプライマー(表7)を、天然のmgsA遺伝子の欠失に用いた。プラスミドpLOI2398を予め構築してペディオコッカス・アシディラクチシ(Pedioccoccus acidilactici)ldhLの大腸菌の染色体ldhA遺伝子への組み込みを促進した(Zhou et al., 2003a)。
前接種物(pre-inoculum)は、250mlフラスコ(2%(w/v)グルコースを含むNBS培地100mlおよび100mM MOPS、pH7.4)にコロニーを播種することで増殖させた。16時間後(37℃、120rpm)、この前接種物を350ml NBS培地(糖は5〜12%、1mMベタイン含有または不含)を含有する500ml発酵容器へ希釈して33mg dcw l-1とした。24時間後(37℃、150rpm、7.0にpHを調整)、この培養物を用いて出発接種物33mg dcw l-1を提供した。容量生産性を、最も活性のある24時間について報告する。比生産性を、容量生産性を24時間での細胞量で割った商として計算した。
pH調整された発酵からの細胞を24時間または48時間間隔で連続的に植え継ぎ、競合的な、増殖に基づく選択によって代謝の進化を促進した。植継ぎごとに、接種物を予め温めた新鮮培地へ希釈した(1/100〜1/350)。これらの選択から単離されたクローンに新規な菌株名を与えた。
Bausch & Lomb Spectronic 70 分光光度計を用いて550nmにて光学濃度を測定することにより細胞量を評価した。総有機酸生成量(主にラクテート)を、pH7.0の維持のためのKOH消費によって評価した。酸性生成物およびキラル純度を、発酵の最後に高速液体クロマトグラフィーによって分析した。塩基消費量による有機酸の推定値は、一貫してHPLCによるラクテートの測定値よりも低かったが、これはおそらく無機代謝に起因するものと思われる。
D-(-)-ラクテート生成のためのキラル純度の回復
菌株SZ194は、無機塩培地においてキラル純度99%にてグルコースからD-(-)-ラクテートを効果的に生成することが示されている(Zhou et al., 2006)。ベタインは、高濃度の糖を含むラクテートの生産性を増加させた(力価および率)が、キラル純度を95%まで低下させた(表8)。大腸菌にはいくつかの考えられるL-(+)-ラクテートの源がある(図9A)。L-(+)-ラクテートは、双方とも本培地では存在しないラムノースまたはフコースの異化中間体(Badia, J., Gimenez, R., Baldoma, L., Barnes, E., Fessner, W.D., Aguilar, J. (1991)「L-lyxose metabolism employs the L-rhamnose pathway in mutant-cells of Escherichia coli-adapted to grow on xylose」J. Bacteriol. 173:5144-5150)であるラクトアルデヒドから生成することも、解糖のメチルグリオキサルバイパス(Methylglyoxal Bypass)からの生成物として生成することもある(図9Aおよび9B)。メチルグリオキサルバイパスは、急速な解糖の際のジヒドロキシアセトンリン酸の蓄積によって、またATP合成のためのリン酸制限によって誘導される、短縮溢流経路を意味する。ジヒドロキシアセトンリン酸の蓄積とリン酸制限の双方とも、高い速度の解糖流量によって激化する場合もあり得る。この仮説を試験するため、最初の関与段階である、メチルグリオキサルシンターゼをコードするmgsA遺伝子を欠失させた。生じた菌株TG112は、キラル的に純粋なD-(-)-ラクテートを生成した(表8および9;図10Aおよび10B)。増殖および初期生産性はこの欠失によってSZ194と比較して増加した。HPLC分析に基づく収量は類似した(表8)。
D-(-)-ラクテート菌株、SZ194を再操作してD-(-)-乳酸デヒドロゲナーゼをコードする天然のldhA遺伝子を、L-(+)-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするP.アシディラクチシ由来のldhL遺伝子に置換することによって、主にL-(+)-ラクテートを生成した(Zhou et al., 2003a)。生じた菌株TG102は、主にL-(+)-ラクテートを生成し、5%(w/v)グルコース、10%(w/v)グルコース、および1mMベタインを含む10%(w/v)グルコースを含有する最少培地に連続的に植え継いで、改良された増殖および生産性について選択した。24日後、1つのクローンを選択し、TG103と命名した。解糖流量の増加に起因してラクテート生産性は改善されたが(図10Cおよび10D;表9)、L-(+)-ラクテートに5%D-(-)-ラクテートが混入した(表8)。メチルグリオキサルバイパスはラクテートの両キラル型を生成する可能性があるため、mgsAを最も可能性の高いキラル不純物の起源と特定した。絶対キラル純度はmgsAの欠失後に回復した。生じた菌株TG105は、L-(+)-ラクテートのみを生成した(図10および10D;表8)。さらなる改良点は、10%〜12%(w/v)グルコースおよび1mMベタインを含有する無機塩培地(接種物の希釈率1:100〜1:350)における連続的な植継ぎの際の同時選択による増殖および生産性であった。TG106およびTG107を、それぞれ10回および22回の植継ぎの後に中間体菌株として単離した(図10Eおよび10F)。菌株TG108を99日後に単離した。全てがL-(+)-ラクテートだけを高い収量で最小レベルの副生成物とともに生成した(表8)。12%(w/v)グルコースにおける容量生産性および細胞収量は、菌株選択の間に増加したが、比生産性は本質的に一定のままであった(表9)。より高度な接種物では、最大容量生産性(最も活性のある24時間)に僅かな増加が観察された。
高力価(48時間で>100gl-1)のキラル的に純粋なL-(+)およびD-(-)-ラクテート(キラル純度>99.9%)は、1mMベタインを補給した無機塩培地において組換え型大腸菌Bによって容易に生成することができる。メチルグリオキサルバイパスの排除は、ラクテートのD-(+)およびL-(-)型鏡像異性体双方の不純物を排除するために不可欠である。
TG114由来の全ての外来DNAの除去によるTG128の構築
ラクテート生成のための組換え型大腸菌株の市販用途を促進するため、先の遺伝子操作の間に染色体に残されていた全ての外来性DNAを除去した、TG114のさらなる派生物を構築した。除去されたDNAには、抗生物質マーカーを除去するために用いたフリッパーゼ(リコンビナーゼ)のFRT認識部位を含有するスカー(scar)領域、ザイモモナス・モビリス由来の小さなDNA断片、クレブシエラ・オキシトカcasABの一部、およびエルウィニア・クリサンテミcelYの一部が含まれる。これらの外来DNAセグメントは、ラクテートの生成を改良するために選択された遺伝子の中心領域が削除された、天然の染色体DNAのみを残して完全に排除された。
本研究で用いられた大腸菌株、プラスミド、および プライマーを表11に列挙する。菌株TG114は以前に大腸菌Bの派生物(ATCC 11303)から構築され、構築の出発点としての役割を果たした(Grabar et al., 2006)。菌株構築の間、培養物を、2%(w/v)グルコースもしくはアラビノースまたは10%スクロースを含有するLuria培養液(1リットルあたり:Difcoトリプトン10g、Difco酵母抽出物5g、および塩化ナトリウム5g)(Miller 1992)において30℃、37℃、または39℃で好気的に増殖させた。アンピシリン(50mg/L)、クロロテトラサイクリン(10mg/L)、またはクロラムフェニコール(40mg/L)を必要に応じて加えた。
遺伝子のクローニング(Invitrogen)、DNA精製(Qiagen)、制限エンドヌクレアーゼ消化(New England Biolabs)、DNA増幅(Stratagene and Invitrogen)、および形質転換については、製造元のプロトコールおよび標準法(Miller 1992, Sambrook and Russell 2001)に従った。染色体欠失および組み込みのための方法は既に記載されている(Causey et al., 2004, Zhou et. al., 2003, Datsenko and Wanner 2000, Martinez-Morales et al., 1999)。用いられるプラスミドおよびプライマーの説明を表11に列挙する。
大腸菌B gDNA、「frdA frdB frdCおよびfrdD」のfrdABCDオペロン内で増幅したプライマーを設計し、その後Invitrogenクローニングベクター、pCR2.1-TOPOに連結することによりプラスミドpLOI4411を作成した(表11)。関心対象の天然の遺伝子、ackA、adhE、focA-plfB、およびmgsAをそれぞれクローニングするために、プラスミドpLOI4412、pLOI4413、pLOI4415、およびpLOI4416を類似のアプローチで構築した。
Datsenko and Wanner (2000)の一段階欠失法(one-step deletion method)によって残された〜85bp FLP認識標的(FRT)スカーを二段階アプローチによって除去した。最初に、FRT部位を環状のFRT-cat-sacBカセットによって個別に標的化し、その結果このカセットの染色体上のFRTスカーへの単一クロスオーバー組み込みをもたらした(FRT-cat-sacB-FRT)。cat-sacB-FRTカセットを含有する環状DNAを以下のように構築した:1.プラスミドpLOI4151を鋳型として用いるFRT-cat-sacBカセットのPCR増幅。増幅したカセットは隣接するPstI部位を含む;2)PstIでの消化の後の自己連結で自己複製ができない閉じた環を作製。この環状DNAを組み込みに用いた。cat遺伝子の発現はクロラムフェニコール耐性を付与し、この組み込みを含有する細胞の直接的な選択を可能にした。
TG114は、lacY、lacA領域における先の構築物から異種DNAのセグメント(ザイモモナス・モビリス、クレブシエラ・オキシトカcasAB、およびエルウィニア・クリサンテミcelYの一部由来のDNA断片)を含んでいた(Grabar et al., 2006)。これらはTG122を作製するためTG120から取り除かれ、TG122のその後の派生物には存在しない。この構築のためのプライマーを表11に列挙する。これを達成するため、天然のlacZ'からcynXの領域を大腸菌Bから増幅し、pCR2.1-TOPOへクローニングしてpLOI3956を作製した。組換え体の選択を促進するため、pLOI3956の中央の領域(lacZ'〜lacA')を、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含有するカセットで次のように置換した。pLOI3956を鋳型として用い、NheI部位を含有するアンチセンスプライマーを用いてlacZ'、pCR2.1、およびcynX(lacZ'の一部、lacY、lacAおよびcynX'の一部を除去したもの)を増幅させた。NheI部位を含有する第2のプライマーのセットを用いてcat-sacBカセットをプラスミドpEL04(本来pK04として公知、Ausubel et al., 2005およびLee et al., 2001)から増幅した。NheIでの消化後、これらのPCR産物を連結してlacZ'-sacB-cat-cynX'を含むPCR2.1の派生物であるpLOI3957を作製した。プラスミドpLOI3957を鋳型として用いて、lacZ'-sacB-cat-cynX'領域をPCRによって増幅し、TG120へ組み込み、クロラムフェニコール耐性について選択してTG121を作製した。pLOI3956を鋳型として用いて、野生型lacZ'-lacY-lacA-cynX'領域をPCRによって増幅し、TG121へ組み込んだ。lacZYAオペロンの天然の配列を含有する組み込み体を、スクロースの存在下での増殖の間にsacB機能の欠如によって選択した。これらのうちの1つをTG122と命名した。菌株TG122はTG128の構築の間の中間体菌株であった。
前接種物を、2%(w/v)グルコースおよび100mM MOPS(pH7.4)を含む100mlのNBS培地(Causey et al., 2004)を含有する250mlフラスコへコロニーを播種することによって増殖させた。16時間後(37℃、120rpm)、この前接種物を350ml AF1無機塩培地(12%糖)を含有する500ml発酵容器へ希釈して33mg dcw/Lとした。24時間後(37℃、150rpm、7.0にpHを調整)、生じた培養物を用いて33mg dcw/Lの出発接種物を準備し、同じ条件下で96時間培養した。サンプルを分析のために取り出した。
Bausch & Lomb Spectronic 70分光光度計を用いて550nmにて光学濃度を測定することにより細胞量を推定した。総有機酸生成量(主にラクテート)を、pH7.0を維持するために用いたKOH消費によって推定した。酸性生成物およびキラル純度を、発酵の最後に高速液体クロマトグラフィーによって分析した。塩基消費量による有機酸の推定値は、一貫してHPLCによるラクテートの測定値よりも低かったが、これはおそらく無機質代謝に起因するものと思われる。
菌株TG114を、集中的な遺伝子操作に供してFRTスカーおよび他の外来性DNAを除去した。生じた生物、菌株TG128は、不必要な発酵生成物を排除するため天然の野生型DNA配列および継ぎ目のない遺伝子の欠失のみを含む。この菌株の発酵性能はTG114のものと本質的に同等であり、最大理論収量の96〜98%のラクテート収量であった(表13)。
代謝の進化を用いて、高温下で効果的なラクテート生成の可能な菌株を選択した。pH調整された発酵からの細胞を24時間間隔で連続的に植え継いで、競合的な、増殖に基づく選択によって代謝の進化を促進した。植継ぎごとに、接種物を予め温められた新鮮な培地へ希釈した(1/100〜1/350)。増殖によって熱耐性菌株の単離が促進されるように、培養温度を僅かな程度上昇させた。菌株TG128は、37℃で至適に発酵する。変異株を、連続的な植継ぎの間に培養温度を漸増させることによって得た。このアプローチを用いて、現在39℃(菌株TG129)および43℃(菌株TG130)で効果的な発酵の可能なTG128から、新規な菌株を選択した。高温下での双方の熱耐性菌株の収量は、37℃でのTG114と同等であった(表13)。
菌株TG114を、集中的な遺伝子操作に供してFRTスカーおよび他の外来性DNAを除去した。生じた生物、菌株TG128は、不必要な発酵生成物を排除するため天然の野生型DNA配列および継ぎ目のない遺伝子の欠失のみを含む。この菌株の発酵性能はTG114のものと本質的に同等であり、最大理論収量の96〜98%のラクテート収量であった(表13)。
代謝の進化を用いて、高温下で効果的なラクテート生成の可能な菌株を選択した。温度を僅かな程度上昇させた発酵槽への連続的植継ぎは、39℃で至適に発酵するTG129および43℃で至適に発酵するTG130の単離を可能にした。高温下での双方の収量は、37℃でTG114と同等であった(表13)。
a特別の定めのない限り、12%(w/v)グルコースを含有するNBS無機塩培地(pH7.0)。示されている場合、1mMベタインも添加された。太字の菌株はD-(-)-ラクテートを生成する。下線の菌株はL-(+)-ラクテートを生成する。
b収量は、最大理論収量を六炭糖1モルあたりラクテート2モルと仮定し、代謝された糖に基づく(等量換算)。
a12%(w/v)グルコース、1mMベタインを含有する、pH7.0に調整した無機塩(NBS)(特別の定めのない限り)。太字の菌株はD-(-)-ラクテートを生成する。下線の菌株はL-(+)-ラクテートを生成する。
bpH7.5に調製。
c5%接種物。
d10%接種物。
e10%グルコース。
f最も生産的な24時間の平均値。
a太字で示されている部分は遺伝子の5'および3'領域の部分配列であり、斜体部分はFRTスカーであり、下線部はTG128株において欠失された領域である。
bこの領域もZ.モビリスプロモーター由来の部分配列、ならびにE.クリサンテミcelY遺伝子由来の部分配列を含んでいた(通常の下線で示す)。
cダッシュ記号は欠失領域を示す。
apH7.0に調整した12%(w/v)グルコース、1mMベタインを含有する無機塩(NBS)。
b収量は、最大理論収量を六炭糖1モルあたりラクテート2モルと仮定し、代謝された糖に基づく(等量換算)。
その他の文献は、以下に示す通りである。
米国公開特許第20040005677号
米国公開特許第20030003553号
米国公開特許第20050112737号
米国公開特許第20040029256号
Bianchi, M.M., Brambilla, L., Protani, F., Liu, C., Lievense, Porro, D. (2001)「Efficient homolactic fermentation by Kluveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with heterologous LDH gene」Appl. Environ. Microbiol. 67:5621-5625.
Posfai, G., Koob, M.D., Kirkpatrick, H.A., Blattner, F.C. (1997)「Versatile insertion plasmids for targeted genome manipulations in bacteria: Isolation, deletion, and rescue of the pathogenicity island LEE of the Escherichia coli O157:H7 genome」J. Bacteriol. 179:4426-4428.
SEQ ID NO:1は、frdBC欠失のためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:2は、frdBC欠失のためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:3は、adhE欠失のためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:4は、adhE欠失のためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:5は、celY欠失のためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:6は、celY欠失のためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:7は、mgsA欠失のためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:8は、mgsA欠失のためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:9は、FRT-cat-sacBの増幅のためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:10は、FRT-cat-sacBの増幅のためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:11は、5'NheI部位を含むcat-sacBの増幅のためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:12は、5'NheI部位を含むcat-sacBの増幅のためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:13は、frdABCDをクローニングするためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:14は、frdABCDをクローニングするためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:15は、ackAをクローニングするためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:16は、ackAをクローニングするためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:17は、lacZ-cynXをクローニングするためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:18は、lacZ-cynXをクローニングするためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:19は、mgsAをクローニングするためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:20は、mgsAをクローニングするためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:21は、focA-pflBをクローニングするためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:22は、focA-pflBをクローニングするためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:23は、adhEをクローニングするためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:24は、adhEをクローニングするためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:25は、frdBCを欠失させるためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:26は、frdBCを欠失させるためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:27は、ackAを欠失させるためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:28は、ackAを欠失させるためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:29は、5'NheI部位を含むlacZアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:30は、5'NheI部位を含むcynXアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:31は、mgsAを欠失させるためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:32は、mgsAを欠失させるためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:33は、focA-pflBを欠失させるためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:34は、focA-pflBを欠失させるためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:35は、adhEを欠失させるためのセンスプライマーの核酸配列である。
SEQ ID NO:36は、adhEを欠失させるためのアンチセンスプライマーの核酸配列である。.
SEQ ID NO:37〜46は、FRTスカーを欠失した遺伝子領域の部分配列を示す。遺伝子の5'領域および3'領域の部分配列を太字で示し、FRTスカーを斜体で示し、菌株TG128における欠失を下線で示す。
Claims (3)
- 以下の改変を含む、単離された遺伝子改変大腸菌(E. coli)株:
i) アセテートキナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;
ii) フマル酸レダクターゼ遺伝子の不活性化または欠失;
iii) pflB遺伝子の不活性化または欠失;
iv) アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化または欠失;および
v) メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子の不活性化または欠失。 - 培地および請求項1に記載の遺伝子改変大腸菌株を含む、組成物。
- 請求項1に記載の遺伝子改変大腸菌株を乳酸の生成を可能とする条件下で培養する段階を含む、乳酸を製造する方法。
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