JP6387063B2 - 乳汁中の特定物質を検出する方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、以下の通りである。
(1)該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分又は該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分又はそれより上流部に接触させる工程;及び
(2)該乳汁を該第2部分又はそれより下流部まで流し、該第2部分又はそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程:
を含む、上記方法。
[3] 該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 特定物質が、細菌の成分又は該細菌が分泌する物質である、[1]から[3]の何れかに記載の方法。
[5] 第一の抗体、及び第二の抗体の少なくとも片方が、モノクローナル抗体である、[1]から[4]の何れかに記載の方法。
[8] 第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される、[1]から[7]の何れかに記載の方法。
[9] 第3部分が下流に配置された第一の部材、及び上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、[8]に記載の方法。
[10] 第一の部材の保持粒子サイズが1.0〜2.0μmであり、第二の部材の保持粒子サイズが3.0〜3.5μmである、[9]に記載の方法。
[12] 溶菌酵素が自己溶菌酵素である、[11]に記載の方法。
[13] 溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて該乳汁中のブドウ球菌を検出する、[11]に記載の方法。
[14] 家畜の***炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する方法であって、
***炎に罹患した家畜から原因菌を含む乳汁を得る工程、該乳汁中に溶菌酵素を混合することにより該原因菌の菌体内に存在する特定物質を菌体外に放出させる工程、及び該特定物質を抗原とする抗体を用いた免疫学的方法によって外特定物質の存在の有無または存在量を測定する工程を含む診断方法。
[15] 溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する、[14]に記載の方法。
[16] 該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分又は該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置。
[17] 第1部分または第2部分に、溶菌酵素または界面活性剤が保持されてなる、[16]記載のイムノクロマトグラフ装置
[18] 溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液と、[16]記載のイムノクロマトグラフ装置とからなる検出キット。
本発明のイムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するための装置であって、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分又は該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図1、図2、図3に断面模式図を示した試験片が挙げられる。図1においては、試料添加用部材4と脂肪球除去用部材(第3部分)7とは一体となって、標識抗体含浸部材(第1部分)1の上流に設置されている。図2においては、脂肪球除去用部材(第3部分)7は、標識抗体含浸部材(第1部分)1の下流、かつクロマト展開用膜担体(第2部分)2の上流に設置されている。図3においては、脂肪球除去用部材(第3部分)7は、試料添加用部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材(第1部分)1の上流に設置されている。
(1)該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分又は該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分又はそれより上流部に接触させる工程;及び
(2)該乳汁を該第2部分又はそれより下流部まで流し、該第2部分又はそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程:
を含む方法である。
(1)イムノクロマトグラフ装置の作製
図1に断面模式図で示されるイムノクロマトグラフ装置を以下のように作製した。
(a)リボゾームタンパク質L7/L12抗体の作製
金コロイド標識する抗体には、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)リボソームタンパク質L7/L12モノクローナル抗体を使用した。国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例5に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのL7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種(SA-1およびSA-2)の組合せを選択した。
BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.5を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体SA-2を100μg/mL加え室温で5分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン(BSA)10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体SA-2(以下、「金コロイド標識抗体」と記す)溶液を調製した。この溶液を遠心分離(15000×rpm、5分間)して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液(pH8.2)に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1(第1部分)とした。
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2(第2部分)として用意した。
上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材4と脂肪球除去用部材(第3部分)7とを兼ねる部材として綿布と、吸収用部材5として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材6(厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの)に貼り合せた後、5mm幅に切断し、図1に断面図を示したイムノクロマトグラフ装置を作成した。試料添加用部材4には表2に示す部材を用いた。
イムノクロマトグラフ装置による牛の乳汁の測定は、マイクロチューブに黄色ブドウ球菌が検出された生乳サンプルを100μl分取し、添加液(終濃度1% Tween20、0.05M NaCl、0.1M MOPSO pH7.5)150μlを加えて混合した。同混合溶液に上記(1)で得られたイムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬してラテラルフロー方式でクロマト展開し、展開液が吸収用部材5まで流れるか検討した。
(1)イムノクロマトグラフ装置の作製
実施例1に記載の方法により、図1記載のイムノクロマトグラフ装置を作製した。試料添加用部材4と脂肪球除去用部材(第3部分)7とを兼ねる部材としては表2に記載のGF/DVAを用いた。
イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は、マイクロチューブに生乳サンプル1〜6を100μl分取し、添加液(終濃度1% Tween20、0.05M NaCl、0.1M MOPSO pH7.5)150μlを加えて混合した。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、ラテラルフロー方式で室温で15分静置して展開後、上記捕捉部位3で捕捉されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインの有無により目視で判定した。
実施例1に記載の方法により、図1記載のイムノクロマトグラフ装置を作製し、乳汁の割合を変えた場合の液流れを確認した。試料添加用部材は表3に記載のものを使用した。生乳サンプルと添加液を割合を変えて混合し(添加液終濃度 1%Tween20、0.05M NaCl、0.1M MOPSO pH7.5、総液量250μl)、イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材から浸漬してラテラルフロー方式でクロマト展開し、液が全量展開されるか否かを検討した。
(a)リボゾームタンパク質L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製
実施例1記載のモノクローナル抗体SA−1とSA−2とを使用した。
(b)ELISAによる溶菌酵素の効果の確認
溶菌酵素の効果については以下のように確認した。
黄色ブドウ球菌を表7に示す界面活性剤または溶菌酵素を用いて10 mM Tris−HCl(pH8.0)により調整し、37℃で20分間処理した後、実施例1(a)と同様のELISAにて吸光度を測定した。黄色ブドウ球菌は生理食塩水にて調整し、終濃度は2.5×105 (cells/ml)とした。陰性コントロールとしてリン酸生理緩衝溶液(PBS)を用いた。陽性コントロールとしては非イオン性界面活性剤TritonX−100を用いた。終濃度は1%とし、室温で一晩処理した。
陰性コントロールとして用いたPBSと比べて、界面活性剤、及び何れの溶菌酵素においても吸光度が高くなった。一般的な溶菌剤として用いられる界面活性剤TritonX−100と比べると、自己溶菌酵素であるアクロモペプチダーゼおよびリゾスタフィンを用いた場合において吸光度が約2倍高くなった。
実施例4において高い溶菌効果が見られたアクロモペプチダーゼ(和光純薬工業)およびリゾスタフィン(和光純薬工業)を用いて、牛乳汁中に添加した黄色ブドウ球菌のELISAによる測定を行った。牛乳汁は市販の飲用品を用い、0〜80%の割合(残部は10 mM Tris−HCl(pH8.0))とし、黄色ブドウ球菌は生理食塩水にて調整し、終濃度1×105(cells/ml)とした。アクロモペプチダーゼおよびリゾスタフィンは10 mM Tris−HCl(pH8.0)を用いて調整し、終濃度5(μg/ml)となるように黄色ブドウ球菌溶液と混合した。ELISAによる測定は実施例4に準じた。
(1)イムノクロマトグラフ装置の作製
イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製した。
(a)金コロイド標識含浸部材
実施例1記載の金コロイド標識含浸部材を使用した。
(b)抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
実施例1と同様に作製した。
上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材4と脂肪球除去用部材(第3部分)7とを兼ねる部材としてGF/DVA(GEヘルスケアバイオサイエンス製:ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材)と、吸収用部材5として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材6(厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの)に貼り合せた後、5mm幅に切断し、図6に断面図を示したイムノクロマトグラフ装置を作製した。
イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。
マイクロチューブに既知量の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁を100μl分取し、添加液(終濃度1% TritonX−100、5μg/ml リゾスタフィン、0.1M MOPSO pH7.5)150μlを加えて室温で混合した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。比較としてリゾスタフィンを混合していない添加液(終濃度1% TritonX−100、0.1M MOPSO pH7.5)についても検討に用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、ラテラルフロー方式で室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインを装置FASTKITイムノクロマトリーダー DiaScan 20−A(日本ベクトンデッキンソン社製)により定量した。
イムノクロマトグラフ装置は実施例6に準じて作製した。
マイクロチューブに黄色ブドウ球菌が検出された生乳サンプルを100μl分取し、添加液150μlを加えて室温で混合した。添加液は実施例6に記載の2種類を用いた。実施例6に準じて測定後、出現した赤紫色のラインを目視により判定した(陽性+、陰性−)。
Claims (2)
- 牛の***炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する方法であって、
***炎に罹患した牛から原因菌を含む乳汁を得る工程、該乳汁中に溶菌酵素とTritonX−100を混合することにより該原因菌の菌体内に存在するタンパク質を菌体外に放出させる工程、及び該タンパク質を抗原とする抗体を用いた免疫学的方法によって該タンパク質の存在の有無又は存在量を測定する工程を含み、
該溶菌酵素がリゾスタフィンである診断方法。 - 該免疫学的方法が、凝集反応法、酵素免疫測定法(ELISA法)、放射能免疫測定法(RIA法)、及び蛍光免疫測定法(FIA法)からなる群より選択される方法である、請求項1に記載の診断方法。
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