JP2022553753A - 好中球細胞外トラップに関連する線維素溶解不全の診断方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、または第１の生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を伴う／伴わない病状およびＮＥＴに関連する線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはその少なくとも１つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスに関する。本発明はまた、線維素溶解不全の治療の効率を決定するためのプロセス、ならびに好ましくは、敗血症性ショックおよび播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全の治療における薬物として使用するためのプラスミノーゲン、およびプラスミノーゲンを含む医薬組成物に関する。

Description

本発明は、第１の生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を伴う／伴わないＮＥＴに関連する線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはその少なくとも１つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスに関する。本発明はまた、線維素溶解不全の治療の効率を決定するためのプロセスに関する。

本発明は、特に医療および獣医学の分野に適用可能である。

以下の説明では、括弧（）内の参照番号は、本文の最後にある参考文献のリストを指す。

敗血症性ショックは、血行力学的機能不全、および多臓器不全症候群につながる凝固線維素溶解障害を誘発する、病原体に応答した宿主の調節不全の炎症反応を特徴とする症候群である。

血栓症に対する主要な防御線である血栓溶解は、血餅成分、主にフィブリンまたは血小板膜に結合したプラスミノーゲンの切断活性化時に生成されるプラスミンによって引き起こされる（１）。プラスミノーゲンは、Ｎ末端領域、５つのクリングル（Ｋ）ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域からなる一本鎖分子である（２）。Ｋ_１およびＫ_４には、プラスミノーゲンがフィブリンのカルボキシ末端リジン残基に確実に結合するリジン結合部位がそれぞれ含まれる（３）。したがって結合したプラスミノーゲンは、Ａｒｇ_５６１－Ｖａｌ_５６２で切断され、表面および局在に依存する方法で、組織型またはウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子であるｔＰＡおよびｕＰＡによってそれぞれプラスミンに変換される。意図的に、ｔＰＡはフィブリンに結合すると完全に活性化されるが、ｕＰＡは膜に固定された受容体ｕＰＡＲに結合すると優先的に機能する。ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）のようなプロテアーゼは、プラスミンを生成せずにプラスミノーゲンを分解する（４、５）。循環中、ＨＮＥは高濃度（２０～４０μＭ）で循環するα_１－プロテイナーゼ阻害剤（α_１－ＰＩ、Ｋａ＝６．５ｘ１０^７Ｍ^－１ｓ^－１）（６）によって急速に阻害される。このように形成されたＨＮＥ－α_１ＰＩ複合体は、循環プラスミノーゲンのタンパク質分解を妨げる。しかし、実験的証拠は、負に帯電した膜プロテオグリカンまたは他の高分子に結合したＨＮＥが阻害を免れ、活性を維持することを示している（７、８）。ＢｅｌｏｒｇｅｙおよびＢｉｅｔｈ（１９９５，１９９８）（９、１０）は、ＨＮＥがα_１－ＰＩによるその阻害を強く損なうＤＮＡとの強固な複合体を形成することを証明している。ＨＮＥに対するこの保護作用に加えて、Ｂｉｅｔｈのグループは、他の結合プロテアーゼに対するＤＮＡの保護作用を完全に文書化した（１１、１２）。好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成またはネトーシスと呼ばれるプロセスにおいて、好中球によるインタクトＤＮＡと添加ＨＮＥとを組み合わせる、機能性足場の細胞外空間への押出しは、２００４年に発見された（１３）。ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート）および細菌感染は、ＮＥＴ誘発：プロテインキナーゼＣの活性化および反応性酸素種の発生の関連経路を使用する（１４）。

ＮＥＴは、核タンパク質（ヒストン）が結合した脱凝縮核ＤＮＡ繊維であり、ＨＮＥ、カテプシンＧおよびミエロペルオキシダーゼなどの細胞質および顆粒プロテアーゼである（１５）。ＨＮＥは最も豊富であり（ＮＥＴ－ＤＮＡ１ｇ当たり５．２４μｍｏｌ）（１６）、ナノモルの親和性でＤＮＡに結合するＮＥＴの特徴的な成分である（１７）。ＮＥＴはタンパク質分解的に活性であり、有用な（１６）微生物の細胞外キラーとして元々記載されていた（１８）。最近のデータは、ＮＥＴも、自己免疫疾患、血栓症（１９、２０）、がん（７４）などの感染性炎症性疾患と病態生理学的に関連があると示している。ＮＥＴおよび凝固システムの複合作用が免疫血栓症の特徴である（２０）。ＮＥＴは血栓形成中に放出され、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子とともにフィブリン足場に統合されることが示されている（２１、２２）。ヒトの冠状動脈および脳血栓におけるＮＥＴの存在は、実際に実証されている（２３～２５）。プラスミンに対するＮＥＴのＤＮＡ－バックボーン非感受性および非線維素溶解性プラスミン－ＤＮＡ－フィブリン複合体の形成は、血栓症に有利な線維素溶解性耐性の考えられる原因として示唆された（２７、２９）。

しかし、現在、特に感染症および非感染症において、特にネトーシスに関連する線維素溶解不全を安全かつ体系的に検出することを可能にするプロセスはない。また、特にネトーシスおよび／またはＤＩＣに関連する線維素溶解不全の、例えば生物学的サンプルからの発生を予測することを可能にするプロセスおよび／または手段もない。

ＤＩＣおよび二次線維素溶解反応のいくつかの可能な生物学的マーカーが開示されている。

しかしながら、既知のマーカーは、特定の条件で、および／または複雑なデバイスおよび／もしくは方法を使用することによって検出／使用され得、ならびに／または、長すぎるか、もしくは長すぎて患者および／もしくは臨床医および／もしくは医師に有用ではない可能性がある遅延後に結果を得ることができる。

したがって、個人の生命予後を改善するため、先行技術のこれらの欠陥、欠点および障害を克服するプロセスおよび／または手段、特に、ネトーシスおよびＤＩＣに関連する線維素溶解能不全および線維素溶解不全を検出することを可能にする単純で迅速かつ効果的なプロセスを見つけることが真に必要である。

個人の生命予後を改善するため、および／または当該個人の治療費を削減するために、先行技術のこれらの欠陥、欠点および障害を克服するプロセスおよび／または手段、特に、ネトーシスおよびＤＩＣに関連する線維素溶解不全および線維素溶解不全を検出することを可能にする単純で迅速かつ効果的なプロセスを見つけることもまた真に必要である。

本発明の目的は、生物学的サンプルから、好ましくは、ネトーシスおよび／または播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全を予測および／または検出するためのプロセスであって、少なくとも１つの生物学的マーカーの濃度および／または含有量を検出および／または測定する工程を含むプロセスを提供することによって、先行技術の欠点を克服することである。

本明細書において、「生物学的マーカー」は、プラスミノーゲンまたはそのフラグメント、および／またはＮＥＴのプロテアーゼ成分、好ましくはヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を含む群から選択される少なくとも１つの生物学的マーカーを意味することを意図する。好ましくは、生物学的マーカーは、プラスミノーゲンまたはそのフラグメント、より好ましくはプラスミノーゲンおよび／またはプロテアーゼ由来のプラスミノーゲンフラグメント、より好ましくはＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントである。

本発明によれば、特にサンプル中の当該少なくとも１つの選択された生物学的マーカーの含有量は、当業者に知られている任意の適切なプロセスによって測定することができる。

本発明によれば、特にサンプル中の当該少なくとも１つの選択された生物学的マーカーの濃度は、当業者に知られている任意の適切なプロセスによって測定することができる。

本発明によれば、当該少なくとも１つの選択された生物学的マーカーは、当業者に知られている任意の適切なプロセスによって検出され得る。

ＮＥＴは血栓溶解を危うくする可能性があるので、本発明者らは、線維素溶解におけるＨＮＥ－ＤＮＡ複合体の役割を調査する。本発明者らは、驚くべきことに、活性ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体を含むＮＥＴの存在下で、プラスミノーゲンが、フィブリンへのプラスミノーゲン結合およびプラスミン形成を阻害するフラグメントに還元され、線維素溶解の障害をもたらすことを実証する。本発明者らは、驚くべきことに、線維素溶解不全の新しい型破りなメカニズムを誘発するＨＮＥ－ＤＮＡ複合体の能力に基づいて、敗血症性ショック血栓症に対する新しい機構的洞察を実証する。

本発明者らはまた、驚くべきことに、敗血症性ショックを有する患者からの生物学的サンプルにおいてプラスミノーゲンの濃度が低下することを実証する。

本発明者らはまた、驚くべきことに、線維素溶解不全、特にネトーシスおよび播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全を有する患者からの生物学的サンプルにおいてプラスミノーゲンの濃度が低下することを実証する。

本発明者らはまた、驚くべきことに、敗血症性ショックによって誘発されるＤＩＣおよびネトーシス、ＤＮＡに結合したヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）によるプラスミノーゲン分解、およびその後のプラスミン形成の失敗に苦しむ患者において実証する。

本発明者らはまた、驚くべきことに、ＮＥＴが、特に敗血症性ショックに関連する播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に苦しむ患者において、プラスミノーゲン濃度、特に血漿中のプラスミノーゲン濃度の低下を誘発することを実証している。

本発明の目的は、生物学的サンプルから、好ましくはＮＥＴ関連および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。

本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を伴う／伴わない異なる病状の線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。

本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を伴う／伴わないＮＥＴを有する病態に関連する線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはその少なくとも１つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。

本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全および線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはその任意のフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。

本発明の目的はまた、生物学的サンプルから、ＮＥＴまたはネトーシスに関連する病状、好ましくは敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはそのフラグメント、好ましくはミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）の濃度を測定することを含む、プロセスである。

本発明の目的はまた、好ましくは生物学的サンプルからの線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、感染性および／または非感染性疾患を有する患者におけるプラスミノーゲンおよびそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。

本発明の目的はまた、生物学的サンプルからネトーシスに関連する病状を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよびそのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセスである。

本明細書において、「ネトーシス」は好中球死のプロセスであるのに対し、ＮＥＴは特に核タンパク質および活性酵素が結合したＤＮＡ繊維、優先的にはＤＮＡ－ＨＮＥ複合体を指す。

本明細書において、「ＮＥＴのプロテアーゼ成分」は、ＮＥＴのＤＮＡ繊維に結合した活性酵素を意味する。

本明細書において、「プロテアーゼ由来のプラスミノーゲンフラグメント」は、当業者から知られている任意のプラスミノーゲンフラグメントを意味する。

本明細書において、「線維素溶解不全」は、線維素溶解プロセスにおける任意の障害および／または欠乏を意味する。それは、例えば、線維素溶解因子、例えば、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター［ｔＰＡ］、ウロキナーゼ［ｕＰＡ］、ならびに阻害剤ＰＡＩ－１およびａ２－アンチプラスミンを含む可能性のある任意の欠乏であり得る。好ましくは、それは、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）放出、および／または播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全を意味する。

本明細書において、「播種性血管内凝固」（ＤＩＣ）は、凝固の全身的活性化を特徴とする状態を意味し、Ｂｌｏｏｄに開示されているように、中小血管の血栓性閉塞を引き起こし、それによって臓器機能障害に寄与する可能性がある。

本明細書において、「ＮＥＴまたはネトーシスに関連する病理」は、ＮＥＴまたはネトーシスを含む当業者から知られている任意の病理を意味する。それは、例えば、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および／または自己免疫疾患であり得る。特に、敗血症－ＤＩＣに関連するＮＥＴ、急性心筋梗塞またはステント血栓症に関連するＮＥＴ、虚血性脳卒中血栓に関連するＮＥＴ、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどの自己免疫疾患に関連するＮＥＴ、または***もしくは肺に関連するＮＥＴまたは膵臓がんであり得る。

本明細書において、「プラスミノーゲン」は、Ｎ末端領域、５つのクリングル（Ｋ）ドメイン（Ｋ_１からＫ_５）およびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域からなる一本鎖分子である９２ｋＤａタンパク質を意味する（２）。Ｋ_１およびＫ_４には、それぞれリジン結合部位が含まれている。言い換えれば、「プラスミノーゲン」は、Ｎ末端領域、５つのクリングル（Ｋ）ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域からなる９２ｋＤａの一本鎖プロ酵素を意味することを意図している。例えば、Ｘｕｅ Ｙ ｅｔ ａｌ（２）および
／またはＬａｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ｜Ｖｏｌｕｍｅ １，ＩＳＳＵＥ ３，Ｐ１８５－１９０，Ｍａｒｃｈ ２９，２０１２（７５）によって説明されているプラスミノーゲンであり得る。これは、アミノ酸配列ＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ（配列番号１）のタンパク質であり得る。

本明細書において、「プラスミノーゲンフラグメント」は、当業者から知られているプラスミノーゲンの任意のフラグメントを意味する。例えば、それは、プラスミノーゲンの任意のドメインを含むプラスミノーゲンのフラグメントであり得、プラスミノーゲンの任意のドメインは、例えばクリングル（Ｋ）１～５のドメイン、例えば配列ＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣ（配列番号１０）のペプチド、またはセリンプロテアーゼドメイン（ＳＰ）、例えば、配列ＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲ（配列番号１１）のペプチドを含むセリンプロテアーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせ、例えば、Ｋ１＋Ｋ２＋Ｋ３からなるフラグメント、例えば配列ＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣ
ＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣ（配列番号７）のペプチド、または配列番号７の配列のペプチドを含むフラグメント、Ｋ１＋Ｋ２＋Ｋ３＋Ｋ４からなるフラグメント、例えば配列ＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣ（配列番号６）のペプチド、または配列番号６の配列のペプチドを含むフラグメント、または例えば単一のＫ４からなるフラグメント、例えば、配列ＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣ（配列番号１２）のペプチド、または単一のＫ４を含むフラグメント、例えばＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶ（配列番号５）である。それは、例えば、ミニプラスミノーゲンとも呼ばれるＫ５およびＳＰドメインからなるフラグメント（Ｋ５－ＳＰ）であり得、例えば、配列ＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲ（配列番号８）のペプチド、もしくは配列番号８のペプチドを含むフラグメント、および／または活性プロテアーゼ－ＤＮＡ複合体、好ましくはＮＥＴのＨＮＥ－ＤＮＡ複合体で得られるプラスミノーゲンの任意のフラグメントである。

本明細書において、「ＨＮＥ由来プラスミノーゲンフラグメント」は、クリングル１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）、クリングル１～４ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３＋４}）ならびに／またはミニプラスミノーゲンとも呼ばれるクリングル５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域（Ｋ_５－ＳＰ）を含むフラグメントの群から選択されるプラスミノーゲンのフラグメントを意味する。例えば、クリングル１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むプラスミノーゲンのフラグメントは、例えば配列番号７の配列のペプチドを含むペプチドであり得、例えば配列ＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶ（配列番号２）のペプチド、および／または配列ＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶ（配列番号９）のペプチドであり、クリングル１～４ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３＋４}）を含むプラスミノーゲンのフラグメントは、例えば配列番号６の配列のペプチドを含むペプチドであり得、例えば配列ＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶ（配列番号３）のペプチドであり、ミニプラスミノーゲンとも呼ばれるドメインＫ５およびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域（Ｋ_５－ＳＰ）を含むプラスミノーゲンのフラグメントは、例えば、配列番号８の配列のペプチドを含むペプチドであり得、例えば配列ＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ（配列番号４）のペプチドである。

本明細書において、「細胞質および顆粒状の活性プロテアーゼ」は、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼまたはエラスターゼを意味する。

本明細書において、「ヒト好中球エラスターゼ」（ＨＮＥ）とは、好中球エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３７）、白血球エラスターゼを意味する。ＨＮＥは、他の白血球顆粒関連プロテアーゼ、例えばプロテイナーゼ３およびカテプシンと同じファミリーのトリプシン／キモトリプシン型セリンプロテイナーゼである。

本明細書において、「ＤＮＡ結合タンパク質」は、ヒストン、優先的にはシトルリン化されたヒストン、フィブロネクチン、およびフォンウィルブランド因子を意味する。

本明細書において、「生物学的サンプル」は、哺乳動物、例えば、単孔目、オポッサム目、ケノレステス目、ミクロビオテリウム目、フクロモグラ形目、フクロネコ目、バンディクート目、双前歯目、管歯目、ジュゴン目、アフリカトガリネズミ目、ハネジネズミ目、イワダヌキ目、長鼻目、被甲目、例えばアルマジロ、有毛目、登木目、皮翼目、霊長目、齧歯目、ウサギ目、ハリネズミ形目、例えばハリネズミ、トガリネズミ目、翼手目、有鱗目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目、およびクジラ目の目を含む群から選択される哺乳動物から得られた任意のサンプルを意味する意図である。それは、例えば、ヒトまたは動物であり得る。それは、例えば、家畜、ペット、絶滅危惧種、またはその他の動物であり得る。

本発明によれば、生物学的サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、または任意の生物学的流体であり得る。それは、例えば、血液、血漿、尿、涙または組織抽出物を含む群から選択される生物学的サンプルであり得る。好ましくは、生物学的サンプルは、血液サンプルまたは血漿サンプル、より好ましくは血漿サンプルであり得る、それはまた、インビトロで培養細胞から得られた培養上清であり得る。

本発明によれば、生物学的サンプルは、敗血症性ショックまたは敗血症性ショックもしくは他の非感染性炎症プロセスのリスクを有する哺乳動物に由来し得る。

本発明によれば、プラスミノーゲンの濃度は、当業者から知られている任意の方法および／またはプロセスによって決定／測定することができる。それは、例えば“Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ；ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ，” ｅＪＩＦＣＣ，ｖｏｌ １２ Ｎｏ ２，２０００（７７）、またはＳ．，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ”に開示されるように、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼ、またはストレプトキナーゼ－プラスミノーゲン複合体のいずれかを用いる抗原または機能アッセイによって測定される濃度であり得る。Ｎａｔ Ｍｅｄ １６，８８７－８９６（４５）。プラスミノーゲンの濃度はまた、その潜在的な線維素溶解活性を、免疫アッセイによって、細胞免疫アッセイによって、またはフローサイトメトリーによって測定することを含むプロセスで決定／測定され得る。

例えば、プラスミノーゲンの濃度が免疫アッセイによって測定される場合、免疫アッセイは循環プラスミノーゲンを検出することを可能にし、プラスミノーゲンの濃度が細胞免疫アッセイによって測定される場合、細胞免疫アッセイはフローサイトメトリーを使用して細胞表面上のプラスミノーゲンを検出し得る。それは、例えば、Ｒｉｆｅ Ｕ，Ｍｉｌｇｒｏｍ Ｆ，Ｓｈｕｌｍａｎ Ｓ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎ．Ｂｌｏｏｄ １９６３，２１２，３２２ Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００３，１，２３９７（８３）に開示されているような免疫アッセイであり得る。

例えば、プラスミノーゲンの濃度が流れによって測定されるとき、それは、細胞表面特異的プラスミノーゲン結合を同定するためにプラスミノーゲン結合を決定することを可能にし得る。

例えば、プラスミノーゲンの濃度は、比色法、例えば、活性化因子としてストレプトキナーゼを使用する比色法、例えば、市販のキット、例えば、Ｈｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄによって商品化されたＢＩＯＰＨＥＮ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＬＲＴ）Ｒｅｆ ２２１５１１、例えば、ＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘによるＣＯＡＭＡＴＩＣ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｆ ８２ ２４５２ ６３、例えばＳＴＡＧＯによるＳｔａｃｈｒｏｍ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ００６５８によって測定され得る。例えば、プラスミノーゲンの濃度がＢＩＯＰＨＥＮ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＬＲＴ）Ｒｅｆ ２２１５１１で測定される場合、参照または正常範囲は７０～１３０％である。例えば、プラスミノーゲンの濃度がＣＯＡＭＡＴＩＣ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｒｅｆ ８２ ２４５２ ６３で測定される場合、参照または正常範囲は８０～１２０％である。例えば、プラスミノーゲンの濃度がＳｔａｃｈｒｏｍ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ００６５８で測定される場合、参照または正常範囲は８０～１２０％である。

例えば、プラスミノーゲンの濃度は、免疫アッセイによって、例えば、市販のキットを使用して測定することができる。例えば、市販のキットは、免疫アッセイ、例えばＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅによるＴｅｃｈｎｏｚｙｍ（登録商標）Ｇｌｕ－Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ Ｒｅｆ ＴＣ１２０４０によってプラスミノーゲンを測定する（正常Ｇｌｕ－プラスミノーゲン値は６０～２５０μｇ／ｍｌの範囲である）。例えば、ＡｂｃａｍによるＨｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＰＬＧ）Ｒｅｆ ａｂ１０８８９３。例えば、プラスミノーゲンの濃度をＨｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＰＬＧ）で測定する場合、血漿中のプラスミノーゲンの濃度の参照または通常の範囲は７０～１３５μｇ／ｍＬである。

例えば、プラスミノーゲンは、例えばポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体による、例えば市販のポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体による、例えば、細胞表面上のプラスミノーゲンを検出するためのフローサイトメトリーのための、測定／検出され得る抗原アッセイであり得る。それは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによる参照番号ＰＡ５－１４１９６および／またはＡｂｃａｍによるａｂ１５４５６０で商品化された抗体であり得る。

本発明によれば、プラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、当業者から知られている任意の方法および／またはプロセスによって測定することができる。それは、例えば、質量分析を使用するプロテオミクス分析によって、またはモノクローナル抗体を使用する抗原アッセイによって、または方法の任意の組み合わせによって測定される濃度であり得る。例えば、アンギオスタチン様とも呼ばれるクリングル１～４を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、ＬＩｊｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１“Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ” Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２００１ １０２（１），５３－９（７６）によって開示されるように、免疫アッセイによって測定され得る。単一のＫ４、Ｋ１－Ｋ２－Ｋ３、Ｋ１－Ｋ２－Ｋ３－Ｋ４またはミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）を含むプラスミノーゲンフラグメントは、好ましくは、例えば特定の抗体を使用するウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって定性的に検出され得る。それは、例えば、Ｍ Ｓｔｅｎ－Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ Ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ” Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；１９；３４０９－１４（７８）、またはＹ Ｔａｋａｄａ“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｋｒｉｎｇｌｅ－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｎ ａｎｄ ｕＰＡ” Ａｃｔｉｏｎｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ １３６３０２，８ ｐａｇｅｓ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／１３６３０２、またはＺ Ｚｈａｎｇ “Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｋｒｉｎｇｌｅ ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｌｋａｌｉ－Ｂｕｒｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ”Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５，Ｖｏｌ．４６，４０６２－４０７１．ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１６７／ｉｏｖｓ．０４－１３３０－（８０）に開示されているプロセスであり得る。

例えば、アンギオスタチン様とも呼ばれるクリングル１～４を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度が、がん患者からの例えば腫瘍液において免疫アッセイによって測定される場合、プロセスは、例えば、サンプル中、好ましくは希釈サンプル中の、例えば免疫吸着による他のプラスミノーゲン部分の除去ステップを含み得る。

本発明によれば、ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントの濃度は、当業者から知られている任意の方法および／またはプロセスによって測定することができる。それは、例えば、モノクローナル抗体を使用する抗原アッセイによって測定される濃度であり得る。例えば、ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントの濃度は、例えば、ＬＩｊｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１（７６）によって開示されるように、免疫アッセイによって測定され得る。単一のＫ４、Ｋ１－Ｋ２－Ｋ３、Ｋ１－Ｋ２－Ｋ３－Ｋ４またはミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）を含むＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントは、好ましくは、例えば特定の抗体を使用するウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーによって定性的に検出され得る。それは、例えば、Ｒｏｕｙ Ｄ ｅｔ ａｌ．“Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｆｉｂｒｉｎ：Ａ Ｓｔｕｄｙ Ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９２；３１；６３３３（５６）、またはＢａｒｂｏｓａ ｄａ Ｃｒｕｚ Ｄ ｅｔ ａｌ“ＤＮＡ－ｂｏｕｎｄ Ｅｌａｓｔａｓｅ ｏｆ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｐｌａｓｍｉｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ Ｐｌａｓｍａ” ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１８９，３３，１４２７０（８１）に開示されているようなプロセスであり得る。ＨＮＥフラグメントの濃度および品質は、免疫抗原法と、フラグメントのアミノ酸配列のサイズまたは決定を測定する他の方法とを組み合わせることによって、例えば、プロテオミクス分析のために組み合わせたものなど、質量分析によって、測定および評価することもできる。例えば、例えば、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．“Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｃｌｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（３５）１４４２５－１４４３７（８２）に開示されているように、ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントの濃度をフローサイトメトリーで測定して、プラスミン生成タンパク質フラグメントの細胞への結合を検出することができる。

例えば、ＨＮＥ由来プラスミノーゲンフラグメントの濃度が、例えばがん患者からの腫瘍液において免疫アッセイによって測定される場合、プロセスは、例えばサンプル中、好ましくは希釈されたサンプル中の、例えば免疫吸着による他のプラスミノーゲン部分の除去ステップを含み得る。

本発明によれば、クリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度の決定／測定は、当業者から知られている任意の適合された方法によって実施され得る。それは、例えば、抗原アッセイによるものであり得る。例えば、クリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、Ｌｉｊｎｅｎ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｔｈｒｏｍｂ
Ｒｅｓ ２００１ １０２（１），５３－９（７６）によって開示されているような免疫アッセイによって測定され得る。

本発明によれば、ミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）またはクリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃
度の決定／測定は、当業者から知られている任意の適合された方法によって実施され得る。それは、例えば、抗原アッセイによるものであり得る。例えば、タンパク質分離と、質量分析によるプロテオミクス分析との組み合わせを使用する。例えば、クリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域またはミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）を含むプラスミノーゲンのフラグメントの濃度は、例えば、Ｍｏｒｏｚ ｅｔ ａｌ．１９８６ “Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｌｉｋｆｅｒ ａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １９８６，４３，４１７（５）に開示されているような免疫アッセイによって測定され得る。

本発明によれば、検出プロセスはまた、プラスミノーゲンの測定された濃度を参照値と比較するステップを含み得る。それは、例えば、参照健康集団の値または区間の通常９５％を表し、好ましくは、例えば、Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）によって開示されるように、統計分析によって決定される、参照値または参照区間であり得る。

本発明によれば、プラスミノーゲンの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定されたプラスミノーゲンの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、プラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプールで測定されたプラスミノーゲンの濃度であり得る。プラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義される内部標準であり得る。プラスミノーゲンの参照濃度値は、例えば、１～２μｍｏｌ／Ｌの濃度、好ましくは１．５～２μｍｏｌ／Ｌの全長プラスミノーゲンの濃度であり得る。

本発明によれば、プラスミノーゲンのフラグメントの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定されたプラスミノーゲンのフラグメントの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、プラスミノーゲンのフラグメントの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプールおよび／または健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義される内部標準において測定されたプラスミノーゲンのフラグメントの濃度であり得る。

本発明によれば、クリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定されたクリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、クリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプールおよび／または健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義された内部標準で測定された、クリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度であり得る。

本発明によれば、クリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域またはミニプラスミノーゲン（Ｋ_５－ＳＰ）を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、対象の生物学的サンプルで測定された、クリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域もしくはミニプラスミノーゲン（Ｋ_５－ＳＰ）を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度、または参照の健康な対象のグループで測定された平均濃度値であり得る。好ましくは、クリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域またはミニプラスミノーゲン（Ｋ_５－ＳＰ）を含むフラグメントプラスミノーゲンの参照濃度値は、健康な対象からの生物学的サンプルのプール、または健康な対象からのサンプルに対して滴定された対象の生物学的サンプルとして定義される内部標準で測定された、クリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域またはミニプラスミノーゲン（Ｋ_５－ＳＰ）を含むフラグメントプラスミノーゲンの濃度であり得る。

本明細書において、「参照の健康な対象」または「健康な対象」は、上で定義されたように、線維素溶解不全および播種性血管内凝固を引き起こす可能性のある身体に、感染、ショック、出血、敗血症性ショックおよび／または任意の他の攻撃を受けていない哺乳動物、例えばヒトを意味することを意図している。それは、例えば、ＮＥＴまたはネトーシスに関連する感染性または非感染性の病状、例えば、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および上記で定義される自己免疫疾患に罹患していないヒトであり得る。

本発明によれば、「参照の対象のグループ」または「参照の健康な対象のグループ」は、信頼できる参照値または信頼できる参照区間を定義することを可能にするグループを意味することを意図している。それは、例えば、上記で定義された少なくとも２つの、例えば、少なくとも１０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも１００の参照の対照または健康な対象を含むグループであり得る。それは、例えば、３０～５００人の対象、４０～２００人、４５～１１０人の参照の対象または健康な対象を含むグループであり得る。

有利なことに、本発明者らは、プラスミノーゲンの測定濃度が参照値または区間よりも低い場合、本発明によるプロセスが、線維素溶解不全を伴う播種性血管内凝固を検出および／または予測することを可能にすることを実証している。

有利なことに、本発明者らはまた、プラスミノーゲンフラグメントの含有量／濃度が参照値または間隔よりも大きい場合、本発明によるプロセスが、線維素溶解および／または線維素溶解不全、特に播種性血管内凝固における線維素溶解不全の阻害を検出および／または予測することを可能にすることを実証している。

有利なことに、本発明の発明者はまた、プラスミノーゲンおよび／またはその少なくとも１つのフラグメントの濃度を測定することを含む、線維素溶解不全を検出するためのプロセスが、線維素溶解不全の検出を可能にすることを実証している。

有利なことに、本発明者らは、プラスミノーゲンのフラグメント、好ましくはミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）が血漿中で検出される場合、特に本発明によるプロセスが、ＮＥＴ、例えば、第１の生物学的サンプルからおまたはネトーシスに関連する敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患を伴う病状を検出および／または予測することを可能にすることを実証している。

有利なことに、本発明の発明者はまた、プラスミノーゲンおよび／またはその少なくとも１つのフラグメントの濃度を測定することを含む線維素溶解不全を検出するためのプロセスが、ＮＥＴに関連する病状の検出を可能にすることを実証している。

本発明の目的はまた、ＤＩＣに関連する線維素溶解不全および／またはＮＥＴに関連する病状、好ましくは敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患、および／またはネトーシスに関連する病状、の治療の有効性を決定するためのインビトロのプロセスであって、
ａ．化合物で治療する前の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび／またはそのフラグメントの濃度Ｃ１の決定および／または測定と、
ｂ．当該化合物で治療した後の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび／また
はそのフラグメントの濃度Ｃ２の決定および／または測定と、任意選択で
ｃ．濃度の比較および以下の式によるスコア（Ｓ）の計算と、を含み、
Ｓ＝Ｃ２／Ｃ１、である、プロセスである。

本発明によれば、生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、治療前の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、治療前の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、プラスミノーゲンおよび／またはフラグメントの濃度の決定および／または測定は、上記で定義／記載された任意の方法／プロセスによって実施することができる。

本発明によれば、プラスミノーゲンのフラグメントは、上記で定義／記載された任意のプラスミノーゲンフラグメントであり得る。

本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンである場合、治療は、比較ステップから得られたＳの値が１より大きいときに有効である。

本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンフラグメントである場合、治療は、比較ステップから得られたＳの値が１未満であるときに有効である。

本発明によれば、ＤＩＣに関連する線維素溶解不全および／またはＮＥＴに関連する病状、好ましくは敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がんおよび自己免疫疾患、およびネトーシスに関連する病状、の化合物による治療の有効性を決定するためのインビトロのプロセスであって、
ａ．化合物で治療する前の第１の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンの濃度Ｃ１の決定および／または測定と、
ｂ．化合物で治療する前の第２の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンフラグメントの濃度Ｃ１Ｆの決定および／または測定と、
ｃ．当該化合物で治療した後の第３の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンの濃度Ｃ２の決定および／または測定と、
ｄ．当該化合物で治療した後の第４の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンフラグメントの濃度Ｃ２Ｆの決定および／または測定と、任意選択で
ｅ。濃度の比較および次の式によるスコア（Ｓ）および（ＳＦ）の計算と、を含み、
Ｓ＝Ｃ２／Ｃ１、
ＳＦ＝Ｃ２Ｆ／Ｃ１Ｆである、プロセスである。

本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンである場合、治療は、比較ステップから得られたＳの値が１より大きいときに有効である。

本発明によれば、プロセスが線維素溶解不全の治療の有効性を決定し、生物学的マーカーがプラスミノーゲンフラグメントである場合、治療は、比較ステップから得られたＳＦの値が１未満であるときに有効である。

本発明によれば、治療前の第１の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、治療前の第２の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、治療前の第２の生物学的サンプルは、治療前の第１の生物学的サンプルと同一でもまたは異なっていてもよい。

本発明によれば、処理前の第１および第２の生物学的サンプルは、同じサンプルであり得る。

本発明によれば、処理後の第３の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、処理後の第４の生物学的サンプルは、上記で定義された生物学的サンプルである。

本発明によれば、処理後の第３の生物学的サンプルは、処理後の第４の生物学的サンプルと同一でもまたは異なっていてもよい。

本発明によれば、処理後の第３および第４の生物学的サンプルは、同じサンプルであり得る。

本明細書において、「化合物による治療」は、医療、例えば、アロパシーな治療を意味し、分子、例えば、化学分子、例えば、有機合成によって得られた分子、生物学的起源の分子、例えば、タンパク質、生物、例えば哺乳動物、微生物、植物からのおよび／もしくは生物によって合成された分子；または任意の他の非化学的処置；または操作されたかどうかにかかわらず、上記の分子、例えばナノベシクルを送達する、例えば天然のプラスミノーゲンを運ぶ、任意の他のデバイス、の摂取を含む。

本発明者らは、驚くべきことに、敗血症性ショック誘発性ＤＩＣを有する患者の血漿サンプルへのプラスミノーゲンの供給が、プラスミン形成および線維素溶解を回復することを可能にすることを実証している。

本発明の目的は、線維素溶解不全、特に、ネトーシスおよび／または播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を有する患者における低プラスミノーゲン濃度によって誘発される線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための天然および／または組換えプラスミノーゲンである。

また、本発明の目的は、好ましくは播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全の治療における薬剤として使用するためのプラスミノーゲンを含む医薬組成物である。

本発明の目的はまた、線維素溶解不全、好ましくは、ネトーシスおよび／または播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を有する患者における低プラスミノーゲン濃度によって誘発される線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための天然および／または組換えプラスミノーゲンを含む医薬組成物である。

本発明の別の目的は、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、例えば、特に敗血症性ショック誘発性ＤＩＣを有する患者における中等度／重度のプラスミノーゲン消費／欠乏に関連するＤＩＣの治療における薬物として使用するための、天然および／または組換えのプラスミノーゲンである。

本発明の目的は、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、例えば、特に敗血症性ショックおよびＤＩＣの患者における、中等度／重度のプラスミノーゲン消費／欠乏に関連するＤＩＣの治療における薬剤として使用するための、天然および／または組換えのプラスミノーゲンを含む医薬組成物である。

本明細書では、「治療」、「治療する」、「治療された」または「治療すること」という用語は、予防および／または治療を指し、特に、その目的が、望ましくない生理学的変化または障害、例えば播種性血管内凝固の発症および／または進行を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは望ましい臨床結果には、臓器不全の改善、病状の安定化（すなわち、悪化しない）、病状進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および治癒（部分的または全体的）が含まれるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に期待される生存および／または生活の質と比較して、生存の延長および／または生活の質の向上を意味し得る。

「対象」または「患者」には、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、疾患または障害を有すると診断された、またはリスクがあると決定された哺乳動物などの、疾患または障害の治療を必要とする哺乳動物が含まれる。

医薬組成物は、ヒトまたは動物に投与され得る任意の形態であり得る。

医薬組成物は、プラスミノーゲン、例えば、天然および／または組換えプラスミノーゲンを含み得る。例えば、それは、対象の６．６ｍｇ／ｋｇの濃度のＧｌｕ－プラスミノーゲンであり得る。

これは、例えば、直接に、すなわち、純粋もしくは実質的に純粋に、またはプラスミノーゲンもしくはそのフラグメントを薬学的に許容される担体および／もしくは媒体と混合した後に実行され得る。本発明によれば、医薬組成物は、シロップまたは注射可能な溶液であり得る。例えば、医薬組成物が注射可能な溶液である場合、それは、１０から３０分の静脈内注入として注射および／または投与され得る。

本発明によれば、プラスミノーゲンを含む医薬組成物は、毎日、２日毎、３日毎に投与することができる。当業者は、その技術的知識を考慮して、プラスミノーゲンを含む医薬組成物の投与頻度を適応させるだろう。

本発明によれば、線維素溶解不全がネトーシスに関連する場合、医薬組成物は、涙滴または外用に適合された任意の調製物であり得る。

本発明によれば、医薬組成物は、液体配合物、経口発泡性剤形、経口粉末、多粒子系、口腔内分散性剤形を含む群から選択される経口投与用医組成物であり得る。例えば、医薬組成物が経口投与用である場合、それは、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液および経口液滴を含む群から選択される液体製剤の形態であり得る。医薬組成物が経口発泡性剤形の形態である場合、それは、錠剤、顆粒、および粉末を含む群から選択される形態であり得る。医薬組成物が経口粉末または多粒子系の形態である場合、それは、ビーズ、顆粒、ミニ錠剤およびマイクロ顆粒を含む群から選択される形態であり得る。医薬組成物が口腔内分散性剤形の形態である場合、それは、口腔内分散性錠剤、凍結乾燥ウエハー、薄膜、チュアブル錠剤、錠剤およびカプセル、医療用チューインガムを含む群から選択される形態であり得る。本発明によれば、医薬組成物は、頬側および舌下経路用であり得、例えば、頬側または舌下錠、粘液接着剤調製物、トローチ剤、口腔粘膜滴およびスプレーを含む群から選択され得る。

本発明によれば、線維素溶解不全がネトーシスに関連する場合、医薬組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、パッチおよびフォームを含む群から選択される局所経皮投与用であり得る。

本発明によれば、医薬組成物は、例えば、点鼻液、鼻内噴霧薬、点鼻粉末を含む群から選択される、経鼻投与用に処方することができる。本発明によれば、医薬品は、直腸投与用に処方することができ、例えば、坐剤または硬ゼラチンカプセルであり得る。本発明によれば、医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内投与用であり得る。当業者は、本明細書で使用される「形態」という用語が、その実際の使用のための製剤を指すことを明確に理解している。

薬学的に許容される担体は、対象に応じて、天然または組換えプラスミノーゲンの投与に使用される任意の公知の薬学的担体であり得る。例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤には、任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤または乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。

医薬組成物の形態は、治療されるヒトまたは動物に関して選択され得る。

別の態様では、本発明は、ＤＩＣ、特に敗血症性ショック中のＤＩＣに罹患している対象を治療する方法を提供する。この方法は、当該対象に天然および／または組換えプラスミノーゲンを投与するステップを含み得る。

天然または組換えプラスミノーゲン、ならびに使用可能な製剤は、上記で定義されたとおりである。投与は、当業者に知られ、天然および／または組換えプラスミノーゲンを投与するのに有用な任意の医薬的方法を使用することによって行うことができ、好ましくは、投与は非経口投与、好ましくは静脈内投与である。投与可能な形態の薬剤／薬物の例を上に示した。

他の利点はなお、例示として与えられた添付の図によって示される以下の実施例を閲読することによって、当業者には明らかであり得る。

フィブリンマトリックスに播種された好中球から生成される好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を表す。ＮＥＴのＤＮＡおよびＨＮＥ活性が示されている。ヒトの血液から分離され、フィブリンマトリックスを含むまたは含まない９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種された好中球は、ＨＢＳＳ中の５０ｎＭ ＰＭＡによって活性化された。加湿した５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした後、プレートを３０００ｇで５分間遠心分離し、上清を収集し、ウェル内の細胞およびＮＥＴを副溝ＤＮＡバインダーであるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の１０μｇ／ｍｌ溶液で染色した。ＮＥＴに結合したエラスターゼ活性は、発色基質であるＮ－メトキシスクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ｐ－ニトロアニリンで検出された。図１Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された核および細胞外ＤＮＡファイバーの蛍光顕微鏡画像（２０倍）を表す。スケールバー：２０μｍ。好中球：ＰＭＡの非存在下でインキュベートされた非刺激好中球は、典型的な多形核の外観を示す。ＮＥＴ：フィブリンの非存在下で生成された好中球細胞外トラップ。ＮＥＴ－フィブリン：フィブリンマトリックス上に生成されたＮＥＴは、フィブリンの非存在下で押し出されたＮＥＴよりも密度が高く網目状の外観を示した。図１Ｂ．は、阻害剤の非存在下（Ｉｎｈなし）、またはα１－プロテイナーゼ阻害剤（α１－ＰＩ、１０μＭ）、アプロチニン（１０μＭ）もしくは合成阻害剤Ｎ－メトキシスクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－クロロメチルケトン（ＡＡＰＶ－ｃｍｋ、１００μＭ）の存在下での、ＮＥＴのＨＮＥ－ＡＤＮ複合体（黒色のバー）および上清（灰色のバー）でのＨＮＥ活性の検出を表す。Ｃ．バッファー中の可溶性ＨＮＥ活性の検出（λ）および正常なヒト血漿に添加した場合のその阻害（■）。精製されたＨＮＥを、１．５ｍＭの発色基質Ｎ－メトキシスクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ｐ－ニトロアニリンで活性測定を行う前に、バッファーまたは血漿中で様々な濃度でインキュベートした（１５分）。 ＮＥＴ関連エラスターゼがプラスミノーゲンをフラグメントに消化することを表す。図１に示すように、プラスミノーゲン（１μＭ）を、５０ｎＭ ＰＭＡで処理した好中球によって生成されたＮＥＴで４時間インキュベートした。サンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびヒトプラスミノーゲンに対する特異的ヒツジ抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した。図２Ａ～Ｂ．３０～２４０分（Ａ）および２～１０時間（Ｂ）のインキュベーション後のＮＥＴ ＨＮＥ・ＤＮＡ複合体によるプラスミノーゲンフラグメント化。Ｃ．精製プラスミノーゲン（Ｐｇ）、プラスミン（Ｐｎ）（左パネル）およびＨＮＥ－ＤＮＡ由来プラスミノーゲンフラグメント（中央パネル）のウエスタンブロット。エラスターゼ特異的阻害剤（ＥＩ）Ｎ－メトキシスクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－クロロメチルケトンの存在下では、ＰＭＡ刺激好中球によって生成されたプラスミノーゲンフラグメント（中央のパネル）は観察されなかった（右のパネル）。 フィブリン上に形成されたＮＥＴによるｔＰＡ媒介プラスミン形成の減少を表す。ヒトの血液から分離された好中球は、９６ウェルマイクロタイタープレートのフィブリンに播種され、ＨＢＳＳ中の５０ｎＭ ＰＭＡによって活性化された。活性化された好中球によって放出されたＮＥＴは、図１に示すように識別された。ｔＰＡがフィブリンに結合した後、様々な濃度のプラスミノーゲンを織り合わされたＮＥＴ－フィブリン構造に添加した。図３Ａ～Ｂ．５０ｎＭ（Ａ）および５００ｎＭ（Ｂ）でのプラスミノーゲン（Ｐｇ）からのプラスミン形成を、０．７５ｍＭでのプラスミン選択的発色基質であるｐＮＡの放出を測定することによってモニターした。フィブリンでのプラスミン形成。●フィブリン－ＮＥＴでのプラスミン形成。■エラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫで処理されたフィブリン－ＮＥＴでのプラスミン形成。図３Ｃ．プラスミノーゲン活性化後、ウェルを注意深く洗浄し、０．７５ｍＭのプラスミン選択的発色基質を添加することによりフィブリン結合プラスミンの量を検出した。灰色バー：プラスミンはフィブリン－ＮＥＴ表面に結合している。白色バー：エラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫで処理されたフィブリン－ＮＥＴ表面に結合したプラスミン。図３Ｄ．２時間のインキュベーション後にフィブリン－ＮＥＴ表面から回収されたタンパク質抽出物中のプラスミノーゲンフラグメント化の分析。プラスミノーゲン特異的モノクローナル抗体を使用した非還元サンプルのウエスタンブロット。１：ＮＥＴの非存在下でフィブリン結合ｔＰＡによって活性化されたプラスミノーゲン（非還元ゲルでは、プラスミノーゲンおよびプラスミンは同様の位置に移動する）。２および４：フィブリン－ＮＥＴ格子とインキュベートしたプラスミノーゲン。プラスミノーゲンフラグメントおよびプラスミンの痕跡の生成。３、５．エラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫの存在下で、プラスミンの生成が回復し、プラスミノーゲンフラグメントの形成が阻害された。 敗血症性ショックによる播種性血管内凝固の患者を循環するプラスミノーゲンフラグメントを表す。患者および対照からの血漿サンプルは、２０％グリセロールおよび４％ＳＤＳを含む１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーｐＨ６．８で１：５に希釈した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％）で分離した後、ヒトプラスミノーゲンに対する特異的ヒツジ抗体またはクリングル１に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体ＣＰＬ１５－ＰＯを使用したウエスタンブロットを行った。Ｃ１～Ｃ４：健康なドナーからの血漿。Ｓ１～Ｓ７：敗血症性ショックによって誘発された播種性血管内凝固の患者からのサンプル。Ｐｇ：患者および健康なドナーからのサンプル中のプラスミノーゲン。Ｓ１～Ｓ７の４９ｋＤａと３８ｋＤａとの間のバンドは、プラスミノーゲンフラグメント（Ｐｇ ｆｒｇ）を表す。プラスミノーゲンフラグメントのプロテオミクス分析には、ユーグロブリン沈殿またはリジン親和性分画によって豊富なタンパク質を除去するために処理された血漿サンプルを使用した。 敗血症性ショックから分離された血漿の線維素溶解活性を表す。血漿の線維素溶解活性は、対応するユーグロブリン画分を、ｔＰＡ（５０ｉｕ／ｍｌ）が以前に結合したフィブリン表面とインキュベートすることによって試験した。ユーグロブリン画分には、質量分析によって同定されたＫ１、Ｋ４、およびＫ５を含むプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンフラグメントが含まれている（テキストおよび補足ファイルを参照）。形成されたプラスミンの量は、図３に示すように、プラスミンに選択的な発色基質を使用してＡ４０５ｎｍでの吸光度の変化を測定することによって定量化された。Ｃ（オープンバー）：対照血漿のプール（（ｎ＝１８、プラスミノーゲン濃度：１．５μＭ）。Ｓ１～Ｓ６：敗血症性ショック患者からのサンプル［プラスミノーゲン］（μＭ）：Ｓ１（０．５４６）、Ｓ２（０．８６３）、Ｓ３（０．４１５）、Ｓ４（０，４９１）、Ｓ５（０．３７２）、Ｓ６（０．５０４）。灰色のバー：天然のプラスミノーゲン濃度でのＳ１～Ｓ６の血漿サンプルの活性。閉じたバー：プラスミノーゲン濃度を１．５μＭに正規化したときのＳ１～Ｓ６の血漿サンプルの活性。 図６。ＮＥＴのＤＮＡ－ＨＮＥ複合体がプラスミノーゲンをプロテオミクス解析で同定された既知の構造のフラグメントに消化することを表す。プラスミノーゲンおよびそのフラグメントは、上記のように質量分析によって精製サンプルおよび血漿タンパク質画分で同定された。プラスミノーゲン構造配列から修飾されたプラスミノーゲンおよびその主要フラグメントの概略図（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｃｍｕ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐｓ／Ｌｌｉｎａｓ／ｒｅｓ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｋｒｉｎｇｌｅ－ｂｉｇ．ｈｔｍｌ）。図６Ａは、全長プラスミノーゲンがＮ末端領域、５つのクリングル（Ｋ）ドメイン、およびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域で構成されていることを表す。矢印はプラスミノーゲンの主なＨＮＥ切断部位を示す（６８）、図６Ｂ．２７ｋＤａ Ｋ１－Ｋ３ Ｌｅｕ７４－Ｖａｌ３３８、図６Ｃ．３４ｋＤａ Ｋ１－Ｋ３ Ｌｅｕ７４－Ｖａｌ３５４、図６Ｄ．３９ｋＤａ Ｋ１－Ｋ３ Ｌｅｕ７４－Ｖａｌ３５４、図６Ｅ．１４ｋＤａ Ｋ４ Ｖａｌ３５５－Ｖａｌ４４３および図６Ｆ．３８ｋＤａ Ｋ５－ＳＰ Ａｌａ４４４－Ａｓｎ７９１。Ｋ_{１＋２＋３}の分子量の違いは、切断およびグリコシル化の部位に関連している。 図６続き 図６続き 図６続き 図６続き 図６続き ヒト好中球エラスターゼ由来のＧｌｕ－プラスミノーゲンフラグメントのウエスタンブロットの写真である。フラグメントは、３７℃で３０分間、プラスミノーゲンをフラグメントに完全に変換するのに十分な２５０ｎＭの精製ＨＮＥとともに１０μＭの精製タンパク質をインキュベートすることによって調製した。対応するフラグメントは、リジン－セファロースのアフィニティークロマトグラフィーによって分離し、質量分析を使用したプロテオミクス分析によって識別した。Ｍ．参照の分子マーカー。１．Ｋ５－ＳＰ。２．第１のバンドＫ１＋２＋３、第２および第３のバンドＫ１＋２＋３。３．Ｋ１＋２＋３＋４。４．Ｋ４ ＮＥＴの活性型ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によりフラグメント化したプラスミノーゲンを表すグラフである。プラスミノーゲンは、ＮＥＴの活性なＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によってフラグメントに還元される。ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体は、タンパク質分解によるプラスミノーゲンの消費を介して重度の線維素溶解障害を引き起こし、抗線溶性プラスミノーゲンフラグメントの生成をもたらすメカニズムの中心にある。この線維素溶解不全は、微小血栓の溶解障害の原因の一部であり、それによって微小循環におけるそれらの安定化を促進し、敗血症性ショック中の臓器不全の一因となる。 播種性血管内凝固を有しない（ＤＩＣなし）かまたは播種性血管内凝固を有する（ＤＩＣ）、敗血症性ショック患者の機能的プラスミノーゲン濃度を示す。プラスミノーゲンは、利用可能な天然プラスミノーゲンからのプラスミン形成を測定する機能アッセイ法によって評価された。Ｄ１、Ｄ３、Ｄ７：Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｕｎｉｔに入院してから数日後。破線は健康な対象の平均プラスミノーゲン濃度を表す（ｎ＝３１）

例１：プラスミノーゲンの濃度の決定およびＤＩＣの検出。
敗血症性ショックにおける血小板および好中球の活性化は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を伴うフィブリンの複雑な足場を含む微小血管血餅の形成をもたらす。ＮＥＴには、内因性線維素溶解に影響を与える可能性のある複数の成分が含まれているため、微小循環内の血餅の溶解に失敗し、全身性微小血栓症を残す。フィブリン－ＮＥＴマトリックスは、好中球をフィブリン表面に播種して活性化することによって調製し、モニターしたプラスミノーゲンの活性化または分解を構築した。ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体のエラスターゼ活性が血漿アンチプロテアーゼによる阻害から保護され、プラスミノーゲンを分解するその能力を維持することを示す。質量分析プロテオミクス分析を使用して、クリングル（Ｋ）ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}、ｋ_{１＋２＋３＋４}）およびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域（Ｋ_５－ＳＰ）で構成されるプラスミノーゲンフラグメントを同定した。本発明者らはさらに、播種性血管内凝固を伴う敗血症性ショック患者が、循環するＨＮＥ－ＤＮＡ複合体、ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメント、低いプラスミノーゲン濃度、およびフィブリン上にプラスミンを生成する能力の低下を有することを実証する。本発明者らは、活性ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体を有するＮＥＴがプラスミノーゲンをフラグメントに還元し、したがって局所プラスミノーゲン濃度、フィブリンへのプラスミノーゲン結合および局所プラスミン形成を減少させることにより線維素溶解を損なうことを実証する。したがって、ＮＥＴ上のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）のリザーバーは、プラスミノーゲンタンパク質分解経路を介して線維素溶解メカニズムを直接妨害する。

材料および方法
略語：
ＡＢＴＳ、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）
ＡＥＢＳＦ、アミノエチル－ベンゼン－スルホニルフルオリド
α１－ＰＩ、α１－プロテイナーゼ阻害剤
ＤＩＣ、播種性血管内凝固
ＨＢＳＳ、ハンクの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）
ＨＮＥ、ヒト好中球エラスターゼ
Ｋ、プラスミノーゲンのクリングルドメイン
ＮＥＴ、好中球細胞外トラップ
ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫ、Ｎ－（メトキシスクシニル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリル－Ｌ－バリンクロロメチルケトン
ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡ、Ｎ－（メトキシスクシニル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリル－Ｌ－バリンｐ－ニトロアニリン
ＭＭ－Ｈ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｐＮＡ、メチル（マロニル）ヒドロキシプロリルアルギニン－ｐ－ニトロアニリン、ＣＢＳ００６５
ＮＥＴ、好中球細胞外トラップ
ＰＭＡ、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート
ＰＭＮ、多形核白血球
ＰＭＳＦ、フェニルメチルスルホニルフルオリド
ｔＰＡ、組織プラスミノーゲン活性化因子
ｕＰＡ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター
ｕＰＡＲ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体

敗血症性ショック患者および健康な対象からの血漿
多臓器不全を伴う敗血症性ショック（平均Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ＳＯＦＡスコア１３±２）（３０）と言われ、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｕｔｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＪＡＡＭ ２０１６スコア（３１）に入院後最初の２４時間に診断された播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を示す、７人の患者（平均年齢７４．５±１０歳）、および１０人の健康な個体を登録した（Ｔｒｉａｌ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ：Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ ＃０２３９１７９２）。Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、この研究を承認した。インフォームドコンセントは入院時に患者または親戚から得られ、できるだけ早く患者によって確認された。血小板を含まない血漿を、０．１３Ｍクエン酸ナトリウム（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に二重遠心分離ステップ（２５００ｇで１５分間）によって収集された血液から調製し、分注し、すぐに－８０℃で凍結した。定期的な止血研究、およびＨＮＥ－α１ＰＩとプラスミン－α２－アンチプラスミンとの複合体の検出は、ヒト血漿で評価した。

ヒトのタンパク質と抗体
ヒトＧｌｕ－プラスミノーゲンは記載されているように精製し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびアミノ末端配列分析によって評価すると９９％以上純粋であった（３、３２）。プラスミノーゲンのプラスミノーゲンエラスターゼ由来のフラグメントは、１０μＭの精製タンパク質と２５０ｎＭの精製ＨＮＥを、３７℃で３０分間インキュベートすることによって調製した。５ｍＭ ＰＭＳＦを添加して反応を停止させた。次に、フラグメントをリジン－セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。フィブリノーゲンは、新鮮な凍結ヒト血漿から精製し、記載されているように特徴付けられた（３３）。ヒトｔＰＡ（＞９５％単鎖）はＢｉｏｐｏｏｌ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ＨＮＥおよびエラスターゼ阻害剤α１ＰＩは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。プラスミノーゲンに対するヒツジポリクローナル抗体およびプラスミノーゲンクリングル１（ＣＰＬ１５）に対するモノクローナルＩｇＧ１抗体は、以前に作製および特性評価されていた（３４、３５）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＣＰＬ１５ ｍＡｂは、メーカーの指示（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってペルオキシダーゼ標識キットを用いて得た。ポリクローナルウサギ抗ヒツジ（ＨＲＰ）結合ＩｇＧは、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。

好中球の分離と好中球細胞外トラップの生成
健康なボランティアからの静脈血は、献血者センター（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ）によってＡｃｉｄ－Ｃｉｔｒａｔｅ－Ｄｅｘｔｒｏｓｅで収集された。記載されているように、抗凝固処理された血液から好中球を単離した（３６）。簡単に説明すると、Ｒａｄｉｏｓｅｌｅｃｔａｎに９％デキストランＴ－５００を含む分離培地で赤血球を赤血球から分離した。赤血球の沈降後、白血球懸濁液をＰａｎｃｏｌｌ １０７７で遠心分離した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、汚染赤血球を低張溶解によって除去した。次に、多形核好中球（ＰＭＮ）をＲＰＭＩ－１６４０またはハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（以下を参照）に再懸濁し、分離直後に使用した。フローサイトメトリーは、ＣＤ１４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋細胞の不在を示し、Ｍａｙ－Ｇｒｕｎｗａｌｄ－Ｇｉｅｍｓａ染色の核形態によって同定された高度に精製されたＰＭＮ（ＣＤ１６＋）の回復を確認した（図示せず）。通常、好中球調製物の純度および細胞生存率（トリパンブルー）は９８％以上であった。単離された好中球は、ＲＰＭＩ－１６４０培地またはＨＢＳＳに、ウェル当たり２０００００細胞の分布を可能にする濃度で再懸濁した。実験は、以下に説明するように調製されおよび特徴付けられた明確なフィブリン表面を含むまたは含まない９６ウェル平底プレートで実施した。

ＰＭＡおよび細菌は関連する経路（プロテインキナーゼＣの活性化およびタンパク質分解活性ＮＥＴの誘導のための活性酸素種の生成）を使用するため、ＰＭＡ刺激の十分に標準化された手法を使用した（１４）。１時間後、加湿された５％ ＣＯ２雰囲気、３７℃、４時間、プレートに播いた好中球を５０ｎＭ ＰＭＡで処理した。ＮＥＴは、（１）Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の１０μｇ／ｍｌ溶液でのＤＮＡ染色、および（２）ＤＮＡ結合エラスターゼの活性の測定によって同定した。

非刺激好中球の染色核およびＰＭＡ誘発細胞外トラップを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｅｖｒｙ，Ｆｒａｎｃｅ）からのＨｉｓｔｏｌａｂソフトウェアを用いるＣＣＤ画像化カメラを備えたＸ２０対物のＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ Ｄ１蛍光顕微鏡を用いて、各条件について３個のウェルの光学視野で検出した。

ＮＥＴに結合したエラスターゼを検出するために、基質ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡ（ウェル当たり１００μｌ、ＨＢＳＳで最終濃度１．５ｍＭ）を、ＨＢＳＳで２回穏やかに洗浄した後、ＮＥＴとインキュベートした。ＤＮＡ結合ＨＮＥ活性は、Ａ４０５ｎｍでのｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出を測定することにより、３７℃のマルチウェルプレートカウンターで検出した。エラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫ（最終１００μＭ）またはα１－ＰＩ（最終１０μＭ）およびＡＥＢＳＦ（１ｍＭ）を使用して、ＤＮＡ結合エラスターゼ活性の保存を認証した。

フィブリンマトリックスの調製および特性評価
フィブリンマトリックスは、以前に記載されたように（ＷＯ／１９８５／００４４２５）調製した（３４、３７、３８）。簡単に説明すると、フィブリノーゲンの単層をポリ（グルタルアルデヒド）で活性化した平底９６ウェルプレートに固定化した。固定化されたフィブリノーゲン（４１０±４ｆｍｏｌ／ｃｍ^２）は、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むトロンビンの１０Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｕ／ｍｌ溶液を使用してフィブリンに変換した。フィブリノペプチドＡの放出は、モノクローナル抗体Ｙ１８を使用して追跡した（３９）。このようにして得られたフィブリンは、ｔＰＡのフィンガードメインと特異的に相互作用するが、プラスミノーゲンは、進行中のフィブリン分解中に明らかになった新たに露出したカルボキシ末端リジン残基に結合する（３、３３、３７）。フィブリン分解の後に、固定化フィブリン上のプラスミンによって明らかにされたＤ－ダイマー構造に特異的なｍＡｂ ＤＤ３Ｂ６が続いた（４０）。有利なことに、フィブリン－ＮＥＴマトリックスは、代替的に、例えばビーズまたはスライドなどの様々な支持体を使用して調製され得る。

試薬
プラスミン（メチルマロニル）ヒドロキシプロリルアルギニン－ｐ－ニトロアニリド（ＣＢＳ００６５）に選択的な発色基質は、Ｇ．Ｃｏｎｔａｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から提供された。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、セリンプロテアーゼ阻害剤アミノエチル－ベンゼン－スルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、エラスターゼ特異的基質Ｎ－メトキシスクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ｐ－ニトロアニリド（ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡ）およびエラスターゼ特異的阻害剤Ｎ－メトキシスクシニル－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリル－バリン－クロロメチルケトン（ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ－Ｃｈｅｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。ハンクの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）はＧｉｂｃｏから入手した。ＳｅｒｖａからのＤｅｘｔｒａｎ Ｔ－５００。Ｒａｄｉｏｓｅｌｅｃｔａｎは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｃｅから入手した。Ｐａｎｃｏｌｌ １．０７７ｍｇ／ｍｌは、ＰＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧｍｂＨ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｂｒｕｍａｔｈ，Ｆｒａｎｃｅから配布）から入手した。ｄｓＤＮＡのマイナーグローブバインダーであるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、ＢｉｏＰｒｏｂｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｆｒａｎｃｅから配布）から入手した。

ＨＮＥ－α_１－ＰＩおよびプラスミン－α_２－アンチプラスミンの複合体の検出
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）のＨｕｍａｎ ＰＭＮ Ｅｌａｓｔａｓｅ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＥＬＩＳＡキットを使用して、α_１－プロテイナーゼ阻害剤（α_１－ＰＩ）との複合体として検出された。プラスミン－α_２－アンチプラスミン複合体は、ＥＬＩＳＡ（Ｔｅｃｈｎｏｚｙｍ、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ ＧｍｎＨ、Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって検出された。

Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｄａｔａｂａｓｅ検索によるプラスミノーゲンおよびそのフラグメントの同定、およびＭＳデータセットの解釈
使用したサンプルは、精製タンパク質（ヒトプラスミノーゲン、プラスミン、およびＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメント）または非常に豊富なタンパク質が枯渇した目的の血漿タンパク質画分（ユーグロブリンおよびリジン親和性画分）のいずれかであった。１００μｌの血漿（患者または対照）からのユーグロブリン画分を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で低イオン強度およびｐＨ５．８で沈殿させ、２．５％ＳＤＳ、６２．５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８サンプルバッファーに再懸濁した。この画分は、アルブミンおよびα－グロブリンが枯渇しているが、プラスミノーゲンおよびそのフラグメントを含むすべてのβ－およびγ－グロブリンを含む。３ｍｌの血漿（６人の患者からの血漿のプール）からのリジン－セファロースに結合したタンパク質は、前述のように３０ｍＭのε－アミノカプロン酸で溶出した（６６）。リジンアフィニティ画分は特にリジン結合部位を有するタンパク質を含む。

サンプル中のタンパク質は、８％または１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した。バンドをゲルから手作業で切り出し、立方体にカットした。次に、わずかな調整を加えた公開された手順に従って、ゲル内消化をトリプシンで実行した（６７）。サンプルを、室温で３０分間、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）および５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリル（ＡＣＮ）の混合物で２回脱色し、次に１００％ＡＣＮを使用して２０分間脱水した後、１０ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭ ＡＢＣで、５７℃で１時間還元し、室温で暗い中、２５ｍＭ ＡＢＣ中の５５ｍＭヨードアセトアミドで３０分間アルキル化した。ゲル片を２５ｍＭ ＡＢＣで２回洗浄し、１００％ＡＣＮで脱水（２回、２０分）した。ゲルキューブをシーケンシンググレード修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ；１０％ＡＣＮを含む４０ｍＭ ＡＢＣ中１２．５ｎｇ／μｌ、ｐＨ８．０）とともに３７℃で一晩インキュベートした。消化後、ペプチドをゲル片から５０％ＡＣＮ－５％ギ酸（ＦＡ）の混合物で２回抽出し、次に１００％ＡＣＮで抽出した。真空遠心濃縮器プラス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して抽出物を乾燥させた。

質量分析を、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＲＳＬＣ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をオンラインで使用して実行した。簡単に説明すると、ペプチドを３．５μＬの１０％ＡＣＮ－０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に可溶化した。次に、ペプチドをＣ１８逆相プレカラム（粒子サイズ３μｍ、細孔サイズ１００Å、内径７５μｍ、長さ２ｃｍ）にロードし、洗浄した。ローディングバッファーには、９８％のＨ_２Ｏ、２％のＡＣＮ、および０．１％のＴＦＡが含まれていた。次に、ペプチドを、Ｃ１８逆相樹脂（粒子サイズ２μｍ、ポアサイズ１００Å、内径７５μｍ、長さ２５ｃｍ）で、９９％Ａ（０．１％ＦＡおよび１００％Ｈ_２Ｏ）から４０％Ｂ（８０％ＡＣＮ、０．０８５％ＦＡおよび２０％Ｈ_２Ｏ）で、３０分の勾配で分離した。

質量分析計は、溶出プロセス全体でデータを取得し、Ｏｒｂｉｔｒａｐで取得したフルＭＳスキャンと、それに続くＯｒｂｉｔｒａｐでの最大１０のＭＳ／ＭＳ ＨＣＤスペクトルを使用したデータ依存スキームで動作した。質量分析計の設定は、フルＭＳ（ＡＧＣ：３×１０ｅ６、分解能：７×１０ｅ４、ｍ／ｚ範囲４００～２０００、最大イオン注入時間：１００ｍｓ）およびＭＳ／ＭＳ（ＡＧＣ：１×１０ｅ５、最大注入時間１００ｍｓ、分離ウィンドウ：４ｍ／ｚ、動的除外時間設定：１５秒）であった。フラグメント化は、＋２、３、および４の電荷状態を持つ前駆体について許容された。スペクトル処理の場合、．ｍｇｆファイルの作成に使用されたソフトウェアは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。データベース検索は、Ｍａｓｃｏｔバージョン２．５．１（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を使用して、５５０、５５２シーケンス（１９６、４７２、６７５残基）を含むＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータバンクの「ヒト」タンパク質（２０、２７３シーケンス）（２０１６年２月）で実行された。検索パラメーターは次のとおりである：セミトリプシンとしての酵素特異性、システインの固定修飾としてのカルバミドメチル化、およびメチオニンの可変修飾としての酸化。最大１回の切断ミスが許容され、すべてのトリプシン質量検索で、プリカーサーに４ｐｐｍ、フラグメントに２０ｍｍｕの質量精度許容レベルが使用された。正の識別は、有意水準（すなわち５％）を超えるマスコットスコアに基づいた。報告されたタンパク質は、常にペプチドの一致数が最も多いタンパク質であった。

フィブリン－ＮＥＴマトリックスでのプラスミノーゲン活性化／フラグメント化の研究
フィブリン－ＮＥＴマトリックスは、上記のように調製されたフィブリン表面に播種された好中球のＰＭＡによる活性化によって達成された。好中球をウェル当たり２０００００細胞でフィブリンマトリックスに播種し、上記のように１時間のプレーティング後にＰＭＡで刺激した。４時間の刺激後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色およびエラスターゼ活性の検出によって視覚化されたフィブリン－ＮＥＴマトリックスが得られた（図１）。ＮＥＴの形成後、上澄み溶液を除去し、ウェルをＨＢＳＳで１回注意深く洗浄し、以下の実験を行った。
１．フィブリン－ＮＥＴマトリックスへのプラスミノーゲン活性化。ＨＢＳＳで洗浄した後、５０ｉ．ｕ．／ｍｌのｔＰＡを表面と３７℃で１時間インキュベートし、ｔＰＡをフィブリンに結合させた。未結合のｔＰＡを注意深く廃棄し、様々な濃度のプラスミノーゲンの溶液を添加して、フィブリン－ＮＥＴ格子に結合したｔＰＡによるプラスミン形成をトリガーした。並行実験では、プラスミノーゲンフラグメント化に対するエラスターゼの効果は、エラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫでブロックされた。マイクロプレートカウンターでＡ４０５ｎｍでのｐＮＡの放出を測定することにより、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の速度論を１時間追跡した。反応の初期速度は、アドホックコンピュータープログラムを使用して計算した。
２．ＮＥＴに結合したエラスターゼによるプラスミノーゲンのフラグメント化。ＮＥＴの形成およびＨＢＳＳによる洗浄に続いて、プラスミノーゲンは１μＭをＮＥＴとともに３７℃で１５分～４時間インキュベートした。示されている場合、プラスミノーゲンを添加する前に、ＮＥＴをエラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫまたはα１－ＰＩで前処理した。インキュベーション後、プレートを３０００ｇで５分間遠心分離し、各ウェルの上清を収集して、さらに分析するために－２０℃で保存した。フィブリン表面の底に残っている材料は、１００μｌのサンプルバッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ６．８、２％ＳＤＳ）または１００μｌのＨＢＳＳを使用して擦ることによって回収し、それぞれウエスタンブロッティングまたはＨＮＥ活性の検出に使用した。ＨＢＳＳで収集されたサンプルのＨＮＥ活性は、上で示されているように、発色基質ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡ（ウェル当たり１００μｌ、ＨＢＳＳでの最終濃度は１．５ｍＭ）で測定した。プラスミノーゲンタンパク質分解は、ＳＤＳ－１０％ＰＡＧＥによってＴｒｉｓ－ＳＤＳに収集されたサンプルで、その後、プラスミノーゲンＫ１（ＣＰＬ１５－ＨＲＰ、１００ｎｇ／ｍｌ）（３５）に対するｍＡｂまたはポリクローナルヒツジＩｇＧ（１２５μｇ／ｍｌ）、続いて二次抗ヒツジＩｇＧ－ＨＲＰ（１：２００００）を用いるウエスタンブロッティングで調査した。信号は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＵＫ）のＥＣＬキットおよび開発用のＣｕｒｉｘ－６０－ＡＧＦＡを使用して検出された。

敗血症性ショック患者の血漿中のプラスミノーゲン、プラスミノーゲンフラグメント、およびプラスミン形成の検出
プラスミノーゲンは、改変を加えた、説明したような機能活性アッセイで定量した（４１）。簡単に説明すると、血漿を、７５ｉ．ｕ．／ｍｌウロキナーゼ、１ｍＭのトラネキサム酸および０．７５ｍＭのプラスミン選択的発色基質を最終容量５０μｌで添加したアッセイバッファー（リン酸塩８０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＢＳＡ ２ｍｇ／ｍｌ）で１：５０に希釈した。反応の動力学に続いて、動力学モードのマイクロプレート光度計でＡ４０５ｎｍでのｐＮＡの放出を測定した。結果は、既知の濃度の精製プラスミノーゲン（０．２～１μＭ）を補充したプラスミノーゲン枯渇血漿で作成された標準曲線を参照することにより、ｎＭ濃度で与えられた。血漿中に存在するプラスミノーゲンフラグメントは、上記のようにウエスタンブロットによって最初に検出された。さらなる同定は、質量分析によって得られた（上記を参照）。フィブリンマトリックス上のプラスミン形成は、上記のように、健康な対照および患者の血漿からのユーグロブリン画分をプラスミノーゲンの供給源として使用して測定された。フィブリン－ＮＥＴマトリックスへのプラスミノーゲン活性化。プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の速度論は、Ａ４０５ｎｍでのｐＮＡの放出を測定することによって１時間追跡され、反応の初速度は上記のように計算された。

ヒト血漿中の好中球細胞外トラップの検出
ＮＥＴの血漿ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体は、以下の改変を加えた、記載されているようなＥＬＩＳＡキャプチャーアッセイ（１９）を使用して同定された。ＨＮＥはプラスミノーゲンフラグメント化に関与する酵素であり、ＮＥＴの最も豊富な顆粒成分でもあるため、我々は、抗ＨＮＥ抗体を使用してＨＮＥ－ＤＮＡ複合体を捕捉することを選択する。抗体（１０μｇ／ｍｌ）は、フィブリノーゲンについて前述したように、ポリ（グルタルアルデヒド）で活性化されたＵ９６ウェルポリ塩化ビニルプレートに固定化された。５０μｌの体積の希釈ヒト血漿を、製造元の指示（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ペルオキシダーゼ標識抗ＤＮＡモノクローナル抗体（市販の細胞死検出ＥＬＩＳＡキットのコンポーネントＮｏ．２）と組み合わせて、ウェル当たりに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、サンプルをウェル当たり１００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを１００μｌ／ウェル添加した。上記のマルチウェルプレート光度計を使用して、暗所で３７℃で波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。

結果
フィブリンマトリックス上に放出されたＮＥＴは密な格子を形成する
ＮＥＴは、主にＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色されたＤＮＡで構成される細胞外線維ネット
ワークとして同定された。活性アッセイを使用してＤＮＡに結合したＨＮＥを検出することにより、さらなる同定が達成された（図１）。刺激されていない好中球は、フィブリンマトリックスを含むまたは含まないプレート上で、３７℃で４時間のインキュベーションの前または後のいずれかで容易に認識される典型的な細胞内小葉核を示した（図１Ａ、好中球）。細胞外ＤＮＡは刺激されていない好中球では観察できず、フィブリンだけではＮＥＴの形成および放出を促進する能力がなかったことを示している。フィブリンの非存在下で同様の条件下で放出されたＮＥＴは、孤立しているように見え、編まれていなかった（図１Ａ、ＮＥＴ）。対照的に、フィブリンに播種された刺激された好中球によって放出された細胞外ＤＮＡは、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色後にはっきりと見える繊維の密なインターレースを形成し（図１Ａ、ＮＥＴ－フィブリン）、フィブリン上に広がるＤＮＡは、フィブリン繊維に沿った正電荷の規則的な分布によって支持されたことを示唆している（４２）。フィブリン単独は、ＮＥＴの出現密度に影響を与え得る自家蛍光を示さなかった（表示せず）ことに留意されたい。ＮＥＴに結合したＨＮＥの存在は、エラスターゼ選択的発色基質ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ｐＮＡで検出された（図１Ｂ）。ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体のタンパク質分解活性は、ペプチジルクロロメチルケトンエラスターゼ阻害剤ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫによって完全にブロックされた（図１Ｂ）。対照的に、上清中または血漿に添加された可溶性ＨＮＥを効率的に阻害するα_１－ＰＩ（図１Ｃ）は、ＤＮＡ関連ＨＮＥの活性を約２０％しか低下させなかった（図１Ｂ）。無関係の阻害剤であるアプロチニンは、ＮＥＴまたは細胞上清にα１－ＰＩ（４０μＭ）と同様の濃度で添加した場合、ＨＮＥの活性に影響を与えなかった（図１Ｂ）。これらのデータは、フィブリンマトリックス上に広がるＨＮＥ－ＤＮＡ格子が完全に活性であることを示している。

ＮＥＴのＨＮＥ・ＤＮＡ複合体はプラスミノーゲンを明確に定義されたフラグメントに切断する。
溶液中のＨＮＥ（好中球によって精製または放出される）が既知の構造のプラスミノーゲンフラグメントを生成することはよく知られている（４、４４）。ただし、ＮＥＴに結合されたＨＮＥがプラスミノーゲンをフラグメントに切断できるかどうかは不明である。この仮説を調査するために、我々はプラスミノーゲンをフィブリンマトリックス上に広がったＮＥＴの格子とともにインキュベートした。図２Ａは、プラスミノーゲンフラグメントがＮＥＴとの３０分および１時間のインキュベーション後にすでに存在していたことを明確に示している。相対分子量が９２ｋＤａ、４７ｋＤａ、および３２ｋＤａの３つの主要なバンド、ならびに４７ｋＤａのバンドの上に約５０ｋＤａの追加の小さなバンドが観察された。より長いインキュベーション時間はこのパターンを変更しなかった（図２Ｂ）。プロテオミクス分析により、９２ｋＤａバンドがヒトプラスミノーゲン、４７および５０ｋＤａバンドがフラグメントＫ１＋２＋３、３２ｋＤａバンドがＫ５－ＳＰであることが確認された（図６）。Ｋ４は、ＮＥＴ－ＨＮＥ処理プラスミノーゲン（図６）およびＨＮＥ処理プラスミノーゲンの精製サンプル（図７）のプロテオミクス分析によって明確に同定された。ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体は、ＮＥＴを選択的プロテイナーゼ阻害剤とプレインキュベートすることによりプラスミノーゲンを特異的に切断することが確認された。エラスターゼ特異的阻害剤であるＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫとのプレインキュベーションは、ＨＮＥを完全に阻害し、プラスミノーゲンのフラグメントへの変換を無効にし、ＨＮＥがＮＥＴで活性であることを確認した（図２Ｃ）。対照的に、プラスミンおよびカリクレイン阻害剤であるアプロチニンは、エラスターゼの活性またはプラスミノーゲンフラグメントの出現を変更することができなかった（図１Ｂ）。エラスターゼの特異的阻害剤であるα１－ＰＩはＨＮＥ－ＤＮＡ複合体の活性にわずかな減少効果しかなかったため（図１Ｂ）、観察されたプラスミノーゲンフラグメントがＨＮＥ－ＤＮＡ複合体のタンパク質分解活性によって生成されることを示している。

ＮＥＴ ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントは線維素溶解を妨害する
ＮＥＴのＨＮＥ・ＤＮＡ複合体がプラスミノーゲンをフラグメントＫ１＋２＋３、Ｋ４
およびＫ５－ＳＰに切断することを実証したので、線維素溶解におけるそれらの役割の重要な質問に答えることが求められた。その目的のために、フィブリンマトリックスに播種された好中球は、上記のようにＰＭＡを用いてＮＥＴを放出するように促された。次に、フィブリン－ＮＥＴ格子に結合したｔＰＡによるプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を、プラスミン選択的発色基質を使用して評価した。フィブリン－ＮＥＴ格子でのプラスミノーゲンのプラスミンへの時間および濃度依存性の変換は、フィブリン単独と比較して減少した（図３Ａ～Ｂ）。エラスターゼ選択的阻害剤であるＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫをフィブリン－ＮＥＴ格子とプレインキュベートすると、プラスミン形成が対照値に回復した。これは、ＨＮＥタンパク質分解活性がプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を妨げることを示している。形成され、フィブリン－ＮＥＴ格子に結合したままのプラスミンの量は、ＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫの存在下での同様の条件と比較して約５０％減少した（図３Ｃ）。フィブリン上に形成されるプラスミンの量のこの減少は、フィブリン表面から溶出された分子種のウエスタンブロット同定によって示されるように、ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によるプラスミノーゲンフラグメント化に関連していた（図３Ｄ）。全体として、図３のデータは、プラスミノーゲンフラグメントがＨＮＥ・ＤＮＡ複合体と低い線維素溶解活性を含むフィブリンマトリックスで同定されたことを示している。対照的に、プラスミノーゲンフラグメントは存在せず、線維素溶解活性は、フィブリン－ＮＥＴマトリックスをＭｅＯ－Ｓｕｃ－ＡＡＰＶ－ＣＭＫで前処理した場合の対照フィブリンと同様であった。

敗血症性ショック血漿におけるＮＥＴ、プラスミノーゲンフラグメント、ＨＮＥ・α１－ＰＩおよび線維素溶解活性。
試験したパラメーターの結果を以下の表１に示す。

ＮＥＴは、敗血症性ショックおよび播種性血管内凝固の患者（患者０．２７６±０．０４３；健康な対照：０．０８６±０．０１４、Ａ４０５ｎｍ）のサンプル中のＨＮＥ・ＤＮＡ複合体を測定することによって検出された。機能アッセイで測定したプラスミノーゲンの濃度は５２０±１８０ｎＭであった（健康な対照ｎ＝３１：１．６９±０．３３μＭ）。循環ＨＮＥ・α１－ＰＩ複合体は、健康な対照と比較して患者で８倍増加し、それぞれ４３７±２７４対４３±１９ｎｇ／ｍｌであった。患者は、中等度の細胞溶解ではあるが、肝機能障害の兆候なしに、Ｄ－ダイマー（１２±８ｍｇ／ｌ）およびプラスミン－α２－アンチプラスミン（範囲４８１４～１５９ｎｇ／ｍｌ、中央値１２０７ｎｇ／ｍｌ）が上昇していた。ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントの存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって証明された。図４は、健康な対照と比較して、７人の選択された患者で検出されたプラスミノーゲンフラグメントのパターンを示している。プラスミノーゲンに加えて、３つの主要なプラスミノーゲンフラグメントが、非常に豊富なタンパク質（ユーグロブリン画分またはリジン親和性画分）が枯渇したサンプルからのタンパク質バンドのアミノ酸配列の質量分析によって同定された。プラスミノーゲンフラグメントは、Ｋ１＋２＋３、Ｋ１＋２を含むプラスミノーゲンフラグメント＋３＋４、およびＫ５－ＳＰで構成されるプラスミノーゲンフラグメントを含む（図６）。小さな孔径またはより短い移動時間のアクリルアミドゲルを使用したにもかかわらず、敗血症性ショック患者の血漿サンプルではＫ４は検出されなかった。対照的に、Ｋ４は、ＮＥＴまたはＨＮＥのみで処理された精製プラスミノーゲンで明確に同定された（図６～７）。

ＮＥＴおよびプラスミノーゲンフラグメントが線維素溶解に及ぼす影響を調べるために、敗血症性ショック血漿サンプルのユーグロブリン画分をフィブリン表面に結合したｔＰＡとともにインキュベートし、形成されたプラスミンの量を発色基質で定量した。異なる敗血症性ショック血漿を正常血漿のプールと比較すると、プラスミンの生成が減少した（＞５０％）（図５）。これらの血漿のかなり低いプラスミノーゲン濃度を補うために、精製されたプラスミノーゲンを通常の血漿プールの濃度と同様の濃度に加えた。その結果、形成されるプラスミンの量は、プラスミノーゲンを補充した血漿のわずか３つ（Ｓ１、Ｓ３、Ｓ５）で正常になる傾向で増加した。残りの血漿サンプルＳ２、Ｓ４、Ｓ６）で不十分またはわずかな応答が観察され、プラスミノーゲンの添加に対する競合効果が示唆された。

考察
主要な抗菌メカニズムであるネトーシスは、感染症および非感染症の両方で代替の役割を果たす。例えば、敗血症性ショックでは、活性化された好中球が細胞外トラップを放出し、病原体を捕らえ、かつ凝固を活性化してフィブリンを形成する。結果として生じる微小血管血餅は、免疫血栓症と呼ばれるメカニズムであり、ＮＥＴ酵素による病原体の制限および殺害に有利に働く（２０、４５、４６）。凝固と自然免疫との間のこの相互接続されたメカニズムのいくつかのアクターはまた、制御されていない血栓症を助長し、それによって反応の初期の利益を妨げる可能性がある（４７）。結果として、ＮＥＴは、敗血症ショック関連血管内凝固に寄与し得る。実際、我々は、血管内凝固を有する敗血症性ショック患者で循環ＮＥＴを検出した（４８）。これは、最近の研究で確認された所見である（４９～５２）。この例は、止血平衡の反対側である線維素溶解反応におけるＮＥＴの役割に焦点を当てている。

蛍光ＤＮＡ結合剤を使用して、本発明者らは、フィブリン表面上にインビトロで形成されたＮＥＴが、フィブリンの非存在下で放出されたＮＥＴよりも密度が高く、より網目状の外観を示すことに注目しいている。フィブリン繊維に沿って規則的に分布する正電荷は、負に帯電したＤＮＡと相互作用し、絡み合ったフィブリン－ＮＥＴマトリックス内のＤＮＡ繊維のより高密度の外観をもたらす。これらの発見は、血餅に組み込まれた無細胞ＤＮＡがフィブリンの構造を改変し、プラスミン媒介分解に対して耐性を与えることを示す以前に報告されたデータと一致する（２６、２８）。血栓内のＤＮＡおよびフィブリンの絡み合ったアセンブリは、インビトロでのｔＰＡ誘発性線維素溶解（２１、２９）および急性虚血性脳卒中患者の血栓溶解に対するＮＥＴを介した耐性（５４）で示唆され得る。このような線維素溶解耐性は、ヒストンによる持続的な血小板活性化（２１）およびＨＮＥによる組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）（４５）による持続する血栓性閉塞に寄与し得る。実際、本発明者らは、フィブリンと絡み合ったＮＥＴが、α１－ＰＩによる阻害に感受性のないＤＮＡと複合体を形成した活性ＨＮＥを含むことを実証している。同様に、ＮＥＴ関連のマウスＮＥは、肝臓の血管系内でタンパク質分解的に活性であることがわかった（５５）。対照的に、好中球の原形質膜に結合したエラスターゼは容易に放出され、循環するα１－ＰＩと可溶性の不可逆的な複合体を形成する（７）。ＨＮＥ活性に対するＤＮＡの機能は、白血球顆粒セリンプロテアーゼがナノモルの親和性でＤＮＡに結合し、ＨＮＥに血漿阻害剤に対する耐性を与え、タンパク質基質の局所分解を確実にすることを示す以前の発見と一致している（９、１１、１２、１７）。

この例は、活性なＨＮＥ－ＤＮＡ複合体を含むＮＥＴの存在下で、プラスミノーゲンは、明確に定義されたサイズのフラグメントである、フィブリン結合ｔＰＡによってプラスミンを生成する能力を失ったＫ１＋２＋３、Ｋ１＋２＋３－４、Ｋ４およびＫ５－ＳＰに還元されることを明確に示している。これらのプラスミノーゲンフラグメントは、インビトロで活性化された好中球によって放出されたＮＥＴにプラスミノーゲンが添加されたときに検出された。フラグメントの性質は、アミノ酸配列の質量分析によって確実に特定された。Ｋ１を有するプラスミノーゲンフラグメントは、フィブリンへのプラスミノーゲン結合、プラスミン生成および線維素溶解の強力な阻害剤であることが以前に示されているので（５６～５８）、本発明者らはこれらのメカニズムにおけるＮＥＴの役割を調査する。本発明者らが使用した実験的フィブリン－ＮＥＴ格子は、ＮＥＴ－ＨＮＥ由来のプラスミノーゲンフラグメントと、プラスミノーゲン結合および活性化に対するＫ１含有フラグメントの競合効果の両方を検出するのに適した優れたセットアップである。本発明者らは、プラスミノーゲンがＮＥＴ－フィブリン格子上のフィブリン結合ｔＰＡによって活性化されると、ｔＰＡによって生成されるプラスミンの量の減少がそのようなフラグメントの出現と同時に起こったことを実証する。これらのデータは、これらのプラスミノーゲンフラグメントがフィブリンへの結合についてプラスミノーゲンと競合し、それによってプラスミンを生成するその能力を低下させることを示している。

本明細書で説明する抗線溶効果とは異なり、ＨＮＥの基質となる可能性のある止血の他のタンパク質成分があり、その一部は、血栓の形成および溶解に直接または間接的な影響を与える可能性がある。特に、ＨＮＥは、ＴＦＰＩを不活性化することによる凝固促進活性（４５）、またはフィブリンの直接切断による（５９）、α２－アンチプラスミンまたはＰＡＩ－１の分解による（６０、６１）もしくはミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）を産生することによる（５）線維素溶解促進活性のいずれかを発揮し得る。ミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）は、溶液中のウロキナーゼによって活性化され得るが、フィブリンに結合しないため、フィブリン表面でｔＰＡによって活性化されない、結果として、ｔＰＡ－フィブリン依存性の血餅溶解に対するＫ５－ＳＰの影響はごくわずかである（５、６２）。

まとめると、結果は、ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体がプラスミノーゲンフラグメントを生成し、プラスミノーゲン濃度を低下させることによって抗線溶作用を発揮することを明確に示している。

ＤＩＣおよび循環ＮＥＴを有する敗血症性ショック患者からの血漿サンプルにおけるインビトロでのＮＥＴ誘発性線維素溶解障害の指標を調査した。本発明者らは、このグループの患者は、プラスミノーゲン濃度が低く、プラスミノーゲンフラグメントを循環させ、フィブリン上でプラスミンを生成できない（正常な血漿のプールと比較した場合、５０％未満）ことを明確に示しており、このことは、観察された血管内凝固および多臓器不全に明確に寄与し、および／またはその原因となる。ウエスタンブロットによって検出され、選択された患者の血漿画分における質量分析アミノ酸分析によって同定されたタンパク質
バンドは、無傷のプラスミノーゲンおよびプラスミノーゲンフラグメントＫ１＋２＋３、Ｋ１＋２＋３＋４およびＫ５－ＳＰに対応する。これらのフラグメントは、精製されたＨＮＥによってインビトロで切断されたプラスミノーゲンに由来するフラグメントと同一であった（４４）。

α１－ＰＩはμＭ濃度で循環し、非常に高い結合定数（Ｋａ＝６．５×１０７Ｍ－１ｓ－１）ですべての遊離ＨＮＥを阻害するため（６）、好中球によって放出されるエラスターゼは、で血症性ショック患者から血漿中のＨＮＥ－α１ＰＩ複合体として容易に発見された。したがって、ＨＮＥ－α１ＰＩ複合体は、敗血症における好中球活性化のマーカーである。本発明者らは、これらの患者の血漿中に活性エラスターゼが存在しない場合、血漿中に見出されるプラスミノーゲンフラグメントが活性ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によって産生されたことを実証している。これらのデータは、敗血症性ショックの患者に見られるプラスミノーゲンフラグメントが血餅のフィブリン－ＮＥＴマトリックス上で局所的に生成された、というメカニズムの経路を強く支持している。それにもかかわらず、フィブリンに加えて、カルボキシ末端リジンを有するヒストンＨ２Ｂは、ＤＮＡ繊維に結合したＨＮＥの近くでプラスミノーゲンを捕捉する可能性がある（６４）。α１－ＰＩに非感受性の活性ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体を含む循環ＮＥＴはまた、プラスミノーゲンのフラグメント化に関与し得る。

実証されているように、ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によるプラスミノーゲンのタンパク質分解は、敗血症性ショック患者の血漿で検出される全長プラスミノーゲンの低濃度、すなわち１μＭ未満の原因の一部である。プラスミノーゲンフラグメントの抗線溶活性と組み合わせた低濃度のプラスミノーゲンは、敗血症性ショックにおける不十分な線維素溶解をもたらし、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）をもたらす。これらのパラメーター、プラスミノーゲン濃度、プラスミノーゲンフラグメント、およびプラスミン形成の失敗は、敗血症および敗血症性ショック誘発性ＤＩＣにおけるＮＥＴの役割を評価するための関連する新しい予後マーカーであり、敗血症性ショック患者の死亡率および臓器不全の予測因子として機能する。

これらの血漿の低いプラスミノーゲン濃度は、部分的に低い線維素溶解活性を説明することができるので、血漿は、試験前にプラスミノーゲンで補充された。正常な血漿プールと同様のプラスミノーゲン濃度に達したにもかかわらず、試験した６つの血漿のうちの３つは、線維素溶解活性を正常な値に戻すことができなかった。これらの結果は、おそらくＫ１を含む循環ＨＮＥ由来プラスミノーゲンフラグメントの存在に関連するプラスミノーゲンに対する競合効果を示している。

結果は、ＮＥＴのＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によって誘発される線維素溶解の深刻な減少が敗血症性ショック中の微小循環における血栓の持続性と安定化に寄与することを明確に示している。

本発明者らはまた、微小循環における敗血症性ショック血栓症が、線維素溶解不全を誘発するＨＮＥ－ＤＮＡ複合体の能力に関連していることを実証している。図５に示すように、敗血症性ショック患者の血漿中の線維素溶解能のこの低下の特定は、これらの患者の線維素溶解反応を改善するための実行可能な代替案の探索に実際的な意味を持っている。例えば、活性酵素、すなわちＨＮＥ－ＤＮＡ複合体、および基質、すなわちプラスミノーゲンは、敗血症－ＤＩＣの治療に有用な新しい標的および／または化合物を提示する。

本発明者らは、ＮＥＴまたはＮＥＴのフラグメントが、プラスミノーゲンの濃度およびプラスミン形成の両方を減少させるように作用する阻害活性（フィブリンに結合するプラスミノーゲンの競合物）を有するプラスミノーゲンフラグメントの産生に関与する活性エ
ラスターゼを含むことを実証する。全体として、エラスターゼ由来のプラスミノーゲンフラグメントの低いプラスミノーゲンおよび阻害活性は、線維素溶解系を無効にすることに寄与し、したがって、微小血栓症および臓器不全に有利に働く。

この例は、活性なＨＮＥ－ＤＮＡ複合体によるプラスミノーゲンのフラグメント化と、それに伴うプラスミノーゲン濃度の低下、およびプラスミン形成が線維素溶解を弱めるために必要であることを明確に示している（図４）。また、プラスミンを生成する能力が低いことは、プラスミノーゲン濃度が低いことと、エラスターゼ由来のプラスミノーゲンフラグメントによる競合効果との両方に起因する、フィブリンに結合するプラスミノーゲンの量の減少に関連していることを示している。データは、ＨＮＥ－ＤＮＡ複合体がメカニズムの中心にあり、タンパク質分解によるプラスミノーゲンの消費を介して重度の線維素溶解障害を引き起こし、抗線溶性プラスミノーゲンフラグメントの生成をもたらすことを明確に示している。この線維素溶解不全は、微小血栓の溶解障害の原因であり、それによって微小循環におけるそれらの安定化を促進し、敗血症性ショック中のＤＩＣおよび臓器不全の一因となる。

この例は、プラスミノーゲンのレベルが、特に敗血症性ショック中のＤＩＣに関連する線維素溶解反応の生物学的マーカーであることを明確に示している。

この例はまた、プラスミノーゲンがＤＩＣに関連するネトーシスおよび敗血症性ショックに苦しむ患者の線維素溶解活性を回復し、補充によるこれらの患者の新しい治療法を構成することを明確に示している。

例２：敗血症－および敗血症性ショックＤＩＣにおける線維素溶解反応の指標であるプラスミノーゲン
プラスミノーゲンは、血餅を溶解するために必要な酵素であるプラスミンの前駆体である。プラスミノーゲンは、内皮プラスミノーゲン活性化因子ｔＰＡによってプラスミンに変換される。プラスミノーゲンは、１．５～２μｍｏｌ／Ｌ（１３８μｇ／ｍｌ～１８４μｇ／ｍｌ）の範囲の濃度で血中を循環し、これは、フィブリンに対するｔＰＡによって完全なプラスミン活性を生成するのに必要な量を超えている。ただし、１μＭ未満の濃度では、プラスミノーゲンはプラスミン生成の律速因子であり、線維素溶解が不十分になる可能性がある（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９５）。

実際、以前の研究では、血栓溶解の速度は、フィブリンへの蓄積を支配する利用可能なプラスミノーゲンの量によって制限されることが示されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ １９９１；Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １９９２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９５）。したがって、循環からの継続的なプラスミノーゲン供給は、血栓への蓄積を確実にし、その最適な溶解の可能性を維持するために必要である。ただし、この供給は、微小循環の血栓症がプラスミノーゲンの重要な減少と組み合わされる病的状態では制限され、不十分な血栓溶解による血流の低下は、それによって臨床的予後を悪化させる可能性がある。

上記の例１は、播種性血管内血栓形成（ＤＩＣ）を示す敗血症性ショックの患者では、機能的プラスミノーゲン濃度が１μＭ未満、または重症の場合は０．５μＭ未満であることを明確に実証している（図９）。

敗血症性ショックの患者に見られるプラスミノーゲン濃度の低下は、ＤＩＣに続発する線維素溶解による消費に一部起因する可能性がある（循環プラスミン・ａ２－アンチプラスミン複合体およびＤ－ダイマー血漿濃度によって示されるように）。ただし、ＤＩＣでの微小血栓の持続は、線維素溶解反応の失敗を示している。

ＤＩＣによる敗血症性ショックでは、好中球および血小板が協調して作用し、免疫血栓症と呼ばれる相互結合プロセスで好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の凝固および形成を促進する（２０、４５）。ＮＥＴの形成は、敗血症性ショックの中間メカニズムである（図４）。

ＮＥＴは、エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、その他の顆粒状タンパク質を含むＤＮＡ繊維である。遊離エラスターゼとは異なり、ＮＥＴ関連エラスターゼはａ１－プロテイナーゼ阻害剤に耐性があるため、プラスミノーゲンを切断して、プラスミンを生成する能力を失ったよく知られたフラグメントにすることができる。

結果は、ＤＩＣの敗血症性ショック患者で検出された機能的プラスミノーゲンの濃度の重要な減少が、主にＮＥＴのエラスターゼ－ＤＮＡ複合体によるタンパク質分解に関連していることを明確に示している。エラスターゼによる全長プラスミノーゲン、Ｎ－ｔｅｒ領域－Ｋ１－Ｋ２－Ｋ３－Ｋ４－Ｋ５－ＳＰ（Ｋ：クリングルドメイン、ＳＰ：セリンプロテアーゼ領域）のタンパク質分解は、プラスミノーゲンフラグメントＫ１＋２＋３、Ｋ１＋２＋３＋４、Ｋ４およびＫ５－ＳＰ（ミニプラスミノーゲンとも呼ばれる）を生じさせる。

患者のコホート（ｎ＝１００）で得られたデータは、健康なボランティアと比較して、敗血症性ショックおよび低プラスミノーゲンの患者でプラスミン生成が有意に減少することを示している。プラスミンを形成する能力が低いと、線維素溶解が不十分になり、微小循環（ＤＩＣ）での血栓の存在と、敗血症性ショックの患者での関連する多臓器不全に有利に働く。ＤＩＣに関連する広範な虚血性組織損傷は、複数の臓器（特に肺、腎臓、肝臓、および脳）の障害につながる。

これらの血漿を使用したフィブリン表面へのプラスミン生成に関するデータは、ミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）が、エラスターゼ・ＤＮＡによるプラスミノーゲンタンパク質分解のマーカーであることを超えて、とりわけ、非線維素溶解ミニプラスミンの供給源、すなわち線維素溶解不全の原因であることを示している。ミニプラスミノーゲンを含む血漿は、フィブリンに結合する能力を欠く、すなわち血漿阻害剤によって容易に阻害され、したがって線維素溶解に対する特異性を持たないミニプラスミンを生成する。このように、血漿中のＫ５－ＳＰは、全長プラスミノーゲンの機能的決定および線維素溶解の評価を妨害する。

内因性循環プラスミノーゲンの重要な減少を有する敗血症性ショックを有する患者へのプラスミノーゲンの投与は、効果的な線維素溶解、血栓溶解、および患者の健康の回復を改善するために有利である。この文脈において、プラスミノーゲンモニタリング（完全長タンパク質および／またはそのフラグメント）は、敗血症性ショック患者におけるＤＩＣに対する線維素溶解反応および臓器機能障害へのその進化の評価、ならびに進行中のヒトＧｌｕ－プラスミノーゲンによる補充療法中のプラスミノーゲン回復のモニタリング、における重要な決定要因である。

ＤＩＣおよび／またはプラスミノーゲン関連線維素溶解不全の診断、およびプラスミノーゲン補充によるその治療の両方のための、例えばネトーシス関連敗血症性ショックを伴う患者の診断および／またはフォローアップにおける重要な分析手段としてのプラスミノーゲン（および／またはそのフラグメント）。

線維素溶解およびＮＥＴの成分／パラメーターは、健康な個体（ｎ＝３１）と比較して敗血症性ショック（ｎ＝１００）の患者で分析される。
さらに、この例は、ミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）の測定がエラスターゼ・ＤＮＡ活性の直接的なマーカーであり、とりわけ、敗血症、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、および自己免疫疾患などのＮＥＴに関連する病状のマーカーであることも明確に裏付けている。機能アッセイによるミニプラスミノーゲンの評価はまた、線維素溶解不全におけるその役割についての情報を提供し得る。

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１４．Ｋｅｎｎｙ，Ｅ．Ｆ．，Ｈｅｒｚｉｇ，Ａ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｒ．，Ｍｕｔｈ，Ａ．，Ｍｏｎｄａｌ，Ｓ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，Ｂｅｒｎｕｔｈ，Ｈ．Ｖ．，ａｎｄ Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ａ．（２０１７）Ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｔｉｍｕｌｉ ｅｎｇａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｅｌｉｆｅ ６
１５．Ｆｕｃｈｓ，Ｔ．Ａ．，Ａｂｅｄ，Ｕ．，Ｇｏｏｓｍａｎｎ，Ｃ．，Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｉ．，Ｗａｈｎ，Ｖ．，Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ，Ｙ．，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，ａｎｄ Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ａ．（２００７）Ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｇｒａｍ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７６，２３１－２４１
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１７．Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｗｈａｎｇｂｏ，Ｊ．，ＭｃＣｒｏｓｓａｎ，Ｇ．，Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｒｔｉｎｏｄ，Ｋ．，Ｗａｌｃｈ，Ｍ．，ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．（２０１４）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９２，５３９０－５３９７
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２２．Ｇｒａｓｓｌｅ，Ｓ．，Ｈｕｃｋ，Ｖ．，Ｐａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｋ．Ｉ．，Ｇｏｒｚｅｌａｎｎｙ，Ｃ．，Ａｐｏｎｔｅ－Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，Ｃ．，Ｂａｌｄａｕｆ，Ｃ．，Ｇｒａｔｅｒ，Ｆ．，Ｓｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．，Ｏｂｓｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｓ．Ｗ．（２０１４）ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ３４，１３８２－１３８９
２３．ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｏ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｔｅｅｌｉｎｇ，Ｐ．，Ｍａｃｋａａｙ，Ｃ．，Ｐｌｏｅｇｍａｋｅｒｓ，Ｈ．Ｊ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏｓ，Ｃ．Ｍ．、Ｄａｅｍｅｎ，Ｍ．Ｊ．、ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ，Ａ．Ｃ．（２０１３）Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉ ｉｎ
ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １０９，２９０－２９７
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２５．Ｌａｒｉｄａｎ，Ｅ．，Ｄｅｎｏｒｍｅ，Ｆ．，Ｄｅｓｅｎｄｅｒ，Ｌ．，Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｏ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔ．，Ｄｅｃｋｍｙｎ，Ｈ．，Ｖａｎｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ，Ｋ．，ａｎｄ Ｄｅ Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｆ．（２０１７）Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｔｈｒｏｍｂｉ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ８２，２２３－２３２
２６．Ｌｏｎｇｓｔａｆｆ，Ｃ．，Ｖａｒｊｕ，Ｉ．，Ｓｏｔｏｎｙｉ，Ｐ．，Ｓｚａｂｏ，Ｌ．，Ｋｒｕｍｒｅｙ，Ｍ．，Ｈｏｅｌｌ，Ａ．，Ｂｏｔａ，Ａ．，Ｖａｒｇａ，Ｚ．，Ｋｏｍｏｒｏｗｉｃｚ，Ｅ．，ａｎｄ Ｋｏｌｅｖ，Ｋ．（２０１３）Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｌｏｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｂｒｉｎ，ＤＮＡ，ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８，６９４６－６９５６
２７．Ｇｏｕｌｄ，Ｔ．Ｊ．，Ｖｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ａ．Ｒ．，Ｄｗｉｖｅｄｉ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｐ．Ｙ．，Ｆｏｘ－Ｒｏｂｉｃｈａｕｄ，Ａ．Ｅ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ａｎｄ Ｌｉａｗ，Ｐ．Ｃ．（２０１５）Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｃｌｏｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｍｐａｉｒｓ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｓｅｐｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ３５，２５４４－２５５３
２８．Ｖａｒｊｕ，Ｉ．，Ｌｏｎｇｓｔａｆｆ，Ｃ．，Ｓｚａｂｏ，Ｌ．，Ｆａｒｋａｓ，Ａ．Ｚ．，Ｖａｒｇａ－Ｓｚａｂｏ，Ｖ．Ｊ．，Ｔａｎｋａ－Ｓａｌａｍｏｎ，Ａ．，Ｍａｃｈｏｖｉｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｋｏｌｅｖ，Ｋ．（２０１５）ＤＮＡ，ｈｉｓｔｏｎｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｅｘｅｒｔ ａｎｔｉ－ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｐｌａｓｍａ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １１３，１２８９－１２９８
２９．Ｆｕｃｈｓ，Ｔ．Ａ．，Ｂｒｉｌｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．（２０１２）Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ（ＮＥＴ）ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ３２，１７７７－１７８３
３０．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．（２０１６）Ｔｈｅ ｎｅｗ ｓｅｐｓｉｓ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ（Ｓｅｐｓｉｓ－３）：ｔｈｅ ｇｏｏｄ，ｔｈｅ ｎｏｔ－ｓｏ－ｂａｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｕａｌｌｙ－ｑｕｉｔｅ－ｐｒｅｔｔｙ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ４２，２０２７－２０２９
３１．Ｉｂａ，Ｔ．，Ｄｉ Ｎｉｓｉｏ，Ｍ．，Ｔｈａｃｈｉｌ，Ｊ．，Ｗａｄａ，Ｈ．，Ａｓａｋｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｎ．，ａｎｄ Ｓａｉｔｏｈ，Ｄ．（２０１６）Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｕｔｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ＪＡＡＭ）ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ （ＤＩＣ）ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ２０，２８７
３２．Ｈｏｌｖｏｅｔ，Ｐ．，Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．（１９８５）Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ
Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０，１２１０６－１２１１１
３３．Ｇｒａｉｌｈｅ，Ｐ．，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．（１９９４）Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｆｉｂｒｉｎ ｕｓｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１９，９６１－９６７
３４．Ｆｌｅｕｒｙ，Ｖ．，Ｌｏｙａｕ，Ｓ．，Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ． Ｒ．，Ｎｉｅｕ
ｗｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｎ ａｎ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｆｉｂｒｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１６，５４９－５５６
３５．Ｍｏｎｔｅｓ，Ｒ．，Ｐａｒａｍｏ，．Ａ．，Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．，ａｎｄ Ｒｏｃｈａ，Ｅ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｌａｓｍｉｎ－ａｌｐｈａ２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９２，９７９－９８５
３６．Ｇｒｅｎｉｅｒ，Ａ．，Ｄｅｈｏｕｘ，Ｍ．，Ｂｏｕｔｔｅｎ，Ａ．，Ａｒｃｅ－Ｖｉｃｉｏｓｏ，Ｍ．，Ｄｕｒａｎｄ，Ｇ．，Ｇｏｕｇｅｒｏｔ－Ｐｏｃｉｄａｌｏ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｈｏｌｌｅｔ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．（１９９９）Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｂｌｏｏｄ ９３，１４１３－１４２１
３７．Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．，ａｎｄ Ｓｕｌｔａｎ，Ｙ．（１９８４）Ａ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｆｉｂｒｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６９，１１５－１２７
３８．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．，Ｍｏｎｔｅｓ，Ｒ．，Ｐａｒａｍｏ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．（２００２）Ｂｉｖａｌｅｎｃｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｔｏ ｆｉｂｒｉｎ ａｎｄ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｌａｓｍｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５９８，１６５－１７６
３９．Ｋｏｐｐｅｒｔ，Ｐ．．，Ｈｕｉｊｓｍａｎｓ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｗ．（１９８５）Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ Ａ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｎｏｔ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｆｒｅｅ ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ Ａ．Ｂｌｏｏｄ ６６，５０３－５０７
４０．Ｒｙｌａｔｔ，Ｄ．Ｂ．，Ｂｌａｋｅ，Ａ．Ｓ．，Ｃｏｔｔｉｓ，Ｌ．Ｅ．，Ｍａｓｓｉｎｇｈａｍ，Ｄ．Ａ．，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｗ．Ａ．，Ｍａｓｃｉ，Ｐ．Ｐ．，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ａ．Ｎ．，Ｅｌｍｓ，Ｍ．，Ｂｕｎｃｅ，Ｉ．，Ｗｅｂｂｅｒ，Ａ．Ｊ． ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ａｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｄ ｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ３１，７６７－７７８
４１．Ｂａｎｇｅｒｔ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｓ．（２０００）Ａｓｓａｙ
ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｎ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ
ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８４，２９９－３０６
４２．Ｐｏｕｉｔ，Ｌ．，Ｈｕｄｒｙ－Ｃｌｅｒｇｅｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｓｕｓｃｉｌｌｏｎ，Ｍ．（１９７３）Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ ｏｎ ｆｉｂｒｉｎ ｆｉｂｒｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ３１７，９９－１０５
４３．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ Ｏｗｅｎ，Ｃ．Ａ．（２００７）Ｔｈｅ
ｓｕｌｆａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ－
ａｎｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｒｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，１４６４５－１４６５４
４４．Ｗａｒｅｊｃｋａ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｔｗｉｎｉｎｇ，Ｓ．Ｓ．（２００５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｏｎｓ，６－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ
ｏｖｅｒａｌｌ ｏｐｅｎｎｅｓｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９２，７０３－７１２
４５．Ｍａｓｓｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｇｒａｈｌ，Ｌ．，ｖｏｎ Ｂｒｕｅｈｌ，Ｍ．Ｌ．，Ｍａｎｕｋｙａｎ，Ｄ．，Ｐｆｅｉｌｅｒ，Ｓ．，Ｇｏｏｓｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，Ｌｏｒｅｎｚ，Ｍ．，Ｂｉｄｚｈｅｋｏｖ，Ｋ．，Ｋｈａｎｄａｇａｌｅ，Ａ．Ｂ．，Ｋｏｎｒａｄ，Ｉ．，Ｋｅｎｎｅｒｋｎｅｃｈｔ，Ｅ．，Ｒｅｇｅｓ，Ｋ．，Ｈｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒ，Ｓ．，Ｂｒａｕｎ，Ｓ．，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｃ．，Ｓｐａｎｎａｇｌ，Ｍ．，Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｋ．Ｔ．，ａｎｄ Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｂ．（２０１０ Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １６，８８７－８９６
４６．Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａ，Ａ．Ｃ．，Ｔａｖｅｎｅｒ，Ｓ．Ａ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｂ．，Ｇｏｏｄａｒｚｉ，Ｚ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｐａｔｅｌ，Ｋ．Ｄ．，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．，ＭｃＡｖｏｙ，Ｅ．，Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｇ．Ｄ．，Ｋｅｙｓ，Ｅ．Ｍ．，Ａｌｌｅｎ－Ｖｅｒｃｏｅ，Ｅ．，Ｄｅｖｉｎｎｅｙ，Ｒ．，Ｄｏｉｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｆ．Ｈ．，ａｎｄ Ｋｕｂｅｓ，Ｐ．（２００７）Ｐｌａｔｅｌｅｔ ＴＬＲ４ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｔｏ ｅｎｓｎａｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｅｐｔｉｃ ｂｌｏｏｄ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １３ ４６３－４６９
４７．ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｂ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｐ．Ｋｉｍ Ｓ Ｊ Ｔｓｅ Ｍ．Ｅｓｍｏｎ Ｃ Ｔ．Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ Ｅ．，，ａｎｄ Ｊｅｎｎｅ，Ｃ．Ｎ．（２０１７）Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ １２９，１３５７－１３６７
４８．Ｄｅｌａｂｒａｎｃｈｅ，Ｘ．，Ｓｔｉｅｌ，Ｌ．，Ｓｅｖｅｒａｃ，Ｆ．，Ｇａｌｏｉｓｙ，Ａ．Ｃ．，Ｍａｕｖｉｅｕｘ，Ｌ．，Ｚｏｂａｉｒｉ，Ｆ．，Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｔ．，Ｔｏｔｉ，Ｆ．，Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．，Ｍｅｚｉａｎｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｂｏｉｓｒａｍｅ－Ｈｅｌｍｓ，Ｊ．（２０１７）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｎｅｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｈｏｃｋ ４７，３１３－３１７
４９．Ｍａｒｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｔｓｕｄａ，Ｍ．，Ｍｏｒｉ，Ｈ．，Ｔａｋｅｎａｋａ，Ｎ．，Ｇｏｃｈｏ，Ｔ．，Ｈｕｑ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｔａｋｅｙａｍａ，Ｎ．（２０１８）Ｐｌａｓｍａ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＤＮＡ ｌｅｖｅｌ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ２２，１７６
５０．Ｌｉ，Ｘ．，ａｎｄ Ｍａ，Ｘ．（２０１８）Ａ ｂｒｉｅｆ ｃｏｍｍｅｎｔ
ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＤＮＡ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ２２，２９４
５１．Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｇｕｐｔａ，Ｅ．，Ｋａｕｓｈｉｋ，Ｓ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｖ．Ｋ．，Ｓａｘｅｎａ，Ｊ．，Ｍｅｈｔａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｊｙｏｔｉ，Ａ．（２０１９）Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＴｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ４９５，６０６－６１０
５２．Ａｂｒａｍｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｂ．，Ａｌｈａｍｄｉ，Ｙ．，Ａｌｓａｂａｎｉ，Ｍ．，Ｌａｎｅ，Ｓ．，Ｗｅｌｔｅｒｓ，Ｉ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，ａｎｄ Ｔｏｈ，Ｃ．Ｈ．（２０１９）Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ （ＮＥＴｓ）Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ Ｉｌｌ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ
Ｃａｒｅ Ｍｅｄ
５３．Ｎｏｕｂｏｕｏｓｓｉｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｒｅｅｖｅｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｓｔｒａｈｌ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｋｅｙ，Ｎ．Ｓ．（２０１９）Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：ｂａｃｋ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ．Ｂｌｏｏｄ １３３，２１８６－２１９７
５４．Ｄｕｃｒｏｕｘ，Ｃ．，Ｄｉ Ｍｅｇｌｉｏ，Ｌ．，Ｌｏｙａｕ，Ｓ．，Ｄｅｌｂｏｓｃ，Ｓ．，Ｂｏｉｓｓｅａｕ，Ｗ．，Ｄｅｓｃｈｉｌｄｒｅ，Ｃ．，Ｂｅｎ Ｍａａｃｈａ，Ｍ．，Ｂｌａｎｃ，Ｒ．，Ｒｅｄｊｅｍ，Ｈ．，Ｃｉｃｃｉｏ，Ｇ．，Ｓｍａｊｄａ，Ｓ．，Ｆａｈｅｄ，Ｒ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｐｉｏｔｉｎ，Ｍ．，Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｌ．，Ｍａｚｉｇｈｉ，Ｍ．，Ｈｏ－Ｔｉｎ－Ｎｏｅ，Ｂ．，ａｎｄ Ｄｅｓｉｌｌｅｓ，Ｊ．Ｐ．（２０１８）Ｔｈｒｏｍｂｕｓ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍｐａｉｒ ｔＰＡ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｓｔｒｏｋｅ．Ｓｔｒｏｋｅ ４９，７５４－７５７
５５．Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ，Ｅ．，Ｊｅｎｎｅ，Ｃ．Ｎ．，Ｓｕｒｅｗａａｒｄ，Ｂ．Ｇ．，Ｔｈａｎａｂａｌａｓｕｒｉａｒ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｙ．，Ｓａｎｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｗｅｎ，Ｋ．，Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｋｕｂｅｓ，Ｐ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＥＴ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６，６６７３
５６．Ｒｏｕｙ，Ｄ．，Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｆｌｅｕｒｙ，Ｖ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．（１９９２）Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｆｉｂｒｉｎ：ａ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｕｓ ３１，６３３３－６３３９
５７．Ｌａｍａｎｕｚｚｉ，Ｌ．Ｂ．，Ｍｔａｉｒａｇ ｅｌ，Ｍ．，Ｐｅｐｅ，Ｇ．，ａｎｄ Ａｎｇｌｅｓ－Ｃａｎｏ，Ｅ．（２００４）Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ｇｅｎｅｒａｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈａｎ ａｐｏ（ａ）．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９２，１０６６－１０７５
５８．Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｓ．，Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ，Ｉ．，Ｓｏｔｔｒｕｐ－Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｓ．（１９８１）Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
ｔｏ ｆｉｂｒｉｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６６８，３７７－３８７
５９．Ｐｌｏｗ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．Ｓ．（１９７５）“Ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｂｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｐＨ．” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５６，３０－３８
６０．Ｍａｃｈｏｖｉｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｏｗｅｎ，Ｗ．Ｇ．（１９８９）“Ａｎ ｅｌａｓｔａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｕｓ ２８，４５１７－４５２２
６１．Ｗｕ，Ｋ．，Ｕｒａｎｏ，Ｔ．，Ｉｈａｒａ，Ｈ．，Ｔａｋａｄａ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｅ，Ｍ．，Ｓｈｉｋｉｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｔａｋａｄａ，Ａ．（１９９５）“Ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１ ｂｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ： ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．” Ｂｌｏｏｄ ８６，１０５６－１０６１
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６８ Ｗａｒｅｊｃｋａ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｔｗｉｎｉｎｇ，Ｓ．Ｓ．（２００５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｏｎｓ，６－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｏｐｅｎｎｅｓｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ， ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９２，７０３－７１２
６９ ”Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｜ ＮＨＬＢＩ，ＮＩＨ”．ｗｗｗ．ｎｈｌｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ２０ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１７．
７０ Ｌｅｖｉ Ｍ， Ｓｃｕｌｌｙ Ｍ Ｈｏｗ Ｉ ｔｒｅａｔ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｌｏｏｄ ２０１８；１３１（８），８４５－８５４．
７１ Ｐｏｄｏｌｓｋａ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１８－Ｒｅｖｉｅｗ．ＰＭＩＤ ３０３６９２６２．
７２ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０２０ ＰＭＩＤ ３１９８２９３９．
７３ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１９ ＰＭＩＤ ３１８５２５１２
７４．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ Ｗｉｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔａｇｅｓ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐａｔｈｏｌ
Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ １９ Ｏｃｔ ２０１６：Ｖｏｌ．８，Ｉｓｓｕｅ ３６１，ｐｐ．３６１ｒａ１３８
７５．Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ｜ Ｖｏｌｕｍｅ １，ＩＳＳＵＥ ３，Ｐ１８５－１９０，Ｍａｒｃｈ ２９，２０１２）．
７６．Ｌｉｊｎｅｎ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２００１ １０２（１），５３－９．
７７．Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ （ｅｎｚｙｍａｔｉｃ；ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ”，ｅＪＩＦＣＣ，ｖｏｌ １２ Ｎｏ ２，２０００
７８．Ｍ Ｓｔｅｎ－Ｌｉｎｄｅｒ，Ｃ Ｌｉｎｄｅｒ，Ｈ Ｓｔｒａｎｄｅｒ，Ｅ Ｍｕｎｃｋ－Ｗｉｋｌａｎｄ，Ｐ Ｗｅｒｓａｌｌ，Ｓ Ｌｉｎｄｅｒ，Ｂ Ｗｉｍａｎ
“Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ Ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ” Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；１９；３４０９－１４
７９ Ｙ Ｔａｋａｄａ “Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｋｒｉｎｇｌｅ－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｎ ａｎｄ ｕＰＡ”
Ａｃｔｉｏｎｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ １３６３０２，８ ｐａｇｅｓ ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／１３６３０２
８０．Ｚ Ｚｈａｎｇ “Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｋｒｉｎｇｌｅ ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｌｋａｌｉ－Ｂｕｒｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ” Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５，Ｖｏｌ．４６，４０６２－４０７１．ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１６７／ｉｏｖｓ．０４－１３３０
８１．Ｂａｒｂｏｓａ ｄａ Ｃｒｕｚ Ｄ ｅｔ ａｌ“ＤＮＡ－ｂｏｕｎｄ Ｅｌａｓｔａｓｅ ｏｆ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ
Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｐｌａｓｍｉｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｏｆ
ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ Ｐｌａｓｍａ” ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０１８９，３３，１４２７０）
８２．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．“Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｃｌｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（３５）１４４２５－１４４３７
８３．Ｒｉｆｅ Ｕ，Ｍｉｌｇｒｏｍ Ｆ，Ｓｈｕｌｍａｎ Ｓ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎ．Ｂｌｏｏｄ １９６３，２１２，３２２ Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００３，１，２３９７

Claims (15)

1. 第１の生物学的サンプルから、好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を伴う／伴わないＮＥＴを伴う病状に関連する、線維素溶解不全を予測および／または検出するためのインビトロのプロセスであって、プラスミノーゲンおよび／またはその少なくとも１つのフラグメントの濃度を測定することを含む、プロセス。
2. 病状が感染性または非感染性である、請求項１に記載のプロセス。
3. ＮＥＴに関連する病状が、敗血症、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、冠状動脈血栓症、がん、外傷、および自己免疫疾患を含む群から選択される、請求項１または２に記載のプロセス。
4. 前記プラスミノーゲン濃度が、機能的アッセイ、免疫アッセイ、細胞免疫アッセイ、フローサイトメトリー、比色法によって測定される、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
5. 前記プラスミノーゲンフラグメントが、プロテオミクス分析、抗原アッセイ、免疫アッセイ、フローサイトメトリーによって測定される、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
6. 前記生物学的サンプルが、血液サンプル、血漿サンプルを含む群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロセス。
7. 前記プラスミノーゲンフラグメントが、クリングル（Ｋ）１～３ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３}）、クリングル（Ｋ）１～４ドメイン（Ｋ_{１＋２＋３＋４}）ならびに／またはクリングル（Ｋ）５ドメインおよびセリンプロテアーゼ（ＳＰ）領域（ミニプラスミノーゲン）（Ｋ_５－ＳＰ）を含むフラグメントの群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の線維素溶解不全を予測および／または検出するためのプロセス。
8. 前記生物学的サンプルが敗血症性ショックを有する患者に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の線維素溶解不全を予測および／または検出するためのプロセス。
9. ミニプラスミノーゲン（Ｋ５－ＳＰ）の濃度を測定することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の、ＮＥＴに関連する病状を予測および／または検出するためのプロセス。
10. 特にＤＩＣに関連する、線維素溶解不全の治療の有効性を決定するためのインビトロのプロセスであって、
    ａ．化合物で治療する前の第１の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび／またはそのフラグメントの濃度Ｃ１の決定および／または測定と、
    ｂ．前記化合物で治療した後の第２の生物学的サンプルからのプラスミノーゲンおよび／またはそのフラグメントの濃度Ｃ２の決定および／または測定と、任意選択で
    ｃ．前記濃度の比較、および以下の式によるスコア（Ｓ）の計算と、を含み、
    Ｓ＝Ｃ２／Ｃ１
    Ｓの値が１より大きい場合は、前記治療が効果的であることを示す、プロセス。
11. 前記第１および第２の生物学的サンプルが、敗血症性ショックを有する患者に由来する、請求項１０に記載のプロセス。
12. 好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する、線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための、プラスミノーゲン。
13. 好ましくは、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する、線維素溶解不全の治療における薬剤として使用するためのプラスミノーゲンを含む、医薬組成物。
14. 特に敗血症の患者において、好ましくは、中等度／重度のプラスミノーゲン消費／欠乏に関連する、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に関連する線維素溶解不全の治療における薬物として使用するための、プラスミノーゲン。
15. 前記播種性血管内凝固（ＤＩＣ）が、中等度／重度のプラスミノーゲン消費／欠乏に関連している、請求項１３に記載の使用のためのプラスミノーゲンを含む医薬組成物。

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