JP4866983B2 - 環境汚染物質の人体曝露評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、環境汚染物質が体内に取り込まれた生体指標の評価・分析方法に関し、特に尿中の１−ニトロピレン（1-Nitropyrene）代謝物の分析による人体曝露評価方法に係る。
ニトロ多環芳香族炭化水素類（ＮＰＡＨｓ：Nitropolycyclic aromatic hydrocarbons）は自動車排ガス，工場，暖房器具から発生するほか、大気中で多環芳香族炭化水素類（ＰＡＨｓ：Polycyclic aromatic hydrocarbons）と窒素酸化物との反応でも生成する。
これらは皮膚・肺・胃腸管を経由して体内に吸収され、人体に発がん性や内分泌かく乱作用などを示すとされている。
ＤＥＰ抽出物のサルモネラ菌ＹＧ１０２４株に対する直接変異原性の３割以上を１，３−ＤＮＰ（１，３−ジニトロピレン），１，６−ＤＮＰ（１，６−ジニトロピレン），１，８−ＤＮＰ（１，８−ジニトロピレン），１−ＮＰ（１−ニトロピレン）の４種類が占めることが確認されているほか、ＩＡＲＣによる人発ガンリスクでは、１−ＮＰ，６−ＮＣ（６−ニトロクリセン）等をクラス２Ｂに指定している。
そのため１−ＮＰは含有量の多いディーゼル排ガス曝露の指標物の一つとして使用されるようになってきた。
しかしながら、この方法では代謝能・障害による修復能の個人差、他の曝露源に含まれるＮＰＡＨｓの影響等を考慮することができない。
これらの問題を解決するため血中１−ＮＰヘモグロビン付加体の測定による生体試料をバイオマーカーとして用いる方法が報告された（非特許文献１）。
一方、ＮＰＡＨｓをラット等に経口投与し、その尿中よりＮＰＡＨｓの代謝物を検出した報告（非特許文献２）があるが、ヒト尿中に存在するこれら代謝物濃度は極めて低いと推測され、これを検出した例はない。
これらは皮膚・肺・胃腸管を経由して体内に吸収され、人体に発がん性や内分泌かく乱作用などを示すとされている。
ＤＥＰ抽出物のサルモネラ菌ＹＧ１０２４株に対する直接変異原性の３割以上を１，３−ＤＮＰ（１，３−ジニトロピレン），１，６−ＤＮＰ（１，６−ジニトロピレン），１，８−ＤＮＰ（１，８−ジニトロピレン），１−ＮＰ（１−ニトロピレン）の４種類が占めることが確認されているほか、ＩＡＲＣによる人発ガンリスクでは、１−ＮＰ，６−ＮＣ（６−ニトロクリセン）等をクラス２Ｂに指定している。
そのため１−ＮＰは含有量の多いディーゼル排ガス曝露の指標物の一つとして使用されるようになってきた。
しかしながら、この方法では代謝能・障害による修復能の個人差、他の曝露源に含まれるＮＰＡＨｓの影響等を考慮することができない。
これらの問題を解決するため血中１−ＮＰヘモグロビン付加体の測定による生体試料をバイオマーカーとして用いる方法が報告された（非特許文献１）。
一方、ＮＰＡＨｓをラット等に経口投与し、その尿中よりＮＰＡＨｓの代謝物を検出した報告（非特許文献２）があるが、ヒト尿中に存在するこれら代謝物濃度は極めて低いと推測され、これを検出した例はない。
P.T.J.Scheepers, H.J.Thuis, M.H.Martens, R.P.Bos, Toxic Let., 72, 191-198(1994)
I.M.Ball, M.J.Kohan, J.P.Inmon, L.D.Claxton, J.Lewtas, Carcinogenesis, 5, 1557-1564(1984)
本発明は、人の尿中のニトロ多環芳香族炭化水素類（ＮＰＡＨｓ）代謝物を生体指標（バイオマーカー）とする精度の高い環境汚染物質の人体曝露評価方法の提供を目的とする。
本発明の技術的要旨は、環境汚染物質の１つであるニトロ多環芳香族炭化水素類（ＮＰＡＨｓ：Nitropolycyclic aromatic hydrocarbons）が体内に取り込まれた生体指標として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Liquid Chromatography - Mass Spectrometry / Mass Spectrometry）分析法を用いて尿中の１−ニトロピレン（1-Nitropyrene）の代謝物濃度を測定することを特徴とする。
環境汚染物質の人への曝露量を評価する方法として、ニトロ多環芳香族炭化水素類（ＮＰＡＨｓ）を取り上げ、その中でも図９に示すように大気中及びディーゼル排ガス中に１−ニトロピレン（１−ＮＰ）が比較的高濃度に存在することに着目し、尿中の１−ニトロピレン代謝物の同定を検討した結果、本発明に至った。
１−ニトロピレン（１−ＮＰ）の代謝物質としては図４に示すように、薬物の解毒酵素チトクロムＰ４５０によりヒドロキシ−１−ニトロピレン（ＯＨＮＰｓ：Hydroxy-1-nitropyrenes）及びエポキシ−１−ニトロピレン（Epoxy-1-nitropyrenes）に代謝される。
ＯＨＮＰｓはニトロ還元酵素（Nitroreductase）及びＮ−アセチル化酵素（N-acetyltransferase）によりヒドロキシ−Ｎ−アセチル−１−アミノピレン（ＯＨＮＡＡＰｓ：Hydroxy-N-acetyl-1-aminopyrenes）に代謝される。
また、１−ニトロピレンはニトロ還元酵素により１−アミノピレン（１−ＡＰ：1-Aminopyrene）さらにＮアセチル化酵素によりＮ−アセチル−１−アミノピレン（１−ＮＡＡＰ：N-Acetyl-1-aminopyrene）に代謝される。
このことからこれらの代謝物の同定を検討した。
代謝物の同定にあたり、ＯＨＮＡＡＰｓ及びＯＨＮＰｓは３位、６位、８位のヒドロキシ体に着目した。
ＯＨＮＰｓはニトロ還元酵素（Nitroreductase）及びＮ−アセチル化酵素（N-acetyltransferase）によりヒドロキシ−Ｎ−アセチル−１−アミノピレン（ＯＨＮＡＡＰｓ：Hydroxy-N-acetyl-1-aminopyrenes）に代謝される。
また、１−ニトロピレンはニトロ還元酵素により１−アミノピレン（１−ＡＰ：1-Aminopyrene）さらにＮアセチル化酵素によりＮ−アセチル−１−アミノピレン（１−ＮＡＡＰ：N-Acetyl-1-aminopyrene）に代謝される。
このことからこれらの代謝物の同定を検討した。
代謝物の同定にあたり、ＯＨＮＡＡＰｓ及びＯＨＮＰｓは３位、６位、８位のヒドロキシ体に着目した。
代謝物の同定を目的にまず標準物質を図５及び図６に示すプロセスにて合成し、図７及び図８に示すようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Liquid Chromatography - Mass Spectrometry / Mass Spectrometry）分析方法による分析結果を得た。
人の尿に対しては詳細は後述するが本発明に基づいて、サンプリングした尿を酵素を用いて脱抱合化処理するステップと、ブルーレーヨンに分析対象化合物を吸着及び溶出するステップと、酸性アルミナ固相カートリッジを用いて夾雑物を除去するステップを経た後に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて尿中の１−ニトロピレン代謝物を分析測定した。
その結果を図１及び図２に示す。
先に合成した標準物質（Standard）と尿中（Urine）の代謝物のクロマトグラフの保持時間及びＭＲＭモードＥＰＩスペクトルのフラグメンテーションの一致からＯＨＮＡＡＰｓ及びＯＨＮＰｓに対して非常に正確に同定できた。
図３にＯＨＮＡＡＰｓ，ＯＨＮＰｓの３位、６位、８位ヒドロキシ体の割合を示す。
尿中の代謝物が正確に同定できたことにより、被検体の重水素化体を内部標準物質として用いることで定量分析が可能になった。
その結果を図１及び図２に示す。
先に合成した標準物質（Standard）と尿中（Urine）の代謝物のクロマトグラフの保持時間及びＭＲＭモードＥＰＩスペクトルのフラグメンテーションの一致からＯＨＮＡＡＰｓ及びＯＨＮＰｓに対して非常に正確に同定できた。
図３にＯＨＮＡＡＰｓ，ＯＨＮＰｓの３位、６位、８位ヒドロキシ体の割合を示す。
尿中の代謝物が正確に同定できたことにより、被検体の重水素化体を内部標準物質として用いることで定量分析が可能になった。
本発明においては、人が環境汚染物質に曝露された程度を評価するバイオマーカーとしてニトロ多環芳香族炭化水素類代謝物を取り上げ、特に尿中の１−ニトロピレンの代謝物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法にて分析することで正確に同定かつ定量分析が可能である。
人の尿をサンプリングし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析装置にかけるまでの前処理方法例を以下説明する。
人の尿（Urine）をサンプリングする。
ＨＣｌおよびリン酸緩衝液を添加してｐＨ５に調整する。
これにβ−グルクロニダーゼ／アリルスルファターゼ溶液（β-glucuronidase / aryl sulfatase）を加えて、３７℃インキュベートする。
これによりグルクロン酸抱合体あるいは硫酸抱合体は加水分解し、脱抱合化される。
次に、ブルーレーヨン（Blue rayon）を入れて室温、約１時間インキュベートする。
これによりブルーレーヨンに分析対象物が吸着する。
ブルーレーヨンを取り出し、水にて洗浄後にメタノール／アンモニア（methanol / ammonia）５０：１混合溶媒に対象物を溶出し、この溶出液を乾固する。
この乾固して得られた固形分をメタノール／酢酸エチル（methanol / ethyl acetate）１：１混合溶媒に再溶解し、この溶液を酸性アルミナ固相抽出カートリッジに通液して夾雑物を除去してから乾固する。
この固形分を再溶解と乾固を繰り返すことで最終的には所定容量のメタノール溶液にする。
これから５μＬをサンプリングし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析装置（アプライドバイオシステムズ社製、4000 Q TRAP LC-MS/MSシステム）にかけた結果が図１及び図２に示すチャートである。
人の尿（Urine）をサンプリングする。
ＨＣｌおよびリン酸緩衝液を添加してｐＨ５に調整する。
これにβ−グルクロニダーゼ／アリルスルファターゼ溶液（β-glucuronidase / aryl sulfatase）を加えて、３７℃インキュベートする。
これによりグルクロン酸抱合体あるいは硫酸抱合体は加水分解し、脱抱合化される。
次に、ブルーレーヨン（Blue rayon）を入れて室温、約１時間インキュベートする。
これによりブルーレーヨンに分析対象物が吸着する。
ブルーレーヨンを取り出し、水にて洗浄後にメタノール／アンモニア（methanol / ammonia）５０：１混合溶媒に対象物を溶出し、この溶出液を乾固する。
この乾固して得られた固形分をメタノール／酢酸エチル（methanol / ethyl acetate）１：１混合溶媒に再溶解し、この溶液を酸性アルミナ固相抽出カートリッジに通液して夾雑物を除去してから乾固する。
この固形分を再溶解と乾固を繰り返すことで最終的には所定容量のメタノール溶液にする。
これから５μＬをサンプリングし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析装置（アプライドバイオシステムズ社製、4000 Q TRAP LC-MS/MSシステム）にかけた結果が図１及び図２に示すチャートである。
本実施例に用いたブルーレーヨンは青色色素（銅フタロシアニン誘導体）を非晶質レーヨンに共有結合させたもので、多環性化合物を特異的に吸着する性質を有する。
次に被検体の重水素化体を内部標準物質として尿に添加して検量線の検定を実施した結果、標準物質にて求めた検量線と一致し、尿中に存在すると予想される濃度範囲で標準物質を添加して前処理した試料の分析結果の日内変動と日間変動を測定した結果ＲＳＤ値は０．０９〜９．９８％であった。
これにより１−ニトロピレン代謝物の定量が正確であることを確認した。
これにより１−ニトロピレン代謝物の定量が正確であることを確認した。
日本人被験者が中国瀋陽市においてタクシーに８時間乗車した後に尿試料を採取して尿中１−ニトロピレン代謝物測定した結果、図１０に示すように乗車前と比較してその尿中濃度が増加していた。
これにより、大気中及びディーゼル排ガス中の１−ニトロピレン曝露を評価できるバイオマーカーであることを確認した。
これにより、大気中及びディーゼル排ガス中の１−ニトロピレン曝露を評価できるバイオマーカーであることを確認した。
１−ニトロピレンの尿中代謝物濃度の定量法が確立できたことにより、環境汚染物質の曝露環境、曝露量と尿中代謝物との相関をとることにより人体曝露評価方法としての有用性が高く、環境評価や健康パラメーターとしての利用が期待できる。
Claims (1)
- 環境汚染物質の１つであるニトロ多環芳香族炭化水素類（ＮＰＡＨｓ：Nitropolycyclic aromatic hydrocarbons）が体内に取り込まれた生体指標として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Liquid Chromatography - Mass Spectrometry / Mass Spectrometry）分析法を用いて尿中の１−ニトロピレン（1-Nitropyrene）の代謝物濃度を測定する環境汚染物質の人体曝露評価方法であって、サンプリングした尿を酵素を用いて脱抱合化処理するステップと、当該脱抱合化処理した試料中にブルーレーヨンを入れることで当該ブルーレーヨンに分析対象化合物を吸着及びその後に溶出するステップと、酸性アルミナ固相カートリッジを用いて夾雑物を除去するステップを経た後に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて尿中の１−ニトロピレン代謝物としてヒドロキシ−１−ニトロピレン又はヒドロキシ−Ｎ−アセチル−１−アミノピレンの濃度を測定することを特徴とする環境汚染物質の人体曝露評価方法。
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