JP4961595B2 - Clec−2シグナル伝達により止血疾患を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Andrews RK,Kamiguti AS, Berlanga O, Leduc M, Theakston RD, Watson SP. The use of snakevenom toxins as tools to study platelet receptors for collagen and von Willebrandfactor. Haemostasis. 2001;31:155-172 Morita T. Structures and functions of snakevenom CLPs (C-typelectin-like proteins) withanti-coagulant-, procoagulant-, and platelet-modulating activities. Toxicon. Inpress Clemetson JM, Polgar J, Magnenat E, Wells TN,Clemetson KJ. The platelet collagen receptor glycoprotein VI is a member of theimmunoglobulin superfamily closely related to FcalphaR and the natural killerreceptors. J Biol Chem. 1999;274:29019-29024 Polgar J, Clemetson JM, Kehrel BE, WiedemannM, Magnenat EM, Wells TN, Clemetson KJ. Platelet activation and signaltransduction by convulxin, a C-type lectin from Crotalus durissus terrificus (tropical rattlesnake) venom via the p62/GPVIcollagen receptor. J Biol Chem. 1997;272:13576-13583 Jandrot-Perrus M, Lagrue AH, Okuma M, Bon C.Adhesion and activation of human platelets induced by convulxin involveglycoprotein VI and integrin alpha2beta1. J Biol Chem. 1997;272:27035-27041 Suzuki-Inoue K, Tulasne D, Shen Y, Bori-SanzT, Inoue O, Jung SM, Moroi M, Andrews RK, Berndt MC, Watson SP. Association of Fyn and Lyn with the proline-rich domain of glycoprotein VI regulates intracellularsignaling. J Biol Chem. 2002;277:21561-21566 Bori-Sanz T, Inoue KS, Berndt MC, Watson SP,Tulasne D. Delineation of the region in the glycoprotein VI tail required forassociation with the Fc receptor gamma-chain. J Biol Chem. 2003;278:35914-35922 Lee WH, Du XY, Lu QM, Clemetson KJ, Zhang Y.Stejnulxin, a novel snake C-type lectin-like protein from Trimeresurusstejnegeri venom is a potent platelet agonist acting specifically via GPVI.Thromb Haemost. 2003;90:662-671 Asazuma N, Marshall SJ, Berlanga O, Snell D,Poole AW, Berndt MC, Andrews RK, Watson SP. The snake venom toxinalboaggregin-A activates glycoprotein VI. Blood. 2001;97:3989-3991 Andrews RK, Gardiner EE,Asazuma N, Berlanga O, Tulasne D, Nieswandt B, Smith AI, Berndt MC, Watson SP.A novel viper venom metalloproteinase, alborhagin, is an agonist at theplatelet collagen receptor GPVI. J Biol Chem. 2001;276:28092-28097 Shin Y, Morita T.Rhodocytin, a functional novel platelet agonist belonging to the heterodimericC-type lectin family, induces platelet aggregation independently ofglycoprotein Ib. BiochemBiophys Res Commun. 1998;245:741-745 Huang TF, Liu CZ, Yang SH.Aggretin, a novel platelet-aggregation inducer from snake (Calloselasma rhodostoma) venom, activatesphospholipase C by acting as a glycoprotein Ia/IIa agonist. Biochem J. 1995;309( Pt 3):1021-1027 Suzuki-Inoue K, Ozaki Y,Kainoh M, Shin Y, Wu Y, Yatomi Y, Ohmori T, Tanaka T, Satoh K, Morita T.Rhodocytin induces platelet aggregation by interacting with glycoprotein Ia/IIa(GPIa/IIa,Integrin alpha 2beta 1). Involvement ofGPIa/IIa-associated src and protein tyrosine phosphorylation. J Biol Chem.2001;276:1643-1652 Navdaev A, Clemetson JM,Polgar J, Kehrel BE, Glauner M, Magnenat E, Wells TN, Clemetson KJ. Aggretin, aheterodimeric C-type lectin from Calloselasma rhodostoma (malayan pit viper), stimulates platelets bybinding to alpha 2beta 1 integrin and glycoprotein Ib, activating Syk andphospholipase Cgamma 2, but does not involve the glycoprotein VI/Fc receptorgamma chain collagen receptor. J Biol Chem. 2001;276:20882-20889 Bergmeier W, Bouvard D, EbleJA, Mokhtari-Nejad R, Schulte V, Zirngibl H, Brakebusch C, Fassler R, NieswandtB. Rhodocytin (aggretin) activates platelets lackingalpha(2)beta(1) integrin, glycoprotein VI,and the ligand-binding domain of glycoprotein Ibalpha. J Biol Chem.2001;276:25121-25126 Suzuki-Inoue K, Garcia A,Eble JA, Fuller G, Pohlmann S, Zitzmann N, Inoue O, Gartner TK, Morita T, OzakiY, Watson SP. 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Syk-Dependent Cytokine Induction by Dectin-1 Reveals aNovel Pattern Recognition Pathway for C Type Lectins. Immunity. 2005;22:507-517 Herre J, Marshall AS, CaronE, Edwards AD, Williams DL, Schweighoffer E, Tybulewicz V, Reis eSousaC, GordonS, Brown GD. Dectin-1 uses novel mechanisms for yeast phagocytosis inmacrophages. Blood. 2004;104:4038-4045 Fallon RJ, Danaher M,Saylors RL, Saxena A. Defective asialoglycoprotein receptor endocytosismediated by tyrosine kinase inhibitors. Requirement for a tyrosine in thereceptor internalization signal. J Biol Chem. 1994;269:11011-11017 Geffen I, Fuhrer C,Leitinger B, Weiss M, Huggel K, Griffiths G, Spiess M. Related signals forendocytosis and basolateral sorting of the asialoglycoprotein receptor. J BiolChem. 1993;268:20772-20777 Chen M, Kakutani M, NarukoT, Ueda M, Narumiya S, Masaki T, Sawamura T. Activation-dependent surfaceexpression of LOX-1 in human platelets. Biochem Biophys Res Commun.2001;282:153-158 Dean YD, McGreal EP, GasqueP. 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本発明は、細胞系アッセイおよび無細胞系アッセイを用いて止血疾患を治療するための治療候補を同定する化合物のスクリーニング方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に、止血疾患を治療するための治療候補を同定する化合物をスクリーニングするための細胞を用いる。
本発明の形質転換細胞および/または遺伝子組み換え非ヒト動物(以下参照のこと)を生成するため、様々な標準的遺伝子組み換え構造を採用することができる。
さらに、SEQ ID NO:2の対立遺伝子変異体(Allelic Variant)の相同部分とそのフラグメントをコードする核酸と、同類(保存的)アミノ酸置換およびそのフラグメントについても検討する、本書で使用しているように、「対立遺伝子変異体」は本書で説明したものとは異なるアミノ酸配列を有する自然発生のCLEC−2を指す。変異は、上述の配列とは異なるアミノ酸配列を有しているが、それでも細胞表面に発現する必須の結合ドメインおよび/またはCLEC−2のシグナル伝達パートナーによって認識されるリン酸化可能なチロシン残基を有しており、関連するシグナル伝達カスケードの一部としてこのパートナーと結合したり作用したりする。
さらに、本発明は、止血調節のための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、全非ヒト動物を使用する方法を提供するものである。この点では、テスト化合物を上述のCLEC−2リガンドとともに動物に投与し、該動物におけるCLEC−2機能の指標の増強あるいは減弱をコントロール動物と比較して検出する。
さらに、本発明は、化合物をスクリーニングするための方法であって、その化合物がCLEC−2遺伝子の転写を調節することによりCLEC−2の発現を調節する方法を提供するものである。かかる化合物は止血疾患を調節するための治療候補である。
さらに本書で提供するのは、無細胞アッセイにおいてCLEC−2に結合する化合物をスクリーニングする方法である。一実施形態において、本発明は、止血疾患を治療する治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、a)化合物をCLEC−2ポリペプチドまたはそのフラグメントに接触させて、CLEC−2ポリペプチドとテスト化合物の結合を検出することによって、CLEC−2ポリペプチドとテスト化合物の結合によって該化合物が止血調節のための候補であることを示す方法を提供する。
CLEC−2アゴニストまたはアンタゴニストとなる化合物を同定するために上記の全ての実施形態でスクリーニングすることのでき、つまりは止血疾患を調節することのできる化合物クラスの例には、核酸(たとえば、DNAやRNA)、炭水化物、脂質、蛋白質、ペプチド、ペプチド・ミミックス、小分子が含まれるが、それらに限定されない。
本発明はまた、止血調節に使用しうる化合物を提供するものである。
一実施形態において、本発明はCLEC−2機能に拮抗する抗体を提供する。用語「抗体」は完全な(intact)免疫グロブリン分子と、そのフラグメントを指す。例としては、Fab,F(ab’)2、そしてFvフラグメントがあり、それらは抗原決定基を結合することができるものである。CLEC−2ポリペプチドに結合する抗体は、免疫抗原として完全なポリペプチドを用いて、あるいは対象となる小ペプチドを含むフラグメントを使用して生成することができる。ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、動物(たとえば、マウス、ラット、ウサギ)に免疫を与えるのに使用するのだが、RNAの転写により得ることができ、化学的に合成したり、所望に応じてキャリア蛋白に共役させることもできる。一般に使用され、化学的にペプチドに結合されるキャリアには、ウシ血清アルブミン,サイログロブリン(thyroglobulin)、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH:keyhole limpet hemocyanin)が含まれる。次いで、結合されたペプチドを利用して動物に免疫を与える。
さらに本発明が提供するのは、CLEC−2シグナル伝達の消失による病的状態の重症度を軽減させる組成物である。組成物には、本書で定義したCLEC−2の実質的に精製されたポリペプチドあるいはそのフラグメント、あるいはその塩と以下で説明する薬学的キャリアが含まれる。他の実施形態によると、本発明はCLEC−2ポリペプチドあるいはそのフラグメントをコードした核酸および薬学的キャリアを提供する。精製したCLEC−2またはCLEC−2をコードした核酸のアミノ酸配列は、天然、合成、半合成成または組み換えにかかわらず、あらゆる種類の動物、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマと、好ましくは、ヒトを含む哺乳類動物から得られる。
また、本発明は、CLEC−2シグナル伝達による病的状態の重症度を軽減させる方法を提供する。この方法には、リン酸化された細胞質ドメインを含むCLEC−2を、シグナル伝達パートナーのCLEC−2への結合を妨げる化合物に接触させるステップを含む。
本書で説明してきた発明をよりよく理解するため、以下の例を説明する。これらの例は一例にすぎず、いかなる方法でも本発明を制限するものではないことを理解されたい。
a) 動物と実験材料
遺伝子操作されたPLCγ2、Syk、LAT、SLP−76およびVav1/3欠損マウスは、先に説明したようにして入手した(非特許文献17−21)。ロドサイチンはCalloselasma rhodostomaの毒から精製した(非特許文献11,22)。ポリクローナルCLEC−2抗体はR & D systems(アメリカ、ミネアポリス)から得た。ポリクローナルウサギロドサイチン抗体はTakashi MoritaとGavin Laingより得た。Gly-Arg-Gly-Asp-Ser(GRGDS)ペプチド(SEQ ID NO:5)はペプチド研究所(大阪府)より購入した。Ser-Phe-Leu-Leu-Asn(SFLLN)ペプチド(SEQ ID NO:6)(トロンビン受容体アゴニストペプチド)はBachem Biochemica(ドイツ,ハイデルベルグ)より購入した。CLEC−2のYXXLモチーフを含むビオチンラベルしたリン酸化、あるいはリン酸を含まないペプチド(Biotin-6-Aminohexanoic acid (Ahx)-MQDEDGY(PO3H2)ITLNIK-OH(SEQ ID NO:7)とBiotin-6-Aminohexanoic acid (Ahx)-MQDEDGYITLNIK-OH)(SEQ ID NO:7)はクラボウで合成した(大阪府)。その他の実験材料は先の報告通りである(非特許文献6,17,21)。
薬を服用していない、健康な供血ボランティアの静脈血を10%チトラート(クエン酸ナトリウム)にて採取した。マウスは二酸化炭素で安楽死させた後、門脈から100μlのACD(acidcitrate dextrose)を用いて採血した。ヒトとマウスの洗浄血小板は、プロスタサイクリンを用いて隔離工程(非特許文献17)の間の活性化を抑えつつ、遠心分離によって先の報告通りに得た。二つの洗浄血小板とも修飾Tyrodeバッファー(非特許文献17)に、血小板数2×108あるいは1×109/mlになるように浮遊させた。
200μgの精製ロドサイチンを、122mgのCNBr活性化Sepharose 4Bビーズに、メーカーの取扱説明書にしたがって共有結合させた。グリシンコートビーズをネガティブコントロールに使用した。洗浄血小板表面の膜蛋白またはロドサイチンをECL Protein Biotinylation System (AmershamBiosciences Corp., Piscataway, NJ)を用いてビオチンラベルした。1mlのビオチンラベルした、あるいはビオチンラベルしていない洗浄血小板(1×109/ml)を等量の2倍濃縮冷却溶解バッファー(非特許文献17)で溶解し、100μlのSepharose 4B(50%スラリー)で1時間プレクリアした。界面活性剤に溶解しない成分を15000gで10分間遠心して除き、上清を200μlのロドサイチンあるいはグリシンコートビーズと4℃で4時間反応させた。ビーズは溶解バッファーで5回洗浄し、蛋白を40μlの還元SDSサンプルバッファーで溶解し、5分間加熱した。免疫沈降した蛋白を4−20%SDS−PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。ビオチンラベルされた表面蛋白は西洋わさびペルオキシダーゼを結合したストレセプタトアビジンで検出した。PVDF膜に転写したラベルのない血小板蛋白はビオチンラベルされたロドサイチンと西洋わさびペルオキシダーゼを結合したストレセプタトアビジンでリガンドブロットし、続いてCLEC−2抗体で再度調べた。マス・スペクトロメトリーの分析では、ラベルされていない洗浄血小板を使用して、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで着色した。
上述のようにゲル片をspeed-vacで乾燥させて、ゲル中でトリプシン処理した(非特許文献23)。HPLC(CapLC,Waters, Milford, MA, USA)はナノエレクトロスプレーを備えたQ−TOFマススペクトロメーター(Micromass, Manchester, UK)に結合していた。HPLCの移動相は5%アセトニトリル、0.1%蟻酸(溶媒A)と95%アセトニトリル、0.1%蟻酸(溶媒B)であった。トリプシン処理したペプチドを300μm径,5mm長のC18 PepMapプレカラム(LC packings, SanFrancisco,CA, USA)に加えて脱塩し、200nl/minの速さで75μm径,25cm長のC18 PepMap ナノカラム(LC packings, SanFrancisco, CA, USA)に、5−40%溶媒Bを40分と、40−80%溶媒Aを3分用いて溶出した。MS/MS分析は以前の報告通りに行った(非特許文献24)。データベース検索はMASCOT search tool(Matrix Science, London,UK) を用いて、SWISS-PROTを検索した。図1(c)はMASCOTMS searchによるSWISS-PROT検索の結果を示す編集データ出力ファイルを示している。八つの一致ペプチドには、TGTLQQLAK(SEQ ID NO:8),YYGDSCYGFFR(SEQ ID NO:9),THLIR(SEQ ID NO:10),NYLQDENENR(SEQ ID NO:11),RFCQVVVK(SEQ ID NO:12),FCQYVVK(SEQ ID NO:13),HYLMCER(SEQ ID NO:14),MHPTFCENK(SEQ ID NO:15)が含まれる。
CLEC−2をtet repressor 蛋白の元で、293T−RExTMセルラインに、以前の報告のように発現させた(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)(非特許文献25)。CLEC−2の発現は、実験の24−48時間前に1μg/mlのドキシサイクリンを培地に加えることで誘導した。溶媒を加えた細胞をコントロールとした。細胞を分離させ、改変Tyrodeバッファーに浮遊させた(非特許文献6)。ドキシサイクリン処理あるいは溶媒で処理した細胞を、500nMロドサイチンで37℃で10分間刺激した。細胞を2倍濃縮SDSサンプルバッファーで溶解した後、反応を止めた。蛋白のチロシンリン酸化あるいはCLEC−2の発現は、抗リン酸化チロシン抗体(4G10)と抗CLEC−2抗体でウェスタンブロットして検出した(非特許文献17)。
ヒト洗浄血小板(1×108/ml)と293T−RExTM細胞(5×106/ml)を、2μg/mlの抗CLEC−2抗体で15分処理した後、FITCラベル抗ヤギIgG抗体ともう15分、室温で反応させた。PBSで3倍に希釈した後、FACScanフローサイトメーターと解析ソフトCellQuest software (Becton Dickinson, SanJose, CA)を用いて報告通りに解析した(非特許文献17)。ロドサイチンの直接結合を検出するため、ドキシサイクリンを加えた293T−RExTM細胞(5×106/ml)あるいは加えてない293T−RExTM細胞(5×106/ml)を100nMロドサイチンと室温で15分予め孵置した。余分なロドサイチンを遠心分離で取り除いた後、細胞を10μg/mlのコントロールウサギIgGまたは抗ロドサイチン抗体と20分室温で孵置した。ついで、サンプルをFITCラベル抗ウサギIgG抗体と反応させ、上述の通り分析した。
1mMのGRGDS(SEQ ID NO:5)ペプチドで処理したヒト洗浄血小板(1×109/ml)あるいは血小板凝集を抑制するロトラフィバン10μMを加えたマウス洗浄血小板(2×108/ml)を50nMのロドサイチン、100μMのSFLLN(SEQ ID NO:6)、あるいは50μg/mlコラーゲンで一定時間刺激した。記載のあるところでは、30μMのPP2(Srcキナーゼ抑制剤)あるいはPP3(PP2の不活性類似物)を加えて、37℃で10分間孵置した。2倍濃縮冷却溶解バッファーを加えて反応をとめた。血小板溶解液はプレクリアし、界面活性剤に溶解しない成分を上述の通り除いた(非特許文献17)。上清の一部分を除き、SDSサンプルバッファーで溶解し、全細胞の蛋白質チロシンリン酸化検出用とした。残りの上清に抗CLEC−2抗体、抗PLCγ2抗体、抗Syk抗体、抗Btk抗体、抗SLP−76抗体、抗LAT抗体、抗Vav1抗体又は抗Vav3抗体を加えて、一晩反応させた。記載のあるところでは、10μgのCLEC−2のYXXLを含むペプチドとアビジンビーズ、あるいはGST融合蛋白とグルタチオンビーズ(glutathione Sepharose)を反応させた。記載した実験では、洗浄ヒト血小板(1×109/ml)を、FcγRIIA抗体(IV.3,10μg/ml)の抗F(ab)’2フラグメントの存在下で10μg/mlの抗CLEC−2抗体あるいはコントロールヤギIgGで刺激した。刺激の前と刺激の5分後でサンプルを2倍濃縮溶解バッファーに溶解させた。刺激前の溶解サンプルに5μg/mlの抗CLEC−2抗体とコントロールヤギIgGを加えた。コントロールヤギIgGに刺激されたサンプルと、抗CLEC−2抗体に刺激されたサンプルにそれぞれ、5μg/mlの抗CLEC−2抗体あるいはコントロールヤギIgGを加えた。遠心分離により不溶成分を取り除いた後、蛋白質Gを加えることによってCLEC−2を免疫沈降させた。免疫沈降された蛋白あるいは全血小板溶解液は、SDS−PAGEで電気泳動、PVDF膜に転写の後、記載の抗体でウェスタンブロットされた。
ヒト洗浄血小板(2×108/ml)を、FcγRIIA抗体(IV.3,10μg/ml)の抗F(ab)’2フラグメントの存在下で10μg/mlの抗CLEC−2抗体あるいはコントロールヤギIgGで刺激した。ヒトまたはマウス洗浄血小板(2×108/ml)を本文に記載の低濃度、高濃度のロドサイチンで刺激した。凝集は透過光法で、説明したBornの血小板凝集計を用いて測定した(非特許文献17)。
膜表面蛋白をビオチンラベルした血小板溶解液から、蛇毒の結合蛋白を分離するため、我々はロドサイチンまたはグリシンを共有結合したSepharose 4Bビーズを使用した。ストレプトアビジンを使用したウェスタンブロットでは、グリシンではなくロドサイチンSepharose 4Bビーズが32kDaの表面蛋白を結合し、それが両方のビーズに非特異的に結合する他の複数の蛋白とともに沈降している(図1A)。同じ32kDaバンドがまた、ビオチンラベルされていない血小板のグリシンではなくロドサイチンビーズに結合しており、それはロドサイチンを用いたリガンドブロットによって検出されている(図1B)。32kDaの部分に相当するゲルの部分を切り取り、トリプシン消化してMS/MS分析にかけた。これにより、CLEC−2が32kDaの構成成分であると同定された (図1C)。CLEC−2の血小板表面への発現はCLEC−2特異抗体を用いて、フローサイトメーターと、ウェスタンブロットで確認した(図1Dおよび1E)。興味深いことに、CLEC−2は、ウェスタンブロットで32kDaの主バンドと40kDaの副バンドの二重バンドとして検出された(図1E)。前者はロドサイチンビーズによる結合である。ロドサイチンアフィニティ溶出液中に40kDaバンドが明らかに欠如しているのは、非特異的蛋白と共に移動すること(図1Aのみ)によるか、あるいは40kDaの発現のレベルが低いことに加えてリガンドブロットアッセイにおける感度に制限があることによると思われる。重要なことは、グリシンではなくロドサイチンビーズによる32kDaバンドと40kDaバンドの結合はCLEC−2の特異抗体を使用して検出することができることであり、40kDaバンドのレベルが32kDaのレベルよりもはるかに低いが、そのことは血小板での結果に一致している(図1F)。複数の血小板サンプルからの抗CLEC−2ウェスタンブロット濃度分析により40kDaの発現レベルが32kDaバンドの23.1±5.3%であることが明らかになった(図1G)。
CLEC−2がロドサイチン受容体であること、そしてチロシンキナーゼの細胞内シグナルの生成能力を確認するため、我々は以前報告されていたtet repressorタンパクの制御下でCLEC−2を発現する細胞ラインを利用した。ドキシサイクリンを、核酸を入れた293T−RExTM細胞に加えると、CLEC−2が表面に発現した。これはレクチンレセプタの特異抗体を用いるか(図2A)、あるいはロドサイチンとロドサイチン抗体の結合(図2B)を用いて測定することができる。さらに、コントロールIgGではなく特異抗体を用いたCLEC−2のウェスタンブロットでは、ドキシサイクリン処理された非コントロール細胞におよそ32と40kDaの主要な二つのバンドと、34kDaの薄いバンドが確認された(図2C)。CLEC−2に対して複数のバンドが認められるのは血小板と同様であった。3つのバンドは一つの細胞ラインより検出され、40kDaバンドが32kDaバンドと同じレベルで確認されている。重要なことに、ロドサイチンはドキシサイクリン処理(CLEC−2発現)細胞においていくつかの蛋白質チロシンリン酸化の増加を惹起したが、溶媒処理細胞では惹起しなかった (図2D)。以上より、CLEC−2がロドサイチンの機能的な受容体であることが確認された。
発明者はCLEC−2抗体を使用して、レクチンレセプタが他のレセプタからのシグナル伝達がないときに血小板の活性化を惹起させることができるか否か調べた。この実験では、ロドサイチンが少なくとも他の二つの血小板レセプタ、すなわちインテグリンα2β1とGPIbαに結合することに注意する必要がある(非特許文献12−14)。図3Aに示すように、CLEC−2抗体は特徴的な遅れの後で血小板凝集を惹起させている。この実験はモノクローナル抗体IV.3の存在下で行われ、抗体のFc部分のFcγRIIAへの結合が妨げられている。コントロールヤギIgGは凝集を惹起しなかった。重要なことに、コントロールヤギIgGではなく、CLEC−2抗体が、CLEC−2の32kDaと40kDa形態の基礎上にチロシンリン酸化の増強を惹起させ、これはCLEC−2の免疫沈降とリン酸化チロシン、つまりはCLEC−2についてのウェスタンブロットにより確認できた(図3B)。CLEC−2は細胞質尾部に単一のチロシンを有するので、リン酸化はYXXLモチーフで行われたと考えられる。これらの結果より明らかなのは、他のレセプタからのシグナル伝達がなくてもCLEC−2の活性により十分に血小板活性を惹起させることである。さらに、レクチンレセプタがチロシンリン酸化の基礎となっていることが確認されたことにより、CLEC−2による血小板活性の潜在的なメカニズムが明らかになった。
ロドサイチンは血小板凝集を、特徴的な長いラグタイムを伴って惹起し、そのラグタイムは毒濃度の増加に伴って減少する(図3A)。比較的高い濃度のロドサイチン(300nM)で、活性化はほぼ30秒送れて開始される(図4A)が、これは蛇毒素が低いのでかなり長い時間である。これを踏まえて、ロドサイチンによる細胞溶解物全体におけるチロシンリン酸化の惹起は、血小板凝集と同じようなタイムスケールで起こり、ロドサイチンの濃度が高ければ高いほど急速に惹起されることになる(図示せず)。意味深いことに、CLEC−2のほぼリン酸化と思われる現象がロドサイチンに応じて60秒後に見受けられた。これは、形態変化の反応および凝集の始まりのピークに対応する(図4A,B)。これは、同じく、量に応じて遅れて発生し、コラーゲンレセプタの一部をなすFcレセプタγ-chainと血小板溶解物のチロシンリン酸化の増加とともに、コラーゲンによる血小板凝集のタイムコースを思い出させるものである(非特許文献27)。
チロシンキナーゼ欠損マウス血小板を使用して、ロドサイチンによるシグナル伝達におけるSykの機能的役割をさらに調べた。ロドサイチンは、マウス血小板の健常なチロシンリン酸化を惹起し、それはSykの欠損で完全に抑制される(図5A)。ロドサイチンによるシグナル伝達におけるSykの重要な役割は、Syk欠損血小板におけるVavファミリー、Vav1とVav3の二つとPLCγ2のリン酸化の完全な欠如によって示される(図5A)。さらに、ロドサイチンによる凝集と形態変化はSykの欠損で完全に抑制される(図5B)。これらの結果よりロドサイチンの血小板活性におけるSykの最も上流での役割が確認できる。
我々は、遺伝子操作マウスの血小板を使用してロドサイチンの刺激によりチロシンリン酸化が行われる複数の蛋白の役割を確立させた。ロドサイチンについては低濃度(3−10nM)と中間濃度(20−30nM)を使用して、濃度を増加させた蛇毒で抑制効果が克服できるかどうか確かめた。低濃度ロドサイチンに対する反応はPLCγ2の欠損状態では完全に消失したが、中間濃度ではわずかに形態変化が認められる。これはおそらく、低レベルのPLCγ1のためと考えられる(非特許文献17)(図6A)。LAT,SLP−76,Vav1/3の欠損状態では低濃度ロドサイチンに対する反応は大きく抑制されたが、高濃度の蛇毒に対してはほぼ凝集の完全な反応が認められた(図6B−D)。LATとPLCγ2の結果は、蛇毒コンバルキシンまたはGPVI特異的コラーゲンペプチド(CRP)をアゴニストとして使用してGPVIによる遺伝子操作マウスの刺激により得られた結果と同じであった(非特許文献17,19)。対照的に、高濃度のロドサイチンがSLP−76欠損状態で、またはVav1とVav3が併せて欠けている状態で最大限の凝集を惹起するという観察は、凝集がかなり抑制されたコンバルキシンやCRPの観察とは対照的である。これらの観察により、CLEC−2のシグナル伝達経路がコラーゲンレセプタのGPVIで使用するシグナル伝達経路と異なることが確認された。
Claims (8)
- 止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法において、
CLEC−2を発現する細胞に、テスト化合物とCLEC−2リガンドを接触させるステップと、
前記CLEC−2を発現する細胞にテスト化合物とCLEC−2リガンドを接触させた場合と、テスト化合物が存在しない環境でCLEC−2を発現する細胞にCLEC−2リガンドを接触させた場合とを比較して、前記テスト化合物の存在により、a)血小板凝集及びb)CLEC−2のチロシンリン酸化のいずれかの指標が増強されているか、または減弱されているかを検出するステップ、
とを具備し、前記a)血小板凝集及びb)CLEC−2のチロシンリン酸化のいずれかの指標の増強あるいは減弱により、テスト化合物が止血調節の治療候補であることが示される方法であって、
前記CLEC−2リガンドがロドサイチン又はCLEC−2の抗体であるスクリーニング方法。 - 前記細胞凝集が、プロテインキナーゼSykとチロシンリン酸化されたCLEC−2との結合を介した血小板凝集である、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
CLEC−2を発現する細胞に、テスト化合物を接触させるステップと、
前記CLEC−2を発現する細胞にテスト化合物に接触させる場合と、CLEC−2を発現する細胞にテスト化合物を接触させない場合とを比較して、CLEC−2機能の指標の変化を検出するステップ、
とを具備するスクリーニング方法であって、前記CLEC−2機能の指標の変化が細胞凝集の増強であることを特徴とするスクリーニング方法。 - 前記細胞が、血小板である請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 止血を調節するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
テスト化合物とCLEC−2リガンドを、CLEC−2を発現する非ヒト動物に投与するステップと、
前記テスト化合物とCLEC−2リガンドを投与されたCLEC−2を発現する非ヒト動物と、テスト化合物は投与せずに、CLEC−2リガンドのみ投与されたCLEC−2を発現する非ヒト動物とを比較して、前記テスト化合物を投与した非ヒト動物におけるCLEC−2機能の指標が増強されているか、または減弱されているかを検出するステップ、とを具備するスクリーニング方法であって、
前記CLEC−2機能の指標における減弱は、血小板凝集を減弱させることを示し、前記CLEC−2機能の指標における増強は、血小板凝集を増強させることを示すスクリーニング方法であって、
前記CLEC−2リガンドがロドサイチン又はCLEC−2の抗体であるスクリーニング方法。 - 前記非ヒト動物が、CLEC−2をコードする外因性核酸配列に遺伝子組み換えされた遺伝子組み換え非ヒト動物であり、前記CLEC−2が前記遺伝子組み換え非ヒト動物に発現する、請求項5に記載のスクリーニング方法。
- 止血を調節するための治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
テスト化合物と、CLEC−2ポリペプチドあるいは核酸フラグメントとを接触させるステップと、
前記CLEC−2の結合ドメインと前記化合物との結合を検出するステップ、
とを具備するスクリーニング方法であって、
前記CLEC−2のポリペプチドはSEQ ID NO:2の配列を含むポリペプチドであり、前記核酸フラグメントはSEQ ID NO:2をコードする核酸配列を含む核酸フラグメントであるスクリーニング方法。 - 止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
細胞質ドメインにリン酸化したチロシンを有するCLEC−2のポリペプチドあるいは核酸フラグメントと、テスト化合物とを接触させるステップと、
前記テスト化合物が、CLEC−2ポリペプチドとチロシンキナーゼSykとの結合を調節するか否か検出するステップ、
とを具備するスクリーニング方法であって、
前記CLEC−2のポリペプチドはSEQ ID NO:2の配列を含むポリペプチドであり、前記核酸フラグメントはSEQ ID NO:2をコードする核酸配列を含む核酸フラグメントであるスクリーニング方法。
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