JP2022553753A - 好中球細胞外トラップに関連する線維素溶解不全の診断方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、第1の生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固(DIC)を伴う/伴わないNETに関連する線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはその少なくとも1つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスに関する。本発明はまた、線維素溶解不全の治療の効率を決定するためのプロセスに関する。
本発明は、特に医療および獣医学の分野に適用可能である。
以下の説明では、括弧()内の参照番号は、本文の最後にある参考文献のリストを指す。
敗血症性ショックは、血行力学的機能不全、および多臓器不全症候群につながる凝固線維素溶解障害を誘発する、病原体に応答した宿主の調節不全の炎症反応を特徴とする症候群である。
血栓症に対する主要な防御線である血栓溶解は、血餅成分、主にフィブリンまたは血小板膜に結合したプラスミノーゲンの切断活性化時に生成されるプラスミンによって引き起こされる(1)。プラスミノーゲンは、N末端領域、5つのクリングル(K)ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域からなる一本鎖分子である(2)。K1およびK4には、プラスミノーゲンがフィブリンのカルボキシ末端リジン残基に確実に結合するリジン結合部位がそれぞれ含まれる(3)。したがって結合したプラスミノーゲンは、Arg561-Val562で切断され、表面および局在に依存する方法で、組織型またはウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子であるtPAおよびuPAによってそれぞれプラスミンに変換される。意図的に、tPAはフィブリンに結合すると完全に活性化されるが、uPAは膜に固定された受容体uPARに結合すると優先的に機能する。ヒト好中球エラスターゼ(HNE)のようなプロテアーゼは、プラスミンを生成せずにプラスミノーゲンを分解する(4、5)。循環中、HNEは高濃度(20~40μM)で循環するα1-プロテイナーゼ阻害剤(α1-PI、Ka=6.5x107M-1s-1)(6)によって急速に阻害される。このように形成されたHNE-α1PI複合体は、循環プラスミノーゲンのタンパク質分解を妨げる。しかし、実験的証拠は、負に帯電した膜プロテオグリカンまたは他の高分子に結合したHNEが阻害を免れ、活性を維持することを示している(7、8)。BelorgeyおよびBieth(1995,1998)(9、10)は、HNEがα1-PIによるその阻害を強く損なうDNAとの強固な複合体を形成することを証明している。HNEに対するこの保護作用に加えて、Biethのグループは、他の結合プロテアーゼに対するDNAの保護作用を完全に文書化した(11、12)。好中球細胞外トラップ(NET)の形成またはネトーシスと呼ばれるプロセスにおいて、好中球によるインタクトDNAと添加HNEとを組み合わせる、機能性足場の細胞外空間への押出しは、2004年に発見された(13)。PMA(ホルボール12-ミリステート13-アセテート)および細菌感染は、NET誘発:プロテインキナーゼCの活性化および反応性酸素種の発生の関連経路を使用する(14)。
NETは、核タンパク質(ヒストン)が結合した脱凝縮核DNA繊維であり、HNE、カテプシンGおよびミエロペルオキシダーゼなどの細胞質および顆粒プロテアーゼである(15)。HNEは最も豊富であり(NET-DNA1g当たり5.24μmol)(16)、ナノモルの親和性でDNAに結合するNETの特徴的な成分である(17)。NETはタンパク質分解的に活性であり、有用な(16)微生物の細胞外キラーとして元々記載されていた(18)。最近のデータは、NETも、自己免疫疾患、血栓症(19、20)、がん(74)などの感染性炎症性疾患と病態生理学的に関連があると示している。NETおよび凝固システムの複合作用が免疫血栓症の特徴である(20)。NETは血栓形成中に放出され、von Willebrand因子とともにフィブリン足場に統合されることが示されている(21、22)。ヒトの冠状動脈および脳血栓におけるNETの存在は、実際に実証されている(23~25)。プラスミンに対するNETのDNA-バックボーン非感受性および非線維素溶解性プラスミン-DNA-フィブリン複合体の形成は、血栓症に有利な線維素溶解性耐性の考えられる原因として示唆された(27、29)。
しかし、現在、特に感染症および非感染症において、特にネトーシスに関連する線維素溶解不全を安全かつ体系的に検出することを可能にするプロセスはない。また、特にネトーシスおよび/またはDICに関連する線維素溶解不全の、例えば生物学的サンプルからの発生を予測することを可能にするプロセスおよび/または手段もない。
DICおよび二次線維素溶解反応のいくつかの可能な生物学的マーカーが開示されている。
しかしながら、既知のマーカーは、特定の条件で、および/または複雑なデバイスおよび/もしくは方法を使用することによって検出/使用され得、ならびに/または、長すぎるか、もしくは長すぎて患者および/もしくは臨床医および/もしくは医師に有用ではない可能性がある遅延後に結果を得ることができる。
したがって、個人の生命予後を改善するため、先行技術のこれらの欠陥、欠点および障害を克服するプロセスおよび/または手段、特に、ネトーシスおよびDICに関連する線維素溶解能不全および線維素溶解不全を検出することを可能にする単純で迅速かつ効果的なプロセスを見つけることが真に必要である。
個人の生命予後を改善するため、および/または当該個人の治療費を削減するために、先行技術のこれらの欠陥、欠点および障害を克服するプロセスおよび/または手段、特に、ネトーシスおよびDICに関連する線維素溶解不全および線維素溶解不全を検出することを可能にする単純で迅速かつ効果的なプロセスを見つけることもまた真に必要である。
本発明の目的は、生物学的サンプルから、好ましくは、ネトーシスおよび/または播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全を予測および/または検出するためのプロセスであって、少なくとも1つの生物学的マーカーの濃度および/または含有量を検出および/または測定する工程を含むプロセスを提供することによって、先行技術の欠点を克服することである。
本明細書において、「生物学的マーカー」は、プラスミノーゲンまたはそのフラグメント、および/またはNETのプロテアーゼ成分、好ましくはヒト好中球エラスターゼ(HNE)を含む群から選択される少なくとも1つの生物学的マーカーを意味することを意図する。好ましくは、生物学的マーカーは、プラスミノーゲンまたはそのフラグメント、より好ましくはプラスミノーゲンおよび/またはプロテアーゼ由来のプラスミノーゲンフラグメント、より好ましくはHNE由来のプラスミノーゲンフラグメントである。
本発明によれば、特にサンプル中の当該少なくとも1つの選択された生物学的マーカーの含有量は、当業者に知られている任意の適切なプロセスによって測定することができる。
本発明によれば、特にサンプル中の当該少なくとも1つの選択された生物学的マーカーの濃度は、当業者に知られている任意の適切なプロセスによって測定することができる。
本発明によれば、当該少なくとも1つの選択された生物学的マーカーは、当業者に知られている任意の適切なプロセスによって検出され得る。
NETは血栓溶解を危うくする可能性があるので、本発明者らは、線維素溶解におけるHNE-DNA複合体の役割を調査する。本発明者らは、驚くべきことに、活性HNE-DNA複合体を含むNETの存在下で、プラスミノーゲンが、フィブリンへのプラスミノーゲン結合およびプラスミン形成を阻害するフラグメントに還元され、線維素溶解の障害をもたらすことを実証する。本発明者らは、驚くべきことに、線維素溶解不全の新しい型破りなメカニズムを誘発するHNE-DNA複合体の能力に基づいて、敗血症性ショック血栓症に対する新しい機構的洞察を実証する。
本発明者らはまた、驚くべきことに、敗血症性ショックを有する患者からの生物学的サンプルにおいてプラスミノーゲンの濃度が低下することを実証する。
本発明者らはまた、驚くべきことに、線維素溶解不全、特にネトーシスおよび播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全を有する患者からの生物学的サンプルにおいてプラスミノーゲンの濃度が低下することを実証する。
本発明者らはまた、驚くべきことに、敗血症性ショックによって誘発されるDICおよびネトーシス、DNAに結合したヒト好中球エラスターゼ(HNE)によるプラスミノーゲン分解、およびその後のプラスミン形成の失敗に苦しむ患者において実証する。
本発明者らはまた、驚くべきことに、NETが、特に敗血症性ショックに関連する播種性血管内凝固(DIC)に苦しむ患者において、プラスミノーゲン濃度、特に血漿中のプラスミノーゲン濃度の低下を誘発することを実証している。
本発明の目的は、生物学的サンプルから、好ましくはNET関連および播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。
本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、播種性血管内凝固(DIC)を伴う/伴わない異なる病状の線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。
本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固(DIC)を伴う/伴わないNETを有する病態に関連する線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはその少なくとも1つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。
本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全および線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはその任意のフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。
本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、NETまたはネトーシスに関連する病状、好ましくは敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメント、好ましくはミニプラスミノーゲン(K5-SP)の濃度を測定することを含む、プロセスである。
本発明の目的はまた、好ましくは生物学的サンプルからの線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、感染性および/または非感染性疾患を有する患者におけるプラスミノーゲンおよびそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。
本発明の目的はまた、生物学的サンプルからネトーシスに関連する病状を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよびそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。
本明細書において、「ネトーシス」は好中球死のプロセスであるのに対し、NETは特に核タンパク質および活性酵素が結合したDNA繊維、優先的にはDNA-HNE複合体を指す。
本明細書において、「NETのプロテアーゼ成分」は、NETのDNA繊維に結合した活性酵素を意味する。
本明細書において、「プロテアーゼ由来のプラスミノーゲンフラグメント」は、当業者から知られている任意のプラスミノーゲンフラグメントを意味する。
本明細書において、「線維素溶解不全」は、線維素溶解プロセスにおける任意の障害および/または欠乏を意味する。それは、例えば、線維素溶解因子、例えば、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター[tPA]、ウロキナーゼ[uPA]、ならびに阻害剤PAI-1およびa2-アンチプラスミンを含む可能性のある任意の欠乏であり得る。好ましくは、それは、好中球細胞外トラップ(NET)放出、および/または播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全を意味する。
本明細書において、「播種性血管内凝固」(DIC)は、凝固の全身的活性化を特徴とする状態を意味し、Bloodに開示されているように、中小血管の血栓性閉塞を引き起こし、それによって臓器機能障害に寄与する可能性がある。
本明細書において、「NETまたはネトーシスに関連する病理」は、NETまたはネトーシスを含む当業者から知られている任意の病理を意味する。それは、例えば、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および/または自己免疫疾患であり得る。特に、敗血症-DICに関連するNET、急性心筋梗塞またはステント血栓症に関連するNET、虚血性脳卒中血栓に関連するNET、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患に関連するNET、または***もしくは肺に関連するNETまたは膵臓がんであり得る。
本明細書において、「プラスミノーゲン」は、N末端領域、5つのクリングル(K)ドメイン(K1からK5)およびセリンプロテアーゼ(SP)領域からなる一本鎖分子である92kDaタンパク質を意味する(2)。K1およびK4には、それぞれリジン結合部位が含まれている。言い換えれば、「プラスミノーゲン」は、N末端領域、5つのクリングル(K)ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域からなる92kDaの一本鎖プロ酵素を意味することを意図している。例えば、Xue Y et al(2)および
/またはLaw et al.Cell Reports|Volume 1,ISSUE 3,P185-190,March 29,2012(75)によって説明されているプラスミノーゲンであり得る。これは、アミノ酸配列EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN(配列番号1)のタンパク質であり得る。
/またはLaw et al.Cell Reports|Volume 1,ISSUE 3,P185-190,March 29,2012(75)によって説明されているプラスミノーゲンであり得る。これは、アミノ酸配列EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN(配列番号1)のタンパク質であり得る。
本明細書において、「プラスミノーゲンフラグメント」は、当業者から知られているプラスミノーゲンの任意のフラグメントを意味する。例えば、それは、プラスミノーゲンの任意のドメインを含むプラスミノーゲンのフラグメントであり得、プラスミノーゲンの任意のドメインは、例えばクリングル(K)1~5のドメイン、例えば配列CKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQC(配列番号10)のペプチド、またはセリンプロテアーゼドメイン(SP)、例えば、配列VVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR(配列番号11)のペプチドを含むセリンプロテアーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、K1+K2+K3からなるフラグメント、例えば配列CKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHC
SGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSC(配列番号7)のペプチド、または配列番号7の配列のペプチドを含むフラグメント、K1+K2+K3+K4からなるフラグメント、例えば配列CKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKC(配列番号6)のペプチド、または配列番号6の配列のペプチドを含むフラグメント、または例えば単一のK4からなるフラグメント、例えば、配列CYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKC(配列番号12)のペプチド、または単一のK4を含むフラグメント、例えばVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVV(配列番号5)である。それは、例えば、ミニプラスミノーゲンとも呼ばれるK5およびSPドメインからなるフラグメント(K5-SP)であり得、例えば、配列CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR(配列番号8)のペプチド、もしくは配列番号8のペプチドを含むフラグメント、および/または活性プロテアーゼ-DNA複合体、好ましくはNETのHNE-DNA複合体で得られるプラスミノーゲンの任意のフラグメントである。
SGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSC(配列番号7)のペプチド、または配列番号7の配列のペプチドを含むフラグメント、K1+K2+K3+K4からなるフラグメント、例えば配列CKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKC(配列番号6)のペプチド、または配列番号6の配列のペプチドを含むフラグメント、または例えば単一のK4からなるフラグメント、例えば、配列CYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKC(配列番号12)のペプチド、または単一のK4を含むフラグメント、例えばVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVV(配列番号5)である。それは、例えば、ミニプラスミノーゲンとも呼ばれるK5およびSPドメインからなるフラグメント(K5-SP)であり得、例えば、配列CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR(配列番号8)のペプチド、もしくは配列番号8のペプチドを含むフラグメント、および/または活性プロテアーゼ-DNA複合体、好ましくはNETのHNE-DNA複合体で得られるプラスミノーゲンの任意のフラグメントである。
本明細書において、「HNE由来プラスミノーゲンフラグメント」は、クリングル1~3ドメイン(K1+2+3)、クリングル1~4ドメイン(K1+2+3+4)ならびに/またはミニプラスミノーゲンとも呼ばれるクリングル5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域(K5-SP)を含むフラグメントの群から選択されるプラスミノーゲンのフラグメントを意味する。例えば、クリングル1~3ドメイン(K1+2+3)を含むプラスミノーゲンのフラグメントは、例えば配列番号7の配列のペプチドを含むペプチドであり得、例えば配列LFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPV(配列番号2)のペプチド、および/または配列LFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPV(配列番号9)のペプチドであり、クリングル1~4ドメイン(K1+2+3+4)を含むプラスミノーゲンのフラグメントは、例えば配列番号6の配列のペプチドを含むペプチドであり得、例えば配列LFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVV(配列番号3)のペプチドであり、ミニプラスミノーゲンとも呼ばれるドメインK5およびセリンプロテアーゼ(SP)領域(K5-SP)を含むプラスミノーゲンのフラグメントは、例えば、配列番号8の配列のペプチドを含むペプチドであり得、例えば配列APPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN(配列番号4)のペプチドである。
本明細書において、「細胞質および顆粒状の活性プロテアーゼ」は、カテプシンG、ミエロペルオキシダーゼまたはエラスターゼを意味する。
本明細書において、「ヒト好中球エラスターゼ」(HNE)とは、好中球エラスターゼ(EC3.4.21.37)、白血球エラスターゼを意味する。HNEは、他の白血球顆粒関連プロテアーゼ、例えばプロテイナーゼ3およびカテプシンと同じファミリーのトリプシン/キモトリプシン型セリンプロテイナーゼである。
本明細書において、「DNA結合タンパク質」は、ヒストン、優先的にはシトルリン化されたヒストン、フィブロネクチン、およびフォンウィルブランド因子を意味する。
本明細書において、「生物学的サンプル」は、哺乳動物、例えば、単孔目、オポッサム目、ケノレステス目、ミクロビオテリウム目、フクロモグラ形目、フクロネコ目、バンディクート目、双前歯目、管歯目、ジュゴン目、アフリカトガリネズミ目、ハネジネズミ目、イワダヌキ目、長鼻目、被甲目、例えばアルマジロ、有毛目、登木目、皮翼目、霊長目、齧歯目、ウサギ目、ハリネズミ形目、例えばハリネズミ、トガリネズミ目、翼手目、有鱗目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目、およびクジラ目の目を含む群から選択される哺乳動物から得られた任意のサンプルを意味する意図である。それは、例えば、ヒトまたは動物であり得る。それは、例えば、家畜、ペット、絶滅危惧種、またはその他の動物であり得る。
本発明によれば、生物学的サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、または任意の生物学的流体であり得る。それは、例えば、血液、血漿、尿、涙または組織抽出物を含む群から選択される生物学的サンプルであり得る。好ましくは、生物学的サンプルは、血液サンプルまたは血漿サンプル、より好ましくは血漿サンプルであり得る、それはまた、インビトロで培養細胞から得られた培養上清であり得る。
本発明によれば、生物学的サンプルは、敗血症性ショックまたは敗血症性ショックもしくは他の非感染性炎症プロセスのリスクを有する哺乳動物に由来し得る。
本発明によれば、プラスミノーゲンの濃度は、当業者から知られている任意の方法および/またはプロセスによって決定/測定することができる。それは、例えば“Criteria for specific measurement of plasminogen(enzymatic;procedure)in human plasma,” eJIFCC,vol 12 No 2,2000(77)、またはS.,et al.“Reciprocal coupling of coagulation and innate immunity via neutrophil serine proteases”に開示されるように、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼ、またはストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体のいずれかを用いる抗原または機能アッセイによって測定される濃度であり得る。Nat Med 16,887-896(45)。プラスミノーゲンの濃度はまた、その潜在的な線維素溶解活性を、免疫アッセイによって、細胞免疫アッセイによって、またはフローサイトメトリーによって測定することを含むプロセスで決定/測定され得る。
例えば、プラスミノーゲンの濃度が免疫アッセイによって測定される場合、免疫アッセイは循環プラスミノーゲンを検出することを可能にし、プラスミノーゲンの濃度が細胞免疫アッセイによって測定される場合、細胞免疫アッセイはフローサイトメトリーを使用して細胞表面上のプラスミノーゲンを検出し得る。それは、例えば、Rife U,Milgrom F,Shulman S.Antigenic analysis of plasminogen and plasmin.Blood 1963,212,322 Okamoto A et al.Population based distribution of plasminogen J Thromb Haemost 2003,1,2397(83)に開示されているような免疫アッセイであり得る。
例えば、プラスミノーゲンの濃度が流れによって測定されるとき、それは、細胞表面特異的プラスミノーゲン結合を同定するためにプラスミノーゲン結合を決定することを可能にし得る。
例えば、プラスミノーゲンの濃度は、比色法、例えば、活性化因子としてストレプトキナーゼを使用する比色法、例えば、市販のキット、例えば、Hyphen Biomedによって商品化されたBIOPHEN Plasminogen(LRT)Ref 221511、例えば、ChromogenixによるCOAMATIC(登録商標)Plasminogen Ref 82 2452 63、例えばSTAGOによるStachrom Plasminogen 00658によって測定され得る。例えば、プラスミノーゲンの濃度がBIOPHEN Plasminogen(LRT)Ref 221511で測定される場合、参照または正常範囲は70~130%である。例えば、プラスミノーゲンの濃度がCOAMATIC(登録商標)Plasminogen Ref 82 2452 63で測定される場合、参照または正常範囲は80~120%である。例えば、プラスミノーゲンの濃度がStachrom Plasminogen 00658で測定される場合、参照または正常範囲は80~120%である。
例えば、プラスミノーゲンの濃度は、免疫アッセイによって、例えば、市販のキットを使用して測定することができる。例えば、市販のキットは、免疫アッセイ、例えばTechnocloneによるTechnozym(登録商標)Glu-Plasminogen ELISA Kit Ref TC12040によってプラスミノーゲンを測定する(正常Glu-プラスミノーゲン値は60~250μg/mlの範囲である)。例えば、AbcamによるHuman Plasminogen ELISA Kit(PLG)Ref ab108893。例えば、プラスミノーゲンの濃度をHuman Plasminogen ELISA Kit(PLG)で測定する場合、血漿中のプラスミノーゲンの濃度の参照または通常の範囲は70~135μg/mLである。
例えば、プラスミノーゲンは、例えばポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体による、例えば市販のポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体による、例えば、細胞表面上のプラスミノーゲンを検出するためのフローサイトメトリーのための、測定/検出され得る抗原アッセイであり得る。それは、例えば、Invitrogenによる参照番号PA5-14196および/またはAbcamによるab154560で商品化された抗体であり得る。
本発明によれば、プラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、当業者から知られている任意の方法および/またはプロセスによって測定することができる。それは、例えば、質量分析を使用するプロテオミクス分析によって、またはモノクローナル抗体を使用する抗原アッセイによって、または方法の任意の組み合わせによって測定される濃度であり得る。例えば、アンギオスタチン様とも呼ばれるクリングル1~4を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、LIjnen et al.2001“Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Specific Detection of Angiostatin-Like Plasminogen Moieties in Biological Samples” Thromb Res 2001 102(1),53-9(76)によって開示されるように、免疫アッセイによって測定され得る。単一のK4、K1-K2-K3、K1-K2-K3-K4またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むプラスミノーゲンフラグメントは、好ましくは、例えば特定の抗体を使用するウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって定性的に検出され得る。それは、例えば、M Sten-Linder et al.“Angiostatin Fragments in Urine From Patients With Malignant Disease” Anticancer Res 1999;19;3409-14(78)、またはY Takada“Potential Role of Kringle-Integrin Interaction in Plasmin and uPA” Actions Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2012,Article ID 136302,8 pages doi:10.1155/2012/136302、またはZ Zhang “Plasminogen Kringle 5 Inhibits Alkali-Burn-Induced Corneal Investigative”Ophthalmology & Visual Science November 2005,Vol.46,4062-4071.doi:https://doi.org/10.1167/iovs.04-1330-(80)に開示されているプロセスであり得る。
例えば、アンギオスタチン様とも呼ばれるクリングル1~4を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度が、がん患者からの例えば腫瘍液において免疫アッセイによって測定される場合、プロセスは、例えば、サンプル中、好ましくは希釈サンプル中の、例えば免疫吸着による他のプラスミノーゲン部分の除去ステップを含み得る。
本発明によれば、HNE由来のプラスミノーゲンフラグメントの濃度は、当業者から知られている任意の方法および/またはプロセスによって測定することができる。それは、例えば、モノクローナル抗体を使用する抗原アッセイによって測定される濃度であり得る。例えば、HNE由来のプラスミノーゲンフラグメントの濃度は、例えば、LIjnen et al.2001(76)によって開示されるように、免疫アッセイによって測定され得る。単一のK4、K1-K2-K3、K1-K2-K3-K4またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むHNE由来のプラスミノーゲンフラグメントは、好ましくは、例えば特定の抗体を使用するウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって定性的に検出され得る。それは、例えば、Rouy D et al.“Apolipoprotein(a)and Plasminogen Interactions With Fibrin:A Study With Recombinant Apolipoprotein(a)and Isolated Plasminogen Fragments” Biochemistry1992;31;6333(56)、またはBarbosa da Cruz D et al“DNA-bound Elastase of Neutrophil Extracellular Traps Degrades Plasminogen,Reduces Plasmin Formation,and Decreases Fibrinolysis:Proof of Concept in Septic Shock Plasma” FASEB J 20189,33,14270(81)に開示されているようなプロセスであり得る。HNEフラグメントの濃度および品質は、免疫抗原法と、フラグメントのアミノ酸配列のサイズまたは決定を測定する他の方法とを組み合わせることによって、例えば、プロテオミクス分析のために組み合わせたものなど、質量分析によって、測定および評価することもできる。例えば、例えば、Constantinescu et al.“Amorphous protein aggregates stimulate plasminogen activation, leading to release of cytotoxic fragments that are clients for extracellular chaperones.” J.Biol.Chem.(2017)292(35)14425-14437(82)に開示されているように、HNE由来のプラスミノーゲンフラグメントの濃度をフローサイトメトリーで測定して、プラスミン生成タンパク質フラグメントの細胞への結合を検出することができる。
例えば、HNE由来プラスミノーゲンフラグメントの濃度が、例えばがん患者からの腫瘍液において免疫アッセイによって測定される場合、プロセスは、例えばサンプル中、好ましくは希釈されたサンプル中の、例えば免疫吸着による他のプラスミノーゲン部分の除去ステップを含み得る。
本発明によれば、クリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度の決定/測定は、当業者から知られている任意の適合された方法によって実施され得る。それは、例えば、抗原アッセイによるものであり得る。例えば、クリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、Lijnen et al 2001 Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Specific
Detection of Angiostatin-Like Plasminogen Moieties in Biological Samples Thromb
Res 2001 102(1),53-9(76)によって開示されているような免疫アッセイによって測定され得る。
Detection of Angiostatin-Like Plasminogen Moieties in Biological Samples Thromb
Res 2001 102(1),53-9(76)によって開示されているような免疫アッセイによって測定され得る。
本発明によれば、ミニプラスミノーゲン(K5-SP)またはクリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃
度の決定/測定は、当業者から知られている任意の適合された方法によって実施され得る。それは、例えば、抗原アッセイによるものであり得る。例えば、タンパク質分離と、質量分析によるプロテオミクス分析との組み合わせを使用する。例えば、クリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、Moroz et al.1986 “Mini-plasminogen-likfer agments of plasminogen in synovial fluid in acute inflammatory arthritis Thromb Res 1986,43,417(5)に開示されているような免疫アッセイによって測定され得る。
度の決定/測定は、当業者から知られている任意の適合された方法によって実施され得る。それは、例えば、抗原アッセイによるものであり得る。例えば、タンパク質分離と、質量分析によるプロテオミクス分析との組み合わせを使用する。例えば、クリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、Moroz et al.1986 “Mini-plasminogen-likfer agments of plasminogen in synovial fluid in acute inflammatory arthritis Thromb Res 1986,43,417(5)に開示されているような免疫アッセイによって測定され得る。
本発明によれば、検出プロセスはまた、プラスミノーゲンの測定された濃度を参照値と比較するステップを含み得る。それは、例えば、参照健康集団の値または区間の通常95%を表し、好ましくは、例えば、The Clinical & Laboratory Standards Institute(CLSI)によって開示されるように、統計分析によって決定される、参照値または参照区間であり得る。
本発明によれば、プラスミノーゲンの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定されたプラスミノーゲンの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、プラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプールで測定されたプラスミノーゲンの濃度であり得る。プラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義される内部標準であり得る。プラスミノーゲンの参照濃度値は、例えば、1~2μmol/Lの濃度、好ましくは1.5~2μmol/Lの全長プラスミノーゲンの濃度であり得る。
本発明によれば、プラスミノーゲンのフラグメントの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定されたプラスミノーゲンのフラグメントの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、プラスミノーゲンのフラグメントの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプールおよび/または健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義される内部標準において測定されたプラスミノーゲンのフラグメントの濃度であり得る。
本発明によれば、クリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定されたクリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、クリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプールおよび/または健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義された内部標準で測定された、クリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度であり得る。
本発明によれば、クリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定された、クリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域もしくはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、クリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプール、または健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義される内部標準で測定された、クリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域またはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度であり得る。
本明細書において、「参照の健康な対象」または「健康な対象」は、上で定義されたように、線維素溶解不全および播種性血管内凝固を引き起こす可能性のある身体に、感染、ショック、出血、敗血症性ショックおよび/または任意の他の攻撃を受けていない哺乳動物、例えばヒトを意味することを意図している。それは、例えば、NETまたはネトーシスに関連する感染性または非感染性の病状、例えば、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および上記で定義される自己免疫疾患に罹患していないヒトであり得る。
本発明によれば、「参照の対象のグループ」または「参照の健康な対象のグループ」は、信頼できる参照値または信頼できる参照区間を定義することを可能にするグループを意味することを意図している。それは、例えば、上記で定義された少なくとも2つの、例えば、少なくとも10、少なくとも40、少なくとも60、少なくとも100の参照の対照または健康な対象を含むグループであり得る。それは、例えば、30~500人の対象、40~200人、45~110人の参照の対象または健康な対象を含むグループであり得る。
有利なことに、本発明者らは、プラスミノーゲンの測定濃度が参照値または区間よりも低い場合、本発明によるプロセスが、線維素溶解不全を伴う播種性血管内凝固を検出および/または予測することを可能にすることを実証している。
有利なことに、本発明者らはまた、プラスミノーゲンフラグメントの含有量/濃度が参照値または間隔よりも大きい場合、本発明によるプロセスが、線維素溶解および/または線維素溶解不全、特に播種性血管内凝固における線維素溶解不全の阻害を検出および/または予測することを可能にすることを実証している。
有利なことに、本発明の発明者はまた、プラスミノーゲンおよび/またはその少なくとも1つのフラグメントの濃度を測定することを含む、線維素溶解不全を検出するためのプロセスが、線維素溶解不全の検出を可能にすることを実証している。
有利なことに、本発明者らは、プラスミノーゲンのフラグメント、好ましくはミニプラスミノーゲン(K5-SP)が血漿中で検出される場合、特に本発明によるプロセスが、NET、例えば、第1の生物学的サンプルからおまたはネトーシスに関連する敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患を伴う病状を検出および/または予測することを可能にすることを実証している。
有利なことに、本発明の発明者はまた、プラスミノーゲンおよび/またはその少なくとも1つのフラグメントの濃度を測定することを含む線維素溶解不全を検出するためのプロセスが、NETに関連する病状の検出を可能にすることを実証している。
本発明の目的はまた、DICに関連する線維素溶解不全および/またはNETに関連する病状、好ましくは敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患、および/またはネトーシスに関連する病状、の治療の有効性を決定するためのインビトロのプロセスであって、
a.化合物で治療する前の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメントの濃度C1の決定および/または測定と、
b.当該化合物で治療した後の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび/また
はそのフラグメントの濃度C2の決定および/または測定と、任意選択で
c.濃度の比較および以下の式によるスコア(S)の計算と、を含み、
S=C2/C1、である、プロセスである。
a.化合物で治療する前の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメントの濃度C1の決定および/または測定と、
b.当該化合物で治療した後の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび/また
はそのフラグメントの濃度C2の決定および/または測定と、任意選択で
c.濃度の比較および以下の式によるスコア(S)の計算と、を含み、
S=C2/C1、である、プロセスである。
本発明によれば、生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、治療前の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、治療前の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、プラスミノーゲンおよび/またはフラグメントの濃度の決定および/または測定は、上記で定義/記載された任意の方法/プロセスによって実施することができる。
本発明によれば、プラスミノーゲンのフラグメントは、上記で定義/記載された任意のプラスミノーゲンフラグメントであり得る。
本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンである場合、治療は、比較ステップから得られたSの値が1より大きいときに有効である。
本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンフラグメントである場合、治療は、比較ステップから得られたSの値が1未満であるときに有効である。
本発明によれば、DICに関連する線維素溶解不全および/またはNETに関連する病状、好ましくは敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がんおよび自己免疫疾患、およびネトーシスに関連する病状、の化合物による治療の有効性を決定するためのインビトロのプロセスであって、
a.化合物で治療する前の第1の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンの濃度C1の決定および/または測定と、
b.化合物で治療する前の第2の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンフラグメントの濃度C1Fの決定および/または測定と、
c.当該化合物で治療した後の第3の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンの濃度C2の決定および/または測定と、
d.当該化合物で治療した後の第4の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンフラグメントの濃度C2Fの決定および/または測定と、任意選択で
e。濃度の比較および次の式によるスコア(S)および(SF)の計算と、を含み、
S=C2/C1、
SF=C2F/C1Fである、プロセスである。
a.化合物で治療する前の第1の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンの濃度C1の決定および/または測定と、
b.化合物で治療する前の第2の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンフラグメントの濃度C1Fの決定および/または測定と、
c.当該化合物で治療した後の第3の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンの濃度C2の決定および/または測定と、
d.当該化合物で治療した後の第4の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンフラグメントの濃度C2Fの決定および/または測定と、任意選択で
e。濃度の比較および次の式によるスコア(S)および(SF)の計算と、を含み、
S=C2/C1、
SF=C2F/C1Fである、プロセスである。
本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンである場合、治療は、比較ステップから得られたSの値が1より大きいときに有効である。
本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンフラグメントである場合、治療は、比較ステップから得られたSFの値が1未満であるときに有効である。
本発明によれば、治療前の第1の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、治療前の第2の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、治療前の第2の生物学的サンプルは、治療前の第1の生物学的サンプルと同一でもまたは異なっていてもよい。
本発明によれば、処理前の第1および第2の生物学的サンプルは、同じサンプルであり得る。
本発明によれば、処理後の第3の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、処理後の第4の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。
本発明によれば、処理後の第3の生物学的サンプルは、処理後の第4の生物学的サンプルと同一でもまたは異なっていてもよい。
本発明によれば、処理後の第3および第4の生物学的サンプルは、同じサンプルであり得る。
本明細書において、「化合物による治療」は、医療、例えば、アロパシーな治療を意味し、分子、例えば、化学分子、例えば、有機合成によって得られた分子、生物学的起源の分子、例えば、タンパク質、生物、例えば哺乳動物、微生物、植物からのおよび/もしくは生物によって合成された分子;または任意の他の非化学的処置;または操作されたかどうかにかかわらず、上記の分子、例えばナノベシクルを送達する、例えば天然のプラスミノーゲンを運ぶ、任意の他のデバイス、の摂取を含む。
本発明者らは、驚くべきことに、敗血症性ショック誘発性DICを有する患者の血漿サンプルへのプラスミノーゲンの供給が、プラスミン形成および線維素溶解を回復することを可能にすることを実証している。
本発明の目的は、線維素溶解不全、特に、ネトーシスおよび/または播種性血管内凝固(DIC)を有する患者における低プラスミノーゲン濃度によって誘発される線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための天然および/または組換えプラスミノーゲンである。
また、本発明の目的は、好ましくは播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全の治療における薬剤として使用するためのプラスミノーゲンを含む医薬組成物である。
本発明の目的はまた、線維素溶解不全、好ましくは、ネトーシスおよび/または播種性血管内凝固(DIC)を有する患者における低プラスミノーゲン濃度によって誘発される線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための天然および/または組換えプラスミノーゲンを含む医薬組成物である。
本発明の別の目的は、播種性血管内凝固(DIC)、例えば、特に敗血症性ショック誘発性DICを有する患者における中等度/重度のプラスミノーゲン消費/欠乏に関連するDICの治療における薬物として使用するための、天然および/または組換えのプラスミノーゲンである。
本発明の目的は、播種性血管内凝固(DIC)、例えば、特に敗血症性ショックおよびDICの患者における、中等度/重度のプラスミノーゲン消費/欠乏に関連するDICの治療における薬剤として使用するための、天然および/または組換えのプラスミノーゲンを含む医薬組成物である。
本明細書では、「治療」、「治療する」、「治療された」または「治療すること」という用語は、予防および/または治療を指し、特に、その目的が、望ましくない生理学的変化または障害、例えば播種性血管内凝固の発症および/または進行を予防または減速(軽減)することである。有益なまたは望ましい臨床結果には、臓器不全の改善、病状の安定化(すなわち、悪化しない)、病状進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および治癒(部分的または全体的)が含まれるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に期待される生存および/または生活の質と比較して、生存の延長および/または生活の質の向上を意味し得る。
「対象」または「患者」には、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、疾患または障害を有すると診断された、またはリスクがあると決定された哺乳動物などの、疾患または障害の治療を必要とする哺乳動物が含まれる。
医薬組成物は、ヒトまたは動物に投与され得る任意の形態であり得る。
医薬組成物は、プラスミノーゲン、例えば、天然および/または組換えプラスミノーゲンを含み得る。例えば、それは、対象の6.6mg/kgの濃度のGlu-プラスミノーゲンであり得る。
これは、例えば、直接に、すなわち、純粋もしくは実質的に純粋に、またはプラスミノーゲンもしくはそのフラグメントを薬学的に許容される担体および/もしくは媒体と混合した後に実行され得る。本発明によれば、医薬組成物は、シロップまたは注射可能な溶液であり得る。例えば、医薬組成物が注射可能な溶液である場合、それは、10から30分の静脈内注入として注射および/または投与され得る。
本発明によれば、プラスミノーゲンを含む医薬組成物は、毎日、2日毎、3日毎に投与することができる。当業者は、その技術的知識を考慮して、プラスミノーゲンを含む医薬組成物の投与頻度を適応させるだろう。
本発明によれば、線維素溶解不全がネトーシスに関連する場合、医薬組成物は、涙滴または外用に適合された任意の調製物であり得る。
本発明によれば、医薬組成物は、液体配合物、経口発泡性剤形、経口粉末、多粒子系、口腔内分散性剤形を含む群から選択される経口投与用医組成物であり得る。例えば、医薬組成物が経口投与用である場合、それは、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液および経口液滴を含む群から選択される液体製剤の形態であり得る。医薬組成物が経口発泡性剤形の形態である場合、それは、錠剤、顆粒、および粉末を含む群から選択される形態であり得る。医薬組成物が経口粉末または多粒子系の形態である場合、それは、ビーズ、顆粒、ミニ錠剤およびマイクロ顆粒を含む群から選択される形態であり得る。医薬組成物が口腔内分散性剤形の形態である場合、それは、口腔内分散性錠剤、凍結乾燥ウエハー、薄膜、チュアブル錠剤、錠剤およびカプセル、医療用チューインガムを含む群から選択される形態であり得る。本発明によれば、医薬組成物は、頬側および舌下経路用であり得、例えば、頬側または舌下錠、粘液接着剤調製物、トローチ剤、口腔粘膜滴およびスプレーを含む群から選択され得る。
本発明によれば、線維素溶解不全がネトーシスに関連する場合、医薬組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、パッチおよびフォームを含む群から選択される局所経皮投与用であり得る。
本発明によれば、医薬組成物は、例えば、点鼻液、鼻内噴霧薬、点鼻粉末を含む群から選択される、経鼻投与用に処方することができる。本発明によれば、医薬品は、直腸投与用に処方することができ、例えば、坐剤または硬ゼラチンカプセルであり得る。本発明によれば、医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内投与用であり得る。当業者は、本明細書で使用される「形態」という用語が、その実際の使用のための製剤を指すことを明確に理解している。
薬学的に許容される担体は、対象に応じて、天然または組換えプラスミノーゲンの投与に使用される任意の公知の薬学的担体であり得る。例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤には、任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料/着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤または乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。
医薬組成物の形態は、治療されるヒトまたは動物に関して選択され得る。
別の態様では、本発明は、DIC、特に敗血症性ショック中のDICに罹患している対象を治療する方法を提供する。この方法は、当該対象に天然および/または組換えプラスミノーゲンを投与するステップを含み得る。
天然または組換えプラスミノーゲン、ならびに使用可能な製剤は、上記で定義されたとおりである。投与は、当業者に知られ、天然および/または組換えプラスミノーゲンを投与するのに有用な任意の医薬的方法を使用することによって行うことができ、好ましくは、投与は非経口投与、好ましくは静脈内投与である。投与可能な形態の薬剤/薬物の例を上に示した。
他の利点はなお、例示として与えられた添付の図によって示される以下の実施例を閲読することによって、当業者には明らかであり得る。
例1:プラスミノーゲンの濃度の決定およびDICの検出。
敗血症性ショックにおける血小板および好中球の活性化は、好中球細胞外トラップ(NET)を伴うフィブリンの複雑な足場を含む微小血管血餅の形成をもたらす。NETには、内因性線維素溶解に影響を与える可能性のある複数の成分が含まれているため、微小循環内の血餅の溶解に失敗し、全身性微小血栓症を残す。フィブリン-NETマトリックスは、好中球をフィブリン表面に播種して活性化することによって調製し、モニターしたプラスミノーゲンの活性化または分解を構築した。HNE-DNA複合体のエラスターゼ活性が血漿アンチプロテアーゼによる阻害から保護され、プラスミノーゲンを分解するその能力を維持することを示す。質量分析プロテオミクス分析を使用して、クリングル(K)ドメイン(K1+2+3、k1+2+3+4)およびセリンプロテアーゼ(SP)領域(K5-SP)で構成されるプラスミノーゲンフラグメントを同定した。本発明者らはさらに、播種性血管内凝固を伴う敗血症性ショック患者が、循環するHNE-DNA複合体、HNE由来のプラスミノーゲンフラグメント、低いプラスミノーゲン濃度、およびフィブリン上にプラスミンを生成する能力の低下を有することを実証する。本発明者らは、活性HNE-DNA複合体を有するNETがプラスミノーゲンをフラグメントに還元し、したがって局所プラスミノーゲン濃度、フィブリンへのプラスミノーゲン結合および局所プラスミン形成を減少させることにより線維素溶解を損なうことを実証する。したがって、NET上のヒト好中球エラスターゼ(HNE)のリザーバーは、プラスミノーゲンタンパク質分解経路を介して線維素溶解メカニズムを直接妨害する。
敗血症性ショックにおける血小板および好中球の活性化は、好中球細胞外トラップ(NET)を伴うフィブリンの複雑な足場を含む微小血管血餅の形成をもたらす。NETには、内因性線維素溶解に影響を与える可能性のある複数の成分が含まれているため、微小循環内の血餅の溶解に失敗し、全身性微小血栓症を残す。フィブリン-NETマトリックスは、好中球をフィブリン表面に播種して活性化することによって調製し、モニターしたプラスミノーゲンの活性化または分解を構築した。HNE-DNA複合体のエラスターゼ活性が血漿アンチプロテアーゼによる阻害から保護され、プラスミノーゲンを分解するその能力を維持することを示す。質量分析プロテオミクス分析を使用して、クリングル(K)ドメイン(K1+2+3、k1+2+3+4)およびセリンプロテアーゼ(SP)領域(K5-SP)で構成されるプラスミノーゲンフラグメントを同定した。本発明者らはさらに、播種性血管内凝固を伴う敗血症性ショック患者が、循環するHNE-DNA複合体、HNE由来のプラスミノーゲンフラグメント、低いプラスミノーゲン濃度、およびフィブリン上にプラスミンを生成する能力の低下を有することを実証する。本発明者らは、活性HNE-DNA複合体を有するNETがプラスミノーゲンをフラグメントに還元し、したがって局所プラスミノーゲン濃度、フィブリンへのプラスミノーゲン結合および局所プラスミン形成を減少させることにより線維素溶解を損なうことを実証する。したがって、NET上のヒト好中球エラスターゼ(HNE)のリザーバーは、プラスミノーゲンタンパク質分解経路を介して線維素溶解メカニズムを直接妨害する。
材料および方法
略語:
ABTS、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)
AEBSF、アミノエチル-ベンゼン-スルホニルフルオリド
α1-PI、α1-プロテイナーゼ阻害剤
DIC、播種性血管内凝固
HBSS、ハンクの平衡塩類溶液(HBSS)
HNE、ヒト好中球エラスターゼ
K、プラスミノーゲンのクリングルドメイン
NET、好中球細胞外トラップ
MeO-Suc-AAPV-CMK、N-(メトキシスクシニル)-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-バリンクロロメチルケトン
MeO-Suc-AAPV-pNA、N-(メトキシスクシニル)-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-バリンp-ニトロアニリン
MM-H-Pro-Arg-pNA、メチル(マロニル)ヒドロキシプロリルアルギニン-p-ニトロアニリン、CBS0065
NET、好中球細胞外トラップ
PMA、ホルボール12-ミリステート13-アセテート
PMN、多形核白血球
PMSF、フェニルメチルスルホニルフルオリド
tPA、組織プラスミノーゲン活性化因子
uPA、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター
uPAR、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体
略語:
ABTS、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)
AEBSF、アミノエチル-ベンゼン-スルホニルフルオリド
α1-PI、α1-プロテイナーゼ阻害剤
DIC、播種性血管内凝固
HBSS、ハンクの平衡塩類溶液(HBSS)
HNE、ヒト好中球エラスターゼ
K、プラスミノーゲンのクリングルドメイン
NET、好中球細胞外トラップ
MeO-Suc-AAPV-CMK、N-(メトキシスクシニル)-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-バリンクロロメチルケトン
MeO-Suc-AAPV-pNA、N-(メトキシスクシニル)-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-バリンp-ニトロアニリン
MM-H-Pro-Arg-pNA、メチル(マロニル)ヒドロキシプロリルアルギニン-p-ニトロアニリン、CBS0065
NET、好中球細胞外トラップ
PMA、ホルボール12-ミリステート13-アセテート
PMN、多形核白血球
PMSF、フェニルメチルスルホニルフルオリド
tPA、組織プラスミノーゲン活性化因子
uPA、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター
uPAR、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体
敗血症性ショック患者および健康な対象からの血漿
多臓器不全を伴う敗血症性ショック(平均Sequential Organ Failure Assessment SOFAスコア13±2)(30)と言われ、Japanese Association for Acute Medicine JAAM 2016スコア(31)に入院後最初の24時間に診断された播種性血管内凝固(DIC)を示す、7人の患者(平均年齢74.5±10歳)、および10人の健康な個体を登録した(Trial Registration:Clinicaltrial.gov identifier NCT #02391792)。Strasbourg University Hospital Ethics Committeeは、この研究を承認した。インフォームドコンセントは入院時に患者または親戚から得られ、できるだけ早く患者によって確認された。血小板を含まない血漿を、0.13Mクエン酸ナトリウム(Vacutainer(商標)、Becton Dickinson)に二重遠心分離ステップ(2500gで15分間)によって収集された血液から調製し、分注し、すぐに-80℃で凍結した。定期的な止血研究、およびHNE-α1PIとプラスミン-α2-アンチプラスミンとの複合体の検出は、ヒト血漿で評価した。
多臓器不全を伴う敗血症性ショック(平均Sequential Organ Failure Assessment SOFAスコア13±2)(30)と言われ、Japanese Association for Acute Medicine JAAM 2016スコア(31)に入院後最初の24時間に診断された播種性血管内凝固(DIC)を示す、7人の患者(平均年齢74.5±10歳)、および10人の健康な個体を登録した(Trial Registration:Clinicaltrial.gov identifier NCT #02391792)。Strasbourg University Hospital Ethics Committeeは、この研究を承認した。インフォームドコンセントは入院時に患者または親戚から得られ、できるだけ早く患者によって確認された。血小板を含まない血漿を、0.13Mクエン酸ナトリウム(Vacutainer(商標)、Becton Dickinson)に二重遠心分離ステップ(2500gで15分間)によって収集された血液から調製し、分注し、すぐに-80℃で凍結した。定期的な止血研究、およびHNE-α1PIとプラスミン-α2-アンチプラスミンとの複合体の検出は、ヒト血漿で評価した。
ヒトのタンパク質と抗体
ヒトGlu-プラスミノーゲンは記載されているように精製し、SDS/PAGEおよびアミノ末端配列分析によって評価すると99%以上純粋であった(3、32)。プラスミノーゲンのプラスミノーゲンエラスターゼ由来のフラグメントは、10μMの精製タンパク質と250nMの精製HNEを、37℃で30分間インキュベートすることによって調製した。5mM PMSFを添加して反応を停止させた。次に、フラグメントをリジン-セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。フィブリノーゲンは、新鮮な凍結ヒト血漿から精製し、記載されているように特徴付けられた(33)。ヒトtPA(>95%単鎖)はBiopool(Uppsala,Sweden)から入手した。HNEおよびエラスターゼ阻害剤α1PIは、Calbiochem(Merck KGaA、Darmstadt,Germany)から入手した。プラスミノーゲンに対するヒツジポリクローナル抗体およびプラスミノーゲンクリングル1(CPL15)に対するモノクローナルIgG1抗体は、以前に作製および特性評価されていた(34、35)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合CPL15 mAbは、メーカーの指示(Roche、Mannheim,Germany)に従ってペルオキシダーゼ標識キットを用いて得た。ポリクローナルウサギ抗ヒツジ(HRP)結合IgGは、DakoCytomation(Glostrup,Denmark)から入手した。
ヒトGlu-プラスミノーゲンは記載されているように精製し、SDS/PAGEおよびアミノ末端配列分析によって評価すると99%以上純粋であった(3、32)。プラスミノーゲンのプラスミノーゲンエラスターゼ由来のフラグメントは、10μMの精製タンパク質と250nMの精製HNEを、37℃で30分間インキュベートすることによって調製した。5mM PMSFを添加して反応を停止させた。次に、フラグメントをリジン-セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。フィブリノーゲンは、新鮮な凍結ヒト血漿から精製し、記載されているように特徴付けられた(33)。ヒトtPA(>95%単鎖)はBiopool(Uppsala,Sweden)から入手した。HNEおよびエラスターゼ阻害剤α1PIは、Calbiochem(Merck KGaA、Darmstadt,Germany)から入手した。プラスミノーゲンに対するヒツジポリクローナル抗体およびプラスミノーゲンクリングル1(CPL15)に対するモノクローナルIgG1抗体は、以前に作製および特性評価されていた(34、35)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合CPL15 mAbは、メーカーの指示(Roche、Mannheim,Germany)に従ってペルオキシダーゼ標識キットを用いて得た。ポリクローナルウサギ抗ヒツジ(HRP)結合IgGは、DakoCytomation(Glostrup,Denmark)から入手した。
好中球の分離と好中球細胞外トラップの生成
健康なボランティアからの静脈血は、献血者センター(Etablissement Francais du Sang)によってAcid-Citrate-Dextroseで収集された。記載されているように、抗凝固処理された血液から好中球を単離した(36)。簡単に説明すると、Radioselectanに9%デキストランT-500を含む分離培地で赤血球を赤血球から分離した。赤血球の沈降後、白血球懸濁液をPancoll 1077で遠心分離した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、汚染赤血球を低張溶解によって除去した。次に、多形核好中球(PMN)をRPMI-1640またはハンクス平衡塩類溶液(HBSS)(以下を参照)に再懸濁し、分離直後に使用した。フローサイトメトリーは、CD14+、CD3+、CD19+細胞の不在を示し、May-Grunwald-Giemsa染色の核形態によって同定された高度に精製されたPMN(CD16+)の回復を確認した(図示せず)。通常、好中球調製物の純度および細胞生存率(トリパンブルー)は98%以上であった。単離された好中球は、RPMI-1640培地またはHBSSに、ウェル当たり200000細胞の分布を可能にする濃度で再懸濁した。実験は、以下に説明するように調製されおよび特徴付けられた明確なフィブリン表面を含むまたは含まない96ウェル平底プレートで実施した。
健康なボランティアからの静脈血は、献血者センター(Etablissement Francais du Sang)によってAcid-Citrate-Dextroseで収集された。記載されているように、抗凝固処理された血液から好中球を単離した(36)。簡単に説明すると、Radioselectanに9%デキストランT-500を含む分離培地で赤血球を赤血球から分離した。赤血球の沈降後、白血球懸濁液をPancoll 1077で遠心分離した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、汚染赤血球を低張溶解によって除去した。次に、多形核好中球(PMN)をRPMI-1640またはハンクス平衡塩類溶液(HBSS)(以下を参照)に再懸濁し、分離直後に使用した。フローサイトメトリーは、CD14+、CD3+、CD19+細胞の不在を示し、May-Grunwald-Giemsa染色の核形態によって同定された高度に精製されたPMN(CD16+)の回復を確認した(図示せず)。通常、好中球調製物の純度および細胞生存率(トリパンブルー)は98%以上であった。単離された好中球は、RPMI-1640培地またはHBSSに、ウェル当たり200000細胞の分布を可能にする濃度で再懸濁した。実験は、以下に説明するように調製されおよび特徴付けられた明確なフィブリン表面を含むまたは含まない96ウェル平底プレートで実施した。
PMAおよび細菌は関連する経路(プロテインキナーゼCの活性化およびタンパク質分解活性NETの誘導のための活性酸素種の生成)を使用するため、PMA刺激の十分に標準化された手法を使用した(14)。1時間後、加湿された5% CO2雰囲気、37℃、4時間、プレートに播いた好中球を50nM PMAで処理した。NETは、(1)Hoechst 33342の10μg/ml溶液でのDNA染色、および(2)DNA結合エラスターゼの活性の測定によって同定した。
非刺激好中球の染色核およびPMA誘発細胞外トラップを、Microvision Instruments(Evry,France)からのHistolabソフトウェアを用いるCCD画像化カメラを備えたX20対物のZeiss AxioObserver D1蛍光顕微鏡を用いて、各条件について3個のウェルの光学視野で検出した。
NETに結合したエラスターゼを検出するために、基質MeO-Suc-AAPV-pNA(ウェル当たり100μl、HBSSで最終濃度1.5mM)を、HBSSで2回穏やかに洗浄した後、NETとインキュベートした。DNA結合HNE活性は、A405nmでのp-ニトロアニリン(pNA)の放出を測定することにより、37℃のマルチウェルプレートカウンターで検出した。エラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMK(最終100μM)またはα1-PI(最終10μM)およびAEBSF(1mM)を使用して、DNA結合エラスターゼ活性の保存を認証した。
フィブリンマトリックスの調製および特性評価
フィブリンマトリックスは、以前に記載されたように(WO/1985/004425)調製した(34、37、38)。簡単に説明すると、フィブリノーゲンの単層をポリ(グルタルアルデヒド)で活性化した平底96ウェルプレートに固定化した。固定化されたフィブリノーゲン(410±4fmol/cm2)は、2mM CaCl2を含むトロンビンの10N.I.H.u/ml溶液を使用してフィブリンに変換した。フィブリノペプチドAの放出は、モノクローナル抗体Y18を使用して追跡した(39)。このようにして得られたフィブリンは、tPAのフィンガードメインと特異的に相互作用するが、プラスミノーゲンは、進行中のフィブリン分解中に明らかになった新たに露出したカルボキシ末端リジン残基に結合する(3、33、37)。フィブリン分解の後に、固定化フィブリン上のプラスミンによって明らかにされたD-ダイマー構造に特異的なmAb DD3B6が続いた(40)。有利なことに、フィブリン-NETマトリックスは、代替的に、例えばビーズまたはスライドなどの様々な支持体を使用して調製され得る。
フィブリンマトリックスは、以前に記載されたように(WO/1985/004425)調製した(34、37、38)。簡単に説明すると、フィブリノーゲンの単層をポリ(グルタルアルデヒド)で活性化した平底96ウェルプレートに固定化した。固定化されたフィブリノーゲン(410±4fmol/cm2)は、2mM CaCl2を含むトロンビンの10N.I.H.u/ml溶液を使用してフィブリンに変換した。フィブリノペプチドAの放出は、モノクローナル抗体Y18を使用して追跡した(39)。このようにして得られたフィブリンは、tPAのフィンガードメインと特異的に相互作用するが、プラスミノーゲンは、進行中のフィブリン分解中に明らかになった新たに露出したカルボキシ末端リジン残基に結合する(3、33、37)。フィブリン分解の後に、固定化フィブリン上のプラスミンによって明らかにされたD-ダイマー構造に特異的なmAb DD3B6が続いた(40)。有利なことに、フィブリン-NETマトリックスは、代替的に、例えばビーズまたはスライドなどの様々な支持体を使用して調製され得る。
試薬
プラスミン(メチルマロニル)ヒドロキシプロリルアルギニン-p-ニトロアニリド(CBS0065)に選択的な発色基質は、G.Contant(Diagnostica Stago、Asnieres,France)から提供された。ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)、セリンプロテアーゼ阻害剤アミノエチル-ベンゼン-スルホニルフルオリド(AEBSF)およびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、エラスターゼ特異的基質N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド(MeO-Suc-AAPV-pNA)およびエラスターゼ特異的阻害剤N-メトキシスクシニル-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-バリン-クロロメチルケトン(MeO-Suc-AAPV-CMK)は、Sigma-Aldrich(L’Isle d’Abeau-Chenes,France)から入手した。ハンクの平衡塩類溶液(HBSS)はGibcoから入手した。ServaからのDextran T-500。Radioselectanは、Schering,Franceから入手した。Pancoll 1.077mg/mlは、PAN BIOTECH GmbH(Dutscher、Brumath,Franceから配布)から入手した。dsDNAのマイナーグローブバインダーであるHoechst33342は、BioProbes(ThermoFisher、Franceから配布)から入手した。
プラスミン(メチルマロニル)ヒドロキシプロリルアルギニン-p-ニトロアニリド(CBS0065)に選択的な発色基質は、G.Contant(Diagnostica Stago、Asnieres,France)から提供された。ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)、セリンプロテアーゼ阻害剤アミノエチル-ベンゼン-スルホニルフルオリド(AEBSF)およびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、エラスターゼ特異的基質N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド(MeO-Suc-AAPV-pNA)およびエラスターゼ特異的阻害剤N-メトキシスクシニル-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-バリン-クロロメチルケトン(MeO-Suc-AAPV-CMK)は、Sigma-Aldrich(L’Isle d’Abeau-Chenes,France)から入手した。ハンクの平衡塩類溶液(HBSS)はGibcoから入手した。ServaからのDextran T-500。Radioselectanは、Schering,Franceから入手した。Pancoll 1.077mg/mlは、PAN BIOTECH GmbH(Dutscher、Brumath,Franceから配布)から入手した。dsDNAのマイナーグローブバインダーであるHoechst33342は、BioProbes(ThermoFisher、Franceから配布)から入手した。
HNE-α1-PIおよびプラスミン-α2-アンチプラスミンの複合体の検出
ヒト好中球エラスターゼ(HNE)は、Affymetrix(Bender MedSystems GmbH,Vienna,Austria)のHuman PMN Elastase Platinum ELISAキットを使用して、α1-プロテイナーゼ阻害剤(α1-PI)との複合体として検出された。プラスミン-α2-アンチプラスミン複合体は、ELISA(Technozym、Technoclone GmnH、Vienna,Austria)によって検出された。
ヒト好中球エラスターゼ(HNE)は、Affymetrix(Bender MedSystems GmbH,Vienna,Austria)のHuman PMN Elastase Platinum ELISAキットを使用して、α1-プロテイナーゼ阻害剤(α1-PI)との複合体として検出された。プラスミン-α2-アンチプラスミン複合体は、ELISA(Technozym、Technoclone GmnH、Vienna,Austria)によって検出された。
Mass Spectrometry Database検索によるプラスミノーゲンおよびそのフラグメントの同定、およびMSデータセットの解釈
使用したサンプルは、精製タンパク質(ヒトプラスミノーゲン、プラスミン、およびHNE由来のプラスミノーゲンフラグメント)または非常に豊富なタンパク質が枯渇した目的の血漿タンパク質画分(ユーグロブリンおよびリジン親和性画分)のいずれかであった。100μlの血漿(患者または対照)からのユーグロブリン画分を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で低イオン強度およびpH5.8で沈殿させ、2.5%SDS、62.5mMのTris-HCl pH6.8サンプルバッファーに再懸濁した。この画分は、アルブミンおよびα-グロブリンが枯渇しているが、プラスミノーゲンおよびそのフラグメントを含むすべてのβ-およびγ-グロブリンを含む。3mlの血漿(6人の患者からの血漿のプール)からのリジン-セファロースに結合したタンパク質は、前述のように30mMのε-アミノカプロン酸で溶出した(66)。リジンアフィニティ画分は特にリジン結合部位を有するタンパク質を含む。
使用したサンプルは、精製タンパク質(ヒトプラスミノーゲン、プラスミン、およびHNE由来のプラスミノーゲンフラグメント)または非常に豊富なタンパク質が枯渇した目的の血漿タンパク質画分(ユーグロブリンおよびリジン親和性画分)のいずれかであった。100μlの血漿(患者または対照)からのユーグロブリン画分を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で低イオン強度およびpH5.8で沈殿させ、2.5%SDS、62.5mMのTris-HCl pH6.8サンプルバッファーに再懸濁した。この画分は、アルブミンおよびα-グロブリンが枯渇しているが、プラスミノーゲンおよびそのフラグメントを含むすべてのβ-およびγ-グロブリンを含む。3mlの血漿(6人の患者からの血漿のプール)からのリジン-セファロースに結合したタンパク質は、前述のように30mMのε-アミノカプロン酸で溶出した(66)。リジンアフィニティ画分は特にリジン結合部位を有するタンパク質を含む。
サンプル中のタンパク質は、8%または15%SDS-PAGEゲルで分離した。バンドをゲルから手作業で切り出し、立方体にカットした。次に、わずかな調整を加えた公開された手順に従って、ゲル内消化をトリプシンで実行した(67)。サンプルを、室温で30分間、100mM重炭酸アンモニウム(ABC)および50%(vol/vol)アセトニトリル(ACN)の混合物で2回脱色し、次に100%ACNを使用して20分間脱水した後、10mM DTTを含む25mM ABCで、57℃で1時間還元し、室温で暗い中、25mM ABC中の55mMヨードアセトアミドで30分間アルキル化した。ゲル片を25mM ABCで2回洗浄し、100%ACNで脱水(2回、20分)した。ゲルキューブをシーケンシンググレード修飾トリプシン(Promega、USA;10%ACNを含む40mM ABC中12.5ng/μl、pH8.0)とともに37℃で一晩インキュベートした。消化後、ペプチドをゲル片から50%ACN-5%ギ酸(FA)の混合物で2回抽出し、次に100%ACNで抽出した。真空遠心濃縮器プラス(Eppendorf)を使用して抽出物を乾燥させた。
質量分析を、Q Exactiveハイブリッド四重極Orbitrap質量分析計(ThermoFisher Scientific)を備えたUltimate 3000 Rapid Separation Liquid Chromatographic(RSLC)システム(Thermo Fisher Scientific)をオンラインで使用して実行した。簡単に説明すると、ペプチドを3.5μLの10%ACN-0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)に可溶化した。次に、ペプチドをC18逆相プレカラム(粒子サイズ3μm、細孔サイズ100Å、内径75μm、長さ2cm)にロードし、洗浄した。ローディングバッファーには、98%のH2O、2%のACN、および0.1%のTFAが含まれていた。次に、ペプチドを、C18逆相樹脂(粒子サイズ2μm、ポアサイズ100Å、内径75μm、長さ25cm)で、99%A(0.1%FAおよび100%H2O)から40%B(80%ACN、0.085%FAおよび20%H2O)で、30分の勾配で分離した。
質量分析計は、溶出プロセス全体でデータを取得し、Orbitrapで取得したフルMSスキャンと、それに続くOrbitrapでの最大10のMS/MS HCDスペクトルを使用したデータ依存スキームで動作した。質量分析計の設定は、フルMS(AGC:3×10e6、分解能:7×10e4、m/z範囲400~2000、最大イオン注入時間:100ms)およびMS/MS(AGC:1×10e5、最大注入時間100ms、分離ウィンドウ:4m/z、動的除外時間設定:15秒)であった。フラグメント化は、+2、3、および4の電荷状態を持つ前駆体について許容された。スペクトル処理の場合、.mgfファイルの作成に使用されたソフトウェアは、Proteome discoverer 1.4(ThermoFisher Scientific)であった。データベース検索は、Mascotバージョン2.5.1(Matrix Science、London,UK)を使用して、550、552シーケンス(196、472、675残基)を含むSwissProtデータバンクの「ヒト」タンパク質(20、273シーケンス)(2016年2月)で実行された。検索パラメーターは次のとおりである:セミトリプシンとしての酵素特異性、システインの固定修飾としてのカルバミドメチル化、およびメチオニンの可変修飾としての酸化。最大1回の切断ミスが許容され、すべてのトリプシン質量検索で、プリカーサーに4ppm、フラグメントに20mmuの質量精度許容レベルが使用された。正の識別は、有意水準(すなわち5%)を超えるマスコットスコアに基づいた。報告されたタンパク質は、常にペプチドの一致数が最も多いタンパク質であった。
フィブリン-NETマトリックスでのプラスミノーゲン活性化/フラグメント化の研究
フィブリン-NETマトリックスは、上記のように調製されたフィブリン表面に播種された好中球のPMAによる活性化によって達成された。好中球をウェル当たり200000細胞でフィブリンマトリックスに播種し、上記のように1時間のプレーティング後にPMAで刺激した。4時間の刺激後、Hoechst染色およびエラスターゼ活性の検出によって視覚化されたフィブリン-NETマトリックスが得られた(図1)。NETの形成後、上澄み溶液を除去し、ウェルをHBSSで1回注意深く洗浄し、以下の実験を行った。
1.フィブリン-NETマトリックスへのプラスミノーゲン活性化。HBSSで洗浄した後、50i.u./mlのtPAを表面と37℃で1時間インキュベートし、tPAをフィブリンに結合させた。未結合のtPAを注意深く廃棄し、様々な濃度のプラスミノーゲンの溶液を添加して、フィブリン-NET格子に結合したtPAによるプラスミン形成をトリガーした。並行実験では、プラスミノーゲンフラグメント化に対するエラスターゼの効果は、エラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMKでブロックされた。マイクロプレートカウンターでA405nmでのpNAの放出を測定することにより、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の速度論を1時間追跡した。反応の初期速度は、アドホックコンピュータープログラムを使用して計算した。
2.NETに結合したエラスターゼによるプラスミノーゲンのフラグメント化。NETの形成およびHBSSによる洗浄に続いて、プラスミノーゲンは1μMをNETとともに37℃で15分~4時間インキュベートした。示されている場合、プラスミノーゲンを添加する前に、NETをエラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMKまたはα1-PIで前処理した。インキュベーション後、プレートを3000gで5分間遠心分離し、各ウェルの上清を収集して、さらに分析するために-20℃で保存した。フィブリン表面の底に残っている材料は、100μlのサンプルバッファー(60mM Tris-HCl pH 6.8、2%SDS)または100μlのHBSSを使用して擦ることによって回収し、それぞれウエスタンブロッティングまたはHNE活性の検出に使用した。HBSSで収集されたサンプルのHNE活性は、上で示されているように、発色基質MeO-Suc-AAPV-pNA(ウェル当たり100μl、HBSSでの最終濃度は1.5mM)で測定した。プラスミノーゲンタンパク質分解は、SDS-10%PAGEによってTris-SDSに収集されたサンプルで、その後、プラスミノーゲンK1(CPL15-HRP、100ng/ml)(35)に対するmAbまたはポリクローナルヒツジIgG(125μg/ml)、続いて二次抗ヒツジIgG-HRP(1:20000)を用いるウエスタンブロッティングで調査した。信号は、Amersham(Arlington Heights,UK)のECLキットおよび開発用のCurix-60-AGFAを使用して検出された。
フィブリン-NETマトリックスは、上記のように調製されたフィブリン表面に播種された好中球のPMAによる活性化によって達成された。好中球をウェル当たり200000細胞でフィブリンマトリックスに播種し、上記のように1時間のプレーティング後にPMAで刺激した。4時間の刺激後、Hoechst染色およびエラスターゼ活性の検出によって視覚化されたフィブリン-NETマトリックスが得られた(図1)。NETの形成後、上澄み溶液を除去し、ウェルをHBSSで1回注意深く洗浄し、以下の実験を行った。
1.フィブリン-NETマトリックスへのプラスミノーゲン活性化。HBSSで洗浄した後、50i.u./mlのtPAを表面と37℃で1時間インキュベートし、tPAをフィブリンに結合させた。未結合のtPAを注意深く廃棄し、様々な濃度のプラスミノーゲンの溶液を添加して、フィブリン-NET格子に結合したtPAによるプラスミン形成をトリガーした。並行実験では、プラスミノーゲンフラグメント化に対するエラスターゼの効果は、エラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMKでブロックされた。マイクロプレートカウンターでA405nmでのpNAの放出を測定することにより、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の速度論を1時間追跡した。反応の初期速度は、アドホックコンピュータープログラムを使用して計算した。
2.NETに結合したエラスターゼによるプラスミノーゲンのフラグメント化。NETの形成およびHBSSによる洗浄に続いて、プラスミノーゲンは1μMをNETとともに37℃で15分~4時間インキュベートした。示されている場合、プラスミノーゲンを添加する前に、NETをエラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMKまたはα1-PIで前処理した。インキュベーション後、プレートを3000gで5分間遠心分離し、各ウェルの上清を収集して、さらに分析するために-20℃で保存した。フィブリン表面の底に残っている材料は、100μlのサンプルバッファー(60mM Tris-HCl pH 6.8、2%SDS)または100μlのHBSSを使用して擦ることによって回収し、それぞれウエスタンブロッティングまたはHNE活性の検出に使用した。HBSSで収集されたサンプルのHNE活性は、上で示されているように、発色基質MeO-Suc-AAPV-pNA(ウェル当たり100μl、HBSSでの最終濃度は1.5mM)で測定した。プラスミノーゲンタンパク質分解は、SDS-10%PAGEによってTris-SDSに収集されたサンプルで、その後、プラスミノーゲンK1(CPL15-HRP、100ng/ml)(35)に対するmAbまたはポリクローナルヒツジIgG(125μg/ml)、続いて二次抗ヒツジIgG-HRP(1:20000)を用いるウエスタンブロッティングで調査した。信号は、Amersham(Arlington Heights,UK)のECLキットおよび開発用のCurix-60-AGFAを使用して検出された。
敗血症性ショック患者の血漿中のプラスミノーゲン、プラスミノーゲンフラグメント、およびプラスミン形成の検出
プラスミノーゲンは、改変を加えた、説明したような機能活性アッセイで定量した(41)。簡単に説明すると、血漿を、75i.u./mlウロキナーゼ、1mMのトラネキサム酸および0.75mMのプラスミン選択的発色基質を最終容量50μlで添加したアッセイバッファー(リン酸塩80mM、NaCl 50mM、BSA 2mg/ml)で1:50に希釈した。反応の動力学に続いて、動力学モードのマイクロプレート光度計でA405nmでのpNAの放出を測定した。結果は、既知の濃度の精製プラスミノーゲン(0.2~1μM)を補充したプラスミノーゲン枯渇血漿で作成された標準曲線を参照することにより、nM濃度で与えられた。血漿中に存在するプラスミノーゲンフラグメントは、上記のようにウエスタンブロットによって最初に検出された。さらなる同定は、質量分析によって得られた(上記を参照)。フィブリンマトリックス上のプラスミン形成は、上記のように、健康な対照および患者の血漿からのユーグロブリン画分をプラスミノーゲンの供給源として使用して測定された。フィブリン-NETマトリックスへのプラスミノーゲン活性化。プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の速度論は、A405nmでのpNAの放出を測定することによって1時間追跡され、反応の初速度は上記のように計算された。
プラスミノーゲンは、改変を加えた、説明したような機能活性アッセイで定量した(41)。簡単に説明すると、血漿を、75i.u./mlウロキナーゼ、1mMのトラネキサム酸および0.75mMのプラスミン選択的発色基質を最終容量50μlで添加したアッセイバッファー(リン酸塩80mM、NaCl 50mM、BSA 2mg/ml)で1:50に希釈した。反応の動力学に続いて、動力学モードのマイクロプレート光度計でA405nmでのpNAの放出を測定した。結果は、既知の濃度の精製プラスミノーゲン(0.2~1μM)を補充したプラスミノーゲン枯渇血漿で作成された標準曲線を参照することにより、nM濃度で与えられた。血漿中に存在するプラスミノーゲンフラグメントは、上記のようにウエスタンブロットによって最初に検出された。さらなる同定は、質量分析によって得られた(上記を参照)。フィブリンマトリックス上のプラスミン形成は、上記のように、健康な対照および患者の血漿からのユーグロブリン画分をプラスミノーゲンの供給源として使用して測定された。フィブリン-NETマトリックスへのプラスミノーゲン活性化。プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の速度論は、A405nmでのpNAの放出を測定することによって1時間追跡され、反応の初速度は上記のように計算された。
ヒト血漿中の好中球細胞外トラップの検出
NETの血漿HNE-DNA複合体は、以下の改変を加えた、記載されているようなELISAキャプチャーアッセイ(19)を使用して同定された。HNEはプラスミノーゲンフラグメント化に関与する酵素であり、NETの最も豊富な顆粒成分でもあるため、我々は、抗HNE抗体を使用してHNE-DNA複合体を捕捉することを選択する。抗体(10μg/ml)は、フィブリノーゲンについて前述したように、ポリ(グルタルアルデヒド)で活性化されたU96ウェルポリ塩化ビニルプレートに固定化された。50μlの体積の希釈ヒト血漿を、製造元の指示(Roche Diagnostic、Mannheim,Germany)に従って、ペルオキシダーゼ標識抗DNAモノクローナル抗体(市販の細胞死検出ELISAキットのコンポーネントNo.2)と組み合わせて、ウェル当たりに添加した。37℃で1時間インキュベートした後、サンプルをウェル当たり100μlのPBSで3回洗浄し、1mg/mlのペルオキシダーゼ基質ABTSを100μl/ウェル添加した。上記のマルチウェルプレート光度計を使用して、暗所で37℃で波長405nmの吸光度を測定した。
NETの血漿HNE-DNA複合体は、以下の改変を加えた、記載されているようなELISAキャプチャーアッセイ(19)を使用して同定された。HNEはプラスミノーゲンフラグメント化に関与する酵素であり、NETの最も豊富な顆粒成分でもあるため、我々は、抗HNE抗体を使用してHNE-DNA複合体を捕捉することを選択する。抗体(10μg/ml)は、フィブリノーゲンについて前述したように、ポリ(グルタルアルデヒド)で活性化されたU96ウェルポリ塩化ビニルプレートに固定化された。50μlの体積の希釈ヒト血漿を、製造元の指示(Roche Diagnostic、Mannheim,Germany)に従って、ペルオキシダーゼ標識抗DNAモノクローナル抗体(市販の細胞死検出ELISAキットのコンポーネントNo.2)と組み合わせて、ウェル当たりに添加した。37℃で1時間インキュベートした後、サンプルをウェル当たり100μlのPBSで3回洗浄し、1mg/mlのペルオキシダーゼ基質ABTSを100μl/ウェル添加した。上記のマルチウェルプレート光度計を使用して、暗所で37℃で波長405nmの吸光度を測定した。
結果
フィブリンマトリックス上に放出されたNETは密な格子を形成する
NETは、主にHoechst色素で染色されたDNAで構成される細胞外線維ネット
ワークとして同定された。活性アッセイを使用してDNAに結合したHNEを検出することにより、さらなる同定が達成された(図1)。刺激されていない好中球は、フィブリンマトリックスを含むまたは含まないプレート上で、37℃で4時間のインキュベーションの前または後のいずれかで容易に認識される典型的な細胞内小葉核を示した(図1A、好中球)。細胞外DNAは刺激されていない好中球では観察できず、フィブリンだけではNETの形成および放出を促進する能力がなかったことを示している。フィブリンの非存在下で同様の条件下で放出されたNETは、孤立しているように見え、編まれていなかった(図1A、NET)。対照的に、フィブリンに播種された刺激された好中球によって放出された細胞外DNAは、Hoechst染色後にはっきりと見える繊維の密なインターレースを形成し(図1A、NET-フィブリン)、フィブリン上に広がるDNAは、フィブリン繊維に沿った正電荷の規則的な分布によって支持されたことを示唆している(42)。フィブリン単独は、NETの出現密度に影響を与え得る自家蛍光を示さなかった(表示せず)ことに留意されたい。NETに結合したHNEの存在は、エラスターゼ選択的発色基質MeO-Suc-AAPV-pNAで検出された(図1B)。HNE-DNA複合体のタンパク質分解活性は、ペプチジルクロロメチルケトンエラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMKによって完全にブロックされた(図1B)。対照的に、上清中または血漿に添加された可溶性HNEを効率的に阻害するα1-PI(図1C)は、DNA関連HNEの活性を約20%しか低下させなかった(図1B)。無関係の阻害剤であるアプロチニンは、NETまたは細胞上清にα1-PI(40μM)と同様の濃度で添加した場合、HNEの活性に影響を与えなかった(図1B)。これらのデータは、フィブリンマトリックス上に広がるHNE-DNA格子が完全に活性であることを示している。
フィブリンマトリックス上に放出されたNETは密な格子を形成する
NETは、主にHoechst色素で染色されたDNAで構成される細胞外線維ネット
ワークとして同定された。活性アッセイを使用してDNAに結合したHNEを検出することにより、さらなる同定が達成された(図1)。刺激されていない好中球は、フィブリンマトリックスを含むまたは含まないプレート上で、37℃で4時間のインキュベーションの前または後のいずれかで容易に認識される典型的な細胞内小葉核を示した(図1A、好中球)。細胞外DNAは刺激されていない好中球では観察できず、フィブリンだけではNETの形成および放出を促進する能力がなかったことを示している。フィブリンの非存在下で同様の条件下で放出されたNETは、孤立しているように見え、編まれていなかった(図1A、NET)。対照的に、フィブリンに播種された刺激された好中球によって放出された細胞外DNAは、Hoechst染色後にはっきりと見える繊維の密なインターレースを形成し(図1A、NET-フィブリン)、フィブリン上に広がるDNAは、フィブリン繊維に沿った正電荷の規則的な分布によって支持されたことを示唆している(42)。フィブリン単独は、NETの出現密度に影響を与え得る自家蛍光を示さなかった(表示せず)ことに留意されたい。NETに結合したHNEの存在は、エラスターゼ選択的発色基質MeO-Suc-AAPV-pNAで検出された(図1B)。HNE-DNA複合体のタンパク質分解活性は、ペプチジルクロロメチルケトンエラスターゼ阻害剤MeO-Suc-AAPV-CMKによって完全にブロックされた(図1B)。対照的に、上清中または血漿に添加された可溶性HNEを効率的に阻害するα1-PI(図1C)は、DNA関連HNEの活性を約20%しか低下させなかった(図1B)。無関係の阻害剤であるアプロチニンは、NETまたは細胞上清にα1-PI(40μM)と同様の濃度で添加した場合、HNEの活性に影響を与えなかった(図1B)。これらのデータは、フィブリンマトリックス上に広がるHNE-DNA格子が完全に活性であることを示している。
NETのHNE・DNA複合体はプラスミノーゲンを明確に定義されたフラグメントに切断する。
溶液中のHNE(好中球によって精製または放出される)が既知の構造のプラスミノーゲンフラグメントを生成することはよく知られている(4、44)。ただし、NETに結合されたHNEがプラスミノーゲンをフラグメントに切断できるかどうかは不明である。この仮説を調査するために、我々はプラスミノーゲンをフィブリンマトリックス上に広がったNETの格子とともにインキュベートした。図2Aは、プラスミノーゲンフラグメントがNETとの30分および1時間のインキュベーション後にすでに存在していたことを明確に示している。相対分子量が92kDa、47kDa、および32kDaの3つの主要なバンド、ならびに47kDaのバンドの上に約50kDaの追加の小さなバンドが観察された。より長いインキュベーション時間はこのパターンを変更しなかった(図2B)。プロテオミクス分析により、92kDaバンドがヒトプラスミノーゲン、47および50kDaバンドがフラグメントK1+2+3、32kDaバンドがK5-SPであることが確認された(図6)。K4は、NET-HNE処理プラスミノーゲン(図6)およびHNE処理プラスミノーゲンの精製サンプル(図7)のプロテオミクス分析によって明確に同定された。HNE-DNA複合体は、NETを選択的プロテイナーゼ阻害剤とプレインキュベートすることによりプラスミノーゲンを特異的に切断することが確認された。エラスターゼ特異的阻害剤であるMeO-Suc-AAPV-CMKとのプレインキュベーションは、HNEを完全に阻害し、プラスミノーゲンのフラグメントへの変換を無効にし、HNEがNETで活性であることを確認した(図2C)。対照的に、プラスミンおよびカリクレイン阻害剤であるアプロチニンは、エラスターゼの活性またはプラスミノーゲンフラグメントの出現を変更することができなかった(図1B)。エラスターゼの特異的阻害剤であるα1-PIはHNE-DNA複合体の活性にわずかな減少効果しかなかったため(図1B)、観察されたプラスミノーゲンフラグメントがHNE-DNA複合体のタンパク質分解活性によって生成されることを示している。
溶液中のHNE(好中球によって精製または放出される)が既知の構造のプラスミノーゲンフラグメントを生成することはよく知られている(4、44)。ただし、NETに結合されたHNEがプラスミノーゲンをフラグメントに切断できるかどうかは不明である。この仮説を調査するために、我々はプラスミノーゲンをフィブリンマトリックス上に広がったNETの格子とともにインキュベートした。図2Aは、プラスミノーゲンフラグメントがNETとの30分および1時間のインキュベーション後にすでに存在していたことを明確に示している。相対分子量が92kDa、47kDa、および32kDaの3つの主要なバンド、ならびに47kDaのバンドの上に約50kDaの追加の小さなバンドが観察された。より長いインキュベーション時間はこのパターンを変更しなかった(図2B)。プロテオミクス分析により、92kDaバンドがヒトプラスミノーゲン、47および50kDaバンドがフラグメントK1+2+3、32kDaバンドがK5-SPであることが確認された(図6)。K4は、NET-HNE処理プラスミノーゲン(図6)およびHNE処理プラスミノーゲンの精製サンプル(図7)のプロテオミクス分析によって明確に同定された。HNE-DNA複合体は、NETを選択的プロテイナーゼ阻害剤とプレインキュベートすることによりプラスミノーゲンを特異的に切断することが確認された。エラスターゼ特異的阻害剤であるMeO-Suc-AAPV-CMKとのプレインキュベーションは、HNEを完全に阻害し、プラスミノーゲンのフラグメントへの変換を無効にし、HNEがNETで活性であることを確認した(図2C)。対照的に、プラスミンおよびカリクレイン阻害剤であるアプロチニンは、エラスターゼの活性またはプラスミノーゲンフラグメントの出現を変更することができなかった(図1B)。エラスターゼの特異的阻害剤であるα1-PIはHNE-DNA複合体の活性にわずかな減少効果しかなかったため(図1B)、観察されたプラスミノーゲンフラグメントがHNE-DNA複合体のタンパク質分解活性によって生成されることを示している。
NET HNE由来のプラスミノーゲンフラグメントは線維素溶解を妨害する
NETのHNE・DNA複合体がプラスミノーゲンをフラグメントK1+2+3、K4
およびK5-SPに切断することを実証したので、線維素溶解におけるそれらの役割の重要な質問に答えることが求められた。その目的のために、フィブリンマトリックスに播種された好中球は、上記のようにPMAを用いてNETを放出するように促された。次に、フィブリン-NET格子に結合したtPAによるプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を、プラスミン選択的発色基質を使用して評価した。フィブリン-NET格子でのプラスミノーゲンのプラスミンへの時間および濃度依存性の変換は、フィブリン単独と比較して減少した(図3A~B)。エラスターゼ選択的阻害剤であるMeO-Suc-AAPV-CMKをフィブリン-NET格子とプレインキュベートすると、プラスミン形成が対照値に回復した。これは、HNEタンパク質分解活性がプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を妨げることを示している。形成され、フィブリン-NET格子に結合したままのプラスミンの量は、MeO-Suc-AAPV-CMKの存在下での同様の条件と比較して約50%減少した(図3C)。フィブリン上に形成されるプラスミンの量のこの減少は、フィブリン表面から溶出された分子種のウエスタンブロット同定によって示されるように、HNE-DNA複合体によるプラスミノーゲンフラグメント化に関連していた(図3D)。全体として、図3のデータは、プラスミノーゲンフラグメントがHNE・DNA複合体と低い線維素溶解活性を含むフィブリンマトリックスで同定されたことを示している。対照的に、プラスミノーゲンフラグメントは存在せず、線維素溶解活性は、フィブリン-NETマトリックスをMeO-Suc-AAPV-CMKで前処理した場合の対照フィブリンと同様であった。
NETのHNE・DNA複合体がプラスミノーゲンをフラグメントK1+2+3、K4
およびK5-SPに切断することを実証したので、線維素溶解におけるそれらの役割の重要な質問に答えることが求められた。その目的のために、フィブリンマトリックスに播種された好中球は、上記のようにPMAを用いてNETを放出するように促された。次に、フィブリン-NET格子に結合したtPAによるプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を、プラスミン選択的発色基質を使用して評価した。フィブリン-NET格子でのプラスミノーゲンのプラスミンへの時間および濃度依存性の変換は、フィブリン単独と比較して減少した(図3A~B)。エラスターゼ選択的阻害剤であるMeO-Suc-AAPV-CMKをフィブリン-NET格子とプレインキュベートすると、プラスミン形成が対照値に回復した。これは、HNEタンパク質分解活性がプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を妨げることを示している。形成され、フィブリン-NET格子に結合したままのプラスミンの量は、MeO-Suc-AAPV-CMKの存在下での同様の条件と比較して約50%減少した(図3C)。フィブリン上に形成されるプラスミンの量のこの減少は、フィブリン表面から溶出された分子種のウエスタンブロット同定によって示されるように、HNE-DNA複合体によるプラスミノーゲンフラグメント化に関連していた(図3D)。全体として、図3のデータは、プラスミノーゲンフラグメントがHNE・DNA複合体と低い線維素溶解活性を含むフィブリンマトリックスで同定されたことを示している。対照的に、プラスミノーゲンフラグメントは存在せず、線維素溶解活性は、フィブリン-NETマトリックスをMeO-Suc-AAPV-CMKで前処理した場合の対照フィブリンと同様であった。
敗血症性ショック血漿におけるNET、プラスミノーゲンフラグメント、HNE・α1-PIおよび線維素溶解活性。
試験したパラメーターの結果を以下の表1に示す。
試験したパラメーターの結果を以下の表1に示す。
NETは、敗血症性ショックおよび播種性血管内凝固の患者(患者0.276±0.043;健康な対照:0.086±0.014、A405nm)のサンプル中のHNE・DNA複合体を測定することによって検出された。機能アッセイで測定したプラスミノーゲンの濃度は520±180nMであった(健康な対照n=31:1.69±0.33μM)。循環HNE・α1-PI複合体は、健康な対照と比較して患者で8倍増加し、それぞれ437±274対43±19ng/mlであった。患者は、中等度の細胞溶解ではあるが、肝機能障害の兆候なしに、D-ダイマー(12±8mg/l)およびプラスミン-α2-アンチプラスミン(範囲4814~159ng/ml、中央値1207ng/ml)が上昇していた。HNE由来のプラスミノーゲンフラグメントの存在は、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングによって証明された。図4は、健康な対照と比較して、7人の選択された患者で検出されたプラスミノーゲンフラグメントのパターンを示している。プラスミノーゲンに加えて、3つの主要なプラスミノーゲンフラグメントが、非常に豊富なタンパク質(ユーグロブリン画分またはリジン親和性画分)が枯渇したサンプルからのタンパク質バンドのアミノ酸配列の質量分析によって同定された。プラスミノーゲンフラグメントは、K1+2+3、K1+2を含むプラスミノーゲンフラグメント+3+4、およびK5-SPで構成されるプラスミノーゲンフラグメントを含む(図6)。小さな孔径またはより短い移動時間のアクリルアミドゲルを使用したにもかかわらず、敗血症性ショック患者の血漿サンプルではK4は検出されなかった。対照的に、K4は、NETまたはHNEのみで処理された精製プラスミノーゲンで明確に同定された(図6~7)。
NETおよびプラスミノーゲンフラグメントが線維素溶解に及ぼす影響を調べるために、敗血症性ショック血漿サンプルのユーグロブリン画分をフィブリン表面に結合したtPAとともにインキュベートし、形成されたプラスミンの量を発色基質で定量した。異なる敗血症性ショック血漿を正常血漿のプールと比較すると、プラスミンの生成が減少した(>50%)(図5)。これらの血漿のかなり低いプラスミノーゲン濃度を補うために、精製されたプラスミノーゲンを通常の血漿プールの濃度と同様の濃度に加えた。その結果、形成されるプラスミンの量は、プラスミノーゲンを補充した血漿のわずか3つ(S1、S3、S5)で正常になる傾向で増加した。残りの血漿サンプルS2、S4、S6)で不十分またはわずかな応答が観察され、プラスミノーゲンの添加に対する競合効果が示唆された。
考察
主要な抗菌メカニズムであるネトーシスは、感染症および非感染症の両方で代替の役割を果たす。例えば、敗血症性ショックでは、活性化された好中球が細胞外トラップを放出し、病原体を捕らえ、かつ凝固を活性化してフィブリンを形成する。結果として生じる微小血管血餅は、免疫血栓症と呼ばれるメカニズムであり、NET酵素による病原体の制限および殺害に有利に働く(20、45、46)。凝固と自然免疫との間のこの相互接続されたメカニズムのいくつかのアクターはまた、制御されていない血栓症を助長し、それによって反応の初期の利益を妨げる可能性がある(47)。結果として、NETは、敗血症ショック関連血管内凝固に寄与し得る。実際、我々は、血管内凝固を有する敗血症性ショック患者で循環NETを検出した(48)。これは、最近の研究で確認された所見である(49~52)。この例は、止血平衡の反対側である線維素溶解反応におけるNETの役割に焦点を当てている。
主要な抗菌メカニズムであるネトーシスは、感染症および非感染症の両方で代替の役割を果たす。例えば、敗血症性ショックでは、活性化された好中球が細胞外トラップを放出し、病原体を捕らえ、かつ凝固を活性化してフィブリンを形成する。結果として生じる微小血管血餅は、免疫血栓症と呼ばれるメカニズムであり、NET酵素による病原体の制限および殺害に有利に働く(20、45、46)。凝固と自然免疫との間のこの相互接続されたメカニズムのいくつかのアクターはまた、制御されていない血栓症を助長し、それによって反応の初期の利益を妨げる可能性がある(47)。結果として、NETは、敗血症ショック関連血管内凝固に寄与し得る。実際、我々は、血管内凝固を有する敗血症性ショック患者で循環NETを検出した(48)。これは、最近の研究で確認された所見である(49~52)。この例は、止血平衡の反対側である線維素溶解反応におけるNETの役割に焦点を当てている。
蛍光DNA結合剤を使用して、本発明者らは、フィブリン表面上にインビトロで形成されたNETが、フィブリンの非存在下で放出されたNETよりも密度が高く、より網目状の外観を示すことに注目しいている。フィブリン繊維に沿って規則的に分布する正電荷は、負に帯電したDNAと相互作用し、絡み合ったフィブリン-NETマトリックス内のDNA繊維のより高密度の外観をもたらす。これらの発見は、血餅に組み込まれた無細胞DNAがフィブリンの構造を改変し、プラスミン媒介分解に対して耐性を与えることを示す以前に報告されたデータと一致する(26、28)。血栓内のDNAおよびフィブリンの絡み合ったアセンブリは、インビトロでのtPA誘発性線維素溶解(21、29)および急性虚血性脳卒中患者の血栓溶解に対するNETを介した耐性(54)で示唆され得る。このような線維素溶解耐性は、ヒストンによる持続的な血小板活性化(21)およびHNEによる組織因子経路阻害剤(TFPI)(45)による持続する血栓性閉塞に寄与し得る。実際、本発明者らは、フィブリンと絡み合ったNETが、α1-PIによる阻害に感受性のないDNAと複合体を形成した活性HNEを含むことを実証している。同様に、NET関連のマウスNEは、肝臓の血管系内でタンパク質分解的に活性であることがわかった(55)。対照的に、好中球の原形質膜に結合したエラスターゼは容易に放出され、循環するα1-PIと可溶性の不可逆的な複合体を形成する(7)。HNE活性に対するDNAの機能は、白血球顆粒セリンプロテアーゼがナノモルの親和性でDNAに結合し、HNEに血漿阻害剤に対する耐性を与え、タンパク質基質の局所分解を確実にすることを示す以前の発見と一致している(9、11、12、17)。
この例は、活性なHNE-DNA複合体を含むNETの存在下で、プラスミノーゲンは、明確に定義されたサイズのフラグメントである、フィブリン結合tPAによってプラスミンを生成する能力を失ったK1+2+3、K1+2+3-4、K4およびK5-SPに還元されることを明確に示している。これらのプラスミノーゲンフラグメントは、インビトロで活性化された好中球によって放出されたNETにプラスミノーゲンが添加されたときに検出された。フラグメントの性質は、アミノ酸配列の質量分析によって確実に特定された。K1を有するプラスミノーゲンフラグメントは、フィブリンへのプラスミノーゲン結合、プラスミン生成および線維素溶解の強力な阻害剤であることが以前に示されているので(56~58)、本発明者らはこれらのメカニズムにおけるNETの役割を調査する。本発明者らが使用した実験的フィブリン-NET格子は、NET-HNE由来のプラスミノーゲンフラグメントと、プラスミノーゲン結合および活性化に対するK1含有フラグメントの競合効果の両方を検出するのに適した優れたセットアップである。本発明者らは、プラスミノーゲンがNET-フィブリン格子上のフィブリン結合tPAによって活性化されると、tPAによって生成されるプラスミンの量の減少がそのようなフラグメントの出現と同時に起こったことを実証する。これらのデータは、これらのプラスミノーゲンフラグメントがフィブリンへの結合についてプラスミノーゲンと競合し、それによってプラスミンを生成するその能力を低下させることを示している。
本明細書で説明する抗線溶効果とは異なり、HNEの基質となる可能性のある止血の他のタンパク質成分があり、その一部は、血栓の形成および溶解に直接または間接的な影響を与える可能性がある。特に、HNEは、TFPIを不活性化することによる凝固促進活性(45)、またはフィブリンの直接切断による(59)、α2-アンチプラスミンまたはPAI-1の分解による(60、61)もしくはミニプラスミノーゲン(K5-SP)を産生することによる(5)線維素溶解促進活性のいずれかを発揮し得る。ミニプラスミノーゲン(K5-SP)は、溶液中のウロキナーゼによって活性化され得るが、フィブリンに結合しないため、フィブリン表面でtPAによって活性化されない、結果として、tPA-フィブリン依存性の血餅溶解に対するK5-SPの影響はごくわずかである(5、62)。
まとめると、結果は、HNE-DNA複合体がプラスミノーゲンフラグメントを生成し、プラスミノーゲン濃度を低下させることによって抗線溶作用を発揮することを明確に示している。
DICおよび循環NETを有する敗血症性ショック患者からの血漿サンプルにおけるインビトロでのNET誘発性線維素溶解障害の指標を調査した。本発明者らは、このグループの患者は、プラスミノーゲン濃度が低く、プラスミノーゲンフラグメントを循環させ、フィブリン上でプラスミンを生成できない(正常な血漿のプールと比較した場合、50%未満)ことを明確に示しており、このことは、観察された血管内凝固および多臓器不全に明確に寄与し、および/またはその原因となる。ウエスタンブロットによって検出され、選択された患者の血漿画分における質量分析アミノ酸分析によって同定されたタンパク質
バンドは、無傷のプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンフラグメントK1+2+3、K1+2+3+4およびK5-SPに対応する。これらのフラグメントは、精製されたHNEによってインビトロで切断されたプラスミノーゲンに由来するフラグメントと同一であった(44)。
バンドは、無傷のプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンフラグメントK1+2+3、K1+2+3+4およびK5-SPに対応する。これらのフラグメントは、精製されたHNEによってインビトロで切断されたプラスミノーゲンに由来するフラグメントと同一であった(44)。
α1-PIはμM濃度で循環し、非常に高い結合定数(Ka=6.5×107M-1s-1)ですべての遊離HNEを阻害するため(6)、好中球によって放出されるエラスターゼは、で血症性ショック患者から血漿中のHNE-α1PI複合体として容易に発見された。したがって、HNE-α1PI複合体は、敗血症における好中球活性化のマーカーである。本発明者らは、これらの患者の血漿中に活性エラスターゼが存在しない場合、血漿中に見出されるプラスミノーゲンフラグメントが活性HNE-DNA複合体によって産生されたことを実証している。これらのデータは、敗血症性ショックの患者に見られるプラスミノーゲンフラグメントが血餅のフィブリン-NETマトリックス上で局所的に生成された、というメカニズムの経路を強く支持している。それにもかかわらず、フィブリンに加えて、カルボキシ末端リジンを有するヒストンH2Bは、DNA繊維に結合したHNEの近くでプラスミノーゲンを捕捉する可能性がある(64)。α1-PIに非感受性の活性HNE-DNA複合体を含む循環NETはまた、プラスミノーゲンのフラグメント化に関与し得る。
実証されているように、HNE-DNA複合体によるプラスミノーゲンのタンパク質分解は、敗血症性ショック患者の血漿で検出される全長プラスミノーゲンの低濃度、すなわち1μM未満の原因の一部である。プラスミノーゲンフラグメントの抗線溶活性と組み合わせた低濃度のプラスミノーゲンは、敗血症性ショックにおける不十分な線維素溶解をもたらし、播種性血管内凝固(DIC)をもたらす。これらのパラメーター、プラスミノーゲン濃度、プラスミノーゲンフラグメント、およびプラスミン形成の失敗は、敗血症および敗血症性ショック誘発性DICにおけるNETの役割を評価するための関連する新しい予後マーカーであり、敗血症性ショック患者の死亡率および臓器不全の予測因子として機能する。
これらの血漿の低いプラスミノーゲン濃度は、部分的に低い線維素溶解活性を説明することができるので、血漿は、試験前にプラスミノーゲンで補充された。正常な血漿プールと同様のプラスミノーゲン濃度に達したにもかかわらず、試験した6つの血漿のうちの3つは、線維素溶解活性を正常な値に戻すことができなかった。これらの結果は、おそらくK1を含む循環HNE由来プラスミノーゲンフラグメントの存在に関連するプラスミノーゲンに対する競合効果を示している。
結果は、NETのHNE-DNA複合体によって誘発される線維素溶解の深刻な減少が敗血症性ショック中の微小循環における血栓の持続性と安定化に寄与することを明確に示している。
本発明者らはまた、微小循環における敗血症性ショック血栓症が、線維素溶解不全を誘発するHNE-DNA複合体の能力に関連していることを実証している。図5に示すように、敗血症性ショック患者の血漿中の線維素溶解能のこの低下の特定は、これらの患者の線維素溶解反応を改善するための実行可能な代替案の探索に実際的な意味を持っている。例えば、活性酵素、すなわちHNE-DNA複合体、および基質、すなわちプラスミノーゲンは、敗血症-DICの治療に有用な新しい標的および/または化合物を提示する。
本発明者らは、NETまたはNETのフラグメントが、プラスミノーゲンの濃度およびプラスミン形成の両方を減少させるように作用する阻害活性(フィブリンに結合するプラスミノーゲンの競合物)を有するプラスミノーゲンフラグメントの産生に関与する活性エ
ラスターゼを含むことを実証する。全体として、エラスターゼ由来のプラスミノーゲンフラグメントの低いプラスミノーゲンおよび阻害活性は、線維素溶解系を無効にすることに寄与し、したがって、微小血栓症および臓器不全に有利に働く。
ラスターゼを含むことを実証する。全体として、エラスターゼ由来のプラスミノーゲンフラグメントの低いプラスミノーゲンおよび阻害活性は、線維素溶解系を無効にすることに寄与し、したがって、微小血栓症および臓器不全に有利に働く。
この例は、活性なHNE-DNA複合体によるプラスミノーゲンのフラグメント化と、それに伴うプラスミノーゲン濃度の低下、およびプラスミン形成が線維素溶解を弱めるために必要であることを明確に示している(図4)。また、プラスミンを生成する能力が低いことは、プラスミノーゲン濃度が低いことと、エラスターゼ由来のプラスミノーゲンフラグメントによる競合効果との両方に起因する、フィブリンに結合するプラスミノーゲンの量の減少に関連していることを示している。データは、HNE-DNA複合体がメカニズムの中心にあり、タンパク質分解によるプラスミノーゲンの消費を介して重度の線維素溶解障害を引き起こし、抗線溶性プラスミノーゲンフラグメントの生成をもたらすことを明確に示している。この線維素溶解不全は、微小血栓の溶解障害の原因であり、それによって微小循環におけるそれらの安定化を促進し、敗血症性ショック中のDICおよび臓器不全の一因となる。
この例は、プラスミノーゲンのレベルが、特に敗血症性ショック中のDICに関連する線維素溶解反応の生物学的マーカーであることを明確に示している。
この例はまた、プラスミノーゲンがDICに関連するネトーシスおよび敗血症性ショックに苦しむ患者の線維素溶解活性を回復し、補充によるこれらの患者の新しい治療法を構成することを明確に示している。
例2:敗血症-および敗血症性ショックDICにおける線維素溶解反応の指標であるプラスミノーゲン
プラスミノーゲンは、血餅を溶解するために必要な酵素であるプラスミンの前駆体である。プラスミノーゲンは、内皮プラスミノーゲン活性化因子tPAによってプラスミンに変換される。プラスミノーゲンは、1.5~2μmol/L(138μg/ml~184μg/ml)の範囲の濃度で血中を循環し、これは、フィブリンに対するtPAによって完全なプラスミン活性を生成するのに必要な量を超えている。ただし、1μM未満の濃度では、プラスミノーゲンはプラスミン生成の律速因子であり、線維素溶解が不十分になる可能性がある(Biochem J 1995)。
プラスミノーゲンは、血餅を溶解するために必要な酵素であるプラスミンの前駆体である。プラスミノーゲンは、内皮プラスミノーゲン活性化因子tPAによってプラスミンに変換される。プラスミノーゲンは、1.5~2μmol/L(138μg/ml~184μg/ml)の範囲の濃度で血中を循環し、これは、フィブリンに対するtPAによって完全なプラスミン活性を生成するのに必要な量を超えている。ただし、1μM未満の濃度では、プラスミノーゲンはプラスミン生成の律速因子であり、線維素溶解が不十分になる可能性がある(Biochem J 1995)。
実際、以前の研究では、血栓溶解の速度は、フィブリンへの蓄積を支配する利用可能なプラスミノーゲンの量によって制限されることが示されている(Biochemistry 1991,Thromb Haemostas 1991;J Lab Clin Med 1992,Circulation 1995)。したがって、循環からの継続的なプラスミノーゲン供給は、血栓への蓄積を確実にし、その最適な溶解の可能性を維持するために必要である。ただし、この供給は、微小循環の血栓症がプラスミノーゲンの重要な減少と組み合わされる病的状態では制限され、不十分な血栓溶解による血流の低下は、それによって臨床的予後を悪化させる可能性がある。
上記の例1は、播種性血管内血栓形成(DIC)を示す敗血症性ショックの患者では、機能的プラスミノーゲン濃度が1μM未満、または重症の場合は0.5μM未満であることを明確に実証している(図9)。
敗血症性ショックの患者に見られるプラスミノーゲン濃度の低下は、DICに続発する線維素溶解による消費に一部起因する可能性がある(循環プラスミン・a2-アンチプラスミン複合体およびD-ダイマー血漿濃度によって示されるように)。ただし、DICでの微小血栓の持続は、線維素溶解反応の失敗を示している。
DICによる敗血症性ショックでは、好中球および血小板が協調して作用し、免疫血栓症と呼ばれる相互結合プロセスで好中球細胞外トラップ(NET)の凝固および形成を促進する(20、45)。NETの形成は、敗血症性ショックの中間メカニズムである(図4)。
NETは、エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、その他の顆粒状タンパク質を含むDNA繊維である。遊離エラスターゼとは異なり、NET関連エラスターゼはa1-プロテイナーゼ阻害剤に耐性があるため、プラスミノーゲンを切断して、プラスミンを生成する能力を失ったよく知られたフラグメントにすることができる。
結果は、DICの敗血症性ショック患者で検出された機能的プラスミノーゲンの濃度の重要な減少が、主にNETのエラスターゼ-DNA複合体によるタンパク質分解に関連していることを明確に示している。エラスターゼによる全長プラスミノーゲン、N-ter領域-K1-K2-K3-K4-K5-SP(K:クリングルドメイン、SP:セリンプロテアーゼ領域)のタンパク質分解は、プラスミノーゲンフラグメントK1+2+3、K1+2+3+4、K4およびK5-SP(ミニプラスミノーゲンとも呼ばれる)を生じさせる。
患者のコホート(n=100)で得られたデータは、健康なボランティアと比較して、敗血症性ショックおよび低プラスミノーゲンの患者でプラスミン生成が有意に減少することを示している。プラスミンを形成する能力が低いと、線維素溶解が不十分になり、微小循環(DIC)での血栓の存在と、敗血症性ショックの患者での関連する多臓器不全に有利に働く。DICに関連する広範な虚血性組織損傷は、複数の臓器(特に肺、腎臓、肝臓、および脳)の障害につながる。
これらの血漿を使用したフィブリン表面へのプラスミン生成に関するデータは、ミニプラスミノーゲン(K5-SP)が、エラスターゼ・DNAによるプラスミノーゲンタンパク質分解のマーカーであることを超えて、とりわけ、非線維素溶解ミニプラスミンの供給源、すなわち線維素溶解不全の原因であることを示している。ミニプラスミノーゲンを含む血漿は、フィブリンに結合する能力を欠く、すなわち血漿阻害剤によって容易に阻害され、したがって線維素溶解に対する特異性を持たないミニプラスミンを生成する。このように、血漿中のK5-SPは、全長プラスミノーゲンの機能的決定および線維素溶解の評価を妨害する。
内因性循環プラスミノーゲンの重要な減少を有する敗血症性ショックを有する患者へのプラスミノーゲンの投与は、効果的な線維素溶解、血栓溶解、および患者の健康の回復を改善するために有利である。この文脈において、プラスミノーゲンモニタリング(完全長タンパク質および/またはそのフラグメント)は、敗血症性ショック患者におけるDICに対する線維素溶解反応および臓器機能障害へのその進化の評価、ならびに進行中のヒトGlu-プラスミノーゲンによる補充療法中のプラスミノーゲン回復のモニタリング、における重要な決定要因である。
DICおよび/またはプラスミノーゲン関連線維素溶解不全の診断、およびプラスミノーゲン補充によるその治療の両方のための、例えばネトーシス関連敗血症性ショックを伴う患者の診断および/またはフォローアップにおける重要な分析手段としてのプラスミノーゲン(および/またはそのフラグメント)。
線維素溶解およびNETの成分/パラメーターは、健康な個体(n=31)と比較して敗血症性ショック(n=100)の患者で分析される。
さらに、この例は、ミニプラスミノーゲン(K5-SP)の測定がエラスターゼ・DNA活性の直接的なマーカーであり、とりわけ、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患などのNETに関連する病状のマーカーであることも明確に裏付けている。機能アッセイによるミニプラスミノーゲンの評価はまた、線維素溶解不全におけるその役割についての情報を提供し得る。
さらに、この例は、ミニプラスミノーゲン(K5-SP)の測定がエラスターゼ・DNA活性の直接的なマーカーであり、とりわけ、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患などのNETに関連する病状のマーカーであることも明確に裏付けている。機能アッセイによるミニプラスミノーゲンの評価はまた、線維素溶解不全におけるその役割についての情報を提供し得る。
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Claims (15)
- 第1の生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固(DIC)を伴う/伴わないNETを伴う病状に関連する、線維素溶解不全を予測および/または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび/またはその少なくとも1つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセス。
- 病状が感染性または非感染性である、請求項1に記載のプロセス。
- NETに関連する病状が、敗血症、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、外傷、および自己免疫疾患を含む群から選択される、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記プラスミノーゲン濃度が、機能的アッセイ、免疫アッセイ、細胞免疫アッセイ、フローサイトメトリー、比色法によって測定される、請求項1~3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記プラスミノーゲンフラグメントが、プロテオミクス分析、抗原アッセイ、免疫アッセイ、フローサイトメトリーによって測定される、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記生物学的サンプルが、血液サンプル、血漿サンプルを含む群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記プラスミノーゲンフラグメントが、クリングル(K)1~3ドメイン(K1+2+3)、クリングル(K)1~4ドメイン(K1+2+3+4)ならびに/またはクリングル(K)5ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)領域(ミニプラスミノーゲン)(K5-SP)を含むフラグメントの群から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の線維素溶解不全を予測および/または検出するためのプロセス。
- 前記生物学的サンプルが敗血症性ショックを有する患者に由来する、請求項1~7のいずれか一項に記載の線維素溶解不全を予測および/または検出するためのプロセス。
- ミニプラスミノーゲン(K5-SP)の濃度を測定することを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の、NETに関連する病状を予測および/または検出するためのプロセス。
- 特にDICに関連する、線維素溶解不全の治療の有効性を決定するためのインビトロのプロセスであって、
a.化合物で治療する前の第1の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメントの濃度C1の決定および/または測定と、
b.前記化合物で治療した後の第2の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび/またはそのフラグメントの濃度C2の決定および/または測定と、任意選択で
c.前記濃度の比較、および以下の式によるスコア(S)の計算と、を含み、
S=C2/C1
Sの値が1より大きい場合は、前記治療が効果的であることを示す、プロセス。 - 前記第1および第2の生物学的サンプルが、敗血症性ショックを有する患者に由来する、請求項10に記載のプロセス。
- 好ましくは、播種性血管内凝固(DIC)に関連する、線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための、プラスミノーゲン。
- 好ましくは、播種性血管内凝固(DIC)に関連する、線維素溶解不全の治療における薬剤として使用するためのプラスミノーゲンを含む、医薬組成物。
- 特に敗血症の患者において、好ましくは、中等度/重度のプラスミノーゲン消費/欠乏に関連する、播種性血管内凝固(DIC)に関連する線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための、プラスミノーゲン。
- 前記播種性血管内凝固(DIC)が、中等度/重度のプラスミノーゲン消費/欠乏に関連している、請求項13に記載の使用のためのプラスミノーゲンを含む医薬組成物。
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