JP4905884B2 - How to monitor bioremediation - Google Patents

Description

本発明は、検出対象物における異なる遺伝子の存在比を簡便に検出することを可能とする、遺伝子の検出方法に関する発明である。特に、本発明は、嫌気的バイオレメディエーションが行われている場所の汚染物質の浄化状況を、当該場所における汚染物質を分解する微生物の存在比として検出する場合等に有用である。   The present invention is an invention relating to a gene detection method that makes it possible to easily detect the abundance ratio of different genes in a detection target. In particular, the present invention is useful when detecting the purification status of a pollutant at a place where anaerobic bioremediation is performed as the abundance ratio of microorganisms that decompose the pollutant at the place.

特定の遺伝子を検出することは、医療、衛生、食品、犯罪捜査等の分野において、種々の目的に応じて行われている。これらの大部分は、特定の遺伝子が、検出対象物中に存在するか否かを検出する定性分析か、その存在量を検出する定量分析に大別される。しかしながら、検出対象物中に、近縁の複数の微生物の遺伝子の存在比を簡便に明らかにする方法については、それほど着目されているとはいえない。このような、遺伝子の存在比を簡便に検出することが求められる分野として、土壌におけるバイオレメディエーションが挙げられる。   Detection of a specific gene is performed according to various purposes in the fields of medical care, hygiene, food, criminal investigation and the like. Most of these are roughly classified into a qualitative analysis for detecting whether or not a specific gene is present in the detection target or a quantitative analysis for detecting the abundance thereof. However, it cannot be said that much attention has been paid to a method for simply clarifying the abundance ratio of genes of a plurality of closely related microorganisms in a detection target. Bioremediation in soil is an example of a field in which it is required to easily detect the abundance ratio of genes.

すなわち、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）といった揮発性有機塩素化合物は、土壌・地下水汚染の原因となっているが、有効な浄化方法がないことから大きな問題となっている。最近、その効率的な浄化技術として、水素供与体であるHRC（登録商標）（Hydrogen Release Compound）を注入し嫌気的微生物による脱塩素化を促進する嫌気的バイオレメディエーションが注目されている。
Kakihara F., et al. (2005) Anal Biochem. 341: 77-82 That is, volatile organochlorine compounds such as tetrachlorethylene (PCE) and trichlorethylene (TCE) cause soil and groundwater contamination, but are a serious problem because there is no effective purification method. Recently, anaerobic bioremediation that injects hydrogen donor HRC (registered trademark) (Hydrogen Release Compound) and promotes dechlorination by anaerobic microorganisms has attracted attention as an efficient purification technique.
Kakihara F., et al. (2005) Anal Biochem. 341: 77-82

しかし、嫌気的脱塩素化は全ての汚染された土壌に有効ではなく、その効果の解析も困難である。その大きな原因の１つが、嫌気微生物の分解能を定性的、定量的に把握する方法が確立されていないことである。   However, anaerobic dechlorination is not effective on all contaminated soils and its effects are difficult to analyze. One of the major causes is that a method for qualitatively and quantitatively determining the resolution of anaerobic microorganisms has not been established.

嫌気的脱塩素化を行う代表的な微生物であるDehalococcoides（ Dhc．）属には様々な種類のものがあり、それらが協調して脱塩素化を行っている。そのため、これらの微生物の種類や量をモニタリングすることがＰＣＥやＴＣＥの嫌気的バイオレメディエーションには重要である。   There are various types of genus Dehalococcoides (Dhc.), Which are representative microorganisms that perform anaerobic dechlorination, and they dechlorinate in cooperation. Therefore, monitoring the types and amounts of these microorganisms is important for anaerobic bioremediation of PCE and TCE.

検出対象物中に存在する特定の微生物を、属レベルで検出するための遺伝子として、属間において高度に保存されている16S rＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列が、しばしば選択されている。   As a gene for detecting a specific microorganism present in a detection target at a genus level, a base sequence of a gene encoding 16S rRNA highly conserved among genera is often selected.

しかしながら、Dhc．属内の16S rＲＮＡをコードする遺伝子の配列は、互いに極めて類似しており、当該遺伝子自体の存在を指標に、Dhc．属内における定量を行うことは容易ではない。また、おそらく、他のマーカー遺伝子についても同様の傾向が認められ、16S rＲＮＡをコードする遺伝子をマーカーとした場合と同様に、Dhc．属内の定量は難しいと思われる。   However, Dhc. The sequences of the genes encoding 16S rRNA in the genus are very similar to each other, and the presence of the gene itself is used as an indicator for Dhc. It is not easy to perform quantification within a genus. In addition, the same tendency was also observed for other marker genes, and as in the case where the gene encoding 16S rRNA was used as a marker, Dhc. Quantification within the genus seems difficult.

嫌気的バイオレメディエーションにおいて重要なことは、地下水を含む土壌試料中のDhc．属に属する微生物の存在比を迅速・簡便に検出して、微生物による土壌の浄化の進捗状況を容易に把握し、その進捗状況に応じた対策を迅速に講ずることにある。   What is important in anaerobic bioremediation is Dhc. In soil samples containing groundwater. It is to detect the abundance ratio of microorganisms belonging to the genus quickly and easily, to easily grasp the progress of soil purification by microorganisms, and to take measures according to the progress.

よって、本発明の課題は、検出対象物中の複数の遺伝子（多くは微生物由来）の存在比を簡便に検出する手段を提供し、例えば、これを嫌気的バイオレメディエーションの分野において活用する途を提供することにある。   Therefore, an object of the present invention is to provide a means for easily detecting the abundance ratio of a plurality of genes (mostly derived from microorganisms) in a detection target, for example, a method of utilizing this in the field of anaerobic bioremediation. It is to provide.

本発明者らは、以前、一塩基伸長反応を表す標識の検出と磁気分離を用いた、ＳＮＰｓ（一塩基置換多型）タイピング技術であるMagSNiPer法を開発した（図１、非特許文献１）。MagSNiPer法は、下記の（ａ）〜（ｃ）のプロセスを経て、ＳＮＰｓをタイピングする技術である。   The present inventors have previously developed the MagSNiPer method, which is a SNPs (single nucleotide substitution polymorphism) typing technique using detection of a label representing a single nucleotide extension reaction and magnetic separation (FIG. 1, Non-Patent Document 1). . The MagSNiPer method is a technique for typing SNPs through the following processes (a) to (c).

（ａ） （１）一塩基置換対象塩基を含む遺伝子領域、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、 (A) (1) a gene region containing a single base substitution target base, (2) 5 ′ complementary to a DNA strand directed from the base 3 ′ side to the 3 ′ side by one base from the base substitution target base 5 ′ A biotinylated primer with biotin bonded to the end, (3) a labeled dideoxyribonucleotide triphosphate having a base complementary to the base to be substituted with a single base, and performing a single base extension reaction,

（ｂ） （Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰のジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去して、 (B) In the reaction system of (A), avidinized magnetic beads are allowed to coexist to bind avidin on the magnetic beads with biotin in the hybridization chain of the amplification reaction product and biotinylated primer, and then the surplus Of dideoxyribonucleotide triphosphate from the reaction system,

（ｃ） 反応系における標識をカウントし、当該標識の有無により、検出対象遺伝子における一塩基多型についての判定を行う。これは、具体的には、上記のジデオキシリボヌクレオチド３リン酸の標識をＴａｇ標識として、これに結合する標識抗体（酵素標識が結合したもの）を結合させて、この結合した標識抗体の標識をカウントすることによる判定として開示されている。 (C) The label in the reaction system is counted, and the single nucleotide polymorphism in the detection target gene is determined based on the presence or absence of the label. Specifically, the above-mentioned dideoxyribonucleotide triphosphate label is used as a Tag label, and a labeled antibody that binds to this is bound (the enzyme label is bound). It is disclosed as a determination by counting.

このMagSNiPer法は、高い感度と定量性を特徴としていることが明らかになっている。   This MagSNiPer method has been characterized by high sensitivity and quantification.

本発明者は、上述した嫌気的バイオレメディエーションにおける浄化状況のモニタリング手段として、このMagSNiPer法を活用することができるのではないかと考え、検討を重ねた。その結果、MagSNiPer法は、一塩基置換の関係で異なる近縁の遺伝子同士の存在割合を、簡便かつ正確に把握することが可能であることを見出し、本発明を完成した。   The inventor considered that this MagSNiPer method could be used as a means for monitoring the purification status in the above-described anaerobic bioremediation, and repeated studies. As a result, it was found that the MagSNiPer method can easily and accurately grasp the abundance ratios of closely related genes that differ due to the single base substitution, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、特定の一塩基置換の関係を有する複数の検出対象遺伝子を含有する可能性のある試料に対して、当該一塩基置換が認められる遺伝子領域の増幅反応産物を調製し、   That is, the present invention prepares an amplification reaction product of a gene region in which a single base substitution is observed for a sample that may contain a plurality of detection target genes having a specific single base substitution relationship,

（Ａ） （１）当該増幅反応産物、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、 (A) (1) The amplification reaction product, (2) Biotin bound to the 5 ′ end that is complementary to the DNA strand directed from the base to be replaced by one base from the 3 ′ base to the 3 ′ side. A biotinylated primer, and (3) a labeled dideoxyribonucleotide triphosphate having a base complementary to the base to be substituted with a single base, and carrying out a single base extension reaction,

（Ｂ） （Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去して、 (B) Avidinized magnetic beads coexist in the reaction system of (A) to bind avidin on the magnetic beads and biotin in the hybridization chain of the amplification reaction product and biotinylated primer, and then surplus Removing the labeled dideoxyribonucleotide triphosphate from the reaction system,

（Ｃ） 反応系における１種又は２種以上の標識をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表す、
ことを特徴とする遺伝子の検出方法（以下、本検出方法ともいう）、を提供する発明である。 (C) Counting one or more labels in the reaction system, and expressing the intensity ratio between the counted labels as the abundance ratio of the detection target gene in the sample,
The present invention provides a method for detecting a gene (hereinafter also referred to as the present detection method).

本検出方法においては、検出対象遺伝子として、微生物の16S rＲＮＡをコードする遺伝子を選択することは好適な態様の一つである。また、本検出方法は、上述したように、嫌気的バイオレメディエーションの分野における、浄化の進捗状況の把握を目的としての使用に非常に適している。この場合、検出対象試料が、土壌試料（地下水を含む）であり、かつ、検出対象遺伝子が、Dehalococcoides属に属する微生物の遺伝子、典型的には、16S rＲＮＡをコードする遺伝子であることが、好適な態様として挙げられる。   In this detection method, it is one of preferred embodiments to select a gene encoding 16S rRNA of a microorganism as a detection target gene. Further, as described above, this detection method is very suitable for use for the purpose of grasping the progress of purification in the field of anaerobic bioremediation. In this case, it is preferable that the detection target sample is a soil sample (including groundwater), and the detection target gene is a gene of a microorganism belonging to the genus Dehalococcoides, typically a gene encoding 16S rRNA. As an example.

本発明により、検出対象における近縁の遺伝子同士の存在割合を簡便に、かつ、正確に把握可能な手段が提供される。この検出手段は、嫌気的バイオレメディエーションが行われている場所の汚染物質の浄化状況のモニタリングを行う上で、非常に有用である。   According to the present invention, there is provided a means capable of easily and accurately grasping the existence ratio of closely related genes in a detection target. This detection means is very useful for monitoring the state of purification of contaminants where anaerobic bioremediation is being performed.

本検出方法においては、原則として、未知の一塩基置換多型を改めて見出すのではなく、既知の一塩基置換多型をマーカーとして、近縁の遺伝子同士の存在割合を把握することを目的とする遺伝子の検出方法である。よって、検出を行う大前提として、検出対象の一塩基多型が目的とする近縁の遺伝子同士において既知であることが挙げられる。例えば、Dehalococcoides属に属する２種の微生物における、16S rＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列は、図２に示すものであり、すでに既知の塩基配列である（図２は、Dehalococcoides strain 195と、Dehalococcoides strain BAV1の16S rＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を比較した図面である）。このような既知の遺伝子の塩基配列のうち、特定の一塩基置換多型を示す塩基（図２であれば、印１で示す塩基：Dehalococcoides strain 195がＧ（グアニン）であり、Dehalococcoides strain BAV1がＡ（アデニン）である）に着目して、相互の遺伝子の存在割合を検出することが本検出方法の特徴である。   In principle, the purpose of this detection method is not to re-discover unknown single nucleotide substitution polymorphisms but to identify the existing proportions of closely related genes using known single nucleotide substitution polymorphisms as markers. This is a gene detection method. Therefore, a major premise for detection is that the single nucleotide polymorphisms to be detected are known among closely related genes. For example, the base sequence of a gene encoding 16S rRNA in two types of microorganisms belonging to the genus Dehalococcoides is shown in FIG. 2 and is a known base sequence (FIG. 2 shows Dehalococcoides strain 195 and Dehalococcoides strain). It is a drawing comparing the base sequences of genes encoding 16S rRNA of BAV1). Among the base sequences of such known genes, the bases exhibiting a specific single nucleotide substitution polymorphism (in FIG. 2, the base indicated by the mark 1: Dehalococcoides strain 195 is G (guanine), and Dehalococcoides strain BAV1 is It is a feature of this detection method that focusing on (A (adenine)) and detecting the relative proportion of genes.

本検出方法では、一塩基置換多型が認められる遺伝子領域の遺伝子増幅処理を、１回以上行うことが必要である。かかる遺伝子増幅法は、ＰＣＲ法を基本とする遺伝子増幅法を行うことが好適である。この場合の遺伝子増幅用プライマーは、一塩基置換多型が認められる検出対象遺伝子同士に共通する既知の遺伝子配列の一部に準じて設計を行い、用いることができる。また、例えば、細菌同士で保存されている遺伝子配列(例えば、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の一部）に基づいて遺伝子増幅用プライマーを設計して、第一次的な遺伝子増幅法を行った後、特定の近縁種間に絞った遺伝子増幅法を行うことも可能である。遺伝子増幅法の具体的な実施手順は、既知の方法に準じて行うことができる。   In this detection method, it is necessary to perform gene amplification treatment of a gene region in which a single nucleotide substitution polymorphism is observed at least once. Such a gene amplification method is preferably a gene amplification method based on the PCR method. The gene amplification primer in this case can be designed and used according to a part of a known gene sequence common to detection target genes in which single nucleotide substitution polymorphisms are observed. In addition, for example, after designing a gene amplification primer based on a gene sequence conserved between bacteria (for example, a part of a gene encoding 16S rRNA) and performing a primary gene amplification method, It is also possible to carry out a gene amplification method focused on specific related species. The specific execution procedure of the gene amplification method can be performed according to a known method.

例えば、嫌気的バイオレメディエーションを行っている地下水中のDehalococcoides属の特定株間の存在割合を検出する場合には、地下水中の微生物のＤＮＡの精製を常法に従い行い、Dehalococcoides属に共通のプライマーにて、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子を増幅することにより、Dehalococcoides属の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のみを特異的に遺伝子増幅産物として得ることが可能である。１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子は、リボゾームという生物の本質に関わる機能を有するＲＮＡをコードする遺伝子であるので、遺伝子の保存性が高く、極めて関係の遠い生物同士でも配列の比較が可能であると同時に、比較的変異しやすい部位も存在し、例えば、Dehalococcoides属のような特定の範疇の微生物の遺伝子のみを選択して増幅することも可能である。また、微生物株同士を区別することが可能な一塩基置換多型も安定して存在するので、本検出方法における検出対象遺伝子としては非常に優れている。また、遺伝子の長さが程よい（１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子は、１６００塩基対程度）ことも、本検出方法で用いるのに好適である理由の一つとして挙げられる。   For example, when detecting the abundance ratio between specific strains of the genus Dehalococcoides in groundwater undergoing anaerobic bioremediation, purify the DNA of microorganisms in the groundwater according to conventional methods and use a primer common to the genus Dehalococcoides. By amplifying a gene encoding 16SrRNA, only the gene encoding 16SrRNA belonging to the genus Dehalococcoides can be obtained specifically as a gene amplification product. Since the gene encoding 16SrRNA is a gene encoding RNA having a function related to the essence of an organism called ribosome, the gene is highly conserved, and it is possible to compare sequences between extremely distantly related organisms, There are also sites that are relatively easily mutated. For example, it is possible to select and amplify only genes of a specific category of microorganisms such as the genus Dehalococcoides. In addition, since a single nucleotide substitution polymorphism that can distinguish microbial strains also exists stably, it is very excellent as a detection target gene in this detection method. Another reason why the length of the gene is moderate (the gene encoding 16SrRNA is about 1600 base pairs) is suitable for use in this detection method.

遺伝子増幅法を行うことにより得られる遺伝子増幅産物に対して、MagSNiPer法を行うことにより、検出対象遺伝子同士において認められる一塩基置換対象塩基を、標識の強度の相対的な比率として明らかにして、かかる標識の強度の比率を基に、検出対象遺伝子同士の検出対象物における存在比率を求めることが可能となる。   For the gene amplification product obtained by performing the gene amplification method, by performing the MagSNiPer method, the single base substitution target base found in the detection target genes is clarified as a relative ratio of the intensity of the label, Based on the intensity ratio of the label, it is possible to determine the ratio of the detection target genes to the detection target.

このようにして得られた遺伝子増幅産物を鋳型ＤＮＡとして、MagSNiPer法に準じた方法を行うことにより、本検出方法を行うことができる。   This detection method can be performed by using the gene amplification product thus obtained as a template DNA and performing a method according to the MagSNiPer method.

具体的には、プロセス（Ａ）〜（Ｃ）として示したように：
プロセス（Ａ）は、（１）上記の鋳型となる遺伝子増幅産物と、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマーと、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を共存させて、一塩基伸長反応を行うプロセスである。 Specifically, as shown as processes (A)-(C):
Process (A) consists of (1) a gene amplification product as a template, and (2) complementary to a DNA strand directed from the base 3 ′ side to the 3 ′ side by one base from the base to be replaced by one base. A biotinylated primer having biotin bonded to the 5 ′ end and (3) a labeled dideoxyribonucleotide triphosphate having a base complementary to the base to be substituted with a single base coexist to carry out a single base extension reaction. Is a process.

上記（２）のビオチン化プライマー１２は、図１に示したように、鋳型ＤＮＡ（遺伝子増幅産物）１１において、一塩基置換対象塩基１１１（Ｃ）から、一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖部分、に対して相補的なＤＮＡ鎖１２１の５’末端にビオチン１２２を結合させたプライマーである。ビオチン化プライマーは、既知の鋳型ＤＮＡの塩基配列に準じて設計され、当該プライマーの塩基長は限定されるものではないが、概ね
２０〜３０塩基程度が好適である。また、５’末端のビオチン化は、常法に従い行うことができる。 As shown in FIG. 1, the biotinylated primer 12 of the above (2) is 3 from the base 3 ′ side from the base 1 (C) of the single base substitution in the template DNA (gene amplification product) 11. It is a primer in which biotin 122 is bound to the 5 ′ end of a DNA strand 121 complementary to a DNA strand portion directed to the “side”. The biotinylated primer is designed according to the base sequence of a known template DNA, and the base length of the primer is not limited, but about 20 to 30 bases are preferable. In addition, biotinylation at the 5 ′ end can be performed according to a conventional method.

さらに上記（３）のジデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ddＮＴＰ）における塩基は、通常は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、及び、シトシン（Ｃ）から選ばれる１〜４種であり、当該塩基は、検出対象となる一塩基置換対象塩基に応じて、さらには、具体的な検出態様に応じて選択することができるが、少なくとも検出対象となる一塩基置換対象塩基に対して相補的な塩基の一方が選択される。例えば、図１に示すように、検出対象となる一塩基置換対象塩基（鋳型ＤＮＡの一塩基置換対象塩基）の一方がＣである場合には、少なくとも、標識ddＮＴＰ１１２として、相補的な塩基がＧ（１１３）となるように、標識ddＧＴＰを選択することが必要である。そして、仮に、他方の一塩基置換対象塩基がＡの場合には、これに対して標識ddＴＴＰを、上記標識ddＧＴＰと共に、あるいは、別個に選択する必要がある。ここで用いる標識１１２１は特に限定されず、酵素標識、蛍光標識、ラジオアイソトープ等を例示することができるが、少なくとも、２種以上のddＮＴＰについては、少なくとも同一カテゴリーの標識であることが、遺伝子の存在比率を標識の強度に応じて求める上で好適である。具体的には、２種以上の標識ddＮＴＰを同一の試験系において共存させる場合は、同一カテゴリーの異なる標識であることが、互いの遺伝子を峻別する上で好適であるが、共存させずに別個に検出系を構築する場合には、同一カテゴリーの、同一若しくは異なる標識であってもよい。さらに具体的には、蛍光標識としては、FITC、Cy5、Cy3、TAMRA、TexasRed等、酵素標識としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等、ラジオアイソトープとしては、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ等が挙げられる。また、特に好適な例として、例えば、蛍光標識等をTagとして用いて、これに対して特異的な標識抗体を結合させて、当該標識抗体の標識をカウントする態様を挙げることができる。   Further, the base in the dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) of (3) is usually 1 to 4 types selected from adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C). The base can be selected according to the single base substitution target base to be detected, and further according to the specific detection mode, but at least for the single base substitution target base to be detected. One of the complementary bases is selected. For example, as shown in FIG. 1, when one of the bases to be detected (bases for single base substitution of the template DNA) is C, at least a complementary base as a labeled ddNTP112 is G It is necessary to select the labeled ddGTP so that (113). If the other single-base substitution target base is A, it is necessary to select the labeled ddTTP together with the labeled ddGTP or separately. The label 1121 used here is not particularly limited, and examples thereof include enzyme labels, fluorescent labels, radioisotopes, etc. At least two or more kinds of ddNTPs should be at least the same category label. This is suitable for obtaining the abundance ratio according to the intensity of the label. Specifically, when two or more kinds of labeled ddNTPs coexist in the same test system, different labels of the same category are preferable for distinguishing genes from each other. In the case of constructing a detection system, the same or different label of the same category may be used. More specifically, examples of fluorescent labels include FITC, Cy5, Cy3, TAMRA, and TexasRed, enzyme labels include alkaline phosphatase and peroxidase, and radioisotopes include 32P, 33P, and 35S. In addition, as a particularly suitable example, for example, a fluorescent label or the like is used as a Tag, a specific labeled antibody is bound thereto, and the label of the labeled antibody is counted.

プロセス（Ａ）において、上記のような条件とすることにより、鋳型ＤＮＡの一塩基置換塩基に相補的な塩基が一塩基分、鋳型ＤＮＡ上で伸長し、当該塩基の標識にて標識がなされたハイブリダイズ鎖が作出される。   In the process (A), by using the conditions as described above, a base complementary to the single base substitution base of the template DNA was extended on the template DNA by one base and labeled with the label of the base. A hybridizing strand is created.

プロセス（Ｂ）は、プロセス（Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズ１３を共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジン１３１と、上記増幅反応産物とビオチン化プライマー１２のハイブリダイズ鎖におけるビオチン１２２とを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去するプロセスである。   In the process (B), the avidinized magnetic beads 13 coexist in the reaction system of the process (A), and the biotin 122 in the hybridized strand of the avidin 131 on the magnetic beads, the amplification reaction product, and the biotinylated primer 12 is used. And the excess labeled dideoxyribonucleotide triphosphate is removed from the reaction system.

アビジン化磁気ビーズは、例えば、市販の磁気ビーズをアビジン（又はストレプトアビジン）水溶液中に浸漬することにより、容易に調製することができる。   Avidinized magnetic beads can be easily prepared, for example, by immersing commercially available magnetic beads in an aqueous solution of avidin (or streptavidin).

かかるアビジン化磁気ビーズを、プロセス（Ａ）で得られた試験系に十分量共存させることにより、ビオチン化プライマー、並びに、ビオチン化プライマーと鋳型ＤＮＡとが、ハイブリダイズした部分二本鎖（標識あり、又は、なし）の、ビオチン化部分がビーズ上のアビジン残基部分が結合反応し、ビーズ上に固定化される。ビーズは十分量共存させているために、余分の標識ddＮＴＰを反応系から除去することにより、ビーズにおける標識量が、特定の一塩基置換対象塩基を有する遺伝子のシグナルとして把握される。   By making a sufficient amount of such avidinized magnetic beads coexist in the test system obtained in the process (A), a biotinylated primer and a partial double strand in which a biotinylated primer and a template DNA are hybridized (labeled) (Or none), the biotinylated moiety binds to the avidin residue moiety on the bead and is immobilized on the bead. Since a sufficient amount of beads coexist, the amount of label on the beads can be grasped as a signal of a gene having a specific single base substitution target base by removing excess labeled ddNTP from the reaction system.

プロセス（Ｃ）は、反応系における１種又は２種以上の標識１１２１をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表すプロセスである。標識のカウントの方法は、用いた標識の種類に応じて適宜選択することが できる。反応系における一塩基置換多型塩基を同一の標識でカウントする場合には、一方の本検出方法の実施により判明した一方の多型遺伝子の存在を表す標識のカウント量と、他方の同実施により判明した他方の多型遺伝子の存在を表す標識のカウント量を、相対比として求めることにより、検出対象とする両遺伝子の存在量を把握することができる。   Process (C) is a process in which one or more kinds of labels 1121 in the reaction system are counted, and the ratio of the intensities of the counted labels is expressed as the abundance ratio of the detection target gene in the sample. The label counting method can be appropriately selected according to the type of label used. When counting single nucleotide substitution polymorphic bases in the reaction system with the same label, the count amount of the label indicating the presence of one polymorphic gene found by one of the present detection methods and the other same By obtaining the count amount of the label indicating the presence of the other polymorphic gene thus found as a relative ratio, the abundance of both genes to be detected can be grasped.

反応系における一塩基置換多型塩基を異なる標識でカウントする場合には、これらの異なる標識を同一の反応系においてカウントすることが効率的である。本検出方法の実施により判明した一方の多型遺伝子の存在を表す一方標識のカウント量と、他方の多型遺伝子の存在を表す他方の標識のカウント量を、相対比として求めることにより、検出対象とする両遺伝子の存在量を把握することができる。   When counting single nucleotide substitution polymorphic bases in a reaction system with different labels, it is efficient to count these different labels in the same reaction system. The detection target is obtained by calculating, as a relative ratio, the count amount of one label that indicates the presence of one polymorphic gene and the count amount of the other label that indicates the presence of the other polymorphic gene, which are found by carrying out this detection method The abundance of both genes can be ascertained.

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
〔実施例１〕規定量の遺伝子を用いた場合の実施例
Dhc. ethenogenes strain 195（以下、DHC195ともいう）の16S rRNAをコードする遺伝子（以下、１６ＳｒＤＮＡ又は１６Ｓｒ遺伝子ともいう）の塩基配列（配列番号１）及びDhc. sp. strain BAV1（以下、ＢＡＶ１ともいう）の16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）を比較し、一塩基の違いのある部分（図２：印１→配列番号１の９７０番目の塩基と配列番号２の９７０番目の塩基に該当）をターゲットとした本検出方法を、以下の要領にて行った。 Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples.
[Example 1] Example using a specified amount of gene
Dhc. Ethenogenes strain 195 (hereinafter also referred to as DHC195) 16S rRNA-encoding gene (hereinafter also referred to as 16SrDNA or 16Sr gene) nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) and Dhc. Sp. Strain BAV1 (hereinafter also referred to as BAV1) ) Of the gene encoding 16S rRNA (SEQ ID NO: 2), a portion having a single base difference (FIG. 2: mark 1 → the 970th base of SEQ ID NO: 1 and the 970th base of SEQ ID NO: 2 This detection method targeting a base) was performed as follows.

（１）遺伝子増幅とサンプルの調製
それぞれの菌株に由来する１６Ｓｒ遺伝子の増幅産物を得るために、それぞれの菌株のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことにより、当該遺伝子の増幅を行った。 (1) Gene amplification and sample preparation In order to obtain 16Sr gene amplification products derived from each strain, the gene was amplified by performing a PCR reaction using the DNA of each strain as a template.

用いた遺伝子増幅用プライマーは：
Ｆｗ：５’−ＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＴＣＴＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３）
Ｒｖ：５’−ＧＣＧＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号４） The gene amplification primers used were:
Fw: 5′-AAGTCGAACGGTCTTAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
Rv: 5′-GCGGTTTACTAGCAACTCCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 4)

また、熱サイクルは、９５℃・５分→３０×（９５℃・３０秒→５５℃・３０秒→７２℃・２分）→７２℃・２分、にて行った。   The thermal cycle was performed at 95 ° C. for 5 minutes → 30 × (95 ° C. for 30 seconds → 55 ° C. for 30 seconds → 72 ° C. for 2 minutes) → 72 ° C. for 2 minutes.

それぞれの遺伝子増幅産物の規定量を混合したサンプルで、それぞれの菌株についての独自の検量線が作成可能であることを実証するために、（ａ）ＢＡＶ１由来の増幅産物の濃度を一定（3.6ng/μl）にして、ＤＨＣ１９５由来の増幅産物の濃度を変化させる系と、（ｂ）ＤＨＣ１９５由来の増幅産物の濃度を一定（3.6ng/μlwater）にして、ＢＡＶ１由来の増幅産物の濃度を変化させる系、を設けた。   In order to demonstrate that it is possible to prepare a unique calibration curve for each strain in a sample in which a prescribed amount of each gene amplification product is mixed, (a) the concentration of the amplification product derived from BAV1 is constant (3.6 ng / μl) to change the concentration of the amplification product derived from DHC195, and (b) the concentration of the amplification product derived from DHC195 to be constant (3.6 ng / μlwater) to change the concentration of the amplification product derived from BAV1. System.

（２）MagSNiPer法
上記の遺伝子増幅により得られた、それぞれの菌株の１６Ｓｒ遺伝子の遺伝子増幅産物における、図２の印１に示す一塩基置換塩基（ＤＨＣ１９５：Ｇ、ＢＡＶ１：Ａ）を、それぞれターゲットにして、上述したMagSNiPer法を行った。 (2) MagSNiPer method In the gene amplification products of the 16Sr genes of the respective strains obtained by the gene amplification described above, the single base substitution bases (DHC195: G, BAV1: A) shown in FIG. Then, the MagSNiPer method described above was performed.

（ａ）ビオチン化プライマー
下記の塩基配列を有する５’ビオチン化プライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて常法により合成した。 (A) Biotinylated primer A 5 ′ biotinylated primer having the following base sequence was synthesized by a conventional method using a DNA synthesizer.

５’(biotin)−ＣＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＧＴＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号５）   5 '(biotin) -CGACCCTGTTAAGTCAGGAA-3' (SEQ ID NO: 5)

（ｂ）標識ｄｄＮＴＰ
標識ｄｄＮＴＰは、Ｔａｇ標識として、蛍光物質であるフルオレセインが標識されている市販品を、滅菌水で希釈して用いた（Perkin Elmer社製）。 (B) Labeled ddNTP
As the labeled ddNTP, a commercial product labeled with fluorescein, which is a fluorescent substance, was used as a Tag label, diluted with sterilized water (manufactured by Perkin Elmer).

（ｃ）上記のように調製した遺伝子サンプルにおいて、ビオチン化プライマー、並びに、フルオレセインで標識されたddNTP及び非標識のddNTP（一塩基伸長反応の目的の塩基についてのみ標識ddNTPとし、それ以外は非標識のddNTPである）を混合し、一塩基伸長反応を行った。次いで、その反応産物とアビジン化磁気ビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin：Dynalbiotech社製）と共存させて、アビジン−ビオチン結合により、当該磁気ビーズに対する結合反応を行い、常法により、余剰のddNTPを除去した。その後、抗フルオレセイン抗体アルカリホスファターゼConjugate（ANTI-FLUORESCEIN-AP CONJUGATE:Perkin Elmer社製）を結合させ、同様に、過剰なConjugateを除去し、アルカリフォスファターゼの基質であり、分解されると発光するCDPstar（Amersham Biosciences社製）を加えて発光強度を測定した。その結果を、図３に示す。図３（１）は、ＤＨＣ１９５に関する検量線であり、（２）は、ＢＡＶ１に関する検量線である。   (C) In the gene sample prepared as described above, biotinylated primer, ddNTP labeled with fluorescein and unlabeled ddNTP (labeled ddNTP only for the target base of the single-base extension reaction, otherwise unlabeled) DdNTP) and a single base extension reaction was performed. Next, the reaction product coexists with avidinized magnetic beads (Dynabeads M-280 Streptavidin: manufactured by Dynalbiotech), and a binding reaction to the magnetic beads is performed by an avidin-biotin bond, and excess ddNTP is removed by a conventional method. did. Thereafter, an anti-fluorescein antibody alkaline phosphatase Conjugate (ANTI-FLUORESCEIN-AP CONJUGATE: manufactured by Perkin Elmer) is bound, and similarly, excess Conjugate is removed, and it is a substrate of alkaline phosphatase, which is a CDPstar that emits light when decomposed ( Amersham Biosciences) was added and the luminescence intensity was measured. The result is shown in FIG. 3 (1) is a calibration curve for DHC195, and (2) is a calibration curve for BAV1.

このようにして、本検出方法では、標識の強度を基に、目的とする遺伝子の存在比を求めることが可能であることが判明した。   Thus, it has been found that the present detection method can determine the target gene abundance ratio based on the intensity of the label.

〔実施例２〕 嫌気的バイオレメディエーション領域の地下水における検出
愛知県下の機械工場の揮発性有機塩素化合物により汚染された領域において、ＨＲＣ（登録商標：粘性のある液体状のポリ乳酸エステル）を用いた嫌気的バイオレメディエーションが行われた領域の地下水におけるＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の存在割合について、本検出方法によるモニタリングを行った。ＨＲＣ（登録商標）は、水と反応して徐々に乳酸を放出し、乳酸は微生物の働きで分解して水素が生成し、その水素が微生物（主にDehalococcoides属）による還元的脱塩素化に利用されて、有機塩素化合物が段階的に分解され、最終的には、エチレンやエタンのような無害な化合物に転換されることが知られている。 [Example 2] Detection of anaerobic bioremediation area in groundwater HRC (registered trademark: viscous liquid polylactic acid ester) was used in an area contaminated by volatile organochlorine compounds in a machine factory in Aichi Prefecture The present detection method was used to monitor the abundance ratio of DHC195 and BAV1 in the groundwater in the area where anaerobic bioremediation was performed. HRC (registered trademark) reacts with water to gradually release lactic acid, which is decomposed by the action of microorganisms to produce hydrogen, which is used for reductive dechlorination by microorganisms (mainly Dehalococcoides). It is known that organochlorine compounds are decomposed stepwise and eventually converted into harmless compounds such as ethylene and ethane.

この嫌気的バイオレメディエーション開始６ヶ月後に、注入井戸に対して地下水下流の観測井戸から地下水をサンプリングし、このサンプリング水におけるDehalococcoides属に属する微生物の１６Ｓｒ遺伝子の塩基配列の解析を、常法により行った。その結果、ＤＨＣ１９５が55％、ＢＡＶ１が32％の割合で、地下水中に存在することが判明した（残りはその他のDehalococcoides属に属する微生物等）。この結果と実質的に同様の結果が本検出方法により導き出されるか否かについて検討を行った。   Six months after the start of anaerobic bioremediation, groundwater was sampled from the observation well downstream of the injection well, and the base sequence of the 16Sr gene of the microorganism belonging to the genus Dehalococcoides in this sampling water was analyzed by a conventional method. . As a result, it was found that DHC195 was present in groundwater at a rate of 55% and BAV1 at 32% (the rest were microorganisms belonging to the genus Dehalococcoides, etc.). It was examined whether or not a result substantially similar to this result was derived by this detection method.

実施例１と同様の要領で、この観測井戸の地下水（嫌気的バイオレメディエーション開始３ヵ月後と６ヶ月後）を、サンプルとして、本検出方法を行った。   In the same manner as in Example 1, this detection method was carried out using the groundwater of this observation well (3 months and 6 months after the start of anaerobic bioremediation) as a sample.

その結果、図４（１）に示すように、試験開始３ヵ月後では、ＢＡＶ１：ＤＨＣ１９５＝１０：９程度、（２）に示すように、試験開始６ヵ月後では、同＝３：５程度の存在比であることが判明した。この試験開始６ヵ月後の結果は、先に行った塩基配列解析の結果と実質的に一致している。   As a result, as shown in FIG. 4 (1), BAV1: DHC195 = about 10: 9 after 3 months from the start of the test, and as shown in (2), about 3: 5 after 6 months from the start of the test. The abundance ratio was found to be. The results 6 months after the start of the test are substantially in agreement with the results of the base sequence analysis performed previously.

これらの結果から、本検出方法を行うことにより、検出対象物における一塩基置換多型で区別される近縁の遺伝子の存在割合を、簡便に、かつ、正確に把握可能であり、特に、本実施例のような嫌気的バイオレメディエーションの進捗状況のモニタリングには極めて有用であることが明らかになった。   From these results, by performing this detection method, it is possible to easily and accurately grasp the existence ratio of closely related genes that are distinguished by single nucleotide substitution polymorphisms in the detection target. It became clear that it was extremely useful for monitoring the progress of anaerobic bioremediation as in the Examples.

MagSNiPer法の原理を図式化して示した図面である。It is the figure which showed the principle of MagSNiPer method in a diagram. Dehalococcoides属に属する微生物のうち、ＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の１６Ｓｒ遺伝子の配列を比較し、その一塩基置換多型部分を示した図面である。It is the figure which compared the 16Sr gene arrangement | sequence of DHC195 and BAV1 among microorganisms which belong to Dehalococcoides genus, and showed the single nucleotide substitution polymorphism part. 混合試料に対して本検出方法を行って得られた、ＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の検量線を示した図面である。It is the figure which showed the calibration curve of DHC195 and BAV1 obtained by performing this detection method with respect to a mixed sample. 嫌気的バイオレメディエーションが行われている領域の地下水を試料として、ＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の存在比を、本検出方法により明らかにした図面である。It is the figure which made clear the abundance ratio of DHC195 and BAV1 by this detection method using the groundwater of the area | region where anaerobic bioremediation is performed as a sample.

Claims (3)

特定の一塩基置換の関係を有する複数のDehalococcoides属に属する微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子、を含有する可能性のある土壌又は地下水由来の試料に対して、当該一塩基置換が認められる遺伝子領域の増幅反応産物を調製し、
（Ａ）（１）当該増幅反応産物、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３'側の塩基から３'側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５'末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、
（Ｂ）（Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去して、
（Ｃ）反応系における１種又は２種以上の標識をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表すことを特徴とする遺伝子の検出方法、を嫌気的バイオレメディエーション施行中において行い、これによりDehalococcoides属に属する微生物の存在比を把握することにより、当該嫌気的バイオレメディエーションの進捗をモニタリングすることを特徴とする、バイオレメディエーションのモニタリング方法。 A gene region in which a single base substitution is observed for a sample derived from soil or groundwater that may contain a plurality of genes encoding 16S rRNA of microorganisms belonging to the genus Dehalococcoides having a specific single base substitution relationship Prepare an amplification reaction product of
(A) (1) The amplification reaction product, (2) Biotin bound to the 5 ′ end that is complementary to the DNA strand from the base to be replaced by one base from the 3 ′ base to the 3 ′ side. A biotinylated primer, and (3) a labeled dideoxyribonucleotide triphosphate having a base complementary to the base to be substituted with a single base, and carrying out a single base extension reaction,
(B) In the reaction system of (A), avidinized magnetic beads coexist to bind avidin on the magnetic beads with biotin in the hybridization chain of the amplification reaction product and biotinylated primer, and then the surplus Removing the labeled dideoxyribonucleotide triphosphate from the reaction system,
(C) a count of the one or more labels in the reaction system, the ratio of the intensity in counts were labeled with each other, it detects the to that gene, wherein expressed as abundance ratio of a detection target gene in a sample A method for monitoring bioremediation, characterized in that the method is performed during anaerobic bioremediation, and thereby the abundance ratio of microorganisms belonging to the genus Dehalococcoides is monitored, whereby the progress of the anaerobic bioremediation is monitored. 嫌気的バイオレメディエーション施行中において、遺伝子の検出方法を行う回数は２回以上であることを特徴とする、請求項１に記載のモニタリング方法。The monitoring method according to claim 1, wherein the number of times of performing the gene detection method during anaerobic bioremediation is two or more. 複数のDehalococcoides属に属する微生物は、Dehalococcoides ethenogenes strain 195、及び、Dehalococcoides sp. strain BAV1、であることを特徴とする請求項１又は２に記載のモニタリング方法。The monitoring method according to claim 1 or 2, wherein the microorganisms belonging to a plurality of Dehalococcoides are Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and Dehalococcoides sp. Strain BAV1.