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Beschreibung der Wirkungsweise
und Vorteile der Erfindung:
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Die
erfindungsgemäße Verwendung
von zwei oder mehreren Scanmodulen ist insbesondere sinnvoll für folgende
Methodenkombinationen (alle genannten Untersuchungen würden von
einem Kombisystem mit gemeinsamem Lasermodul deutlich profitieren,
da Aufwand, Reproduzierbarkeit und Flexibilität gegenüber Einzelsystemen deutlich
optimiert wären):
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1. Methodenkombination
Imaging <-> fast scanning (z.B.
hochauflösender
Punkt- und schneller Disk-Scanner)
-
Egner
et al., J. Microsc. 2002, 206: 24-32 vergleichen die Effizienz und
Auflösung
von Spinning-Disk und multifokalen Multiphotonen-Mikroskopen; je
nach Präparaten
wären beide
Systeme sinnvoll.
-
Stephens
und Allan, Science 2003, 300:82-86 stellen die Vorteile verschiedener
licht- und konfokalmikroskopischer
Techniken für
live cell Imaging dar; trotz verschiedener Detektionswege kommt
bei hochwertigen Systemen meist ein Laser als Lichtquelle zum Einsatz.
-
2. Methodenkombination
Imaging <-> manipulation (z.B.
Einkopplung UV für
Uncaging/NLO)
-
Knight
et al., Am J. Physiol. Cell Physiol. 2003, 284: C1083-1089 beschreiben
Ca2+-Imaging mit
Lichtaktivierung durch Laser; der Laser könnte auch für Imaging genutzt werden.
-
Denk,
J. Neurisc. Methods 1997, 72: 39-42 beschreibt die Verwendung gepulster
Quecksilberdampflampen für
die Freisetzung von Pharmaka; würde
hier ein Laser genutzt, wären
Positionierbarkeit und Effizienz deutlich verbessert.
-
Wang
und Augustine, Neuron 1995, 15: 755-760 beschreiben schnelles Ca2+-Imaging mit lokaler
Freisetzung von Pharmaka durch Laserlicht; der Laser könnte auch
für Imaging
genutzt werden.
-
3. Methodenkombination
Imaging <-> Spektroskopie FCS
(Unter Verwendung des gleichen VIS-Lasers)
-
Quing
et al., Appl. Opt. 2003, 42: 2987-2994 beschreiben Bakterienuntersuchungen
mit FCS in Wasser; der Laser könnte
sowohl die Bildgebungs- als auch die FCS-Komponente versorgen.
-
Bigelow
et al., Opt. Lett. 2003, 28: 695-697 beschreiben die Untersuchung
von Tumorzellen mit konfokaler Fluoreszenzspektroskopie und Fluoreszenzanisotropie;
der Laser könnte
sowohl die Bildgebungs- wie auch die Spektroskopiekomponente versorgen.
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4. Paralleles Imaging
an mehr als einer Mikroskopanordnung (Unter Verwendung des gleichen
gepulsten NIR-Lasers)
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McLellan
et al., J. Neurosc. 2003, 23: 2212-2217 beschreiben die Verwendung
von in-vivo Multiphotonen-Mikroskopie zur Darstellung von Amyloid-Plaques
in Alzheimer-Tiermodellen; die Mikroskopaufbauten sind speziell
an die Tiermodelle angepasst, die Verwendung mehrerer Aufbauten
mit gemeinsamem Laser würde
den Durchsatz deutlich steigern.
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Zipfel
et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 2003, 100: 7075-7080 beschreiben
die Untersuchung von Autofluoreszenzen in lebendem Gewebe mit Multiphotonen-
und SHG-Mikroskopie; der Mikroskopaufbau ist durch Spezialanpassungen
nicht sehr universell, ein zweiter Aufbau würde die Flexibilität erhöhen.
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5. Kombination
konfokale- und TIRF-Mikroskopie
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Pollard
und Apps, Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002, 971: 617-619 beschreiben neue
Techniken zur Untersuchung von Exocytose und Ionentransport mit TIRF-Mikroskopie; der
Imaging-Laser könnte
auch für
die TIRF-Anregung genutzt werden. Ruckstuhl und Seeger, Appl. Opt.,
2003, 42: 3277-3283 beschreiben die konfokale und spektroskopische
Untersuchung von Nanopartikeln und Molekülen mit einem neuartigen Spiegelobjektiv
in der TIRF-Mikroskopie; durch die Spezialoptik ist der Aufbau nicht
sehr universell, ein zweiter Imaging-Aufbau würde die Flexibilität steigern.
-
Tsuboi
et al., Biophys. J. 2002, 83: 172-183 beschreiben die Untersuchung
von endocrinen Zellen mit Lasermikroforce- und TIRF-Mikroskopie;
der Imaging-Laser könnte
auch für
die TIRF-Anregung genutzt werden.
-
In
diesem Zusammenhang ist es jeweils vorteilhaft oder sogar notwendig,
den Strahlengang auf dem Lasermodul so zu gestalten, dass eine stufenlose/variable
Strahlaufteilung zwischen den verwendeten Beleuchtungsmodulen möglich ist.
Die Verwendung eines einzigen Lasermoduls ist sinnvoll, um den Geräteaufwand
zu reduzieren, und damit effektiv Kosten zu sparen.
-
Die
Ausführung
der variablen Strahlaufteilung dient dem Ziel, einzelne Wellenlängen oder
Wellenlängenbereiche
der Lichtquelle ohne Beeinflussung der restlichen Wellenlängen in
verschiedene Strahlwege zu schalten bei gleichzeitiger Sicherstellung
der individuellen Linienselektion und Strahlabschwächung. Dies
Kann auf mehrere verschiedene Arten erfolgen:
- 1.
Aufteilung einer Lichtquelle in mindestens zwei getrennte Strahlengänge mittels
eines optischen Elements durch das stufenlos das Teilungsverhältnis am
optischen Element den applikativen Erfordernissen flexibel angepasst
werden kann, wobei die beiden Strahlengänge eine der Methodenkombinationen
1-4 bedienen, oder alternativ ein Strahlengang in eine Lichtfalle
geleitet wird um die verfügbare
Laserleistung den applikativen Erfordernissen anzupassen.
a.:
mit mindestens einer Faserkopplung
b.: mit mindestens einem
AOTF für
laserlinienselektive Strahlabschwächung
- 2. Aufteilung einer Lichtquelle in zwei getrennte Strahlengänge, wobei
die Aufteilung der Strahlquelle mittels eines Polarisationsstrahlteilers
und vorgeschalteter, drehbarer, lambda/2 Platte oder einem anderen
Element, das die Drehung der Polarisation individuell für jeden
Laser ermöglicht
(liquid crystal, Pockelszelle, Farraday Rotator ...). Durch die über die
lambda/2 Platten quasi stufenlos einstellbare Orientierung des E-Vektors
(ggf. individuell für
jeden Laser), kann das Teilungsverhältnis am Polarisationsstrahlteiler
quasi stufenlos eingestellt werden und damit den applikativen Erfordernissen
flexibel angepasst werden
a.: mit mindestens einer Faserkopplung
b.:
mit mindestens einem AOTF für
laserlinienselektive Strahlabschwächung
- 3. Aufteilung einer Lichtquelle in zwei getrennte Strahlengänge, wobei
die Aufteilung der Strahlengänge
mittels eines oder mehrerer dichroitischerStrahlteiler erfolgt,
deren Reflexions,- bzw. Transmissionseigenschaften durch manuelles
oder motorisches Verkippen verändert
werden.
Das Ändern
des Winkels (also z.B. von 45° nach 50°) für den die
Schicht konzipiert ist führt
zu einer Veränderung
der spektralen Eigenschaften, da sich im Schichtsystem (entspricht
quasi Fabry Perot Interferometer) die Weglängen ändern, wodurch sich wiederum
die Bereiche konstruktiver bzw. destruktiver Interferenz verschieben
variabel eingestellt werden können,
und wodurch das Teilungsverhältnis
den applikativen Erfordernissen flexibel angepasst werden kann.
a.:
mit mindestens einer Faserkopplung
b.: mit mindestens einem
AOTF für
laserlinienselektive Strahlabschwächung
- 4. Aufteilung einer Lichtquelle in zwei getrennte Strahlengänge, wobei
die Aufteilung der Strahlengänge
mittels eines akusto- optischen oder eines anderen diffraktiven
Elements erfolgt, wobei die Beugungseffizienz in eine (+) oder (-)
erste Ordnung im Verhältnis
zur nullten Ordnung variabel eingestellt werden kann und wodurch
das Teilungsverhältnis
zwischen nullten Ordnung und (+) oder (-) erster Ordnung den applikativen
Erfordernissen flexibel angepasst werden kann.
a.: mit mindestens
einer Faserkopplung
b.: mit mindestens einem AOTF für laserlinienselektive
Strahlabschwächung
- 5. Aufteilung einer Lichtquelle in zwei getrennte Strahlengänge, wobei
die Aufteilung der Strahlengänge
mittels eines schnell schaltbaren Spiegels erfolgt. Die Schaltfrequenz
sollte dabei in der Größenordnung
der Bildaufnahmerate liegen. Um die in die einzelnen Strahlengänge transportierte
Energie zu beeinflussen, ist weiterhin eine zur Schaltfrequenz des
Spiegels synchronisierte schnell schaltbare Strahlabschwächung für jeden Laser über Liquid
Crystal Filter zu integrieren.
- 6. Wie 5, wobei die Strahlabschwächung dem Laser nachgeordnet
mittels akustooptischer oder anderer diffraktiver Bauteile erfolgt.
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Der
Vorteil der Varianten 1-4 liegt darin, dass beim Umschalten zwischen
den Strahlengängen
keine Teile bewegt werden müssen
und auf diese Weise die volle dynamische Leistungsfähigkeit
des Aufbaus erhalten bleibt,
-
Beschreibung anhand der
Zeichnungen:
-
Im
folgenden wird ein RT (real time) Scanner mit Linienabtastung anhand
der Zeichnungen 1-4 näher erläutert.
-
1 zeigt
schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das im wesentlichen
aus fünf
Komponenten aufgebaut ist: einem Strahlungsquellenmodul 2,
das Anregungsstrahlung für
die Laserscanningmikroskopie erzeugt, einem Scanmodul 3,
das die Anregungsstrahlung konditioniert und zum Scannen über eine
Probe geeignet ablenkt, einem zur Vereinfachung nur schematisch
gezeigten Mikroskopmodul 4, das die vom Scanmodul bereitgestellte
scannende Strahlung in einem mikroskopischen Strahlengang auf eine
Probe richtet, sowie einem Detektormodul 5, das optische
Strahlung von der Probe erhält
und detektiert. Das Detektormodul 5 kann dabei, wie es
in 1 dargestellt ist, spektral mehrkanalig ausgeführt sein.
-
Zur
allgemeinen Beschreibung eines punktweise abtastenden Laser Scanning
Mikroskopes wird auf
DE
19702753A1 verwiesen, die somit Bestandteil der hier vorliegenden
Beschreibung ist.
-
Das
Strahlungsquellenmodul 2 erzeugt Beleuchtungsstrahlung,
die für
die Laserscanningmikroskopie geeignet ist, also insbesondere Strahlung,
die Fluoreszenz auslösen
kann. Je nach Applikation weist das Strahlungsquellenmodul dazu
mehrere Strahlungsquellen auf. In einer dargestellten Ausführungsform
werden zwei Laser 6 und 7 im Strahlungsquellenmodul 2 vorgesehen,
denen jeweils ein Lichtventil 8 sowie ein Abschwächer 9 nachgeschaltet sind
und die ihre Strahlung über
ein Koppelstelle 10 in eine Lichtleitfaser 11 einkoppeln.
Das Lichtventil 8 wirkt als Strahlablenker, mit dem eine
Strahlabschaltung bewirkt werden kann, ohne den Betrieb der Laser
in der Lasereinheit 6 bzw. 7 selbst abschalten
zu müssen.
Das Lichtventil 8 ist beispielsweise als AOTF ausgebildet,
das zur Strahlabschaltung den Laserstrahl vor der Einkopplung in
die Lichtleitfaser 11 in Richtung einer nicht dargestellten
Lichtfalle ablenkt.
-
In
der beispielhaften Darstellung der 1 weist
die Lasereinheit 6 drei Laser B, C, D auf, wohingegen die
Lasereinheit 7 nur einen Laser A beinhaltet. Die Darstellung
ist also beispielhaft für
eine Kombination aus Einzel- und Multiwellenlängenlaser, die einzeln oder
auch gemeinsam an eine oder mehrere Fasern angekoppelt sind. Auch
kann die Ankopplung über
mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung später nach
Durchlaufen einer Anpaßoptik durch
Farbvereiniger gemischt wird. Es ist somit möglich, verschiedenste Wellenlängen oder
-bereiche für
die Anregungsstrahlung zu verwenden.
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Die
in die Lichtleitfaser 11 eingekoppelte Strahlung wird mittels
verschieblichen Kollimationsoptiken 12 und 13 über Strahlvereinigungsspiegel 14, 15 zusammengeführt und
in einer Strahlformungseinheit hinsichtlich des Strahlprofils verändert.
-
Die
Kollimatoren 12, 13 sorgen dafür, daß die vom Strahlungsquellenmodul 2 an
das Scanmodul 3 zugeführte
Strahlung in einen Unendlichstrahlengang kollimiert wird. Dies erfolgt
jeweils vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung
entlang der optischen Achse unter Steuerung (einer nicht dargestellten)
zentralen Ansteuereinheit eine Fokussierungsfunktion hat, indem
der Abstand zwischen Kollimator 12, 13 und dem
jeweiligen Ende der Lichtleitfaser veränderbar ist.
-
Die
Strahlformungseinheit, welche später noch
eingehend erläutert
wird, erzeugt aus dem rotationssymmetrischen, gaußförmig profilierten
Laserstrahl, wie er nach den Strahlvereinigungsspiegeln 14, 15 vorliegt,
einen zeilenförmigen
Strahl, der nicht mehr rotationssymmetrisch ist, sondern im Querschnitt
zur Erzeugung eines rechteckig befeuchteten Feldes geeignet ist.
-
Dieser
auch als zeilenförmig
bezeichnete Beleuchtungsstrahl dient als Anregungsstrahlung und
wird über
einen Hauptfarbteiler 17 und eine noch zu beschreibende
Zoomoptik zu einem Scanner 18 geleitet. Auf den Hauptfarbteiler
wird später
ebenfalls noch eingegangen, hier sei lediglich erwähnt, daß er die
Funktion hat, vom Mikroskopmodul 4 zurückkehrende Probenstrahlung
von der Anregungsstrahlung zu trennen.
-
Der
Scanner 18 lenkt den zeilenförmigen Strahl ein- oder zweiachsig
ab, wonach er durch ein Scanobjektiv 19 sowie eine Tubuslinse
und ein Objektiv des Mikroskopmoduls 4 in einen Fokus 22 gebündelt wird,
der in einem Präparat
bzw. in einer Probe liegt. Die optische Abbildung erfolgt dabei
so, daß die
Probe in einer Brennlinie mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird.
-
Derart
im linienförmigen
Fokus angeregte Fluoreszenz-Strahlung gelangt über Objektiv und Tubuslinse
des Mikroskopmoduls 4 und das Scanobjektiv 19 zurück zum Scanner 18,
so daß in
Rückrichtung
nach dem Scanner 18 wieder ein ruhender Strahl vorliegt.
Man spricht deshalb auch davon, daß der Scanner 18 die
Fluoreszenz-Strahlung descannt.
-
Der
Hauptfarbteiler 17 läßt die in
anderen Wellenlängenbereichen
als die Anregungsstrahlung liegende Fluoreszenz-Strahlung passieren,
so daß sie über einen
Umlenkspiegel 24 im Detektormodul 5 umgelenkt
und dann analysiert werden kann. Das Detektormodul 5 weist
in der Ausführunsform
der 1 mehrere spektrale Kanäle auf, d.h. die vom Umlenkspiegel 24 kommende
Fluoreszenz-Strahlung
wird in einem Nebenfarbteiler 25 in zwei spektrale Kanäle aufgeteilt.
-
Jeder
spektrale Kanal verfügt über eine Schlitzblende 26,
die eine konfokale oder teil-konfokale Abbildung bezüglich der
Probe 23 realisiert und deren Größe die Tiefenschärfe, mit
der die Fluoreszenz-Strahlung detektiert werden kann, festlegt.
Die Geometrie der Schlitzblende 26 bestimmt somit die Schnittebene
innerhalb des (dicken) Präparates,
aus der Fluoreszenz-Strahlung detektiert wird.
-
Der
Schlitzblende 26 ist noch ein Blockfilter 27 nachgeordnet,
das unerwünschte,
in das Detektormodul 5 gelangte Anregungsstrahlung abblockt. Die
derart abseparierte, aus einem bestimmten Tiefenabschnitt stammende,
zeilenförmig
aufgefächerte Strahlung
wird dann von einem geeigneten Detektor 28 analysiert.
Analog zum geschilderten Farbkanal ist auch der zweite spektrale
Detektionskanal aufgebaut, der ebenfalls eine Schlitzblende 26a,
ein Blockfilter 27a sowie einen Detektor 28a umfaßt.
-
Die
Verwendung einer konfokalen Schlitz-Apertur im Detektormodul 5 ist
nur beispielhaft. Natürlich
kann auch ein Einzelpunktscanner realisiert sein. Die Schlitzblenden 26, 26a sind
dann durch Lochblenden ersetzt und die Strahlformungseinheit kann
entfallen. Im übrigen
sind für
eine solche Bauweise alle Optiken rotationssymmetrisch ausgeführt. Dann
können
natürlich
statt einer Einzelpunktabtastung und -detektion auch prinzipiell
beliebige Mehrpunktanordnungen, wie Punktwolken oder Nipkow-Scheibenkonzepte,
verwendet werden, wie sie später
noch anhand 3 und 4 erläutert werden.
Wesentlich ist dann allerdings, daß der Detektor 28 ortsauflösend ist,
da eine parallele Erfassung mehrerer Probenpunkte beim Durchlauf
des Scanners erfolgt.
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In 1 ist
zu sehen, daß die
nach den beweglichen, d.h. verschieblichen Kollimatoren 12 und 13 vorliegenden
Gauß'schen Strahlenbündel über eine
Spiegeltreppe in Form der Strahlvereinigungsspiegel 14, 16 vereinigt
und bei der gezeigten Bauweise mit konfokaler Schlitzblende anschließend in ein
Strahlbündel
mit rechteckigem Strahlquerschnitt konvertiert werden. In der Ausführungsform
der 1 wird in der Strahlformungseinheit ein Zylinderteleskop 37 verwendet,
dem eine Asphäreneinheit 38 nachgeordnet
ist, auf das eine Zylinderoptik 39 folgt.
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Nach
der Umformung liegt ein Strahl vor, der in einer Profilebene im
wesentlichen ein rechteckiges Feld ausleuchtet, wobei die Intensitätsverteilung
entlang der Feldlängsachse
nicht gaußförmig, sondern kastenförmig ist.
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Die
Beleuchtungsanordnung mit der Asphäreneinheit 38 kann
zur gleichmäßigen Füllung einer Pupille
zwischen einer Tubuslinse und einem Objektiv dienen. Damit kann
die optische Auflösung
des Objektivs voll ausgeschöpft
werden. Diese Variante ist somit auch zweckmäßig in einem Einzelpunkt oder Multipunkt
scannenden Mikroskopsystem, z.B. in einem linien-scannenden System
(bei letzterem zusätzlich
zu der Achse, in der auf bzw. in die Probe fokussiert wird).
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Die
z.B. linienförmig
konditionierte Anregungsstrahlung wird auf den Hauptfarbteiler
17 gelenkt.
Dieser ist in einer bevorzugten Ausführungsform als spektral-neutraler
Teilerspiegel gemäß der
DE 10257237 A1 ausgeführt, deren
Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich
einbezogen ist. Der Begriff „Farbteiler" umfaßt also
auch nichtspektral wirkende Tellersysteme. Anstelle des beschriebenen
spektral unabhängigen
Farbteilers kann auch ein homogener Neutralteiler (z.B. 50/50, 70/30,
80/20 o.ä.)
oder ein dichroitischer Teiler Verwendung finden. Damit applikationsabhängig eine
Auswahl möglich
ist, ist der Hauptfarbteiler vorzugsweise mit einer Mechanik versehen,
die einen einfachen Wechsel ermöglicht,
beispielsweise durch ein entsprechendes Tellerrad, das einzelne,
austauschbare Teiler enthält.
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Ein
dichroitischer Hauptfarbteiler ist besonders dann vorteilhaft, wenn
kohärente,
d. h. gerichtete Strahlung detektiert werden soll, wie z.B. Reflexion,
Stokes'sche bzw.
anti-Stokes'sche
Raman-Spektroskopie, kohärente
Raman-Prozesse höherer
Ordnung, allgemein parametrische nicht-lineare optische Prozesse,
wie Second Harmonic Generation, Third Harmonic Generation, Sum Frequency
Generation, Zwei- und Mehrfotonenabsorption bzw. Fluoreszenz. Mehrere
dieser Verfahren der nicht-linearen optischen Spektroskopie erfordern
den Einsatz zweier oder mehrer Laserstrahlen, die kollinear überlagert werden.
Hierbei erweist sich die dargestellte Strahlvereinigung der Strahlung
mehrerer Laser als besonders vorteilhaft. Grundsätzlich können die in der Fluoreszenzmikroskopie
weltverbreiteten dichroitischen Strahlteiler verwendet werden. Auch
ist es für
Raman-Mikroskopie vorteilhaft vor den Detektoren holografische Notch-Teiler
oder -Filter zu Unterdrückung des
Rayleigh-Streuanteils zu verwenden.
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In
der Ausführungsform
der 1 wird die Anregungsstrahlung bzw. Beleuchtungsstrahlung dem
Scanner 18 über
eine motorisch steuerbare Zoom-Optik 41 zugeführt. Damit
kann der Zoom-Faktor angepaßt
werden und das abgetastete Sehfeld ist in einem bestimmten Verstellbereich
kontinuierlich variierbar. Besonders vorteilhaft ist eine Zoom-Optik, bei
der während
Anpassung der Fokuslage und des Abbildungsmaßstabes die Pupillenlage im
kontinuierlichen Durchstimmvorgang erhalten bleibt. Die in 1 dargestellten,
durch Pfeile symbolisierten, drei motorischen Freitheitsgrade der
Zoom-Optik 41 entsprechen genau der Zahl der Freitheitsgrade,
die zur Anpassung der drei Parameter, Abbildungsmaßstab, Fokus-,
Pupillenlage, vorgesehen sind. Besonders bevorzugt ist eine Zoom-Optik 41,
an deren ausgangsseitigen Pupille eine feste Blende 42 angeordnet
ist. In einer praktischen einfachen Realisierung kann die Blende 42 auch
durch die Begrenzung der Spiegelfläche des Scanners 18 vorgegeben
sein. Die ausgangsseitige Blende 42 mit der Zoom-Optik 41 erreicht,
daß unabhängig vom
Verstellen der Zoomvergrößerung immer
ein festgelegter Pupillendurchmesser auf das Scanobjektiv 19 abgebildet
wird. Somit bleibt die Objektivpupille auch bei beliebiger Verstellung
der Zoomoptik 41 vollständig
ausgeleuchtet. Die Verwendung einer eigenständigen Blende 42 verhindert
vorteilhaft das Auftreten ungewollter Streustrahlung im Bereich
des Scanners 18.
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Mit
der Zoom-Optik 41 wirkt das Zylinderteleskop 37 zusammen,
das ebenfalls motorisch betätigbar
ist und der Asphäreneinheit 38 vorgeordnet
ist. Dies ist in der Ausführungsform
der 2 aus Gründen
eines kompakten Aufbaus gewählt,
muß aber nicht
so sein.
-
Wird
ein Zoom-Faktor kleiner 1,0 gewünscht, wird
das Zylinderteleskop 37 automatisch in den optischen Strahlengang
eingeschwenkt. Es verhindert, daß die Aperturblende 42 unvollständig ausgeleuchtet
ist, wenn das Zoomobjektiv 41 verkleinert ist. Das einschwenkbare
Zylinderteleskop 37 gewährleistet somit,
daß auch
bei Zoom-Faktoren kleiner 1, d. h. unabhängig von der Verstellung der
Zoomoptik 41 am Ort der Objektivpupille stets eine Beleuchtungslinie
konstanter Länge
vorliegt. Im Vergleich zu einem einfachen Sehfeld-Zoom sind somit
Laserleistungsverluste in dem Beleuchtungsstrahl vermieden.
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Da
beim Einschwenken des Zylinderteleskops 37 ein Bildhelligkeitssprung
in der Beleuchtungslinie unvermeidlich ist, ist in der (nicht dargestellten)
Steuereinheit vorgesehen, daß die
Vorschubgeschwindigkeit des Scanners 18 oder ein Verstärkungsfaktor
der Detektoren im Detektormodul 5 bei aktiviertem Zylinderteleskop 37 entsprechend
angepaßt
ist, um die Bildhelligkeit konstant zu halten.
-
Neben
der motorisch angetriebenen Zoomoptik 41 sowie dem motorisch
aktivierbaren Zylinderteleskop 37 sind auch im Detektormodul 5 des
Laserscanningmikroskops der 1 fernsteuerbare
Justierelemente vorgesehen. Zur Kompensation von Farblängsfehlern
sind beispielsweise vor der Schlitzblende eine Rundoptik 44 sowie
eine Zylinderoptik 39 und unmittelbar vor dem Detektor 28 eine
Zylinderoptik 39 vorgesehen, die jeweils in axialer Richtung
motorisch verschiebbar sind.
-
Zusätzlich ist
zur Kompensation eine Korrektureinheit 40 vorgesehen, die
nachfolgend kurz beschrieben wird.
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Die
Schlitzblende 26 bildet zusammen mit einer vorgeordneten
Rundoptik 44 sowie der ebenfalls vorgeordneten ersten Zylinderoptik 39 sowie
der nachgeordneten zweiten Zylinderoptik ein Pinhole-Objektiv der
Detektoranordnung 5, wobei das Pinhole hier durch die Schlitzblende 26 realisiert
ist. Um eine unerwünschte
Detektion von im System reflektierter Anregungsstrahlung zu vermeiden,
ist der zweiten Zylinderlinse 39 noch das Blockfilter 27 vorgeschaltet,
das über
geeignete spektrale Eigenschaften verfügt, um lediglich gewünschte Fluoreszenzstrahlung
zum Detektor 28, 28a gelangen zu lassen.
-
Ein
Wechsel des Farbteilers 25 oder des Blockfilters 27 bringt
unvermeidlich einen gewissen Kipp- oder Keilfehler bei Einschwenken
mit sich. Der Farbteiler kann einen Fehler zwischen Probenbereich
und Schlitzblende 26, das Blockfilter 27 einen Fehler
zwischen Schlitzblende 26 und Detektor 28 nach
sich ziehen. Um zu verhindern, daß dann eine Neujustierung der
Lage der Schlitzblende 26 bzw. des Detektors 28 erforderlich
ist, ist zwischen der Rundoptik 44 und der Schlitzblende 26,
d.h. im Abbildungsstrahlengang zwischen Probe und Detektor 28 eine
planparallele Platte 40 angeordnet, die unter Steuerung
eines Controllers in verschiedene Kippstellungen gebracht werden
kann. Die planparallele Platte 40 ist dazu in einer geeigneten
Halterung verstellbar angebracht.
-
2 zeigt,
wie mit Hilfe der Zoom-Optik 41 innerhalb des zur Verfügung stehenden
maximalen Scanfeldes SF ein Bereich (region of interest) ROI ausgewählt werden
kann. Beläßt man die
Ansteuerung des Scanners 18 so, daß die Amplitude sich nicht
verändert,
wie dies beispielsweise bei Resonanz-Scanner zwingend erforderlich
ist, bewirkt eine an der Zoom-Optik eingestellte Vergrößerung größer 1,0
eine Einengung des ausgewählten
Bereiches ROI zentriert um die optische Achse des Scanfeldes SF.
-
Resonanzscanner
sind beispielsweise in Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy,
Plenum Press 1994, Seite 461ff beschrieben.
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Steuert
man den Scanner so an, daß er
ein Feld asymmetrisch zur optischen Achse, d. h. zur Ruhelage der
Scannerspiegel abtastet, so erhält
man im Zusammenhang mit einer Zoomwirkung eine Offsetverschiebung
OF des ausgewählten
Bereiches ROI. Durch die bereits erwähnte Wirkung des Scanners 18,
zu descannen, und durch den nochmaligen Durchlauf durch die Zoom-Optik 41,
wird die Auswahl des interessierenden Bereiches ROI im Detektionsstrahlengang
wieder in Richtung auf den Detektor hin aufgehoben. Somit kann man
eine beliebige innerhalb des Scanbildes SF liegende Auswahl für den Bereich
ROI treffen. Zusätzlich
kann man für
verschiedene Auswahlen des Bereiches ROI Bilder gewinnen und diese
dann zu einem hochauflösenden Bild
zusammensetzen.
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Möchte man
den ausgewählten
Bereich ROI nicht nur um einen Offset OF gegenüber der optischen Achse verschieben,
sondern auch zusätzlich drehen,
ist eine Ausführungsform
zweckmäßig, die
in einer Pupille des Strahlenganges zwischen Hauptfarbteiler 17 und
Probe 23 ein Abbe-König-Prisma vorsieht,
das bekanntermaßen
eine Bildfelddrehung zur Folge hat. Auch diese wird in Richtung
auf den Detektor hin wieder aufgehoben. Nun kann man Bilder mit
verschiedenen Offsetverschiebungen OF und verschiedenen Drehwinkeln
messen und anschließend
zu einem hochauflösenden
Bild verrechnen, beispielsweise gemäß einem Algorithmus, wie er
in der Veröffentlichung,
Gustafsson, M., „Doubling
the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using
structured illumination", in „Three-dimensional
and multidimensional microscopy: Image acquisition processing VII", Proceedings of
SPIE, Vol. 3919 (2000), p 141-150, beschrieben ist.
-
3 zeigt
eine weitere mögliche
Bauweise für
ein Laserscanningmikroskop
1, bei dem ein Nipkowscheiben-Ansatz
zur Verwirklichung kommt. Das Lichtquellenmodul
2, das
in
3 stark vereinfacht dargestellt ist, beleuchtet über ein
Minilinsenarray
65 durch den Hauptfarbteiler
17 hindurch
eine Nipkow-Scheibe
64, wie sie beispielsweise in
US 6.028.306 , WO 88 07695
oder
DE 2360197 A1 beschrieben
ist. Die über
das Minilinsenarray
65 beleuchteten Pinholes der Nipkow-Scheibe
werden in die im Mikroskopmodul
4 befindliche Probe abgebildet.
Um auch hier die probenseitige Bildgröße variieren zu können, ist
wiederum die Zoom-Optik
41 vorgesehen.
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In
Abwandlung zur Bauweise der 1 ist beim
Nipkow-Scanner die Beleuchtung im Durchgang durch den Hauptfarbteiler 17 vorgenommen und
die zu detektierende Strahlung wird ausgespiegelt. Darüber hinaus
ist in Abwandlung zu 2 der Detektor 28 nun
ortsauflösend
ausgeführt,
damit die mit der Nipkow-Scheibe 64 erreichte Multipunktbeleuchtung
auch entsprechend parallel abgetastet wird. Ferner ist zwischen
der Nipkow-Scheibe 64 und der Zoom-Optik 41 eine
geeignete feststehende Optik 63 mit positiver Brechkraft
angeordnet, welche die durch die Pinholes der Nipkow-Scheibe 64 divergent austretende
Strahlung in geeignete Bündeldurchmesser
umwandelt. Der Hauptfarbteiler 17 ist für den Nipkow-Aufbau der 3 ein
klassischer dichroitischer Strahlteiler, d. h. nicht der zuvor erwähnte Strahlteiler
mit schlitzförmig
oder punktförmig
reflektierendem Bereich.
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Die
Zoom-Optik 41 entspricht der zuvor erläuterten Bauweise, wobei natürlich der
Scanner 18 durch die Nipkow-Scheibe 64 überflüssig wird.
Er kann dennoch vorgesehen werden, wenn man die anhand 2 erläuterte Auswahl
eines Bereiches ROI vornehmen möchten.
Gleiches gilt für
das Abbe-König-Prisma.
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Einen
alternativen Ansatz mit Multipunktabtastung zeigt in schematischer
Darstellung 4, bei der mehrere Lichtquellen
schräg
in die Scannerpupille einstrahlen. Auch hier läßt sich durch Nutzung der Zoom-Optik 41 zur
Abbildung zwischen Hauptfarbteiler 17 und Scanner 18 eine
Zoomfunktion wie in 2 dargestellt realisieren. Durch
gleichzeitiges Einstrahlen von Lichtbündeln unter verschiedenen Winkeln
in einer zur Pupille konjugierten Ebene, werden Lichtpunkte in einer
zur Objektebene konjugierten Ebene erzeugt, die vom Scanner 18 gleichzeitig über einen
Teilbereich des gesamten Objektfeldes geführt werden. Die Bildinformation
entsteht durch Auswertung sämtlicher
Teilbilder auf einem ortsauflösenden
Matrixdetektor 28.
-
Als
weitere Ausführungsform
kommt eine Multipunkt-Abtastung, wie in
US 6.028.306 beschrieben, in Frage,
deren Offenbarung vollumfänglich diesbezüglich hier
einbezogen wird. Auch hier istein ortsauflösender Detektor
28 vorzusehen.
Die Probe wird dann durch eine Multipunktlichtquelle beleuchtet,
die durch einen Strahlexpander mit nachgeordneten Mikrolinsenarray
realisiert wird, das eine Multiaperturenplatte so beleuchtet, daß dadurch
eine Multipunktlichtquelle realisiert ist.
-
In
den weiteren Zeichnungen sind folgende Elemente und Bezeichnungen
dargestellt und verwendet (verwiesen wird zur Erläuterung
auch auf
EP977069A1 )
Laser
1-4 bzw. A-G als Lichtquellen
Umlenkspiegel US zur Umlenkung
des Laserstrahls
Lichtklappe oder Shutter V als Lichtverschluss
λ/2 Platte
drehbar
Polteiler PT zur Polteilung
Lichtleitfasern LF
zur Lichtübermittlung
Faser-
Koppelport zur Faserankopplung
Abschwächer A (bevorzugt AOTF oder
AOM)
Monitordiode MD zur Strahlungsdetektion
Detektoren
PMT1-3 zur wellenlängenselektiven Strahlungsdetektion
Detektor
T – PMT
zur Detektion der transmittierten Strahlung
Pinholes PH1-4
Farbteiler
DBS 1-3
Pinholeoptiken zur Fokussierung auf das Pinhole
Hauptfarbteiler
MDB
Emissionsfilter EF1-3
Kollimatoren zur wellenlängenabhängigen Einstellung
Scanner
Scanoptik
oder Scanlinse
Okular
Tubuslinsen
Strahlvereiniger
Non-descannt
Detektor zwischen Objektiv und Scanner
Objektiv
Probe
Kondensor
HBO
Weißlichtquelle
Halogenlampe
HAL zur Durchlichtbeleuchtung
Teleskopoptik
Zoomoptik
Strahlformer
zur Erzeugung einer Beleuchtungslinie
Zylinderteleskop
Zylinderoptik
Spalt
Detektor
zur Linienerfassung mit Spaltblenden
Schneller Schaltspiegel
SS
-
In 5 sind
vier Laser 1-4 dargestellt mit unterschiedlichen Wellenlängen, denen
in Lichtrichtung Shutter und drehbare λ/2 Platten zur Einstellung einer
definierten Polarisationsebene aus dem im linear polarisierten Laserstrahl
nachgeordnet sind. Die Laser 1-3 werden über Umlenkspiegel und dichroitische
Teiler zusammengeführt
und gelangen wie der Laser 4 auf den Polarisationsstrahlteilerwürfel Die
dichroitischen Teiler sind dabei in besonderer Weise so auszuführen, das
ihre Transmissions bzw. Reflexionseigenschaften unabhaengig von
der Drehung der Polarisationsebene sind.
-
Entsprechend
der jeweiligen Einstellung ihrer Polarisationsebene werden sie vollständig oder nur
teilweise transmittiert oder reflektiert (Laser 4 hier wird nicht
mit anderen Lasern vereinigt, sondern direkt auf den Polteiler geführt) und
gelangen über
selektive Strahlabschwächer
( AOTF) in Richtung von Lichtleitfasern. Eine die feste lambda/2
Platte stellt im transmittierten (VIS) bzw. reflektierten (V) die
richtige Polarisationsebene für
den AOTF ein
-
Es
sind Koppelports für
Lichtleitfasern in verschiedene Mikroskopsysteme vorgesehen, die
weiter hinten im Detail beschrieben werden. Der Polarisationsstrahlteilerwuerfel
kennt nur zwei Zustaende. Das transmittierte Licht ist immer parallel
zur Montageplatte polarisiert, das reflektierte immer sinkrecht
zur Montageplatte. Steht die lambda/2 Platte vor einem Laser mit
der optischen Achse unter 22.5° zur
Laserpolarisation (linear polarisiert und senkrecht zur Montageplatte)
wird die Polarisationsebene um 45° gedreht.
Das bedeutet, dass der Polarisationstrahlteiler als 50/50 Teiler
wirkt. Andere Winkel ergeben andere Teilungsverhaeltnisse. z.B.
lambda/2 Platte unter 45° heisst
Drehung der Polarisationsebene um 90° und theoretisch 100% Reflexion
am Polariosationsteilerwuerfel. Das heisst weiter: Der AOTF im reflektierten Pfad
(am Polteiler) sieht immer senkrecht polarisiertes Licht, so dass
der AOTF korrekt genutzt wird. Fuer den transmittierten Pfad ist
eine feste Drehung der Polarisationsebene um 90° notwendig um die Bedingung 'Eingangspolarisation
AOTF senkrecht zur Montageplatte' zu
erfuellen. Die Entkopplung der lambda/2 Platten erfolgt durch den
Polarisationsteilerwuerfel.
-
Hier
ist beispielhaft ein Scanningmikroskop RT und ein scannender Manipulator
angegeben, auf die unterschiedlichen Wellenlängen unterschiedlich aufgeteilt
werden können.
-
Dies
geschieht stufenlos durch entsprechende, elektronisch koordinierte
Drehung der einzelnen λ/2
Platten.
-
Hierdurch
ist ein sehr variabler Betrieb auch von mehreren unabhängigen Beobachtungs- und/oder
Manipulationssystemen möglich.
-
In 6 ist
ein AOM Kristall schematisch dargestellt, der einen Eingangsstrahl,
beispielsweise einen Laserstrahl mit 405 nm Wellenlänge, in
zwei linear aber senkrecht zueinander polarisierte Strahlen 0ter
und erster Ordnung aufteilt, die in unterschiedliche Strahlengänge eingekoppelt
werden können. Durch
entsprechende Ansteuerung des AOM wird das Verhältnis der Anteile verändert.
-
In 7 sind
zwei Laser dargestellt, die über Umlenkspiegel
und Strahlvereiniger vereinigt werden und denen ein AOTF1 zur einstellbaren
Aufteilung der Strahlung in die 0te und erste Ordnung nachgeordnet
ist.
-
Die
erste Beugungsordnung des AOTF, der eigentliche Arbeitsstrahl ist
kollinear fuer den gesamten definierten Spektralbereich (also z.B. 450-700nm).
Die nullte Ordnung wird durch die prismatische Wirkung des Kristalles
aufgespalten. Die Anordnung ist somit nur fuer eine bestimmte Wellenlaenge
nutzbar (muss festgelegt werden). Es sind natuerlich Anordnungen
denkbar, die die spektrale Aufspaltung der ersten Ordnung kompensieren
(zweites Prisma mit umgekehrter Dispersion, entsprechend modifizierter
AOTF Kristall).
-
Die
Intensität
in den Zweigen unterschiedlicher Ordnung ist wellenlängenabhängig einstellbar, eine
angelegte Steuerspannung regelt die in die erste Ordnung gebeugte
Intensitaet, der Rest verbleibt in der 0ten Ordnung) Die Strahlen
0ter und erster Ordnung können
in unterschiedliche Beobachtungs/ und oder Manipulationssysteme
gelangen.
-
In
einem Zweig, hier dem 1.ter Ordnung kann ein weiterer AOTF2 vorgesehen
sein, der eine weitere Aufteilung vornehmen kann.
-
In 8 ist
in dem anderen Zweig (0ter Ordnung) ebenfalls ein AOTF3 vorgesehen.
Wenn beispielsweise AOTF1 in diesen Zweig eine Wellenlänge mit
voller Intensität
einleitet, kann mittels AOTF 3 wiederum eine Aufteilung vorgenommen
werden.
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In 9 ist
ein Beleuchtungsteil mit Laser A vorgesehen, dessen Licht mittels
einer λ/2
Platte bezüglich
der Orientierung seiner Polarisationsebene einstellbar ist und dementsprechend
am Polarisationsteilerwuerfel reflektiert oder transmittiert wird
und über
dargestellte Lichtleitfasern in einstellbar in unterschiedliche
Systeme, beispielsweise ein LSM510 und einen Linienscanner RT gelangt.
-
Das
Licht der Laser B-D wird wie in 1 zusammengeführt und
jeweils vorher über λ/2 Platten bezüglich der
Orientierung seiner Polarisationsebene eingestellt.
-
Am
Polteiler wird es reflektiert bzw. transmittiert und gelangt so
jeweils über
Lichtleitfasern entweder zu einem Linienscanner RT oder zu einem weiteren
Beleuchtungsmodul mit Lasern E-G.
-
Die
Einkopplung in den Beleuchtungsstrahlengang der Laser E-G erfolgt
beispielsweise über
einen schnellen Schaltspiegel SS, der abwechselnd den Strahlengang
freigibt oder einkoppelnd wirt.
-
Bei
dem Schaltspiegel kann es sich auch um ein Rad handeln, das abwechselnd
reflektierende und transmittierende Abschnitte aufweist.
-
Ein
fester Strahlteiler zur Zusammenführung ist ebenfalls denkbar.
-
Durch
diese Koppelstelle kann also Licht der Laser B-D mit dem Licht der
Laser E-G einstellbar gemischt werden und gelangt über eine
Lichtleitfaser beispielsweise zu einem LSM 510 In 10 ist
ein Laser Scanning Mikroskop mit Lichtquellen E-G, einem Scanmodul
(LSM) und einem Mikroskopmodul vorgesehen, wie es beispielsweise
in DE beschrieben wird.
-
Über einen
Strahlvereiniger wird ein Manipulationssystem, bestehend aus einem
Lichtquellenmodul und einem Manipulatormodul, eingekoppelt.
-
Über den
Scanner des Manipulators können z.B.
gezielt bestimmte Probenbereiche gebleicht werden oder physiologische
Reaktionen ausgelöst werden,
wobei gleichzeitig oder alternierend mittels des LSM 510 eine Bildai8ufnahme
erfolgen kann.
-
Im
Lichtquellenmodul des Manipulators ist, beispielsweise dem Laser
A nachfolgend, eine λ/2 Plattevorgesehen,
die mit einem Polarisationsstrahlteilerwürfel zusammenwirkt der das
Licht des Lasers A wie oben beschrieben einstellbar auf den Manipuiationsstrahlengang
und den LSM510 Strahlengang, jeweils über Lichtleitfasern aufteilt.
-
Am
LSM ist zu diesem Zweck eine separate Einkoppelstelle vorgesehen,
wobei unterschiedliche Einkopplungen wiederum über (interne) Spiegel und Strahlteiler
zusammengeführt
werden.
-
Aus
diese Weise kann der Laser A von beiden Systemen genutzt werden.
-
In 11 sind
weiterhin auch die Verhältnisse
der Laser B-D am Manipulator über λ/2 Platten und
Polarisationsstrahlteilerwürfel
einstellbar und eine weitere Verbindung besteht am Polteiler in
Richtung des LSM über
eine Lichtleitfaser, wobei am LSM beispielsweise über einen
schnellschaltbaren Spiegel (Klappspiegel) eingekoppelt werden kann.
-
Auf
diese Weise gelangt Licht der Laser B-G neben dem Licht des Lasers
A auch einstellbar in beide Strahlengänge.
-
In 12 ist
neben dem Manipulator ein Linienscanner RT vorgesehen, bei dem das
Licht über Strahlformer
linienförmig
in den Mikroskopstrahlengang gelangt.
-
Hier
ist ein gemeinsamer Lichtquellenmodul vorgesehen, wobei wiederum über λ/2 Platten
und Polteiler eine Aufteilung in die Systeme einstellbar vorgenommen
werden kann.
-
So
steht das Licht der Laser A-D beiden Systemen zur Verfügung. Das
bedeutet eine wesentliche Vereinfachung und Kostenersparnis.
-
Eine
weitere Lichtquelle E kann optional beispielsweise nur für den Manipulator
vorgesehen sein, weil ihre Wellenlänge im RT Scanner nicht benötigt wird.
-
In 13 ist
ein RT Scanner und ein punktscannendes LSM vorgesehen, die über einen
gemeinsamen Strahlvereiniger beide Bilder von der Probe in gleichen
oder unteerschiedlichen Probenbereichen ausführen können.
-
Verschiedene
Lasermodule B-D, A, G-E sind vorgesehen, die jeweils wie oben beschrieben
wahlweise einstellbar für
beide Systeme zur Verfügung stehen
In 14 werden über
eine Umschalteinheit (Einschiebbare Spiegel) durch Umschaltung zwischen
einem von unten und einem seitlich eingekoppelten Strahlengang wahlweise
oder alternierend ein RT Scanner und ein Manipulator in das Mikroskopteil eingekoppelt.
-
Ein
gemeinsames Lichtquellenmodul ist für beide Systeme wie oben beschrieben
wirksam.
-
In 15 ist
dargestellt, daß eine
einstellbare Einkopplung von Lichtquellen 1 und 2, jeweils vorteilhaft
bestehend aus mehreren Lasern, in einen gemeinsamen Strahlengang,
beispielsweise über
einen schnellen Schaltspiegel SS erfolgt.
-
Die
Laser sind durch nachgeordnete λ/2
Platten zumindest teilweise in ihrer Polarisation beeinflußbar. Das
Licht aus der Lichtquelle 2 kann auch erst nach Passieren der Lichtleitfaser
eine λ/2
Platte passieren, um den Lichtanteil der Lichtquelle 2 vor der Einkopplung
in den gemeinsamen Strahlengang zu beeinflussen.
-
Ein
Polteiler im gemeinsamen Strahlengang dient zur Aufteilung wiederum
in unterschiedliche Beleuchtungsmodule 1 und 2, für unterschiedliche
Scaneinrichtungen zur Bildaufnahme und/oder Manipulation, wobei
Lichtanteile und Intensitäten,
die in die einzelnen Beleuchtungsmodule gelangen, vorteilhaft steuerbar
sind. Die Steuerung erfolgt sowohl über λ/2 Platten als auch mittels
der Abschwächer
(AOTF) in den wieder getrennten Strahlengängen.
-
In 16 ist
eine Ausführung
wie in 15 dargestellt bei der das Licht
eines Lasermoduls 2 jedoch ohne Lichtleitfasern, beispielsweise
in einem Gehäusekanal,
auf eine Strahlvereinigung geführt
ist.
-
Die
beschriebene Erfindung stellt eine bedeutende Ausweitung der Anwendungsmöglichkeiten
von schnellen konfokalen Laserscanmikroskopen dar. Die Bedeutung
einer solchen Weiterentwicklung lässt sich anhand der zellbiologischen
Standardliteratur und den dort beschriebenen schnellen zellulären und
subzellulären
Vorgängen1 und den eingesetzten Untersuchungsmethoden
mit einer Vielzahl von Farbstoffen2 ablesen.
-
Siehe
z.B.:
-
- 1B. Alberts et al. (2002): Molecular
Biology of the Cell; Garland Science.
- 1,2G. Karp (2002): Cell and Molecular
Biology: Concepts and Experiments; Wiley Text Books.
- 1,2R. Yuste et al. (2000): Imaging neurons – a laboratory
Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- 2R.P. Haugland (2003): Handbook of fluorescent
Probes and research Products, 10th Edition; Molecular Probes Inc.
and Molecular Probes Europe BV.
-
De
Erfindung hat insbesondere große
Bedeutung für
die folgenden Prozesse und Vorgange:
-
Entwicklung
von Organismen
-
Die
beschriebene Erfindung ist u.a. für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen
geeignet, die sich vor allem durch dynamische Prozesse im Zehntelsekunden
bis hin zum Stundenbereich auszeichnen. Beispielanwendungen auf
der Ebene von Zellverbänden
und ganzen Organismen sind z.B. hier beschrieben:
- • Abdul-Karim,
M.A. et al. beschreiben 2003 in Microvasc. Res., 66:113-125 eine
Langzeitanalyse von Blutgefässveränderungen
im lebenden Tier, wobei Fluoreszenzbilder in Intervallen über mehrere
Tage aufgenommen wurde. Die 3D-Datensätze wurden
mit adaptiven Algorithmen ausgewertet, um die Bewegungstrajektorien
schematisch darzustellen.
- • Soll,
D.R. et al. beschreiben 2003 in Scientific World Journ. 3:827-841
eine softwarebasierte Bewegungsanalyse von mikroskopischen Daten
von Kernen und Pseudopodien lebender Zellen in allen 3 Raumdimensionen.
- • Grossmann,
R. et al. beschreiben 2002 in Glia, 37:229-240 eine 3D-Analyse der
Bewegungen von Mikrogliazellen der Ratte, wobei die Daten über bis
zu 10 Stunden aufgenommen wurden. Gleichzeitig kommen nach traumatischer
Schädigung
auch schnelle Reaktionen der Glia vor, so dass eine hohe Datenrate
und entsprechendes Datenvolumen entsteht.
- Das betrifft insbesondere folgende Schwerpunkte:
- • Analyse
lebender Zellen in einer 3D Umgebung, deren Nachbarzellen empfindlich
auf Laserbeleuchtung reagieren und die von der Beleuchtung der 3D-ROI
geschützt
werden müssen;
- • Analyse
lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt
durch Laserbeleuchtung in 3D gebleicht werden sollen, z.B. FRET-Experimente;
- • Analyse
lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt
durch Laserbeleuchtung gebleicht und gleichzeitig auch ausserhalb der
ROI beobachtet werden sollen, z.B. FRAP- und FLIP-Experimente in
3D;
- • Gezielte
Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen und
Pharmaka, die manipulationsbedingte Änderungen durch Laserbeleuchtung
aufweisen, z.B. Aktivierung von Transmittern in 3D;
- • Gezielte
Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die
manipulationsbedingte Farbänderungen
durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede;
- • Gezielte
Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit sehr schwachen
Markierungen, die z.B. eine optimale Balance von Konfokalität gegen
Detektionsempfindlichkeit erfordern.
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit variierenden Mehrfachmarkierungen,
z.B. CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed u.ä.
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die funktionsabhängige Farbänderungen
aufweisen, z.B. Ca+-Marker
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die entwicklungsbedingte
Farbänderungen
aufweisen, z.B. transgene Tiere mit GFP
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die manipulationsbedingte
Farbänderungen
durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit sehr schwachen Markierungen,
die eine Einschränkung
der Konfokalität
zugunsten der Detektionsempfindlichkeit erfordern.
- • Letztgenannter
Punkt in Kombination mit den Vorangehenden.
-
Transportvorgänge in Zellen
-
Die
beschriebene Erfindung ist für
die Untersuchung von innerzellulären
Transportvorgängen
exzellent geeignet, da hierbei recht kleine motile Strukturen, z.B.
Proteine, mit hoher Geschwindigkeit (meist im Bereich von Hundertstelsekunden)
dargestellt werden müssen.
Um die Dynamik von komplexen Transportvorgängen zu erfassen, kommen oft auch
Anwendungen wie FRAP mit ROI-Bleichen zum Einsatz. Beispiele für solche
Studien sind z.B. hier beschrieben:
- • Umenishi,
F. et al. beschreiben 2000 in Biophys J., 78:1024-1035 eine Analyse
der räumlichen
Beweglichkeit von Aquaporin in GFP-transfizierten Kulturzellen.
Hierzu wurden in den Zellmembranen Punkte gezielt lokal gebleicht
und die Diffusion der Fluoreszenz in der Umgebung analysiert.
- • Gimpl,
G. et al. beschreiben 2002 in Prog. Brain Res., 139:43-55 Experimente
mit ROI-Bleichen und Fluoreszenzimaging zur Analyse der Mobilität und Verteilung
von GFP-markierten Oxytocin-Rezeptoren in Fibroblasten. Dabei stellen
sich hohe Anforderungen an die räumliche
Positionierung und Auflösung
sowie die direkte zeitliche Folge von Bleichen und Imaging.
- • Zhang
et al. beschreiben 2001 in Neuron, 31:261-275 live cell Imaging
von GFP-transfizierten
Nervenzellen, wobei die Bewegung von Granuli durch kombiniertes
Bleichen und Fluoreszenzimaging analysiert wurde. Die Dynamik der
Nervenzellen stellt dabei hohe Anforderungen an die Geschwindigkeit
des Imaging.
-
Wechselwirkungen von Molekülen
-
Die
beschriebene Erfindung ist insbesondere für die Darstellung molekularer
und anderer subzellulärer
Wechselwirkungen geeignet. Hierbei müssen sehr kleine Strukturen
mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich um die Hundertstelsekunde)
dargestellt werden. Um die für
die Wechselwirkung notwendige räumliche
Position der Moleküle
aufzulösen,
sind auch indirekte Techniken wie z.B. FRET mit ROI-Bleichen einzusetzen.
Beispielanwendungen sind z.B. hier beschrieben:
- • Petersen,
M.A. und Dailey, M.E. beschreiben 2004 in Glia, 46:195-206 eine
Zweikanalaufnahme lebender Hippokampuskulturen der Ratte, wobei
die zwei Kanäle
für die
Marker Lectin und Sytox räumlich
in 3D und über
einen längeren
Zeitraum aufgezeichnet werden.
- • Yamamoto,
N. et al. beschreiben 2003 in Clin. Exp. Metastasis, 20:633-638
ein Zweifarbimaging von humanen fibrosarcoma Zellen, wobei grünes und
rotes fluoreszentes Protein (GFP und RFP) simultan in Echtzeit beobachtet
wurde.
- • Bertera,
S. et al. beschreiben 2003 in Biotechniques, 35:718-722 ein Multicolorimaging
von transgenen Mäusen
markiert mit Timer reporter Protein, welches seine Farbe nach Synthese
von grün in
rot ändert.
Die Bildaufnahme erfolgt als schnelle Serie 3-dimensional im Gewebe
am lebenden Tier.
-
Signalübertragung zwischen Zellen
-
Die
beschriebene Erfindung ist für
die Untersuchung von meist extrem schnellen Signalübertragungsvorgängen hervorragend
sehr gut geeignet. Diese meist neurophysiologischen Vorgänge stellen höchste Anforderungen
an die zeitliche Auflösung, da
die durch Ionen vermittelten Aktivitäten sich im Bereich von Hundertstel-
bis kleiner als Tausendstelsekunden abspielen. Beispielanwendungen
von Untersuchungen im Muskel- oder Nervensystem sind z.B. hier beschrieben:
- • Brum
G et al. beschreiben 2000 in J Physiol. 528: 419-433 die Lokalisation
von schnellen Ca+ Aktivitäten
in Muskelzellen des Frosches nach Reizung mit Caffeine als Transmitter.
Die Lokalisation und Mikrometer-genaue Auflösung gelang nur durch Einsatz
eines schnellen, konfokalen Mikroskopes.
- • Schmidt
H et al. beschreiben 2003 in J Physiol. 551:13-32 eine Analyse von
Ca+ Ionen in Nervenzellfortsätzen
von transgenen Mäusen.
Die Untersuchung von schnellen Ca+-Transienten in Mäusen mit
veränderten
Ca+ bindenden Proteinen konnte nur mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie
durchgeführt
werden, da auch die Lokalisation der Ca+ Aktivität innerhalb der Nervenzelle und
deren genaue zeitliche Kinetik eine wichtige Rolle spielt.