KR20190067779A

KR20190067779A - 다른 방식으로 항원을 고정화한 항원 담지 불용성 담체 입자를 사용하는 항체 측정법, 항체 측정용 시약

Info

Publication number: KR20190067779A
Application number: KR1020197009255A
Authority: KR
Inventors: 유스케 우에노; 다츠노리 기쿠치; 유스케 무라카미
Original assignee: 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2019-06-17
Also published as: JPWO2018043584A1; EP3508849B1; JP6918808B2; EP3508849A1; KR102505384B1; CN109642899B; TWI757328B; WO2018043584A1; EP3508849A4; CN109642899A; TW201812302A; AU2017321642A1

Abstract

본 발명은, 항원이 담지된, 라텍스 등의 불용성 담체 입자의 항체 측정에서의 이용 가능성의 폭을 넓히는 것, 특히, 미생물 유래의 용해물 등의 복수 물질의 혼합물을 담지시켜도 양호한 측정 결과를 얻는 수단을 제공하는 것을 과제로 하고, 물리 흡착에 의해 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자, 및, 화학 결합에 의해 당해 항원이 담지된 불용성 담체 입자 둘다를 함유하는 불용성 담체 입자의 함유액을, 표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플과 접촉시켜, 당해 담체 입자에 담지된 항원과, 당해 샘플 중의 표적 항체와의 항원 항체 반응에 의한 당해 담체 입자의 응집 반응을 검출하는 것을 특징으로 하는 항체 측정 방법을 제공한다.

Description

다른 방식으로 항원을 고정화한 항원 담지 불용성 담체 입자를 사용하는 항체 측정법, 항체 측정용 시약

본 발명은, 생체 물질의 측정 방법에 관한 발명이며, 더욱 구체적으로는 다른 방식으로 항원을 고정화한 항원 담지 불용성 담체 입자, 예를 들면, 항원 담지 라텍스 입자끼리를 혼합하여 사용하는 항체의 측정 수단에 관한 발명이다.

현재 불용성 담체 입자를 사용한 진단약에 있어서는, 특히 면역학적 측정 방법의 하나로서 라텍스 응집법을 사용하는 시약이 범용되고 있다.

라텍스 응집법에서는, 액상 중에 있어서 항원 또는 항체를 담지시킨(coated 또는 coupled) 라텍스를 사용하여, 항체 또는 항원을 검출하는 측정계를 형성한다. 면역 복합체의 형성에 의해 라텍스 입자가 응집하는 성질에 기초하여, 응집의 정도를 육안으로 확인하거나, 광학적으로 탁도의 증가를 흡광도 또는 산란광 강도의 변화로서 측정을 행할 수 있다(이하, 라텍스법이라고도 한다: 특허문헌 1).

ELISA 등의 샌드위치 면역 측정법은, 측정 자체는 정확하여, 기준법으로서 사용하는 것이 가능하지만, 측정 과정에 있어서 측정 샘플에 포함되는 피측정 물질 이외의 성분이나 측정 시약 중의 성분을 제거하는 세정 공정을 포함하기 때문에, 측정에 장시간을 요하여, 측정 조작이 번잡하다는 결점을 갖는다. 그 때문에, 단시간으로의 다수의 측정 시료의 측정에는 적합하지 않다.

이에 대하여 라텍스법은, 조작이 간편하고, 임상 검사에서 널리 이용되고 있는 범용의 생화학 자동 분석 장치로의 적용이 용이하고, 단시간으로의 측정과 다수의 피험 시료의 측정이 가능하다.

따라서, 많은 임상 검사 항목에 있어서 라텍스법이 이용되고 있다.

특허문헌 1: 일본 특허공개공보 특개 소53-62826호

본 발명에서는, 항원이 담지된 라텍스 등의 불용성 담체 입자를 이용한 항체 측정에 있어서 측정 범위를 확대하는 것, 및 감도와 특이성의 향상을 과제로 한다. 특히, 미생물 유래의 용해물 등의 복수 물질의 혼합물을 담지시켜도 양호한 측정 결과를 얻는 수단의 제공을 행하는 것이다.

불용성 담체 입자를 이용하는 진단약의 개발시에는, 불용성 담체 입자에 담지시키는 물질의 분자량이나, 담지 방식의 선택이 그 성능에 크게 영향을 준다.

예를 들면, 물리 흡착법을 이용하는 경우, 즉, 불용성 담체 입자와 담지 단백질과의 정전적 상호 작용(소수성 상호 작용)을 이용하여, 직접적인 접촉에 의해 불용성 담체 입자에 단백질 등을 담지시키는 경우에는, 비교적 고분자량의 물질의 담지에는 적합하다. 그러나, 저분자량의 물질이나 합텐의 담지에는, 불용성 담체 표면에서의 매몰이나, 비특이적인 응집을 억제하기 위해서 사용되는 블로킹제에 의한 매몰이 일어날 수 있다고 하는 난점이 있다. 또한, 소수성 아미노산 잔기가 매우 부족한 단백질의 담지에도, 물리 흡착법은 난점이 인정된다.

화학 결합법을 사용하는 경우, 즉, 불용성 담체 입자 또는 단백질 표면의 카복실기와 아미노기를 카르보디이미드 등의 커플링 시약에 의해 공유 결합시키는 방법, 불용성 담체 입자 표면의 알데히드기나 토실기 등과 단백질의 아미노기를 결합시키는 방법 등에 의해 불용성 담체 입자에 단백질 등을 담지하는 경우에는, 물리 흡착법에 대해서는 난점이 있는 저분자량의 단백질이나 합텐의 담지도 비교적 용이하다. 또한, 화학 결합법을 사용하는 경우에는, 불용성 담체의 관능기를 적절하게 선택함으로써, 공유 결합을 형성하는 단백질측의 결합 부위측의 컨트롤, 즉, 단백질측의 결합 부위(공유 결합하는 아미노산 잔기)를 선택하는 것이 가능하다. 그러나, 관능기가 부족한 단백질(바꿔 말하면, 소수성이 높은 단백질)의 담지가 곤란하다고 하는 문제가 보이고, 또한 당해 담지 입자의 제작 공정이 번잡하며, 담지 단백질의 변성 문제도 보인다.

특히, 미생물 유래의 용해물 등의 「복수 물질의 혼합물」을 담지시키는 경우, 담지 방식이 물리 흡착법 또는 화학 결합법 중 어느 한쪽뿐이라면, 물질마다 그 크기나 단백질에 있어서는 친수성 아미노산 잔기와 소수성 아미노산 잔기의 함유량이 다르므로, 담지되는 물질에 편향이 발생해 버리고, 그 결과, 얻어진 항원 담지 불용성 담체 입자에서는, 양호한 측정 결과를 얻는 것이 곤란하다, 란 문제, 즉, 포착되는 표적 항체의 종류가, 한정된 물질에 결합하는 것으로 한정되어 버려, 당해 표적 항체가 유래하는 질병 등의 원인이 되는 미생물 등에 대한 데이터 취득이, 충분히 행하여지지 않을 가능성이 있다, 는 문제가 있다.

또한, 생체 내에서의 미생물에 대한 항체는, 단일 항원에 대한 항체가 아니라, 복수의 항원에 대한 복수의 항체로서 존재하므로, 이들 복수의 항체를 한번에 포착할 수 있다면, 보다 확실한 데이터 취득으로 이어진다. 항원으로서, 생물 유래의 항원성 물질 등의 불특정 다수의 물질의 혼합물을 담지한 불용성 담체 입자를 사용한 예는, 본원 출원시에 있어서, 본 발명자가 아는 한 존재하지 않는다.

본 발명자들은, 상기의 과제에 대해 검토를 행하여, 물리 흡착법에 의해 항원 물질의 담지가 행하여진 불용성 담체 입자와, 화학 결합법에 의해 당해 항원 물질의 담지가 행하여진 불용성 담체 입자의 쌍방을 함유하는, 불용성 담체 입자의 함유액을 항체 측정에 있어서 사용함으로써, 넓은 측정 범위와 함께, 높은 감도와 특이성을 실현하는 것, 특히 항원이, 생물 유래의 항원성 물질 등의 복수 물질의 혼합물인 경우에 있어서도 실현하는 것이 가능한 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은, 물리 흡착에 의해 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자(이하, 물리 흡착 입자라고도 함), 및 화학 결합에 의해 당해 항원이 담지된 불용성 담체 입자(이하, 화학 결합 입자라고도 함)의 양쪽을 함유하는 불용성 담체 입자의 함유액(이하, 본 발명의 함유액이라고도 함)을, 표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플과 접촉시켜, 당해 담체 입자에 담지된 항원과, 당해 샘플 중의 표적 항체와의 항원 항체 반응에 의한 당해 담체 입자의 응집 반응을 검출하는 것을 특징으로 하는 항체 측정 방법(이하, 본 발명의 측정 방법이라고도 함)을 제공한다. 본 발명의 항체 측정 방법에 있어서, 적합하게는, 본 발명의 함유액에 추가하여, 희석액이 사용된다. 희석액을 사용하는 경우, 표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플을 희석액으로 희석한 후, 불용성 담체 입자의 함유액과 접촉시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은, 물리 흡착 입자, 및 화학 결합 입자 둘다를 함유하는 불용성 담체 입자의 함유액(본 발명의 함유액)인 것을 특징으로 하는 항체의 측정용 시약(이하, 본 발명의 측정용 시약이라고도 함)을 제공한다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 측정용 시약(본 발명의 함유액) 및 희석액을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정용 키트(이하, 본 발명의 키트라고도 함)를 제공한다.

물리 흡착 입자도 화학 결합 입자도, 모두 라텍스로서 제공되는 것이 적합하다. 그 외에, 실리카 콜로이드, 자성 입자, 금속 콜로이드 등의 불용성 담체 입자를 사용할 수 있다. 함유액은, 불용성 담체 입자를 함유하고 있으면, 그 함유 상태는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 함유액에는, 분산액, 유화액, 부유액, 침전액, 다층 분리액 등이 포함된다. 또한, 함유액 중의 불용성 담체 입자는, 필요에 따른 표면 처리가 되어 있어도 좋다.

물리 흡착 입자는, 상기의 규정대로 물리 흡착법에 의해 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자이다. 물리 흡착 입자의 평균 입자직경은 0.01μm 내지 1.0μm의 범위에서 사용하는 것이 가능하며, 적합하게는 0.05μm 내지 0.35μm, 더욱 적합하게는 0.10μm 내지 0.35μm, 가장 적합하게는 0.20μm 내지 0.35μm이다. 물리 흡착 입자는, 물리 흡착법을 행할 대상이 되는 불용성 담체 입자의 함유액에, 흡착 대상 항원을 접촉시킴으로써 제작할 수 있다.

화학 결합 입자는, 상기의 규정대로 화학 결합법에 의해 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자이다. 화학 결합 입자의 평균 입자직경은 0.01μm 내지 1.0μm의 범위에서 사용하는 것이 가능하며, 적합하게는 0.05μm 내지 0.35μm, 더욱 적합하게는 0.10μm 내지 0.35μm, 가장 적합하게는 0.20μm 내지 0.35μm이다. 화학 결합 입자는, 화학 결합법을 행할 대상이 되는 불용성 담체 입자의 함유액에, 결합 대상 항원을 공유 결합시키는 조작을 행함으로써 제작할 수 있다.

즉, 본 발명의 함유액은, 적합하게는 상기의 「물리 흡착 입자 함유액」과 「화학 결합 입자의 함유액」을 혼합함으로써 조제할 수 있다.

물리 흡착 입자와 화학 결합 입자의 혼합비(질량비)는, 적합하게는 10:1 내지 1:10(물리 흡착 입자:화학 결합 입자), 더욱 적합하게는 5:1 내지 1:5(물리 흡착 입자:화학 결합 입자), 매우 적합하게는 3:1 내지 1:3(물리 흡착 입자:화학 결합 입자), 가장 적합하게는 3:1 내지 1:2(물리 흡착 입자:화학 결합 입자)이다. 단, 샘플 중의 표적 항체를 측정할 때의 측정용 시약 중 또는, 희석액을 사용하는 경우에는 측정용 시약 및 희석액의 혼합액 중의 물리 흡착 입자의 함유량이 0.045질량% 이상이면, 당해 입자의 함유량 증가에 알맞은 효과의 향상이 확인되지 않게 되는 경향이 있다.

「소정의 항원」에서의 「소정의」란, 예를 들면, 「선택된」으로 바꿔 말할 수 있다. 측정의 대상으로서 선택된 항체에 결합하는 항원으로서 「정해진」 또는 「선택된」이라는 의미이며, 일단 정해지고, 또는 일단 선택되면, 당해 항원은 일의적으로 확정된다.

「소정의 항원」이 될 수 있는 항원은 특별히 한정되지 않고, 측정 대상의 항체에 결합하는 물질이면 널리 선택할 수 있지만, 바람직하게는 생체로부터 분리된 샘플 중의 항체에 결합하는 항원이다. 즉, 특정 질병이나 체질에 따라 생체 내에 존재하는 물질에 대한 항체를 표적 항체로 하고, 이것에 결합하는 항원을 「소정의 항원」으로 하는 것이 바람직하다. 「소정의 항원」이 될 수 있는 물질은, 단백질이 대표적이지만, 당쇄, 지질 등의 다른 물질도 포함된다.

또한, 「생체」는 널리 생물 일반의 몸을 가리키지만, 통상적으로는 인체이다.

당해 항원을 「복수 물질의 혼합물」로 함으로써, 본 발명의 효과가 적합하게 발휘된다. 당해 혼합물로서는, 생물 유래의 항원성 물질을 들 수 있고, 적합하게는 세균, 바이러스 등의 미생물 유래의 용해물을 들 수 있다.

또한, 당해 항원은, 분자량이 5000 이상, 특히 바람직하게는 10000 이상의 물질을 적어도 1종 함유하는 경우에, 본 발명의 효과가 적합하게 발휘된다. 미생물 유래의 용해물에 대하여, 물리 흡착 입자와 화학 결합 입자의 양자를 합쳐서 사용함으로써, 총체로서 다양한 에피토프 제시가 가능해진다. 당해 분자량의 상한은 불용성 담체 입자에 대한 담지가 가능한 한 특별히 한정되지 않지만, 대체로 2000000 이하 정도인 것이 적합하다. 상기의 「복수 물질의 혼합물」이 이 특정 분자량의 조건에 꼭 들어맞는 경우도 있다.

상기 본 발명의 함유액을, 표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플과 접촉시켜, 당해 함유액의 불용성 담체 입자에 담지된 항원과, 당해 샘플 중의 표적 항체와의 항원 항체 반응에 의한 당해 담체 입자의 응집 반응의 정도를 검출할 수 있다.

「표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플」은, 피측정 항체를 함유할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 림프액, 자액(刺液), 수액(髓液), 땀, 타액, 위액, 폐 세정액, 분변 등을 들 수 있다. 이것들 중, 혈액, 혈청, 혈장이 바람직하다.

「항원 항체 반응에 의한 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자의 반응」으로서 주요한 것은 응집 반응이며, 슬라이드 응집법, 광학 측정법, 마이크로타이 터법, 필터 분리법 등을 이용하여, 불용성 담체 입자의 응집을 검출함으로써, 원하는 항체의 측정을 행할 수 있다.

본 발명의 측정 방법은, 적합하게는, 생화학 자동 분석 장치를 이용하여 행하여진다. 생화학 자동 분석 장치는, 광학적 측정 방법을 측정 원리로 하는 것이며, 통상적으로, 사용시에, 혈청 등의 샘플을 희석액으로 희석하여 가온한 후에, 시약(본 발명의 경우라면, 본 발명의 함유액)을 첨가하여 측정을 행하는 방법으로 되어 있다. 현재 제공되고 있는 생화학 자동 분석 장치로서는, 예를 들면, 히타치 7180형, LABOSPECT 008, LABOSPECT 006 등(가부시키가이샤 히타치 하이테크놀로지스 제조); JCA-BM6010, JCA-BM6050, JCA-BM9130 등(닛뽄 덴시 가부시키가이샤 제조); TBA-c16000, TBA-2000FR, TBA-120FR 등(도시바 메디컬 시스템즈 가부시키가이샤 제조); AU680, AU5800 등(벡크만 쿨터 가부시키가이샤 제조) 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의해, 넓은 측정 범위와 함께, 높은 감도와 특이성을 수반하여 항체를 측정하는 수단이 제공된다.

[도 1] 입자직경 0.145μm의 화학 결합 라텍스와 입자직경 0.235μm의 물리 흡착 라텍스의 혼합의 반응성에서의 효과를 검토한 도면이다.
[도 2] 입자직경 0.235μm의 물리 흡착 라텍스에 대한, 입자직경 0.300μm의 화학 결합 라텍스의 혼합량을 변화시키는 것에 의한 반응성에서의 효과를 검토한 도면이다.

1. 본 발명의 함유액

상술한 바와 같이, 본 발명의 함유액은, 물리 흡착 입자, 및 화학 결합 입자 둘다를 함유하는 함유액이다.

(1) 불용성 담체 입자의 조달

상술한 바와 같이, 물리 흡착 입자도 화학 결합 입자도, 모두 라텍스로서 제공되는 것이 적합하다. 라텍스는, 수성 용매 중에 폴리머의 미립자(라텍스 입자)가 안정적으로 분산된 에멀젼이다.

라텍스의 제작 방법은 유화 중합법, 솝 프리(soap-free) 유화 중합법, 시드 중합법, 스테이지 피드 유화 중합법, 파워 피드 중합법, 현탁 중합법 등의 상법을 사용하여 행하는 것이 가능하다. 입자직경의 조절도, 이들 라텍스의 조제 방법의 각각에서의 상법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 유화 중합법이면, 모노머, 유화제, 개시제의 종류와 양, 중합 온도 등을 조절함으로써, 라텍스의 입자직경의 조절을 행할 수 있다. 라텍스의 시판품을 사용하는 것도 당연히 가능하다.

라텍스의 종류는, 물리 흡착 입자의 제작에 사용되는 물리 흡착법, 또는 화학 결합 입자의 제작에 사용되는 화학 결합법을 적용할 수 있는 한에서 특별히 한정되지 않고, 물리 흡착법 및 화학 결합법의 각각에 적합한 종류를 선택하는 것이 적합하다.

물리 흡착법에 적합한 라텍스로서는, 폴리스티렌 라텍스, 극저 카복실산 라텍스, 친수기 국재화 라텍스 등을 들 수 있다.

화학 결합법에 적합한 라텍스로서는, 카복실기, 수산기, 아미노기, 알데히드기, 또는, 토실기 등을 표면에 갖는 라텍스 입자를 함유하는 라텍스를 들 수 있다.

물리 흡착법에 적합한 라텍스라도, 또는 화학 결합법에 적합한 라텍스라도, 착색된 착색 라텍스나 형광 물질이 입혀진 형광 라텍스를 사용하는 것도 가능하다.

전술한 바와 같이, 물리 흡착을 행하는 라텍스 입자도 화학 결합을 행하는 라텍스 입자의 입자직경도 특별히 한정되지 않고, 0.01μm 내지 1.0μm의 범위에서 사용하는 것이 가능하며, 적합하게는 0.05μm 내지 0.35μm, 더욱 적합하게는 0.10μm 내지 0.35μm, 가장 적합하게는 0.20μm 내지 0.35μm이다.

이들 양쪽의 담지 방식의 라텍스 입자의 각각에 있어서, 담지 항원과 측정 항체의 특성에 따른 적절한 감도와 특이성과 측정 범위를 얻기 위해, 측정에 있어서 사용하는 라텍스 입자의 입자직경을 결정할 수 있다. 구체적으로는, 면역 반응에 의한 라텍스의 응집성을 높이고 싶은 경우에는, 중간 정도에서 큰 입자직경(0.20 내지 0.35μm)을 선택하는 것이 적합하지만, 측정 대상(항체)의 농도가 매우 높은 경우에는, 작은 입자직경(0.10μm 이하)을 선택하는 것이 바람직한 경우도 있다.

상술한 바와 같이, 라텍스 입자 이외의 불용성 담체 입자로서, 실리카 콜로이드 입자, 자성 입자, 금속 콜로이드 입자 등을 들 수 있다. 이들 불용성 담체 입자에는, 물리 흡착 또는 화학 결합에 적합한 관능기를 부가하는 입자 표면의 개질을 행함으로써 본 발명에 있어서 사용하는 것이 가능한 불용성 담체 입자로 하는 것이 가능하다.

(2) 불용성 담체 입자로의 담지 공정

(A) 담지 항원

불용성 담체 입자에 대하여 담지시키는 항원은, 측정의 표적으로 하는 항체와 결합 가능한 한 전혀 한정되지 않지만, 전술한 바와 같이 「복수 물질의 혼합물」이나 「큰 분자량의 물질의 함유물」로 함으로써, 본 발명의 효과가 적합하게 발휘된다. 당해 혼합물로서는, 생물 유래의 항원성 물질을 들 수 있고, 적합하게는 세균, 바이러스 등의 미생물 유래의 용해물을 들 수 있다. 예를 들면, 후술하는 실시예에 있어서 이용한 헬리코박터 파이로리의 용해물에는 우레아제B(UreaseB), 우레아제A(UreaseA), 캐그A(CagA), 플라젤린(Flagellin), 열 충격 단백질(Heat Shock Protein), 기타 물질이 함유되어 있다. 이들 헬리코박터 파이로리의 용해물에 포함되는 물질의 분자량은 대부분이 10000-200000 정도이다.

이 헬리코박터 파이로리와 같은 체내에서의 감염 미생물의 특정을 위해서, 당해 감염 미생물에 특유의 물질을 담지 항원으로서 사용할 수 있다. 미생물로서는, 이 헬리코박터 파이로리 외에, A군 용균 렌서구균, B군 용균 렌서구균, 폐렴구균 U중 항원, 대장균 O157, 클로스트리듐 디피실, 레지오넬라균, 콜레라균, 수막염 기인균 등의 세균류; 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 로타 바이러스, 노로 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 광견병 바이러스, 폴리오 바이러스, 에코 바이러스, 콕사키 바이러스 A군, 콕사키 바이러스 B군, 멈프스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 수두·대상 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, EB 바이러스, 유두종 바이러스, 전염성 연속종 바이러스, 수족구병 바이러스, 급성 출혈성 결막염 바이러스, HAV, HBV, HCV, 유행성 각결막염 바이러스, 헌터 바이러스, 인간 T세포 림프구 친화성 바이러스, HIV, 림프구성 맥락수막염 바이러스, RS 바이러스, 아데노 바이러스, 레오 바이러스, 라이노 바이러스, 코로나 바이러스 등의 바이러스류; 칸디다증, 아스페르길루스증, 크립토콕쿠스증, 접합균증, 뉴모시스티스 폐렴, 트리코스포론증 등의 심재성 진균증의 원인이 되는 진균; 쯔쯔가무시증, 홍반증, 발진티푸스 등의 원인이 되는 리케차; 클라미디아, 원충, 기생충 등을 들 수 있다.

미생물 유래의 항원 이외에 본 발명에 사용할 수 있는 담지 항원으로서, 항TSH 수용체 항체, 항아세틸콜린 수용체 항체, 항인슐린 수용체 항체 등의 항수용체 항체에 대한 항원; 항티로글로불린 항체, 항마이크로솜 항체 등의 항갑상선 항체에 대한 항원; 항췌도세포 항체, 항GAD 항체, 항인슐린 항체 등의 항췌도 항체에 대한 항원; 항부신피질 항체, 항평활근 항체, 항LKM 항체, 항위벽 세포 항체, 항내인자 항체, 항횡문근 항체, 항심근 항체, 항피부 데스모글레인 항체, 항호중구 세포질 항체, 항인지질 항체 등의 장기 특이적 자기 항체에 대한 항원 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 사용할 수 있는 담지 항원으로서, DNA, 뉴클레오솜, 히스톤, 폴리ADP 리보오스, 센트로미어, Scl-70, Ku 등의 크로마틴에 분포하는 자기 항원; U1RNP, Sm, SS-B/LA, SS-A/Ro, PCNA, Ki 등의 핵질에 분포하는 자기 항원; U3RNP, Th/To, PM-Sci, RNA 폴리메라아제 등의 핵소체에 분포하는 자기 항원; AA-A/Ro, Jo-1, 리보솜P, 미토콘드리아M2, 시그널 인식 입자 등의 세포질에 분포하는 자기 항원 등의 장기 비특이적 자기 항체에 대한 항원을 들 수 있다.

이상의 기재는 예시 열거이며, 그 이외의 현시점에서 적용 가능한 항원을 사용하는 것도 가능하며, 또한 장래에 제공되는 항원을 이용하는 것도 가능하다.

(b) 항원의 담지 공정

항원의 불용성 담체 입자로의 담지는, 물리 흡착법, 화학 결합법, 각각 상법에 따라 행할 수 있다.

물리 흡착법은, 예를 들면, 증류수나 PBS에 있어서 0.1 내지 1질량% 정도로 불용성 담체 입자를 함유하는 함유액을, 담지하고자 하는 항원과 혼합하여, 불용성 담체 입자에 당해 항원을 담지시킬 수 있다. 또한, 원심 분리를 이용하여 미흡착의 항원과, 항원 담지 담체 입자를 나누고, 수성 용매(통상, 완충액) 중에 재분산시킴으로써 물리 흡착 입자의 함유액을 제작할 수 있다. 완충액으로서는, 예를 들면, HEPES 완충액 등의 굳 완충액(Good's buffers), TRIS 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다.

화학 결합법은, 불용성 담체 입자 표면의 관능기를 이용하여, 소정의 항원을 공유 결합으로 결합한다. 예를 들면, 불용성 담체 입자 표면의 관능기가, 카복실기, 수산기, 아미노기인 경우에는, 각각 카르보디이미드, 브롬시안, 글루타르알데히드를 활성제로서 이용함으로써 항원을 불용성 담체 입자 표면에 공유 결합시키는 것이 가능하다. 활성화제로 사전에 불용성 담체 입자 표면의 관능기를 활성화시키고나서 항원과 접촉시키는 것도 가능하며, 활성화제와 항원을 동시에 불용성 담체 입자와 접촉시켜도 좋다. 불용성 담체 입자 표면의 관능기가 알데히드기, 토실기인 경우에는, 활성제를 사용할 필요가 없다. 또한, 불용성 담체 입자와 항원 사이에, 올리고아미노산이나 아미노카복실산 등의 스페이서 분자를 넣어 공유 결합을 행하는 것도 가능하다.

상기의 화학 결합 반응은, 수성 용매(통상, 완충액) 중에서 행하여지고, 얻어진 화학 결합 입자를 수성 용매(통상, 완충액) 중에 재분산시킴으로써 화학 결합 입자의 함유액을 제작할 수 있다. 완충액으로서는, 예를 들면, HEPES 완충액 등의 굳 완충액, TRIS 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다.

이와 같이 하여, 물리 흡착 입자와 화학 결합 입자를 제작할 수 있다. 물리 흡착 입자와 화학 결합 입자는, 수성 용매 중에서 불용성 담체 입자의 함유액으로서 보존된다.

(3) 본 발명의 함유액

　본 발명의 함유액은, 물리 흡착 입자, 및, 화학 결합 입자 둘다를 함유하는 함유액이며, 그 용매는 통상, 완충액이다. 완충액으로서는, 예를 들면, HEPES 완충액 등의 굳 완충액, TRIS 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 함유액은, 상기의 물리 흡착 입자의 함유액으로서 제작된 물리 흡착 입자와, 화학 결합 입자 함유액으로서 제작된 화학 결합 입자를, 수성 용매(통상, 완충액) 중에서 혼합함으로서 제작할 수 있다. 물리 흡착 입자, 및, 화학 결합 입자 둘다를 함유하는 함유액이 얻어지는 것이라면, 본 발명의 함유액의 제작 방법은 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 함유액에는, 필요에 따라, 예를 들면, 각종 전해질, 안정화제, 계면활성제, 증감제 등이 함유되어 있어도 좋다.

본 발명의 함유액 중에서의, 각각의 항원 담지 담체 입자의 함유비는, 원하는 측정 범위와 감도에 따라서도 다르지만, 적합하게는 질량비로 10:1 내지 1:10(물리 흡착 입자:화학 결합 입자), 더욱 적합하게는 5:1 내지 1:5(물리 흡착 입자:화학 결합 입자), 매우 적합하게는 3:1 내지 1:3(물리 흡착 입자:화학 결합 입자), 가장 적합하게는 3:1 내지 1:2(물리 흡착 입자:화학 결합 입자)이다. 단, 샘플 중의 표적 항체를 측정할 때의 함유액 중, 또는 희석액을 사용하는 경우에는 함유액 및 희석액의 혼합액 중의 물리 흡착 입자의 함유량이 0.045질량% 이상이면, 당해 입자의 함유량의 증가에 알맞는 효과의 향상이 확인되지 않게 될 경향이 있다.

2. 항체의 측정

본 발명의 측정 방법에서는, 상술한 본 발명의 함유액을 이용하여 항체의 측정을 행한다. 즉, 본 발명의 함유액을, 표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플과 접촉시켜, 당해 함유액의 불용성 담체 입자에 담지된 항원과 당해 샘플 중의 표적 항체와의 항원 항체 반응에 의한 당해 미립자의 반응을 검출할 수 있다. 희석액을 사용하지 않고 본 발명의 측정 방법을 행하는 것도 가능하지만, 바람직하게는 희석액을 사용하여 행하여진다.

희석액을 사용하여 측정을 행할 경우, 희석액을 혼합하여 희석한 본 발명의 함유액을 당해 샘플과 접촉시킬 수도 있지만, 적합하게는, 당해 샘플에 희석액을 첨가하여 희석한 당해 샘플과, 본 발명의 함유액을 접촉시킨다. 본 발명의 함유액에 대하여, 용적비로 9배 이하의 희석액을 사용하는 것이 바람직하고, 1 내지 5배 희석액을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

「표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플」은, 피측정 항체를 함유할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않는 것은 상기와 같고, 예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 림프액, 자액, 수액, 땀, 타액, 위액, 폐 세정액, 분변 등을 들 수 있고, 이것들 중 혈액, 혈청, 혈장이 적합하다. 혈청 등의 샘플은, 필요에 따라 생리 식염수 등으로 희석될 수 있다. 식염수 등으로 희석된 샘플도 「표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플」에 포함된다. 또한, 여기에서의 희석은 희석액에 의한 희석과는 별개이다.

3. 본 발명의 키트

본 발명의 키트는, 본 발명의 측정 방법을 행하기 위한 측정용 키트이며, 본 발명의 함유액 및 하기의 희석액을 구성 요소로서 포함하는 것이다.

본 발명의 함유액 이외의 본 발명의 키트에서의 구성 요소로는, 예를 들면, 측정 대상이 되는 표적 항체의 표준품, 정밀도 관리용 시료, 희석액 등을 들 수 있다.

희석액은, 바람직하게는 「표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플」을, 본 발명의 함유액과 접촉시키기 전에 희석하기 위한 액체이며, 표적 항체의 측정을 실질적으로 저해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 희석액은 본 발명의 함유액과 마찬가지로, 완충액이 전형적이다. 완충액으로서는, 예를 들면, HEPES 완충액 등의 굳 완충액, TRIS 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다. 당해 희석액에는 필요에 따라, 예를 들면, 각종 전해질, 안정화제, 계면활성제, 증감제 등이 함유되어 있어도 좋다. 당해 희석액은, 본 발명의 함유액의 용매와 동일 또는 유사한 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 키트를 사용하여 본 발명의 측정 방법을 행할 경우, 희석액을 사용하지 않고 측정을 행할 경우도 있을 수 있으나, 희석액을 사용하는 경우에는, 본 발명의 함유액에 대하여, 용적비로 바람직하게는 9배 이하, 특히 바람직하게는 1 내지 5배 희석액을 사용한다.

후술하는 실시예에 있어서는, 사용시 희석액인 제1 시약이 상기의 희석액이며, 라텍스 분산액인 제2 시약이 본 발명의 함유액이다. 이것들 제1 시약과 제2 시약을 구성 요소로서 포함하는 것이, 본 발명의 키트의 구체예의 하나이다.

실시예

이하, 본 발명의 실시예를 기재한다. %는 특별히 언급하지 않는 한 질량%이다.

[제조예]

1. 라텍스

본 실시예에 있어서 사용한 라텍스는 하기와 같다.

(1) 물리 흡착법을 행하는 라텍스

· 0.235μm 폴리스티렌 라텍스(이하, 물리 라텍스 1이라고 한다)

· 0.223μm 폴리스티렌 라텍스(이하, 물리 라텍스 2라고 한다)

· 0.310μm 폴리스티렌 라텍스(이하, 물리 라텍스 3이라고 한다)

(2) 화학 결합법을 행하는 라텍스

· 0.145μm 카복시 라텍스(이하, 화학 라텍스 1이라고 한다)

· 0.245μm 카복시 라텍스(이하, 화학 라텍스 2라고 한다)

· 0.300μm 카복시 라텍스(이하, 화학 라텍스 3이라고 한다)

2. 담지 항원의 조제

본 실시예의 세균 유래의 담지 항원으로서는, 파이로리균(헬리코박터 파이로리)의 조제 항원을 사용했다. 당해 세균 유래의 항원의 조제는, 하기의 수순으로 행하였다.

(1) 예비 배양

원균주를 헬리코박터 파이로리 선택 분리용 포어미디어(등록상표) HP 분리 배지(에이켄카가쿠 가부시키가이샤)를 이용하고, 아네로팩(미츠비시 가스 카가쿠 가부시키가이샤)에 의해 미호기(微好氣) 환경으로 하여, 37℃에서 배양했다.

(2) 본 배양

본 배양의 배양액은, 펄코아(등록상표) 브레인 하트 인퓨전 브로스 배지 '에이켄'(에이켄카가쿠 가부시키가이샤)에 5% 말혈청을 첨가한 배양액 200mL를 사용했다. 이 본 배양액에, 상기 예비 배지의 단일 콜로니를 조균(釣菌)한 후, McFarland No. 1.0으로 조정한 접종균액을 접종하여, 미호기 가스 하에서 37℃에서 진탕 배양을 행하였다.

(3) 용균

상기 본 배양 완료 후, 원심으로 집균을 행하고, 또한 생리 식염수로 원심 세정하고, 침전에 용균액(0.15M NaCl, 0.1% 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 5mM EDTA, 0.1% NaN₃를 포함하는 50mM HEPES 완충액, pH7.4)을 첨가해서, 이것을 동결 융해로 용균을 행하였다.

(4) 항원 조제

상기의 헬리코박터 파이로리의 용해물을, 0.15M NaCl, 0.1% NaN₃를 포함하는 HEPES 완충액(pH7.4)에 대하여 투석 후, 원심 상청을 얻어, 이것에 구멍직경 0.45μm의 멤브레인 필터 여과를 실시했다. 당해 여과물을 항원으로 해서 항원 준비를 완료하고, 이것을 「헬리코박터 파이로리 용해물」로 하여 이하의 공정에 제공했다. 헬리코박터 파이로리 용해물의 항원 단백질 농도는 BCA법에 의해 측정했다.

3. 라텍스의 담지 공정

(1) 물리 흡착법에 의한 담지

0.09% 폴리스티렌 라텍스 함유액 21.1mL에 0.5M CHES 완충액(pH8.8) 0.48mL를 첨가한 후, 8mg/mL의 헬리코박터 파이로리 용해물 0.25mL를 혼합했다. 혼합물을 실온에서 30분 교반한 후, 10% BSA 용액 1.04mL를 첨가하여, 정제수로 전량을 24.0mL로 했다. 또한, 56℃에서 4시간 가열 처리한 후, 원심 분리로 미흡착 항원을 제거했다. 원심 분리기로 미흡착 항원을 제거한 라텍스를 0.01M HEPES 완충액(pH7.4) 4.0mL에 재분산시키고, 10% BSA 용액 0.04mL를 첨가한 후, 이것을 56℃에서 2시간 가열 처리했다. 가열 후의 항원 흡착 라텍스 함유액을 여과하여, 라텍스 농도 0.48%의 물리 흡착 라텍스를 제작했다.

원심 분리에 의한 미흡착 항원 제거 후에 라텍스의 재분산에 사용하는 0.01M HEPES 완충액(pH7.4)의 용량을 적절히 변경함으로써, 제작하는 물리 흡착 라텍스의 농도를 적절히 조정할 수 있다(화학 결합에 대해서도 마찬가지이다).

(2) 화학 결합법에 의한 담지

0.3% 카복시 라텍스 함유액 6.4mL에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르 보디이미드 염산염을 카복실기의 2몰등량 첨가하고, 15분 교반 반응시켜서 카복실기를 활성화했다. 카복실기를 활성화시킨 라텍스 함유액에 정제수 63.2mL 및 0.5M HEPES 완충액(pH7.0) 1.28mL를 첨가 후, 8mg/mL의 헬리코박터 파이로리 용해물 0.340mL를 혼합하여 3시간 반응시켰다. 반응 혼합물에 10% BSA 용액 0.776mL를 첨가하여 4시간 반응시킨 후, 원심 분리로 미흡착 항원을 제거했다. 원심 분리로 미결합 항원을 제거한 라텍스를 0.01M HEPES 완충액(pH7.4) 4.0mL에 재분산시키고, 10% BSA 용액 0.04mL를 첨가하여, 56℃에서 4시간 가열 처리했다. 가열 후의 항원 결합 라텍스 함유액을 여과하여, 라텍스 농도 0.48%의 화학 결합 라텍스를 제작했다.

(3) 라텍스 분산액의 조제

0.3M NaCl, 0.8M L-아르기닌 염산염 및 0.2% NaN₃를 포함하는 HEPES 완충액(pH7.4) 2.5mL에, 상기 (1)에서 조제한 물리 흡착 라텍스 1.563mL 및 상기 (2)에서 조제한 화학 결합 라텍스 0.521mL를 첨가하고, 정제수로 전량 5.0mL로 하여, 0.15%의 물리 흡착 라텍스와 0.05%의 화학 결합 라텍스를 포함하는 라텍스 분산액을 조제했다.

물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 첨가량을 적절히 선택함으로써, 다양한 혼합 비율로 할 수 있다.

4. 측정계

본 실시예에서의 측정은 탁도법을 이용하여 행하였다.

제1 시약은 희석액(사용시 희석액)으로서, 0.05M HEPES, 0.15M NaCl, 0.5% 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) Na, 0.1% BSA, 0.1% PBC-34, 0.1% NaN₃　pH7.4, 잔량은 정제수이다.

제2 시약은 라텍스 분산액(본 발명의 함유액)으로서, 0.05M HEPES, 0.15M NaCl, 0.4M L-Arg·HCl, 0.1% NaN₃, Latex pH7.4, 잔량은 정제수이다.

측정은, 생화학 자동 분석 장치 JCA-BM2250(닛뽄 덴시 가부시키가이샤)을 사용하여 행하였다.

구체적으로는, 당해 장치에서, 생리 식염수로 5배 희석한 샘플(혈청 샘플) 6.0μL에 제 1 시약 60μL를 혼합하여 37℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 이 혼합액에 제2 시약을 20μL 혼합하여 37℃에서 반응시키고, 제2 시약 혼합 후 약 3분간의 주파장 658nm 및 부파장 805nm의 두 파장에서의 흡광도 변화를 측정했다. 즉, 본 실시예에서는, 제 2 시약에 대해, 용적비로 3배의 제1 시약을 사용했다(희석 배율: 4 배).

기준법으로서, ELISA법(E 플레이트 「에이켄」 에이취. 파이로리 II: 에이켄카가쿠 가부시키가이샤)에 의한 측정을 행하였다.

[실시예 1] 2종의 라텍스의 혼합 효과의 검토

상기와 같이, 다른 방식으로 헬리코박터 파이로리 용해물을 담지시킨, 입자직경 0.235μm의 물리 흡착 라텍스(물리 라텍스 2)와, 입자직경 0.145μm의 화학 결합 라텍스(화학 라텍스 1)를 이용하여, 물리 흡착 라텍스만을 사용한 경우, 화학 결합 라텍스만을 사용한 경우, 및 이것들의 혼합물을 사용한 경우의 반응성을, 풀혈청의 희석 계열을 이용하여 확인했다(표 1·도 1). 검토에 사용한 제2 시약 라텍스 농도는, 물리 흡착 라텍스만을 사용한 경우에는 0.15%, 화학 결합 라텍스만을 사용한 경우에는 0.30%, 혼합물을 사용한 경우에는 물리 흡착 라텍스, 화학 결합 라텍스, 각각 0.15%, 0.30%로 했다. 다음으로, 혈청 샘플을 측정하여, 각각의 경우의 특이성을 검토했다(표 2). 또한, 「표 1의 반응성의 단위」와 「도 1의 세로축의 단위」는, 흡광도 변화량(ΔOD/min)을 10000배한 것이다.

또한, 표 1에 나타내어진 물리 흡착 라텍스 및 화학 결합 라텍스의 농도는, 상기와 같이 제2 시약에서의 농도이며, 측정시에서의 당해 라텍스 농도는, 제1 시약에 의한 희석에 의해, 각각 당해 표시의 1/4이다. 예를 들면, 「물리 라텍스 1 0.15%」의 표시라면, 측정시에서의 물리 라텍스 1의 농도는, 「0.15×1/4=0.0375%」이다.

물리 흡착 라텍스에 화학 결합 라텍스를 혼합함으로써, 높은 음성 일치율을 유지한 채로 양성 일치율이 향상되어 특이성이 향상되고, 물리 흡착 라텍스, 화학 결합 라텍스의 제2 시약에서의 농도를 각각 0.15%, 0.30%(1:2)로 한 경우에, 전체의 일치율에 있어서 바람직한 결과가 확인되었다(표 2).

[실시예 2] 2종의 라텍스의 혼합 비율의 검토

싱기와 같이, 다른 방식으로 헬리코박터 파이로리 용해물을 담지시킨, 입자직경 0.223μm의 물리 흡착 라텍스(물리 라텍스 2)의 제2 시약 중의 농도를 0.20%로 하고, 이것에 입자직경 0.145μm의 화학 결합 라텍스 입자(화학 라텍스 1)를 0 내지 0.20%가 되도록 첨가해서, 혈청 샘플을 측정하여 특이성을 검토했다(표 3).

또한, 표 3에서의 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 농도의 표시와, 제1 시약에 의한 4배 희석에 의한 측정시의 그것들이 농도의 관계는, 실시예 1에 기재한 바와 같다.

화학 결합 라텍스를 혼합한 경우에는, 화학 결합 라텍스의 혼합량이 증가함으로서 일치율이 향상되었다. 특히, 화학 결합 라텍스의 제2 시약 중의 농도가 0%, 0.05%, 0.10%, 0.20%로 증가함에 따라 양성 일치율이 53%, 67%, 73%, 80%로 현저하게 향상되어, 위음성(미발견)을 회피하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 단, 물리 흡착 라텍스의 혼합량이 0.20%이며, 후술하는 0.18%(측정시: 0.045%)를 초과하고 있으므로, 일치율의 신장은 억제적이었다(표 3).

[실시예 3] 2종의 라텍스의 혼합 비율의 검토 (1)

상기와 같이, 다른 방식으로 헬리코박터 파이로리 용해물을 담지시킨 입자직경 0.235μm의 물리 흡착 라텍스 입자(물리 라텍스 1)의 제2 시약 중의 농도를 0.12%로 해서, 이것에 입자직경 0.300μm의 화학 결합 라텍스 입자(화학 라텍스 3)를 0 내지 0.10%가 되도록 첨가한 경우의 반응성을, LZ-에이취. 파이로리 항체 캘리브레이터 '에이켄'(에이켄카가쿠 가부시키가이샤)을 이용하여 검토하고(표 4·도 2), 이어서, 혈청 샘플을 측정하여 특이성을 검토했다(표 5). 또한, 「표 4의 반응성의 단위」와 「도 2의 세로축의 단위」는, 흡광도 변화량(ΔOD/min)을 10000배한 것이다.

또한, 표 4 및 표 5에서의 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 농도의 표시와, 제1 시약에 의한 4배 희석에 의한 측정시의 그것들의 농도의 관계는, 실시예 1에 기재한 바와 같다.

이 결과로부터, 물리 흡착 라텍스에 대한 화학 결합 라텍스의 혼합량이 증가함에 따라, 양성 일치율이 향상되어, 위음성(미발견)을 회피할 수 있었다. 또한, 화학 결합 라텍스의 혼합량이 증가함에 따라, 반응성이 향상되어, 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 제2 시약 중의 농도비가 12:5 내지 12:10(3:1 내지 1:3 이내)에 있어서, 전체의 일치율은 적합했다(표 5).

[실시예 4] 2종의 라텍스의 혼합 비율의 검토 (2)

실시예 3과 같은 취지의 검토를, 측정 범위를 더욱 확대해서 행하였다. 사용한 라텍스는 실시예 3과 마찬가지로, 물리 라텍스 1과 화학 라텍스 3이다.

(1) 물리 라텍스 1의 제2 시약 중의 농도를 0.12%로 고정하여, 화학 라텍스 3의 농도를 0%(물리 흡착:화학 결합=7.5:1), 0.016%(7.5:1), 0.048%(7.5:3), 0.08%(7.5:5), 0.12%(7.5:7.5), 0.16%(7.5:10)로 한 경우의 특이성을, 혈청 샘플을 측정하여 검토했다(표 6). 에이취. 파이로리 항체값은, LZ-에이취. 파이로리 항체 캘리브레이터 '에이켄'(에이켄카가쿠 가부시키가이샤)을 사용하여 작성한 검량선으로부터 구했다.

또한, 표 6에서의 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 농도의 표시와, 제1 시약으로 4배 희석에 의한 측정시의 그것들의 농도의 관계는, 실시예 1에 기재한 바와 같다.

(2) 화학 라텍스 3의 제2 시약 중의 농도를 0.08%로 고정하고, 물리 라텍스 1의 농도를 0%(물리 흡착:화학 결합=0:5), 0.024%(1.5:5), 0.072%(4.5:5), 0.12%(7.5:5), 0.18%(11.3:5), 0.24%(15:5)로 한 경우의 특이성을, 혈청 샘플을 측정하여 검토했다(표 7). 에이취. 파이로리 항체값은 LZ-에이취. 파이로리 항체 캘리브레이터 '에이켄'(에이켄카가쿠 가부시키가이샤)을 사용하여 작성한 검량선으로부터 구했다.

또한, 표 7에서의 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 농도의 표시와, 제1 시약으로 4배 희석에 의한 측정시의 그것들의 농도의 관계는, 실시예 1에 기재한 바와 같다.

상기 (1) 및 (2)에 있어서, 상기 실시예 4보다도 넓은 범위에서의, 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스 혼합의 효과가 확인되었다.

즉, 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 제2 시약 중의 농도비가, 7.5:1 내지 7.5:10의 범위에 있어서 검토를 행한 결과, 7.5:1의 예에 있어서는, 이들 2종의 라텍스의 혼합 효과가 확인되고, 다른 7.5:3 내지 7.5:10(3:1 내지 1:3 이내)에 있어서, 전체의 일치율은 적합했다(표 6).

또한, 상기 농도비가, 1.5:5 내지 15:5의 범위에 있어서 검토를 행한 결과, 1.5:5(5:1 내지 1:5 이내), 및, 4.5:5와 7.5:5(3:1 내지 1:3 이내)에 있어서, 전체의 일치율은 적합했지만, 물리 흡착 라텍스의 제2 시약에서의 농도가 0.18%(측정시: 0.045%) 이상의 2예(11.3:5와 15:5의 예)는, 배합비 자체는 3:1 내지 1:3의 범위이지만, 혼합에 의한 특이성의 향상 효과가 저해되었다(표 7).

또한, 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스 중 어느 한쪽을 사용할 경우에는, 양성 일치율과 음성 일치율의 차가 한층 극단적이었지만, 이것은 샘플 수가 적은 것이 요인이 되고 있다고 생각된다.

[실시예 5] 라텍스 입자의 입자직경에 대한 검토

상기와 같이, 다른 방식으로 헬리코박터 파이로리 용해물을 담지한, 입자직경을 0.235μm의 물리 흡착 라텍스 입자(물리 라텍스 1)의 제2 시약 중의 농도를 0.15%로 하고, 이것에 입자직경 0.245μm 또는 0.300μm의 화학 결합 라텍스 입자(각각 화학 라텍스 2(중입자직경), 화학 라텍스 3(대입자직경))를 0.05% 혼합하여, 각각의 특이성을, 혈청 샘플을 측정하여 검토했다. 에이취. 파이로리 항체값은, LZ-H. 파이로리 항체 캘리브레이터 '에이켄'(에이켄카가쿠 가부시키가이샤)을 사용하여 작성한 검량선으로부터 구했다. 그 결과, 전체의 일치율(양성 일치율과 음성 일치율을 합한 것)이 각각 92%와 88%로, 쌍방 실질적인 차이는 확인되지 않았다.

또한, 물리 흡착 라텍스간의 입자직경의 측정값에 끼치는 영향을 확인하기 위해, 물리 라텍스 2(입자직경: 0.223μm(중입자직경))와 물리 라텍스 3(입자직경: 0.310μm(대입자직경))을, 각각 제2 시약 중 0.10%의 농도로 해서, 각각의 특이성을 상기와 동일한 방법으로 측정했지만, 양성 일치율, 음성 일치율, 및, 전체의 일치율에 있어서 실질적인 차이는 확인되지 않았다.

또한, 본 실시예 5에 있어서도, 물리 흡착 라텍스와 화학 결합 라텍스의 농도의 표시와, 제1 시약에 의한 4배 희석에 의한 측정시의 그것들의 농도의 관계는 실시예 1에 기재한 바와 같다.

이 결과로부터, 화학 결합 라텍스의 입자직경과 물리 흡착 라텍스의 입자직경은, 적어도 중 내지 대입자직경에 있어서는, 모두 생체로부터 분리된 샘플의 측정의 특이성에는 실질적으로 영향을 끼치지 않는 것이 확인되었다.

Claims

물리 흡착에 의해 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자, 및 화학 결합에 의해 당해 항원이 담지된 불용성 담체 입자 둘다를 함유하는 불용성 담체 입자의 함유액을, 표적 항체를 함유할 수 있는 생체로부터 분리된 샘플과 접촉시켜, 당해 담체 입자에 담지된 항원과, 당해 샘플 중의 표적 항체와의 항원 항체 반응에 의한 당해 담체 입자의 응집 반응을 검출하는 것을 특징으로 하는, 항체 측정 방법.
제1항에 있어서, 소정의 항원은, 복수 물질의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 항체 측정 방법.
제2항에 있어서, 복수 물질의 혼합물은, 미생물 유래의 용해물인 것을 특징으로 하는, 항체 측정 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 항원은, 분자량이 5000 이상의 물질을 적어도 1종 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 측정 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 불용성 담체 입자는, 라텍스 입자인 것을 특징으로 하는, 항체 측정 방법.
생체로부터 분리된 샘플 중의 표적 항체와의 항원 항체 반응에 의한 당해 담체 입자의 반응을 검출하기 위한 항체의 측정용 시약으로서, 물리 흡착에 의해 소정의 항원이 담지된 불용성 담체 입자, 및, 화학 결합에 의해 당해 항원이 담지된 불용성 담체 입자 둘다를 함유하는 불용성 담체 입자의 함유액인 것을 특징으로 하는, 항체의 측정용 시약.
제6항에 있어서, 소정의 항원은, 복수 물질의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 측정용 시약.
제7항에 있어서, 복수 물질의 혼합물은, 미생물 유래의 용해물인 것을 특징으로 하는, 측정용 시약.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 항원은, 분자량이 5000 이상의 물질을 적어도 1종 포함하는 것을 특징으로 하는, 측정용 시약.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 불용성 담체 입자는, 라텍스 입자인 것을 특징으로 하는, 측정용 시약.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 측정용 시약 및 희석액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 측정용 키트.