CN101415831B - 用于产生香茅醛的方法 - Google Patents
用于产生香茅醛的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101415831B CN101415831B CN200680043009.4A CN200680043009A CN101415831B CN 101415831 B CN101415831 B CN 101415831B CN 200680043009 A CN200680043009 A CN 200680043009A CN 101415831 B CN101415831 B CN 101415831B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- citral
- geranial
- zymomonas mobilis
- enzyme
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- NEHNMFOYXAPHSD-UHFFFAOYSA-N citronellal Chemical compound O=CCC(C)CCC=C(C)C NEHNMFOYXAPHSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 4
- 229930003633 citronellal Natural products 0.000 title abstract 2
- 235000000983 citronellal Nutrition 0.000 title abstract 2
- WTEVQBCEXWBHNA-JXMROGBWSA-N geranial Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=O WTEVQBCEXWBHNA-JXMROGBWSA-N 0.000 claims abstract description 128
- WTEVQBCEXWBHNA-UHFFFAOYSA-N Citral Natural products CC(C)=CCCC(C)=CC=O WTEVQBCEXWBHNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 82
- 229940043350 citral Drugs 0.000 claims abstract description 40
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 claims abstract description 27
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 241000134874 Geraniales Species 0.000 claims description 36
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 17
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 12
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 claims description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 241000235072 Saccharomyces bayanus Species 0.000 claims description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 6
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 claims description 5
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 claims description 5
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 claims description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 241000588264 Rhizopus javanicus Species 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N Geraniol Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCO GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N Geraniol Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/CO GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 19
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 19
- 239000005792 Geraniol Substances 0.000 description 18
- 229940113087 geraniol Drugs 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 10
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000002247 NADPH Dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 108010014870 NADPH Dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 6
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 6
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 5
- WTEVQBCEXWBHNA-YFHOEESVSA-N citral B Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/C=O WTEVQBCEXWBHNA-YFHOEESVSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- ZHYZQXUYZJNEHD-VQHVLOKHSA-N geranic acid Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C(O)=O ZHYZQXUYZJNEHD-VQHVLOKHSA-N 0.000 description 5
- 229930008392 geranic acid Natural products 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- ZHYZQXUYZJNEHD-UHFFFAOYSA-N trans-geranic acid Natural products CC(C)=CCCC(C)=CC(O)=O ZHYZQXUYZJNEHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- DQYBDCGIPTYXML-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;hydrate Chemical compound O.CCOCC DQYBDCGIPTYXML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 4
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- ZYTMANIQRDEHIO-KXUCPTDWSA-N isopulegol Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@H](C(C)=C)[C@H](O)C1 ZYTMANIQRDEHIO-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N (-)-Menthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@H]1O NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 2
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 2
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 2
- 240000004784 Cymbopogon citratus Species 0.000 description 2
- 235000017897 Cymbopogon citratus Nutrition 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 241000235644 Issatchenkia Species 0.000 description 2
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 2
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- ULDHMXUKGWMISQ-UHFFFAOYSA-N carvone Chemical compound CC(=C)C1CC=C(C)C(=O)C1 ULDHMXUKGWMISQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DYLIWHYUXAJDOJ-OWOJBTEDSA-N (e)-4-(6-aminopurin-9-yl)but-2-en-1-ol Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2C\C=C\CO DYLIWHYUXAJDOJ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWKAGZWJHCTVJY-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyoctadecan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(C)=O MWKAGZWJHCTVJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBUZIKSJGRBJP-UHFFFAOYSA-N 4-acetoxy benzoic acid Chemical compound CC(=O)OC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 GDBUZIKSJGRBJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000281995 Backhousia citriodora Species 0.000 description 1
- 235000009465 Backhousia citriodora Nutrition 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical group COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- -1 Hexose phosphate Chemical class 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000193804 Planococcus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193802 Planococcus citreus Species 0.000 description 1
- 238000010478 Prins reaction Methods 0.000 description 1
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186428 Propionibacterium freudenreichii Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 238000011152 Q-Sepharose FF chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 241001464780 Zymobacter palmae Species 0.000 description 1
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000019568 aromas Nutrition 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000003849 aromatic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000498 ball milling Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000013462 industrial intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 239000003799 water insoluble solvent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及使用来自运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)的还原酶酶促还原柠檬醛而产生光学活性香茅醛的方法。
Description
柠檬醛是抗微生物的萜,它赋予植物植物如柠檬草(lemon grass)和澳洲柠檬桃金娘(Australian lemon myrtle)特征性柠檬香气。它还可便利地作为工业中间体例如在维生素A和E的合成中获得。已经报道通过还原或氧化醛基[1]、偶姻形成[2]和裂合酶活性[1,3]而对柠檬醛的几种生物转化。
本研究的目的是筛选使柠檬醛中α,β-不饱和碳键还原以产生手性产物香茅醛的酶活性(图1)。柠檬醛是反式异构体香叶醛与顺式异构体橙花醛的混合物,然而对这两种异构体中任一异构体的底物专一性可能不是重要的,因为氨基酸可以催化异构化[4]。
产物(R)-(+)-香茅醛的有价值用途是经Prins反应而后继环合至异蒲勒醇,随后水合成(1R,2S,5R)-(-)-薄荷醇[5]。非生物学策略因它们受限的立体选择性(柠檬醛具有三个双键)和对映选择性而仍受到挑战[6](见图1)。
使其它a,β-不饱和羰基的碳双键还原的酶已经在文献中报道。它们主要属于黄素和NADPH依赖性还原酶的“老黄酶(old yellow enzyme)”家族,这由Williams和Bruce[7]在可能的生物技术应用方面综述。
另一个实例是来自红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的香芹酮还原酶,该酶使用未鉴定的热稳定辅因子并且不依赖于添加的NADH或NADPH[8]。
为检测柠檬醛至香茅醛的生物转化,相应酶必须有活性,还原用电子必须可获得,非常的疏水性底物柠檬醛必须以足够的浓度接触酶并且香茅醛形成必须比任何后续的转化更快。因此,开发了筛选策略以试验用于柠檬醛转化的多种微生物。
本发明的第一个实施方案是用于通过以所选择的来自发酵单孢菌属(Zymomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、根霉属(Rhizopus)的还原酶酶促还原柠檬醛而产生光学活性香茅醛的方法,其中还原在两相液体***中完成。
该方法的优选实施方案使用所选择的来自运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、爪哇根霉(Rhizopus javanicus)的还原酶。
以上提及的微生物是本领域众所周知的并且可以通过已知方法分离或来自公共保藏中心如ATCC和DSMZ。
运动发酵单孢菌已经尤其作为ATCC 10998、ATCC 29192、ATCC31821、ATCC 35001、ATCC 39985保藏。弗氏柠檬酸杆菌已经尤其作为ATCC 8090D、ATCC 11811保藏。皱落假丝酵母已经尤其作为DSM 70761保藏。东方伊萨酵母已经尤其作为DSM 3433、DSM 6128、DSM 11956、DSM 70075、70079保藏。
还原酶可以分离或纯化的形式或作为“全细胞酶(whole-cell-enzyme)”使用,其中所述的“全细胞酶”应当意指酶与微生物一起用于本发明的方法。微生物也可以受到透化以改善底物、产物、辅因子转移入和转移出细胞。
术语“还原酶”应当不仅意指分离的酶,还意指包含酶的提取物、溶液或混悬液、其中酶已被固定的载体和含有酶的全细胞。
本发明的改良实施方案是利用因柠檬醛的同时还原而氧化的辅因子。作为辅因子,可以在本发明方法的条件下氧化的每种物质都是合适的。
优选的辅因子***是可以在等摩尔或甚至更高的量上使用或可以通过已知***如电化学方法或酶再生***如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行再生的NADH或NADPH。若再生辅因子,则在该方法中优选低于等摩尔的量。
两相液体***意指含有相互不较大程度地混合的两种液相的***。优选其中一种相含有有机液体而第二相含有水或基于水的溶剂的两相液体***。更优选其中有机相由醚如***、甲基叔丁基醚(MTBE)或芳香烃如苯和甲苯构成的两相液体***。作为第二液相,优选缓冲的水溶液。
本发明研究了用于立体专一性和对映专一性地将萜类柠檬醛(异构体香叶醛和橙花醛)的a,β-不饱和碳键还原成香茅醛的生物学策略。46种原核和真核微生物的常规含水筛选表明仅革兰氏阴性细菌运动发酵单孢菌能够形成香茅醛。这种含水***的缺点是底物柠檬醛在含水介质中的低溶解度。
在具有运动发酵单孢菌细胞的两相生物转化***中,形成了比未添加有机溶剂的***中高至多到10倍浓度的香茅醛。最佳结果用有机溶剂甲苯、甲基叔丁基醚(MTBE)、异戊醇和二***实现。有机介质在使用全细胞的生物催化反应中提供几种优势[9]。一个益处是底物和/或产物溶解度提高。有机相提供底物在反应中高的总浓度并同时维持水相中有毒或抑制性化合物的低水平。使细胞透化是有机溶剂的另一益处。除了“冻融”循环之外,还使用有机溶剂如甲苯用于透化已经报道用于多种生物,例如克鲁维酵母[10]和运动发酵单孢菌[11],引起经细胞膜的被动流动(passive flux)增加。EDTA的存在可以导致外膜透性的显著提高,如对大肠杆菌所示[12]。
使用20%[v/v]甲苯或MTBE作为有机溶剂,46个菌株中先前检验呈阴性的10株菌株证明是阳性的。与含水***相比,本方法代表在筛选用于将柠檬醛生物转化成香茅醛的潜在微生物上成功得多的策略。最高的产物浓度在原核菌株运动发酵单孢菌和弗氏柠檬酸杆菌获得,分别具有(S)-对映体>99%和75%的对映体过量值(e.e.)。与之相对,真核菌株显示相反的对映专一性,皱落假丝酵母、贝酵母和酿酒酵母分别具有(R)对映体大于98%、97%和96%的e.e.值。
在使用全细胞的生物转化中遭遇的一个问题是因细胞内众多催化剂所致的副产物形成。有趣的是,用运动发酵单孢菌进行试验的大部分有机溶剂引起醇副产物香叶醇、橙花醇和香茅醇整体减少。类似地EDTA对原核菌株和真核菌株均减少醇的形成并且在大多数情况下提高香茅醛浓度。这些在产物和副产物形成上的相反作用可能提示对柠檬醛中醛基的还原和碳双键的还原由不同酶催化。
对a,β-不饱和羰基中双键的酶还原已经描述。尤其“老黄酶(OYE)”家族的氧化还原酶即在酵母、植物和细菌中常见的黄素依赖性酶[13]接受种类庞大的a,β-不饱和醛和酮[7、14、15]。然而,没有报道由OYE对柠檬醛的转化。进行了酵母OYE 1、2和3蛋白质序列针对最近公开的运动发酵单孢菌ZM4基因组中翻译读码框的BLAST P(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索[16]。观察到与具有未知功能的推定NADH:黄素氧化还原酶(ZM01885)的最密切相似性。然而,对酵母OYE的氨基酸相似性小于50%。香茅醛形成是否与OYE家族的酶相关仍然未知,并且需要过量表达相应的基因以便开发高产量的生物方法。
实验
微生物培养
20株酵母菌株、9株丝状真菌菌株和17株细菌菌株从新南威尔士大学培养物收集中心(世界培养物收集编号248)得到。酵母菌株、丝状真菌和细菌运动发酵单孢菌和掌形发酵单孢菌(Zymobacter palmae)在YPG培养基(3g/l酵母提取物,5g/1蛋白胨,10g/l D-葡萄糖,pH6.9)中培育。乳酸细菌在来自Oxoid的MRS(de Man,Rogosa,Sharpe)肉汤(pH6.2)中培育。来自Oxoid的营养肉汤(pH7.4)用于全部其它细菌。对于柠檬色动性球菌(Planococcus citreus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),营养肉汤中补充以3%[w/v]NaCl。生长温度是30℃或37℃,这取决于哪个温度更接近已报道的最佳生长温度。培养物在定轨摇床中于150转/分钟搅拌,除干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freundenreichii)的非搅拌培养之外。全部培养物培育至稳定期。为了产生透化细胞,生物质在缓冲液(50mMMOPS/KOH pH7)中洗涤两次并重悬于一半体积的缓冲液(对酵母和丝状真菌而言)或四分之一体积的缓冲液(对细菌培养物而言)中。使用液氮和25℃水浴,将混悬液冻融三次并且随后以等分试样在-20℃贮存。
在含水***中的培养物筛选
柠檬醛(5mM)以异丙醇中0.2M溶液的形式添加。2.5%[v/v]异丙醇发挥两种功能:增加疏水性底物柠檬醛的溶解度并且作为胞内醇脱氢酶的底物潜在发挥作用以再生NAD(P)H。每种培养物进行三个实验。
活性测定(用于确定柠檬醛还原酶活性的GC测定)
方法:
500μl样品或水(空白)
100μl 1M磷酸钾,pH7.0
100μl 1M葡萄糖溶液
100μl溶液,在每一情况下具有10M NADPH/NADH
100μl葡萄糖脱氢酶大肠杆菌细胞混悬液
25μl在DMSO中的10%顺/反式柠檬醛
温育:在35℃至少15小时,剧烈摇动
提取:向每个样品添加250μl氯仿并充分搅拌至少5分钟。随后离心3分钟。将下层有机相取出并在4A分子筛上干燥,转移至带微量衬管(micro inset)的HPLC小玻璃瓶中,通过GC进行测量。纯化酶(通过对面积比较而估计)的e.e.值超过98%。
a.培养基中的全细胞
添加5mL新鲜培养基至温度不变的5mL稳定期培养物,150转/分钟搅拌1小时并且随后添加在异丙醇中的柠檬醛。在3小时后及在24小时后,1ml肉汤以0.2ml新鲜制备的在氯仿中的0.3%[v/v]1-辛醇(GC内标)溶液提取。回收有机相,用异丙醇稀释并通过GC进行分析。
b.透化的细胞+NADH
在定轨摇床上于150转/分钟并在30℃振摇的2ml螺口盖小玻璃瓶含有在1ml总体积中的0.5ml融化的透化细胞,其中所述总体积中具有终浓度50mM pH7的MOPS缓冲液、10mM NADH,5mM柠檬醛和2.5%[v/v]异丙醇。在3小时后,全部样品用如上文的氯仿/辛醇提取。
c.透化的细胞+NADPH再生***
方法与b中所述相同,除了NADH由具有终浓度1.5mM NADP+、10mM葡萄糖-6-磷酸、3.3mM MgC12和0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的NADPH再生***替换之外。
在两相***中的培养物筛选
在生物转化之前,0.5mL透化细胞与0.15ml甲苯在2ml螺旋盖玻璃小瓶中涡旋混合并且在室温温育10分钟。随后添加其它组分以产生具有如含水/NADPH***那样相同组成的1mL水相,仅无柠檬醛和异丙醇。反应通过添加0.05mL在甲苯中的0.4M柠檬醛而启动并且将小瓶在30℃在轮上垂直转动。在3小时后,全部样品用0.4ml新鲜制备的在氯仿中的0.15%[v/v]1-辛醇(GC内标)提取。在离心后,取出0.4mL下层有机相(甲苯/氯仿混合物)用于GC分析。将形成香茅醛的菌株如下文详述在甲苯和甲基叔丁基醚(MTBE)两相***中进行比较。
生物转化
图2-4中所示的生物转化如对两相培养物筛选那样实施,但是用4ml螺旋盖玻璃小瓶中的0.8ml水相和0.2ml有机溶剂,以磁力方式搅拌以维持有机溶剂在水相中的乳液。组成和条件的细节在分别的附图说明中给出。在启动反应前,以定义的生物质浓度的0.5mL已洗涤细胞与0.15mL分别的有机溶剂在冰上搅拌30分钟。反应通过添加0.05mL在相同有机溶剂中的0.4M柠檬醛而启动。
分析方法
萜类的浓度由使用毛细管柱(来自Varian的Chrompack CP-SIL 5B,50M×0.25mm,0.12μm相厚度)的气相色谱(GC)确定,以氮气作为载气(0.98ml/分钟)并且具有氢(20ml/分钟)及空气(300ml/分钟)的火焰离子化检测器(250℃)。注射体积是1μl,分流比29∶1。注射温度是250℃并且柱温度在100℃维持9分钟并随后以50℃/分钟提高至240℃。使用1-辛醇作为内标,萜浓度基于已经接受如样品那样的相同提取方法处理的标准物进行计算。为分离香茅醛和异蒲勒醇,初始柱温度是75℃持续12分钟。橙花醇和香茅醇在任一先前条件下未得到分离。它们的分离以及手性分析用Supelco Beta Dex 225柱(30m×0.25mm,0.25μm相厚度)进行。分流比是1∶35,柱流速是2.77ml/分钟,柱温度是95℃持续35分钟,以5℃/分钟增加至160℃。香茅醛通过从两个GC柱中与香茅醛标准物共洗脱而鉴定。
实施例1
在含水***中的培养物筛选
对20株酵母菌株、9株丝状真菌菌株和17株细菌菌株在三种含水***中试验柠檬醛转化:使用在培养基中的全细胞或者洗涤和透化的细胞以及NADH或NADPH。仅透化运动发酵单孢菌与NADPH才形成香茅醛。NADPH再生***或NADPH的直接添加均支持香茅醛形成。香叶醇是在全细胞培养物中以及向透化细胞添加NADH或NADPH时众多测试菌株的主要产物。也形成橙花醇和/或香茅醇。因此,用于还原醛基的酶活性与双键还原所需的活性相竞争。
实施例2
溶剂对由运动发酵单孢菌所致柠檬醛转化的影响
使用运动发酵单孢菌以试验有机/水两相***将柠檬醛转化成香茅醛的可行性。图2a显示在缺乏和存在多种水溶性(星号)和水不溶性溶剂时的香茅醛形成,其中所述的溶剂按官能性分类:2种正烷、9种脂族醇、3种酮、2种酯、2种醚和3种芳族溶剂。与无任何有机溶剂的对照相比,4种溶剂即异戊醇、MTBE、二***和甲苯支持高约10倍的产物水平。作为额外优点,大部分溶剂引起副产物香叶醇、橙花醇和/或香茅醇的水平降低(图2b)。对照实验即对香叶醇、橙花醇及香茅醇标准物的提取证实相对于内标,它们的提取未受例如样品中异丙醇、甲苯或MTBE存在的影响。因此下降的副产物水平可以归因于酶还原醛基的减少。选择甲苯和MTBE用于进一步的实验。
实施例3
在两相***中的培养物筛选
在水/甲苯筛选***中,香茅醛由先前在含水筛选***中未鉴定的几个菌株自柠檬醛形成。为了比较,调节这些培养物至相似的生物质浓度,并且甲苯和MTBE两相***的香茅醛产生在图3中显示。在甲苯***中,2株细菌菌株实现比9株真核菌株高至少5倍的香茅醛浓度。在MTBE***中,弗氏柠檬酸杆菌形成比甲苯存在下更少的香茅醛。对东方伊萨酵母得到阳性结果,其中东方伊萨酵母在甲苯***中不形成香茅醛。添加5mMEDTA对大部分菌株导致更高的香茅醛浓度,但是这对弗氏柠檬酸杆菌和丝状真菌爪哇根霉产生相反作用(图3b)。由运动发酵单孢菌形成的香茅醛不受EDTA影响。
就MTBE/EDTA***中的副产物形而言,酵母菌株和细菌弗氏柠檬酸杆菌产生大部分香叶醇、一些橙花醇和少量香茅醇。尤其是,酵母属菌株形成多达13mM香叶醇。省去EDTA则对酵母属菌株增加醇副产物形成约10%,并且对运动发酵单孢菌增加甚至9倍。在任何实验中未检测到异蒲勒醇。
产物香茅醛的对映体过量(e.e.)值列于表1。对运动发酵单孢菌而言,细菌酶优先形成e.e.值>99%的(S)-对映体,并且对弗氏柠檬酸杆菌而言,细菌酶优先形成e.e.值>75%的(S)-对映体。相反,酵母菌株主要产生(R)-香茅醛,例如皱落假丝酵母产生超过98%的e.e.值。
表1:由多种菌株在含有5mM EDTA的水/MTBE两相***中所形成的香茅醛的对映体过量(图3b)
柠檬醛生物转化曲线
图4显示在水/甲苯及在水/MTBE两相***中由运动发酵单孢菌所致柠檬醛生物转化的曲线。对前者而言,香茅醛浓度的增加以极为线性的方式继续进行3小时时间。当NADPH再生***的浓度加倍时,实现相同的香茅醛终浓度。这表明该反应不受NADPH再生***限制。两种柠檬醛异构体即香叶醛及橙花醛的浓度均随时间降低。未检测到醇即橙花醇、香叶醇和香茅醇。对于水/MTBE两相***,观察到香茅醛形成随时间变慢,尽管两种柠檬醛异构体即香叶醛和橙花醛均随时间以线性方式消耗。就醇副产物而言,形成0.34mM的香叶醇和小于0.1mM的香茅醇。3小时后的摩尔平衡表明初始底物在甲苯***中丢失16%,并且在MTBE***中丢失10%。在比较时,没有生物质的对照经3小时未显示柠檬醛或香茅醛的丢失。然而,具有煮沸的生物质的对照以如生物转化中观察到的相似程度丢失柠檬醛和香茅醛。
实施例4
自运动发酵单孢菌分离和表征还原酶
运动发酵单孢菌的培养:
细胞在由以下组成的培养基中培育
细菌用蛋白胨 10g/l
酵母提取物 10g/l
葡萄糖*H2O 20g/l
KH2PO4 41g/l
(NH4)2SO4 1g/l
MgSO4*7H2O 0.5g/l
pH7.0;灭菌: 121℃20分钟。
为此目的,在每一情况下将800mL培养基导入1L锥形烧瓶(无挡板)并在100转/分钟和30℃温育至少48小时(通常约65-72小时)。由离心去除轻微混浊(slight clouding)。生物质产量低(约2.0-2.5g/l湿生物质)。
蛋白质的纯化:
匀浆化
106g湿生物质重悬于500mL破裂缓冲液(20mM Tris/HCl,2mMEDTA,10片/L全蛋白酶抑制剂,pH8.0)中,并且pH用NaOH从pH6.6校正至7.5。混悬液的100mL等分试样与100mL玻璃珠(直径0.1-0.2mm)混合并且在球磨中以5000转/分钟破裂12分钟。玻璃珠经G1玻璃抽吸滤器以抽吸作用除去并且洗涤。滤液(710ml)于12000转/分钟(Sorvall,4℃)离心30分钟。上清液(610ml,18.6mg/ml蛋白质,pH7.4,电导率2.6mS/cm)分成3个200ml等分试样并在-20℃贮存。
离子交换层析(Q-Sepharose FF)
将匀浆物施加(15ml/分钟)至Q-Sepharose FF层析柱(直径5cm,体积400ml)上,以20mM Tris/HCl,pH8.0,2mM EDTA,2片全蛋白酶抑制剂/L(缓冲液A)预洗涤。为此目的,将融化的粗制匀浆物用缓冲液A稀释成500ml(电导率1.6mS/cm,pH8.0)。在上样后,柱用1000mL缓冲液A洗涤(15ml/分钟)。随后用线性梯度展开至100%缓冲液B(具有0.5M NaCl的缓冲液A,pH8.0)(1500ml)。随后将又一个750mL 100%B用于洗涤。在每一情况下,将10个12ml级分合并并进行测试。
疏水层析(TSK-Phenyl)
来自Q-Sepharose柱的目的级分用于上样(142ml,pH7.0,用32.2g硫酸铵调节至40%饱和度;500mg蛋白质)。
来自Pharmacia的苯基-Sepharose柱具有2.6cm直径,体积170ml,并且以每分钟10ml运行。该柱用缓冲液A:40%硫酸铵饱和度,2mMEDTA,2片全蛋白酶抑制剂/L,20mM磷酸二氢钠pH7.0)平衡。在上样后,柱用缓冲液A洗涤直至达到吸光度基线。随后用线性梯度展开至100%缓冲液B(无硫酸铵的缓冲液A,3个柱体积)。在结束时,柱用2.5个柱体积的缓冲液C(具有20%异丙醇的缓冲液B)洗脱。在每一情况下,将10个级分合并且测定活性。收集第61至70级分(92ml)。
分子筛层析(Superdex)
来自苯基Sepharose柱的目的级分(90ml)用46.4g硫酸铵(80%饱和度)沉淀并且通过离心取出沉淀。将沉淀在运行缓冲液(20mM磷酸钠,pH6.8,1片全蛋白酶抑制剂/L,1mM EDTA)(9ml)中重悬并施加至Superdex柱(4ml/分钟,2分钟级分)。收集活性级分27和28。
使用以上全部方法,对所有三份匀浆物均进行处理。得到含有总计18.8mg蛋白质的67mL目的级分。
亲和层析(Blue Sepharose FF)
蓝色Sepharose FF柱(直径2.6cm,50ml,Pharmacia)在20mM磷酸二氢钠pH6.8,1片全蛋白酶抑制剂/L,1mM EDTA中平衡。来自分子筛层析的合并目的级分以3ml流量施加。柱随后用150mL的相同缓冲液洗涤并随后用添加0.5M NaCl的该缓冲液(130ml)洗涤。使用第二洗涤缓冲液实施洗脱,其中向第二洗涤缓冲液在每一情况下还已经添加1mMNADH和NADPH。在用该缓冲液洗脱之前,将柱在所述缓冲液中温育16小时。收集活性级分。蛋白质在所选择条件下不与蓝色Sepharose结合。然而,其它蛋白质以如此方式除去,导致成功的纯化。
亲和层析(4-羟基苯甲酸亲和柱)
亲和柱的制备:50mL氨基己酸Sepharose用5L水洗涤。滤饼重悬于40mL水中。4.2g的4-乙酸基苯甲酸(受保护的羟基苯甲酸)溶解于50mlDMF中并调节至pH4.7(10M NaOH)。将3.9g EDC溶解于10mL水中并且在15分钟内添加至偶联混合物中。将pH用HCl维持在4.7。添加另一份50ml DMF并且将混合物在室温搅拌16小时。柱材料以抽吸作用经G2玻璃抽吸滤器去除,并且用1L 50%水/DMF溶液洗涤。随后,用1L水洗涤。柱材料随后重悬于200ml NaHCO3***液中并且添加2mL乙酸酐。在冰上实施脱保护90分钟,强烈产生CO2。反应溶液以抽吸作用除去并且柱材料用水洗涤。随后,将柱材料在1M咪唑溶液pH7.9中搅拌1小时,随后再次以抽吸作用取出并且用水洗涤,并且也在这种状态下贮存。蛋白质也不与该柱结合。
Mono-Q层析
Mono-Q层析柱(1ml Pharmacia)用20mM磷酸钠,pH7.5,1片全蛋白酶抑制剂/L,1mM EDTA进行平衡。(1ml/分钟)施加130mL来自蓝色Sepharose柱的流通物(pH7.5,2.7mS/cm)。柱随后用相同缓冲液洗涤。这里,蛋白质再次在上样期间被洗脱,而杂质与柱结合。
疏水层析(Resource-Phenylsepharose,FPLC)
1ml Resource柱(Amersham)用20mM磷酸钠,pH7.0,2片全蛋白酶抑制剂/L,2mM EDTA,40%硫酸铵饱和度进行平衡。来自Mono-Q-Sepharose柱的140mL流通物(pH7.5,2.7mS/cm)用31.6g硫酸铵调节至40%饱和度并施加(160ml,1ml/分钟)。柱随后用相同缓冲液洗涤。柱使用线性梯度展开至不含硫酸铵的相同缓冲液。收集活性级分并将其通过SDS凝胶电泳展开(图1)。条带在40kDa处并进行氨基端测序。
在下表2中总结了纯化。
表2
纯化步骤 | 总蛋白质 | 总活性 |
匀浆物 | 11.4g | 6U |
Q-Sepharose目的级分 | 1.5g | 1U |
苯基-Sepharose目的级分 | 471mg | 2U |
Superdex目的级分 | 18.8mg | 1U |
Blue Sepharose目的级分 | 3mg | 0.74U |
Mono Q目的级分 | 2mg | 0.7U |
Resource Phenyl目的级分 | 1mg | 0.5U |
氨基端测序
得到下列氨基端序列:
PSLFDPIRFGAFTAKNRIWMAPLTRGR
以这个已鉴定的氨基端肽在运动发酵单孢菌公开的基因组(Seo J.S等,“生乙醇细菌运动发酵单孢菌ZM4的基因组序列”,Nat.Biotechnol.23:63-68(2005),EMBL AE008692)中进行的计算机搜索鉴定该蛋白质是具有358个氨基酸和39489道尔顿分子量的NADH黄素氧化还原酶(EMBLAE008692,AAV90509.1,原始登录号Q5NLA1.)。
参考文献
W.A.M.Wolken,M.J.van der Werf,Appl.Microbiol.Biotechnol.57(2001)731.
B.Stumpf,K.Kieslich,Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1991)598.
W.A.M.Wolken,W.J.V.Van Loo,J.Tramper,M.J.van derWerf,Eur.J.Biochem.269(2002)5903.
W.A.M.Wolken,R.ten Have,M.J.van der Werf,J.Agric.食物Chem.48(2000)5401.
A.F.Trasarti,A.J.Marchi,C.R. Apesteguia,J.Catal.224(2004)484.
P.Arvela,N.Kumar,D.Kubicka,A.Nasir,T.V.P.Lehto,R.Sjoholm,T.Salmi,D.Y.Murzin,J.Mol.Cat.A:CheM240(2005)72.
R.E.Williams,N.C.Bruce,Microbiology 148(2002)1607.
M.J.van der Werf,A.M.Boot,Microbiology 146(2000)1129.
R.León,P.Fernandes,H.M.Pinheiro,J.M.S.Cabral,EnzymeMicrob.Technol.23(1998)483.
M.Decleire,W.De Cat,N.Van Huynh,Enzyme Microb.Technol.9(1987)300.
U.H.Chun,P.L.Rogers,Appl.Microbiol.Biotechnol.29(1988)19.
H.J.P.Marvin,M.B.A.Ter Beest,B.Witholt,J.Bacteriol.171(1989)5262.
K.Kitzing,T.B.Fitzpatrick,C.Wilken,J.Sawa,G.P.Bourenkov,P.Macheroux,T.Clausen,J.Biol.Chem.280(2005)27904.
A.D.N.Vaz,S.Chakraborty,V.Massey,Biochemistry34(1995)4246.
K.Stott,K.Saito,D.J.Thiele,V.Massey,268(1993)6097.
J.S.Seo,H.Chong,H.S.Park,K.O.Yoon,C.Jung,J.J.Kim,J.H.Hong,H.Kim,J.H.Kim,J.I.Kil,C.J.Park,H.M.Oh,J.S.Lee,S.J.Jin,H.W.Urn,H.J.Lee,S.J.Oh,J.Y.Kim,H.L.Kang,S.Y.Lee,K.J.Lee,H.S.Kang,Nature Biotechnol.23(2005)63.
附图描述:
图1:柠檬醛(香叶醛和橙花醛)至香茅醛的生物转化
图2:由运动发酵单孢菌细胞在NADPH再生***和多种溶剂存在下对柠檬醛的生物转化:a)产物香茅醛;b)副产物香叶醇、橙花醇和香茅醇的总和。初始条件:20%v/v有机溶剂,20mM柠檬醛,5mM二硫苏糖醇,3.3mM MgCl2,1.5mM NADP+,10mM葡萄糖-6-磷酸,0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,约14g/l DCM运动发酵单孢菌,50mM MOPS/KOH,pH7.0,在30℃持续3小时。*以星号标记的溶剂溶解于水中,全部其它溶剂形成乳液。MTBE=甲基叔丁基醚,nd=未检测到。AU=任意单位:化合物的GC面积除以内标的GC面积。给出三个重复的平均值和误差条表示最高结果和最低结果。对于甲苯,面积比对应于1.4mM香茅醛的浓度。
图3:在a)水/甲苯两相***和b)水/甲基叔丁基醚(MTBE)两相***中由细菌、酵母和丝状真菌所形成的香茅醛的比较(在30℃温育3小时,组成如图2中所示,生物质浓度约12g DCM/l)。给出两个重复的平均值和误差条表示最高结果和最低结果。nd=未检测到。
图4:由运动发酵单孢菌在具有NADPH再生***的a)水/甲苯和b)水/甲基叔丁基醚(MTBE)两相***(30℃,组成如图2中所示,生物质浓度约14g DCM/l)中所致的柠檬醛生物转化。给出三个重复的平均值和误差条表示最高结果和最低结果。
Claims (6)
1.使用所选择的来自如下种的柠檬醛还原酶通过酶促还原柠檬醛而产生光学活性香茅醛的方法:运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、爪哇根霉(Rhizopus javanicus),其中还原反应是在两相液体***中完成的,所述两相液体***是指含有相互不较大程度地混合的两种液相的***,其中一种相含有有机液体而第二相含有水或基于水的溶剂,所述有机液体选自MTBE和甲苯。
2.根据权利要求1所述的方法,其中(S)-香茅醛通过所选择的来自运动发酵单孢菌、弗氏柠檬酸杆菌的柠檬醛还原酶产生。
3.根据权利要求1所述的方法,其中(R)-香茅醛通过所选择的来自皱落假丝酵母、贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、产朊假丝酵母、爪哇根霉的柠檬醛还原酶产生。
4.根据权利要求1所述的方法,其中两相液体***由MTBE和水形成。
5.根据权利要求4所述的方法,其中使用缓冲水溶液作为两相液体***的一个相。
6.根据权利要求1所述的方法,其中柠檬醛还原酶偶联至NADPH再生***。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US73750005P | 2005-11-17 | 2005-11-17 | |
EP05110867.8 | 2005-11-17 | ||
EP05110867 | 2005-11-17 | ||
US60/737,500 | 2005-11-17 | ||
PCT/EP2006/068338 WO2007057354A1 (en) | 2005-11-17 | 2006-11-10 | Process for the production of citronellal |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101415831A CN101415831A (zh) | 2009-04-22 |
CN101415831B true CN101415831B (zh) | 2013-03-13 |
Family
ID=40595603
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200680043009.4A Active CN101415831B (zh) | 2005-11-17 | 2006-11-10 | 用于产生香茅醛的方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4938786B2 (zh) |
CN (1) | CN101415831B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106086089A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-09 | 浙江工业大学 | 一种酶法不对称还原柠檬醛提高(r)‑香茅醛光学纯度的方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104293847A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-01-21 | 青岛科技大学 | 一种生产亚环己基二氧基庚烯醇的产朊酵母催化法 |
US20180016596A1 (en) * | 2014-12-29 | 2018-01-18 | Futragene Israel Ltd. | Nucleic acid constructs, plants comprising same and uses thereof in enhancing plant pest resistance and altering plant monoterpene profile |
CN113355340B (zh) * | 2020-03-09 | 2023-05-09 | 深圳蓝晶生物科技有限公司 | 一种构建生产柠檬醛的重组菌的方法及由其构建的重组菌及其应用 |
CN111454918B (zh) * | 2020-03-10 | 2022-05-24 | 浙江工业大学 | 一种烯醇还原酶突变体及其在制备(r)-香茅醛中的应用 |
CN112680483B (zh) * | 2020-12-25 | 2022-09-16 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 山鸡椒醇脱氢酶LcADH31在制备柠檬醛或以其为活性物质的产品中的应用 |
CN113717910B (zh) * | 2021-07-20 | 2023-09-05 | 浙江工业大学 | 一种三酶共表达重组菌及其在(s)-香茅醇合成中的应用 |
CN113930457B (zh) * | 2021-09-28 | 2024-05-03 | 浙江工业大学 | 一种双酶偶联合成(s)-香茅醇的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0000315A1 (fr) * | 1977-07-04 | 1979-01-10 | Rhone-Poulenc Industries | Procédé de préparation de citronellal optiquement actif |
CN1247182A (zh) * | 1999-07-08 | 2000-03-15 | 中国科学院广州化学研究所 | 香茅醇气相催化加氢制香茅醇的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2314911A1 (fr) * | 1975-06-18 | 1977-01-14 | Rhone Poulenc Ind | Procede de semi-hydrogenation du citral et de ses homologues en citronnellal et homologues du citronnellal |
-
2006
- 2006-11-10 JP JP2008540587A patent/JP4938786B2/ja active Active
- 2006-11-10 CN CN200680043009.4A patent/CN101415831B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0000315A1 (fr) * | 1977-07-04 | 1979-01-10 | Rhone-Poulenc Industries | Procédé de préparation de citronellal optiquement actif |
CN1247182A (zh) * | 1999-07-08 | 2000-03-15 | 中国科学院广州化学研究所 | 香茅醇气相催化加氢制香茅醇的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Andre Muller等.Enzymatic reduction of the α,β-unsaturated carbon bond in citral.《Journal of Molecular catalysis B: enzymatic》.2006,第38卷(第3-6期),第126-130页. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106086089A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-09 | 浙江工业大学 | 一种酶法不对称还原柠檬醛提高(r)‑香茅醛光学纯度的方法 |
CN106086089B (zh) * | 2016-06-17 | 2019-10-29 | 浙江工业大学 | 一种酶法不对称还原柠檬醛提高(r)-香茅醛光学纯度的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4938786B2 (ja) | 2012-05-23 |
CN101415831A (zh) | 2009-04-22 |
JP2009515541A (ja) | 2009-04-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101415831B (zh) | 用于产生香茅醛的方法 | |
Peters et al. | A novel NADH-dependent carbonyl reductase with an extremely broad substrate range from Candida parapsilosis: purification and characterization | |
Plata et al. | Formation of ethyl acetate and isoamyl acetate by various species of wine yeasts | |
Müller et al. | Enzymatic reduction of the α, β-unsaturated carbon bond in citral | |
CN102272314B (zh) | 无细胞生产化学品的方法 | |
US5523223A (en) | Ketoester reductase for conversion of keto acid esters to optically active hydroxy acid esters | |
Kataoka et al. | Old yellow enzyme from Candida macedoniensis catalyzes the stereospecific reduction of the C= C bond of ketoisophorone | |
Zelinski et al. | Purification and characterization of a novel carbonyl reductase isolated from Rhodococcus erythropolis | |
CN101857887B (zh) | 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法 | |
US8124387B2 (en) | Process for the production of citronellal | |
Kallel-Mhiri et al. | Mechanism of ethyl acetate synthesis by Kluyveromyces fragilis | |
CN102329745B (zh) | 高稳定性耐有机溶剂脂肪酶产生菌及脂肪酶和其基因与应用 | |
TW201918551A (zh) | Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法 | |
US6001618A (en) | Haloacetoacetate reductase, method for producing said enzyme, and method for producing alcohols using said enzyme | |
CN102174422B (zh) | 一种耐有机溶剂脂肪酶生产菌及该脂肪酶的基因和应用 | |
JP6392534B2 (ja) | ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用 | |
Pandey et al. | Production, purification, and application of the microbial enzymes | |
CN110982757A (zh) | 阴沟肠杆菌zjph1903及应用 | |
EP1476544B1 (en) | Enone reductase | |
WO2002002791A1 (en) | Microbial production of r-phenylacetylcarbinol by biotransformation of benzaldehyde by filamentous fungi | |
AU2001270612A1 (en) | Microbial production of r-phenylacetylcarbinol by biotransformation of benzaldehyde by filamentous fungi | |
Isobe et al. | Thermostable NAD+-dependent (R)-specific secondary alcohol dehydrogenase from cholesterol-utilizingBurkholderia sp. AIU 652 | |
CN105567756A (zh) | 一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法 | |
Kira et al. | Purification and Characterization of a (R)-1-Phenyl-1, 3-propanediol-producing Enzyme from Trichosporon fermentans AJ-5152 and Enzymatic (R)-1-Phenyl-1, 3-propanediol Production | |
Yang et al. | Purification and characterization of a novel carbonyl reductase with high stereo-selectivity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |