JP4970754B2 - クラゲ類からのコラーゲン回収方法 - Google Patents
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Description
ステップ101(図中ではステップをSと略す。以下同じ。)では、クラゲ類をそのまま、または細断した後に、クラゲ類が凍結する温度またはそれ以下の温度で凍結保存する。
ステップ102は、凍結したクラゲ類をクラゲ類が有するコラーゲンが未変性状態を維持できる所定の温度で解凍する工程である。本解凍工程は、後述する撹拌工程において、クラゲが流動性を有し撹拌可能な状態にまで解凍して、クラゲ類自身が有する内因性酵素を活性化して、分解反応を開始させるものである。
ステップ103では、解凍したクラゲ類を、撹拌することによりコラーゲンを未変性の状態で可溶化する。この撹拌工程により、クラゲの体組織は内因性酵素による分解を受け、ほぼ完全に崩壊し、液状となる。クラゲの体液は海水に匹敵する塩分(約0.5mol/l)を含み、pHは7.4〜7.9である。このため、クラゲ類の体組織が液状化すると、緩衝液等を加えるまでもなく未変性のコラーゲンを含む中性塩溶液となる。
ステップ104では、可溶化した未変性のコラーゲンを塩析法により回収する。塩析法は、コラーゲンに関しては未変性のものしか回収されず、簡易な精製も兼ねることが可能となるため、未変性のコラーゲンの回収に好適である。
本実施例の評価に採用したクラゲ組織の凍結・解凍方法の概要を図2に示す。
図2(a)は、凍結・解凍方法Aを示す図であり、図2(b)は、凍結・解凍方法Bを示す図である。
組織内在性の酵素により可溶化されたコラーゲンを回収するため、本実施例の評価では図3に示す2通りの方法を採用した。図3(a)は、中性条件下における沈殿(沈殿方法Iとする)を示す図であり、図3(b)は、酸性条件下における沈殿(沈殿方法IIとする)を示す図である。
凍結乾燥物またはクロマトグラフィーによって得られた画分について、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行うことにより、それらの性状を調べた。
上述したように沈殿方法Iにて沈殿させた場合に再現性の良いSDS-PAGEパターンを示すコラーゲンを回収することができたため、ここではコラーゲンA(実施例1)についてアミノ酸分析を行い、ミズクラゲのPSCおよびエチゼンクラゲ(Stomolophus nomurai)のPSCのアミノ酸組成と比較した(図6)。
アミノ酸分析は、次の方法にて行った。コラーゲンA凍結乾燥試料100μgを100μlの0.1M塩酸に溶解して試料とした。分析は、ODSカラム(Cosmosil 5C18-AR; 4.6×250mm; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)を備え付けたアミノ酸分析システム(Waters PICO TAG system; Waters, Milford, Mass)を用いてPICO TAG法により行った。試験管に入れた試料溶液は、減圧下のバイアル内で6M塩酸により150℃で1時間気相加水分解した。加水分解物はメタノール-超純水-トリエチルアミン(2:2:1)混合液で中和した。中和した加水分解物にメタノール-超純水-トリエチルアミン-フェニルイソチオシアネート(PITC)(7:1:1:1)の混合液を添加し、PITCとアミノ酸との反応で生成するフェニルチオカルバモイル誘導体を上記アミノ酸分析システムで分離定量した。
次に、本実施例にて得られるコラーゲンの変性温度を測定した。変性温度の測定のための試料調製は4℃にて行い、次に示す2通りの条件にて測定を行った。
最後に、インヒビターを用いて組織解凍時に作用する内因性プロテアーゼの探索を行った。セリン系、システイン系、アスパラギン酸系の各種プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼに対するインヒビターを加えて凍結した試料を解凍し、その溶解画分中のタンパク質量の測定を行ったところ、メタロプロテアーゼに対するインヒビター(EDTA)を添加した実験区のみ有意なタンパク質量の減少が認められた。
Claims (4)
- クラゲ類を凍結する凍結工程と、
クラゲ類自身が有する内因性酵素を活性化してクラゲ類の分解反応を開始するために、前記凍結したクラゲ類を解凍する解凍工程と、
クラゲ類が有するコラーゲンを未変性の状態で可溶化して前記未変性のコラーゲンを含む中性塩溶液を生成するために、前記解凍したクラゲ類を撹拌する撹拌工程と、
前記中性塩溶液から前記未変性のコラーゲンを回収する回収工程と、
を有し、
前記解凍工程、及び、前記攪拌工程は、
クラゲ類自身が有する内因性酵素が活性を有する4℃以上で行われ、かつ、
クラゲ類が有するコラーゲンが未変性状態を維持できる10℃以下で行われることを特徴とするクラゲ類からのコラーゲン回収方法。 - クラゲ類を細断して凍結する凍結工程と、
クラゲ類自身が有する内因性酵素を活性化してクラゲ類の分解反応を開始し、クラゲ類が有するコラーゲンを未変性の状態で可溶化して前記未変性のコラーゲンを含む中性塩溶液を生成するために、前記凍結したクラゲ類を解凍する解凍工程と、
前記中性塩溶液から前記未変性のコラーゲンを回収する回収工程と、
を有し、
前記解凍工程は、
クラゲ類自身が有する内因性酵素が活性を有する4℃以上で行われ、かつ、
クラゲ類が有するコラーゲンが未変性状態を維持できる10℃以下で行われることを特徴とするクラゲ類からのコラーゲン回収方法。 - 前記回収工程において、前記未変性のコラーゲンを塩析法により回収することを特徴とする請求項1または2に記載のクラゲ類からのコラーゲン回収方法。
- 前記内因性酵素には、メタロプロテアーゼが含まれることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載のクラゲ類からのコラーゲン回収方法。
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