JP4938786B2 - シトロネラールの生産法 - Google Patents
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Description
Wolkenおよびvan der Werf, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001年、57巻、731頁 StumpfおよびKieslich, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991年、34巻、598頁 Wolkenら、Eur. J. Biochem., 2002年、269巻、5903頁 Wolkenら、J. Agric. Food Chem., 2000年、48巻、5401頁 Trasartiら、J. Catal., 2004年、224巻、484頁 Maki-Arvelaら、J. Mol. Cat. A: Chem., 2005年、240巻、72頁 WilliamsおよびBruce, Microbiology, 2002年、148巻、1607頁 van der WerfおよびBoot, Microbiology, 2000年、146巻、1129頁
20種の酵母株、9種の糸状菌株および17種の細菌株はニューサウスウェールズ大学培養細胞保存機関(世界培養細胞保存番号:World Culture Collection number 248)より得た。酵母株、糸状菌株ならびに細菌Zymomonas mobilisおよびZymobacter palmaeはYPG培地(3 g/l 酵母抽出物、5 g/l ペプトンおよび10 g/l D-グルコース、pH 6.9)中で生育させた。乳酸菌はオキソイド社(Oxoid)の MRS (de Man, Rogosa, Sharpe)ブロス(pH 6.2)中で生育させた。オキソイド社の栄養ブロス (pH 7.4)を他のすべての細菌に用いた。Planococcus citreusおよびVibrio harveyiに対しては、 栄養ブロスに3重量/体積% (% w/v)の塩化ナトリウムを添加した。生育温度は30℃又は37℃であったが、これは報告されている至適生育温度により近くすることに依存したものである。培養は、Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenteroidesおよびPropionibacterium freundenreichiiの非撹拌培養を除き、旋回振盪機中で150 rpmで撹拌培養した。すべての培養は定常期に到達するまで生育させた。透過処理した細胞を作成するために、該生物体を2回緩衝液(50 mM MOPS/KOH, pH 7)中で洗浄し、ついで半量体積(酵母および糸状菌)又は1/4量体積(細菌培養)の該緩衝液に再懸濁した。該懸濁液を、液体窒素および25℃恒温水浴を用いて3回凍結融解を行い、その後分注して-20℃にて保存した。
シトラール(5 mM)は、0.2 Mのイソプロパノール溶液の形態として加えた。2.5体積%(% v/v)のイソプロパノールは2つの役割を果たした、すなわち疎水性基質であるシトラールの溶解度向上と、NAD(P)Hを再生する細胞内アルコール脱水素酵素の基質として潜在的に作用することである。それぞれの培養物は3つの実験に供した。
手順:
500 μlの試料又は水(ブランク)
100 μlの1 Mリン酸カリウム、pH 7.0
100 μlの1 Mグルコース溶液
100 μlのそれぞれ10 M のNADPH/NADH溶液
100 μlのグルコース脱水素酵素を含む大腸菌細胞懸濁液
25 μlの10% cis-/trans-シトラールを含むDMSO溶液
インキュベーション:35℃で少なくとも15時間激しく撹拌する。
5 mlの新鮮培地を5 mlの定常期培養液に温度変化がないように加え、150 rpmで1時間撹拌した後、シトラールのイソプロパノール溶液を加えた。3時間後および24時間後、1 mlのブロスを、新規に調製した0.3体積%の1-オクタノール(GC分析の内部標準物質)を含むクロロホルム溶液0.2 mlにより抽出した。有機相を回収後、イソプロパノールで希釈しGC分析に供した。
0.5 mlの解凍透過処理した細胞を含み、それぞれ最終濃度として50 mM MOPS緩衝液(pH 7)、10 mM NADH、5 mMシトラールおよび2.5体積%イソプロパノールを含む全量1 mlの溶液を注入した2 ml容スクリューキャップガラスバイアルを、旋回振盪機により30℃、150 rpmで振盪撹拌した。3時間後、該試料全てを上記方法にしたがい、クロロホルム/オクタノール溶液にて抽出した。
手順は、最終濃度でそれぞれNADHを1.5 mM NADP+, 10 mM グルコース-6-リン酸、 3.3 mM 塩化マグネシウムおよび0.4 U/ml グルコース-6-リン酸脱水素酵素を含むNADPH再生系と置き換える点を除いて、前記bと同様であった。
生物変換に先立ち、0.5 mlの透過処理した細胞を、2 ml容スクリューキャップガラスバイアル中で0.15 mlのトルエンと共にボルテックス撹拌して、室温下10分間静置した。次いでそのほかの成分を加え、シトラールとイソプロパノールを除いて前記水/NADPH系と同一の組成となる1 mlの水相を得た。反応は、0.05 mlの0.4 Mシトラールを含むトルエン溶液を加えることで開始し、バイアルは、30℃で回転培養器により垂直方向に転回させた。3時間後、該試料全てを、新規に調製した0.15体積%の1-オクタノール(GC分析の内部標準物質)を含むクロロホルム溶液0.4 mlにより抽出した。遠心分離後、0.4 mlの下層の有機相(トルエン/クロロホルム混合液)を、GC分析に用いるために回収した。シトロネラールを形成した細胞株は、トルエンおよびメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)の二相系について、以下に詳細を記す方法により比較した。
図2〜4に示す生物変換は、二相系における培養スクリーニング手順に従うが、4 ml容スクリューキャップガラスバイアル中にて、0.8 mlの水相および0.2 mlの有機溶剤を、水相中の有機溶剤がエマルジョンを維持するように磁気撹拌子で撹拌しながら実施した。組成および条件の詳細は、対応する図の説明に示す。反応開始に先立ち、規定の生物体濃度に調製した洗浄済み細胞0.5 mlを、氷浴上にて30分間、0.15 mlの対応する有機溶剤とともに撹拌した。反応は、0.05 mlの0.4 M シトラールを含む同一有機溶剤を加えることで開始した。
テルペン類の濃度は、キャピラリーカラム(Chrompack CP-SIL 5B、Varian, 50 m x 0.25 mm, 相厚0.12 μm) を接続したガスクロマトグラフィー(GC)により、キャリアーガス(窒素:0.98 ml/min)および水素炎イオン化検出器(250℃、水素:20 ml/min、空気:300 ml/min)の条件によって決定した。試料注入体積は1 μlとし、スプリット比は29:1とした。インジェクター部の温度は250℃とし、カラム温度は100℃で9分間一定とし、その後240℃まで50℃/minで昇温した。1-オクタノールを内部標準物質として用い、テルペン濃度は試料と同一の抽出手順に従った標品を基に算出した。シトロネラールとイソプレゴールの分離のためには、初期カラム温度を12分間75℃とした。ネロールとシトロネロールは前記のいかなる条件においても分離しなかった。これらの分離はキラル分析と同様に、Supelco Beta Dex 225 カラム (30 m x 0.25 mm, 相厚0.25 μm)を用いることで達成した。スプリット比は1:35, カラム流量は2.77 ml/min, カラム温度は95℃で35分間一定とし、その後160℃まで5℃/minで昇温した。シトロネラールは、いずれのGCカラムにおいても標品のシトロネラールとの共溶出にて同定した。
20種の酵母株、9種の糸状菌株および17種の細菌株について、3種類の水系、すなわち、培養液中の全細胞を用いた場合、又は洗浄および透過処理した細胞にNADHを加えて用いた場合、又は前記細胞にNADPHを加えて用いた場合におけるシトラールの変換試験を実施した。透過処理したZymomonas mobilisにNADPHを加えた場合のみがシトロネラールを形成した。NADPH再生系又はNADPHの直接添加のどちらもシトロネラールの形成を支持した。透過処理した細胞に対するNADH又はNADPH添加と同様に、全細胞培養物で試験した多くの株において、ゲラニオールが主生成物であった。また、ネロールおよび/又はシトロネロールも形成した。このように、アルデヒド基の還元に対する酵素活性は、二重結合の還元に対して必要となる活性と競合した。
Zymomonas mobilisを用いて、シトラールからシトロネラールへの変換に対する有機/水二相系の実施可能性を試験した。図2aは、様々な水可溶(アスタリスク)および水不溶性溶剤の非存在下および存在下におけるシトロネラール形成を、官能基順に2種の直鎖アルカン、9種の脂肪族アルコール、3種のケトン、2種のエステル、2種のエーテルおよび3種の芳香族溶剤の順に配列して図示する。4種の溶剤、すなわちイソアミルアルコール、MTBE、ジエチルエーテルおよびトルエンは有機溶剤を含まない対照と比較して、約10倍高い生成物量を支持した。さらなる利点として、ほとんどの溶剤において、副生成物であるゲラニオール、ネロールおよび/又はシトロネロールの量を減少させることとなった(図2b)。対照試験である、ゲラニオール、ネロールおよびシトロネロール標品の抽出で、内部標準物質に対するこれらの抽出量は、例えばイソプロパノール、トルエン又はMTBEが試料中に存在することによって影響を受けないことが確認された。したがって、副生成物量の減少は、アルデヒド基の酵素的還元の低下によるものであったと思われる。トルエンおよびMTBEをさらなる試験のために選択した。
水/トルエンスクリーニング系において、いくつかの株でシトロネラールがシトラールより形成されたが、これらは以前に水スクリーニング系では同定されなかった。比較のために、これらの培養物を同程度の生物体濃度となるように調整し、トルエンおよびMTBE二相系におけるシトロネラール生産を図3に図示する。トルエン系においては、2種の細菌株が9種の真核細胞株に比べて、少なくとも5倍高いシトロネラール濃度を達成した。MTBE系においては、Citrobacter freundiiはトルエン存在下に比べて少量のシトロネラールを形成した。トルエン系ではシトロネラールを形成しなかったIssatchenkia orientalisでは、陽性の結果が得られた。5 mM EDTAの添加はほとんどの株でより高濃度のシトロネラールを得る結果となったが、Citrobacter freundiiおよび糸状菌であるRhizopus javanicusにおいては反対の効果を奏した(図3b)。Zymomonas mobilisによるシトロネラール形成は、EDTAによって影響を受けなかった。
図4に水/トルエン系および水/MTBE二相系におけるZymomonas mobilisによるシトラールの生物変換の特性を図示する。前者については、シトロネラール濃度の増加は3時間にわたってやや直線的に続いた。NADPH再生系の濃度を二倍としたとき、同じシトロネラール最終濃度が達成された。これは、反応がNADPH再生系によって制限されなかったことを示す。ゲラニアールおよびネラールのどちらのシトラール異性体の濃度についても、時間経過とともに減少した。アルコールであるネロール、ゲラニオールおよびシトロネロールは検出されなかった。水/MTBE二相系においては、シトラール異性体であるゲラニアールおよびネラールは時間経過とともに直線的に消費されるものの、シトロネラール形成が時間経過とともに遅くなることが観察された。アルコール副生成物のうち、0.34 mMのゲラニオールおよび0.1 mM未満のシトロネロールが形成された。3時間経過後のモル濃度均衡は、トルエン系では初発基質のうち16%の減少、MTBE系では10%の減少を示した。これに対して、生物体を含まない対照では3時間にわたってシトラール又はシトロネラールの消失を示さなかった。しかしながら、沸騰処理した生物体を含む対照では、該生物変換で観察されたのと同程度のシトラールおよびシトロネラールが消失した。
Zymomonas mobilisの培養:
細胞は以下の組成である培地中、
Bactoペプトン 10 g/l
酵母抽出物 10 g/l
グルコース一水和物 20 g/l
リン酸二水素カリウム 1 g/l
硫酸アンモニウム 1 g/l
硫酸マグネシウム七水和物 0.5 g/l
pH 7.0; 滅菌処理: 20分、121℃
で生育させる。
均質化
106 gの湿生物体を、500 mlの破砕緩衝液(20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 10錠/l コンプリートプロテアーゼインヒビター, pH 8.0)中に再懸濁し、pHは水酸化ナトリウムを用いてpH 6.6から7.5に調整する。懸濁液の100 ml画分を100 mlのガラスビーズ(直径0.1-0.2 mm)と混合し、5000 rpm、12分の条件でボールミル中にて破砕処理する。該ガラスビーズはG1ガラス吸引フィルターを介した吸引処理により除去し洗浄する。濾液(710 ml)は12000 rpm、4℃の条件で30分間遠心分離(Sorvall)する。上清(610 ml, 18.6 mgタンパク質/ml, pH 7.4, 電気伝導率2.6 mS/cm)は200 mlの画分3つに分注し-20℃で保存する。
均質液を、Q-Sepharose FFクロマトグラフィーカラム(直径5 cm, カラム体積400 ml)に注入(15 ml/min)し、20 mM Tris/HCl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 2錠/l コンプリートプロテアーゼインヒビター(緩衝液A)にて前洗浄した。本目的のために、解凍粗均質液は緩衝液Aで500mlに希釈した(電気伝導率1.6 mS/cm, pH 8.0)。試料導入後、該カラムを1000mlの緩衝液A(15 ml/min)にて洗浄した。この後100%の緩衝液B(0.5 M塩化ナトリウムを含む緩衝液A、pH 8.0)(1500 ml)への直線濃度勾配により展開した。さらに750 mlの100%緩衝液Bを洗浄のために使用した。それぞれの場合について、12 mlの画分を10画分合わせて検定した。
Q-Sepharoseカラムからの所定の画分を、試料導入に用いた(142 ml, pH 7.0, 32.2 gの硫酸アンモニウムにより40%飽和に調整した; タンパク質量500 mg)。
Phenyl-Sepharoseカラムからの所定の画分(90 ml)を、46.4 gの硫酸アンモニウム(80%飽和)を用いて沈殿し、遠心分離により回収した。ペレットを分離緩衝液(20 mM リン酸ナトリウム、pH 6.8, 1錠/l Complete, 1 mM EDTA) (9 ml)にて再懸濁し、Superdexカラムに注入(4 ml/min, 2 min 画分)した。該活性画分27および28を回収した。
Blue Sepharose FFカラム (直径2.6 cm, カラム体積50 ml, Pharmacia)を緩衝液(20 mM リン酸二水素ナトリウム、pH 6.8、1錠/l Complete, 1 mM EDTA)にて平衡化した。この分子ふるいクロマトグラフィーからの所定の画分を合わせて、3 ml流量で注入した。その後、該カラムを150 mlの同緩衝液にて洗浄し、次いで0.5 M塩化ナトリウムを含む同緩衝液(130 ml)にて洗浄した。溶出は、それぞれの場合について1 mM NADHおよびNADPHを加えた第二洗浄緩衝液を使用することで実施した。該緩衝液による溶出に先立ち、該カラムは前記緩衝液を満たして16時間インキュベートした。その後、活性画分を回収した。選択された該条件においては、該タンパク質はBlue Sepharoseカラムに結合しない。しかしながら、それ以外のタンパク質はこの方法により除去され、結果として精製が成功した。
アフィニティーカラムの調製:50 mlのアミノヘキサン酸 Sepharoseを5 Lの水で洗浄する。フィルターケーキを40 mlの水にて再懸濁する。4.2 gの4-アセトキシ安息香酸(保護基を導入したヒドロキシ安息香酸)を50 mlのDMFに溶解し、pH 4.7に調整(10 M水酸化ナトリウム)する。3.9 gのEDCを10 mlの水に溶解し、15分以内に結合混合液に加える。pHは塩酸により4.7に保持する。その後、さらに50 mlのDMFを加え、該混合物は室温で16時間撹拌する。該カラム材料はG2ガラス吸引フィルターを介した吸引処理により回収し、1 Lの50%水/DMF溶液により洗浄する。その後1Lの水で洗浄する。該カラム材料はその後200 mlの冷炭酸水素ナトリウム溶液に再懸濁し、2 mlの無水酢酸を加える。脱保護は氷上で90分間実施するが、これにより二酸化炭素が激しく発生する。反応溶液を吸引処理により除き、カラム材料を水によって洗浄する。次いで、該カラム材料は1 Mイミダゾール溶液中、pH 7.9で1時間撹拌し、その後再び吸引処理により除き、水で洗浄し、この状態で保存する。タンパク質はこのカラムには吸着しない。
Mono-Qクロマトグラフィーカラム(1 ml、ファルマシア社)を緩衝液(20 mM リン酸ナトリウム、 pH 7.5, 1錠/l Complete, 1 mM EDTA)にて平衡化する。130 mlのBlue Sepharose FFカラムからの非吸着画分(pH 7.5, 2.7 mS/cm)をカラムに注入(1 ml/min)する。該カラムはその後、同緩衝液にて洗浄する。ここでもまた、該タンパク質は試料導入中にすでに溶出しているが、夾雑物は該カラムに結合する。
1 mlのResourceカラム(Amersham)を緩衝液(20 mMリン酸ナトリウム、 pH 7.0, 2錠/l Complete, 2 mM EDTA, 40%飽和硫酸アンモニウム)にて平衡化する。140 mlのMono-Q-Sepharoseカラムからの非吸着画分(pH 7.5, 2.7 mS/cm)を31.6 gの硫酸アンモニウムにより40%飽和に調整し、カラムに注入(160 ml, 1 ml/min)する。該カラムはその後同緩衝液により洗浄する。該カラムはその後硫酸アンモニウムを含まない同緩衝液への直線濃度勾配により展開する。活性画分を回収し、SDSゲル電気泳動によって分離する(図1)。40 kDaのバンドをブロットし、N末端配列解析を行う。
下記に示したN末端配列、
PSLFDPIRFGAFTAKNRIWMAPLTRGR
が得られた。
Claims (6)
- 還元が二相液体系で行われる、Zymomonas mobilis, Citrobacter freundii, Candida rugosa, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Candida utilis, Issatchenkia orientalisおよびRhizopus javanicusの種および属からなる群より選択される還元酵素を用いるシトラールの酵素的還元によって、光学活性なシトロネラールを生産するための方法。
- (S)-シトロネラールがZymomonas mobilisおよびCitrobacter freundiiより選択される酵素によって生産される、請求項1に記載の方法。
- (R)-シトロネラールがCandida rugosa, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Candida utilis, Issatchenkia orientalisおよびRhizopus javanicusより選択される酵素によって生産される、請求項1に記載の方法。
- 該二相液体系がMTBEおよび水によって形成される、請求項1に記載の方法。
- 緩衝化された水溶液が該二相液体系の一の相として使用される、請求項4に記載の方法。
- 該還元酵素がNADPH再生系と共役する、請求項1に記載の方法。
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