CN101415831B

CN101415831B - 用于产生香茅醛的方法

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Publication number: CN101415831B
Application number: CN200680043009.4A
Authority: CN
Inventors: R·施蒂默尔; T·弗里德里希; A·米勒; B·豪尔; B·罗舍
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-11-17
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2026-11-10
Also published as: JP4938786B2; CN101415831A; JP2009515541A

Abstract

本发明涉及使用来自运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)的还原酶酶促还原柠檬醛而产生光学活性香茅醛的方法。

Description

用于产生香茅醛的方法

柠檬醛是抗微生物的萜，它赋予植物植物如柠檬草(lemon grass)和澳洲柠檬桃金娘(Australian lemon myrtle)特征性柠檬香气。它还可便利地作为工业中间体例如在维生素A和E的合成中获得。已经报道通过还原或氧化醛基[1]、偶姻形成[2]和裂合酶活性[1，3]而对柠檬醛的几种生物转化。

本研究的目的是筛选使柠檬醛中α，β-不饱和碳键还原以产生手性产物香茅醛的酶活性(图1)。柠檬醛是反式异构体香叶醛与顺式异构体橙花醛的混合物，然而对这两种异构体中任一异构体的底物专一性可能不是重要的，因为氨基酸可以催化异构化[4]。

产物(R)-(+)-香茅醛的有价值用途是经Prins反应而后继环合至异蒲勒醇，随后水合成(1R，2S，5R)-(-)-薄荷醇[5]。非生物学策略因它们受限的立体选择性(柠檬醛具有三个双键)和对映选择性而仍受到挑战[6](见图1)。

使其它a，β-不饱和羰基的碳双键还原的酶已经在文献中报道。它们主要属于黄素和NADPH依赖性还原酶的“老黄酶(old yellow enzyme)”家族，这由Williams和Bruce[7]在可能的生物技术应用方面综述。

另一个实例是来自红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的香芹酮还原酶，该酶使用未鉴定的热稳定辅因子并且不依赖于添加的NADH或NADPH[8]。

为检测柠檬醛至香茅醛的生物转化，相应酶必须有活性，还原用电子必须可获得，非常的疏水性底物柠檬醛必须以足够的浓度接触酶并且香茅醛形成必须比任何后续的转化更快。因此，开发了筛选策略以试验用于柠檬醛转化的多种微生物。

本发明的第一个实施方案是用于通过以所选择的来自发酵单孢菌属(Zymomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、根霉属(Rhizopus)的还原酶酶促还原柠檬醛而产生光学活性香茅醛的方法，其中还原在两相液体***中完成。

该方法的优选实施方案使用所选择的来自运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、爪哇根霉(Rhizopus javanicus)的还原酶。

以上提及的微生物是本领域众所周知的并且可以通过已知方法分离或来自公共保藏中心如ATCC和DSMZ。

运动发酵单孢菌已经尤其作为ATCC 10998、ATCC 29192、ATCC31821、ATCC 35001、ATCC 39985保藏。弗氏柠檬酸杆菌已经尤其作为ATCC 8090D、ATCC 11811保藏。皱落假丝酵母已经尤其作为DSM 70761保藏。东方伊萨酵母已经尤其作为DSM 3433、DSM 6128、DSM 11956、DSM 70075、70079保藏。

还原酶可以分离或纯化的形式或作为“全细胞酶(whole-cell-enzyme)”使用，其中所述的“全细胞酶”应当意指酶与微生物一起用于本发明的方法。微生物也可以受到透化以改善底物、产物、辅因子转移入和转移出细胞。

术语“还原酶”应当不仅意指分离的酶，还意指包含酶的提取物、溶液或混悬液、其中酶已被固定的载体和含有酶的全细胞。

本发明的改良实施方案是利用因柠檬醛的同时还原而氧化的辅因子。作为辅因子，可以在本发明方法的条件下氧化的每种物质都是合适的。

优选的辅因子***是可以在等摩尔或甚至更高的量上使用或可以通过已知***如电化学方法或酶再生***如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行再生的NADH或NADPH。若再生辅因子，则在该方法中优选低于等摩尔的量。

两相液体***意指含有相互不较大程度地混合的两种液相的***。优选其中一种相含有有机液体而第二相含有水或基于水的溶剂的两相液体***。更优选其中有机相由醚如***、甲基叔丁基醚(MTBE)或芳香烃如苯和甲苯构成的两相液体***。作为第二液相，优选缓冲的水溶液。

本发明研究了用于立体专一性和对映专一性地将萜类柠檬醛(异构体香叶醛和橙花醛)的a，β-不饱和碳键还原成香茅醛的生物学策略。46种原核和真核微生物的常规含水筛选表明仅革兰氏阴性细菌运动发酵单孢菌能够形成香茅醛。这种含水***的缺点是底物柠檬醛在含水介质中的低溶解度。

在具有运动发酵单孢菌细胞的两相生物转化***中，形成了比未添加有机溶剂的***中高至多到10倍浓度的香茅醛。最佳结果用有机溶剂甲苯、甲基叔丁基醚(MTBE)、异戊醇和二***实现。有机介质在使用全细胞的生物催化反应中提供几种优势[9]。一个益处是底物和/或产物溶解度提高。有机相提供底物在反应中高的总浓度并同时维持水相中有毒或抑制性化合物的低水平。使细胞透化是有机溶剂的另一益处。除了“冻融”循环之外，还使用有机溶剂如甲苯用于透化已经报道用于多种生物，例如克鲁维酵母[10]和运动发酵单孢菌[11]，引起经细胞膜的被动流动(passive flux)增加。EDTA的存在可以导致外膜透性的显著提高，如对大肠杆菌所示[12]。

使用20％[v/v]甲苯或MTBE作为有机溶剂，46个菌株中先前检验呈阴性的10株菌株证明是阳性的。与含水***相比，本方法代表在筛选用于将柠檬醛生物转化成香茅醛的潜在微生物上成功得多的策略。最高的产物浓度在原核菌株运动发酵单孢菌和弗氏柠檬酸杆菌获得，分别具有(S)-对映体＞99％和75％的对映体过量值(e.e.)。与之相对，真核菌株显示相反的对映专一性，皱落假丝酵母、贝酵母和酿酒酵母分别具有(R)对映体大于98％、97％和96％的e.e.值。

在使用全细胞的生物转化中遭遇的一个问题是因细胞内众多催化剂所致的副产物形成。有趣的是，用运动发酵单孢菌进行试验的大部分有机溶剂引起醇副产物香叶醇、橙花醇和香茅醇整体减少。类似地EDTA对原核菌株和真核菌株均减少醇的形成并且在大多数情况下提高香茅醛浓度。这些在产物和副产物形成上的相反作用可能提示对柠檬醛中醛基的还原和碳双键的还原由不同酶催化。

对a，β-不饱和羰基中双键的酶还原已经描述。尤其“老黄酶(OYE)”家族的氧化还原酶即在酵母、植物和细菌中常见的黄素依赖性酶[13]接受种类庞大的a，β-不饱和醛和酮[7、14、15]。然而，没有报道由OYE对柠檬醛的转化。进行了酵母OYE 1、2和3蛋白质序列针对最近公开的运动发酵单孢菌ZM4基因组中翻译读码框的BLAST P(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索[16]。观察到与具有未知功能的推定NADH：黄素氧化还原酶(ZM01885)的最密切相似性。然而，对酵母OYE的氨基酸相似性小于50％。香茅醛形成是否与OYE家族的酶相关仍然未知，并且需要过量表达相应的基因以便开发高产量的生物方法。

实验

微生物培养

20株酵母菌株、9株丝状真菌菌株和17株细菌菌株从新南威尔士大学培养物收集中心(世界培养物收集编号248)得到。酵母菌株、丝状真菌和细菌运动发酵单孢菌和掌形发酵单孢菌(Zymobacter palmae)在YPG培养基(3g/l酵母提取物，5g/1蛋白胨，10g/l D-葡萄糖，pH6.9)中培育。乳酸细菌在来自Oxoid的MRS(de Man，Rogosa，Sharpe)肉汤(pH6.2)中培育。来自Oxoid的营养肉汤(pH7.4)用于全部其它细菌。对于柠檬色动性球菌(Planococcus citreus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，营养肉汤中补充以3％[w/v]NaCl。生长温度是30℃或37℃，这取决于哪个温度更接近已报道的最佳生长温度。培养物在定轨摇床中于150转/分钟搅拌，除干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freundenreichii)的非搅拌培养之外。全部培养物培育至稳定期。为了产生透化细胞，生物质在缓冲液(50mMMOPS/KOH pH7)中洗涤两次并重悬于一半体积的缓冲液(对酵母和丝状真菌而言)或四分之一体积的缓冲液(对细菌培养物而言)中。使用液氮和25℃水浴，将混悬液冻融三次并且随后以等分试样在-20℃贮存。

在含水***中的培养物筛选

柠檬醛(5mM)以异丙醇中0.2M溶液的形式添加。2.5％[v/v]异丙醇发挥两种功能：增加疏水性底物柠檬醛的溶解度并且作为胞内醇脱氢酶的底物潜在发挥作用以再生NAD(P)H。每种培养物进行三个实验。

活性测定(用于确定柠檬醛还原酶活性的GC测定)

方法：

500μl样品或水(空白)

100μl 1M磷酸钾，pH7.0

100μl 1M葡萄糖溶液

100μl溶液，在每一情况下具有10M NADPH/NADH

100μl葡萄糖脱氢酶大肠杆菌细胞混悬液

25μl在DMSO中的10％顺/反式柠檬醛

温育：在35℃至少15小时，剧烈摇动

提取：向每个样品添加250μl氯仿并充分搅拌至少5分钟。随后离心3分钟。将下层有机相取出并在4A分子筛上干燥，转移至带微量衬管(micro inset)的HPLC小玻璃瓶中，通过GC进行测量。纯化酶(通过对面积比较而估计)的e.e.值超过98％。

a.培养基中的全细胞

添加5mL新鲜培养基至温度不变的5mL稳定期培养物，150转/分钟搅拌1小时并且随后添加在异丙醇中的柠檬醛。在3小时后及在24小时后，1ml肉汤以0.2ml新鲜制备的在氯仿中的0.3％[v/v]1-辛醇(GC内标)溶液提取。回收有机相，用异丙醇稀释并通过GC进行分析。

b.透化的细胞+NADH

在定轨摇床上于150转/分钟并在30℃振摇的2ml螺口盖小玻璃瓶含有在1ml总体积中的0.5ml融化的透化细胞，其中所述总体积中具有终浓度50mM pH7的MOPS缓冲液、10mM NADH，5mM柠檬醛和2.5％[v/v]异丙醇。在3小时后，全部样品用如上文的氯仿/辛醇提取。

c.透化的细胞+NADPH再生***

方法与b中所述相同，除了NADH由具有终浓度1.5mM NADP+、10mM葡萄糖-6-磷酸、3.3mM MgC1₂和0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的NADPH再生***替换之外。

在两相***中的培养物筛选

在生物转化之前，0.5mL透化细胞与0.15ml甲苯在2ml螺旋盖玻璃小瓶中涡旋混合并且在室温温育10分钟。随后添加其它组分以产生具有如含水/NADPH***那样相同组成的1mL水相，仅无柠檬醛和异丙醇。反应通过添加0.05mL在甲苯中的0.4M柠檬醛而启动并且将小瓶在30℃在轮上垂直转动。在3小时后，全部样品用0.4ml新鲜制备的在氯仿中的0.15％[v/v]1-辛醇(GC内标)提取。在离心后，取出0.4mL下层有机相(甲苯/氯仿混合物)用于GC分析。将形成香茅醛的菌株如下文详述在甲苯和甲基叔丁基醚(MTBE)两相***中进行比较。

生物转化

图2-4中所示的生物转化如对两相培养物筛选那样实施，但是用4ml螺旋盖玻璃小瓶中的0.8ml水相和0.2ml有机溶剂，以磁力方式搅拌以维持有机溶剂在水相中的乳液。组成和条件的细节在分别的附图说明中给出。在启动反应前，以定义的生物质浓度的0.5mL已洗涤细胞与0.15mL分别的有机溶剂在冰上搅拌30分钟。反应通过添加0.05mL在相同有机溶剂中的0.4M柠檬醛而启动。

分析方法

萜类的浓度由使用毛细管柱(来自Varian的Chrompack CP-SIL 5B，50M×0.25mm，0.12μm相厚度)的气相色谱(GC)确定，以氮气作为载气(0.98ml/分钟)并且具有氢(20ml/分钟)及空气(300ml/分钟)的火焰离子化检测器(250℃)。注射体积是1μl，分流比29∶1。注射温度是250℃并且柱温度在100℃维持9分钟并随后以50℃/分钟提高至240℃。使用1-辛醇作为内标，萜浓度基于已经接受如样品那样的相同提取方法处理的标准物进行计算。为分离香茅醛和异蒲勒醇，初始柱温度是75℃持续12分钟。橙花醇和香茅醇在任一先前条件下未得到分离。它们的分离以及手性分析用Supelco Beta Dex 225柱(30m×0.25mm，0.25μm相厚度)进行。分流比是1∶35，柱流速是2.77ml/分钟，柱温度是95℃持续35分钟，以5℃/分钟增加至160℃。香茅醛通过从两个GC柱中与香茅醛标准物共洗脱而鉴定。

实施例1

在含水***中的培养物筛选

对20株酵母菌株、9株丝状真菌菌株和17株细菌菌株在三种含水***中试验柠檬醛转化：使用在培养基中的全细胞或者洗涤和透化的细胞以及NADH或NADPH。仅透化运动发酵单孢菌与NADPH才形成香茅醛。NADPH再生***或NADPH的直接添加均支持香茅醛形成。香叶醇是在全细胞培养物中以及向透化细胞添加NADH或NADPH时众多测试菌株的主要产物。也形成橙花醇和/或香茅醇。因此，用于还原醛基的酶活性与双键还原所需的活性相竞争。

实施例2

溶剂对由运动发酵单孢菌所致柠檬醛转化的影响

使用运动发酵单孢菌以试验有机/水两相***将柠檬醛转化成香茅醛的可行性。图2a显示在缺乏和存在多种水溶性(星号)和水不溶性溶剂时的香茅醛形成，其中所述的溶剂按官能性分类：2种正烷、9种脂族醇、3种酮、2种酯、2种醚和3种芳族溶剂。与无任何有机溶剂的对照相比，4种溶剂即异戊醇、MTBE、二***和甲苯支持高约10倍的产物水平。作为额外优点，大部分溶剂引起副产物香叶醇、橙花醇和/或香茅醇的水平降低(图2b)。对照实验即对香叶醇、橙花醇及香茅醇标准物的提取证实相对于内标，它们的提取未受例如样品中异丙醇、甲苯或MTBE存在的影响。因此下降的副产物水平可以归因于酶还原醛基的减少。选择甲苯和MTBE用于进一步的实验。

实施例3

在两相***中的培养物筛选

在水/甲苯筛选***中，香茅醛由先前在含水筛选***中未鉴定的几个菌株自柠檬醛形成。为了比较，调节这些培养物至相似的生物质浓度，并且甲苯和MTBE两相***的香茅醛产生在图3中显示。在甲苯***中，2株细菌菌株实现比9株真核菌株高至少5倍的香茅醛浓度。在MTBE***中，弗氏柠檬酸杆菌形成比甲苯存在下更少的香茅醛。对东方伊萨酵母得到阳性结果，其中东方伊萨酵母在甲苯***中不形成香茅醛。添加5mMEDTA对大部分菌株导致更高的香茅醛浓度，但是这对弗氏柠檬酸杆菌和丝状真菌爪哇根霉产生相反作用(图3b)。由运动发酵单孢菌形成的香茅醛不受EDTA影响。

就MTBE/EDTA***中的副产物形而言，酵母菌株和细菌弗氏柠檬酸杆菌产生大部分香叶醇、一些橙花醇和少量香茅醇。尤其是，酵母属菌株形成多达13mM香叶醇。省去EDTA则对酵母属菌株增加醇副产物形成约10％，并且对运动发酵单孢菌增加甚至9倍。在任何实验中未检测到异蒲勒醇。

产物香茅醛的对映体过量(e.e.)值列于表1。对运动发酵单孢菌而言，细菌酶优先形成e.e.值＞99％的(S)-对映体，并且对弗氏柠檬酸杆菌而言，细菌酶优先形成e.e.值＞75％的(S)-对映体。相反，酵母菌株主要产生(R)-香茅醛，例如皱落假丝酵母产生超过98％的e.e.值。

表1：由多种菌株在含有5mM EDTA的水/MTBE两相***中所形成的香茅醛的对映体过量(图3b)

柠檬醛生物转化曲线

图4显示在水/甲苯及在水/MTBE两相***中由运动发酵单孢菌所致柠檬醛生物转化的曲线。对前者而言，香茅醛浓度的增加以极为线性的方式继续进行3小时时间。当NADPH再生***的浓度加倍时，实现相同的香茅醛终浓度。这表明该反应不受NADPH再生***限制。两种柠檬醛异构体即香叶醛及橙花醛的浓度均随时间降低。未检测到醇即橙花醇、香叶醇和香茅醇。对于水/MTBE两相***，观察到香茅醛形成随时间变慢，尽管两种柠檬醛异构体即香叶醛和橙花醛均随时间以线性方式消耗。就醇副产物而言，形成0.34mM的香叶醇和小于0.1mM的香茅醇。3小时后的摩尔平衡表明初始底物在甲苯***中丢失16％，并且在MTBE***中丢失10％。在比较时，没有生物质的对照经3小时未显示柠檬醛或香茅醛的丢失。然而，具有煮沸的生物质的对照以如生物转化中观察到的相似程度丢失柠檬醛和香茅醛。

实施例4

自运动发酵单孢菌分离和表征还原酶

运动发酵单孢菌的培养：

细胞在由以下组成的培养基中培育

细菌用蛋白胨 10g/l

酵母提取物 10g/l

葡萄糖＊H₂O 20g/l

KH₂PO₄ 41g/l

(NH₄)₂SO₄ 1g/l

MgSO₄＊7H₂O 0.5g/l

pH7.0；灭菌： 121℃20分钟。

为此目的，在每一情况下将800mL培养基导入1L锥形烧瓶(无挡板)并在100转/分钟和30℃温育至少48小时(通常约65-72小时)。由离心去除轻微混浊(slight clouding)。生物质产量低(约2.0-2.5g/l湿生物质)。

蛋白质的纯化：

匀浆化

106g湿生物质重悬于500mL破裂缓冲液(20mM Tris/HCl，2mMEDTA，10片/L全蛋白酶抑制剂，pH8.0)中，并且pH用NaOH从pH6.6校正至7.5。混悬液的100mL等分试样与100mL玻璃珠(直径0.1-0.2mm)混合并且在球磨中以5000转/分钟破裂12分钟。玻璃珠经G1玻璃抽吸滤器以抽吸作用除去并且洗涤。滤液(710ml)于12000转/分钟(Sorvall，4℃)离心30分钟。上清液(610ml，18.6mg/ml蛋白质，pH7.4，电导率2.6mS/cm)分成3个200ml等分试样并在-20℃贮存。

离子交换层析(Q-Sepharose FF)

将匀浆物施加(15ml/分钟)至Q-Sepharose FF层析柱(直径5cm，体积400ml)上，以20mM Tris/HCl，pH8.0，2mM EDTA，2片全蛋白酶抑制剂/L(缓冲液A)预洗涤。为此目的，将融化的粗制匀浆物用缓冲液A稀释成500ml(电导率1.6mS/cm，pH8.0)。在上样后，柱用1000mL缓冲液A洗涤(15ml/分钟)。随后用线性梯度展开至100％缓冲液B(具有0.5M NaCl的缓冲液A，pH8.0)(1500ml)。随后将又一个750mL 100％B用于洗涤。在每一情况下，将10个12ml级分合并并进行测试。

疏水层析(TSK-Phenyl)

来自Q-Sepharose柱的目的级分用于上样(142ml，pH7.0，用32.2g硫酸铵调节至40％饱和度；500mg蛋白质)。

来自Pharmacia的苯基-Sepharose柱具有2.6cm直径，体积170ml，并且以每分钟10ml运行。该柱用缓冲液A：40％硫酸铵饱和度，2mMEDTA，2片全蛋白酶抑制剂/L，20mM磷酸二氢钠pH7.0)平衡。在上样后，柱用缓冲液A洗涤直至达到吸光度基线。随后用线性梯度展开至100％缓冲液B(无硫酸铵的缓冲液A，3个柱体积)。在结束时，柱用2.5个柱体积的缓冲液C(具有20％异丙醇的缓冲液B)洗脱。在每一情况下，将10个级分合并且测定活性。收集第61至70级分(92ml)。

分子筛层析(Superdex)

来自苯基Sepharose柱的目的级分(90ml)用46.4g硫酸铵(80％饱和度)沉淀并且通过离心取出沉淀。将沉淀在运行缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8，1片全蛋白酶抑制剂/L，1mM EDTA)(9ml)中重悬并施加至Superdex柱(4ml/分钟，2分钟级分)。收集活性级分27和28。

使用以上全部方法，对所有三份匀浆物均进行处理。得到含有总计18.8mg蛋白质的67mL目的级分。

亲和层析(Blue Sepharose FF)

蓝色Sepharose FF柱(直径2.6cm，50ml，Pharmacia)在20mM磷酸二氢钠pH6.8，1片全蛋白酶抑制剂/L，1mM EDTA中平衡。来自分子筛层析的合并目的级分以3ml流量施加。柱随后用150mL的相同缓冲液洗涤并随后用添加0.5M NaCl的该缓冲液(130ml)洗涤。使用第二洗涤缓冲液实施洗脱，其中向第二洗涤缓冲液在每一情况下还已经添加1mMNADH和NADPH。在用该缓冲液洗脱之前，将柱在所述缓冲液中温育16小时。收集活性级分。蛋白质在所选择条件下不与蓝色Sepharose结合。然而，其它蛋白质以如此方式除去，导致成功的纯化。

亲和层析(4-羟基苯甲酸亲和柱)

亲和柱的制备：50mL氨基己酸Sepharose用5L水洗涤。滤饼重悬于40mL水中。4.2g的4-乙酸基苯甲酸(受保护的羟基苯甲酸)溶解于50mlDMF中并调节至pH4.7(10M NaOH)。将3.9g EDC溶解于10mL水中并且在15分钟内添加至偶联混合物中。将pH用HCl维持在4.7。添加另一份50ml DMF并且将混合物在室温搅拌16小时。柱材料以抽吸作用经G2玻璃抽吸滤器去除，并且用1L 50％水/DMF溶液洗涤。随后，用1L水洗涤。柱材料随后重悬于200ml NaHCO₃***液中并且添加2mL乙酸酐。在冰上实施脱保护90分钟，强烈产生CO₂。反应溶液以抽吸作用除去并且柱材料用水洗涤。随后，将柱材料在1M咪唑溶液pH7.9中搅拌1小时，随后再次以抽吸作用取出并且用水洗涤，并且也在这种状态下贮存。蛋白质也不与该柱结合。

Mono-Q层析

Mono-Q层析柱(1ml Pharmacia)用20mM磷酸钠，pH7.5，1片全蛋白酶抑制剂/L，1mM EDTA进行平衡。(1ml/分钟)施加130mL来自蓝色Sepharose柱的流通物(pH7.5，2.7mS/cm)。柱随后用相同缓冲液洗涤。这里，蛋白质再次在上样期间被洗脱，而杂质与柱结合。

疏水层析(Resource-Phenylsepharose，FPLC)

1ml Resource柱(Amersham)用20mM磷酸钠，pH7.0，2片全蛋白酶抑制剂/L，2mM EDTA，40％硫酸铵饱和度进行平衡。来自Mono-Q-Sepharose柱的140mL流通物(pH7.5，2.7mS/cm)用31.6g硫酸铵调节至40％饱和度并施加(160ml，1ml/分钟)。柱随后用相同缓冲液洗涤。柱使用线性梯度展开至不含硫酸铵的相同缓冲液。收集活性级分并将其通过SDS凝胶电泳展开(图1)。条带在40kDa处并进行氨基端测序。

在下表2中总结了纯化。

表2

纯化步骤	总蛋白质	总活性
			匀浆物	11.4g	6U
Q-Sepharose目的级分	1.5g	1U
			苯基-Sepharose目的级分	471mg	2U
Superdex目的级分	18.8mg	1U
			Blue Sepharose目的级分	3mg	0.74U
Mono Q目的级分	2mg	0.7U
			Resource Phenyl目的级分	1mg	0.5U

氨基端测序

得到下列氨基端序列：

PSLFDPIRFGAFTAKNRIWMAPLTRGR

以这个已鉴定的氨基端肽在运动发酵单孢菌公开的基因组(Seo J.S等，“生乙醇细菌运动发酵单孢菌ZM4的基因组序列”，Nat.Biotechnol.23：63-68(2005)，EMBL AE008692)中进行的计算机搜索鉴定该蛋白质是具有358个氨基酸和39489道尔顿分子量的NADH黄素氧化还原酶(EMBLAE008692，AAV90509.1，原始登录号Q5NLA1.)。

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附图描述：

图1：柠檬醛(香叶醛和橙花醛)至香茅醛的生物转化

图2：由运动发酵单孢菌细胞在NADPH再生***和多种溶剂存在下对柠檬醛的生物转化：a)产物香茅醛；b)副产物香叶醇、橙花醇和香茅醇的总和。初始条件：20％v/v有机溶剂，20mM柠檬醛，5mM二硫苏糖醇，3.3mM MgCl₂，1.5mM NADP+，10mM葡萄糖-6-磷酸，0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，约14g/l DCM运动发酵单孢菌，50mM MOPS/KOH，pH7.0，在30℃持续3小时。＊以星号标记的溶剂溶解于水中，全部其它溶剂形成乳液。MTBE＝甲基叔丁基醚，nd＝未检测到。AU＝任意单位：化合物的GC面积除以内标的GC面积。给出三个重复的平均值和误差条表示最高结果和最低结果。对于甲苯，面积比对应于1.4mM香茅醛的浓度。

图3：在a)水/甲苯两相***和b)水/甲基叔丁基醚(MTBE)两相***中由细菌、酵母和丝状真菌所形成的香茅醛的比较(在30℃温育3小时，组成如图2中所示，生物质浓度约12g DCM/l)。给出两个重复的平均值和误差条表示最高结果和最低结果。nd＝未检测到。

图4：由运动发酵单孢菌在具有NADPH再生***的a)水/甲苯和b)水/甲基叔丁基醚(MTBE)两相***(30℃，组成如图2中所示，生物质浓度约14g DCM/l)中所致的柠檬醛生物转化。给出三个重复的平均值和误差条表示最高结果和最低结果。

Claims

1.使用所选择的来自如下种的柠檬醛还原酶通过酶促还原柠檬醛而产生光学活性香茅醛的方法：运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、爪哇根霉(Rhizopus javanicus)，其中还原反应是在两相液体***中完成的，所述两相液体***是指含有相互不较大程度地混合的两种液相的***，其中一种相含有有机液体而第二相含有水或基于水的溶剂，所述有机液体选自MTBE和甲苯。

2.根据权利要求1所述的方法，其中(S)-香茅醛通过所选择的来自运动发酵单孢菌、弗氏柠檬酸杆菌的柠檬醛还原酶产生。

3.根据权利要求1所述的方法，其中(R)-香茅醛通过所选择的来自皱落假丝酵母、贝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、产朊假丝酵母、爪哇根霉的柠檬醛还原酶产生。

4.根据权利要求1所述的方法，其中两相液体***由MTBE和水形成。

5.根据权利要求4所述的方法，其中使用缓冲水溶液作为两相液体***的一个相。

6.根据权利要求1所述的方法，其中柠檬醛还原酶偶联至NADPH再生***。