CN111087452A - 一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法 - Google Patents

一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，以PCV2毒株基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游偶联SUMO促溶表达标签编码基因，在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，优化基因，重组至PUC57质粒，以重组质粒为模板，设计特异性引物，经PCR扩增后产物克隆入pMAL‑C4x原核表达载体，构建重组质粒，转入大肠杆菌进行诱导、纯化。本发明成功构建了pMAL‑MBP‑HisSUMO‑Cap重组表达载体，MBP‑HisSUMO‑Cap融合蛋白在BL21(DE3)中可实现可溶性表达，纯化后MBP‑HisSUMO‑Cap融合蛋白作为免疫原，能与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP‑tag多克隆抗体和免疫小鼠抗血清均能发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。

Description

一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)属于无囊膜、单股、环状、负链DNA病毒，是已知最小的动物病毒之一，是断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)、皮炎和肾病综合征(PNDS)的主要病原。临床特征常为坏死性***炎、急性肺水肿、生殖障碍和肉芽肿性肠炎。在临床案例中，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)、古典猪瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、链球菌(Streptococcus)和大肠杆菌(Escherichia coli)等病原混合感染，严重制约着全球养猪业的持续健康发展。PCV主要分为三个基因型，即PCV1、PCV2和PCV3，PCV2作为该PCV家族中重要的基因型，包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e基因亚型，其中PCV2b是我国猪群中主要流行的基因亚型。在临床病例中常出现PCV2b和PCV2a亚型的共同感染，促进PCV2b和PCV2a亚型间的基因组同源重组，有利于在病毒进化过程中发挥重要作用。
PCV2粒子呈球形，直径大小约12～23nm，基因组大小约为1760bp，含有11个开放阅读框(ORFs)，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒基因组正链，其他ORFs则位于基因组互补链。ORF1和ORF2为两个主要的ORF，ORF1编码病毒复制蛋白，即Rep蛋白。ORF2编码病毒结构蛋白，即Cap蛋白，由233～234个氨基酸组成，分子量大小约278000。Cap蛋白作为一种免疫相关性蛋白，在病毒入侵宿主细胞和复制过程中起重要作用。有学者发现，PCV2通过Cap蛋白与宿主细胞表面的特异性受体结合，由网格蛋白介导的内吞途径进入宿主细胞。因此，Cap蛋白常作为PCV2分子病原学、致病机理和诊断技术等研究的靶蛋白。国内、外学者先后采用真核、杆状病毒表达***等表达Cap蛋白，为Cap蛋白的研究奠定坚实的基础，而大肠杆菌具有生长速度快、培养经济快捷、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，是常用的蛋白表达***，但是外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达的同时，易被宿主蛋白酶降解或形成包涵体。因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
以PCV2毒株(CAU0673)基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，并进而在SUMO的上游引入6个His(组氨酸)标签编码基因，在此基础上，根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-PCV2b-Cap基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57重组质粒为模板，设计特异性引物，
(2)PCR扩增
以HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57重组质粒为模板进行PCR扩增反应，所述PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 21μL；反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，并凝胶回收目的片段，-20℃保存；
(3)MBP-HisSUMO-Cap重组质粒的构建与鉴定
采用EcoR I和PstI分别双酶切pMAL-C4x空载体和PCR凝胶回收产物，振荡混匀，37℃水浴12h；酶切产物进行连接反应，取连接产物热击转化于DH5α和BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LA平板，37℃培养12h，挑取单菌落接种于LB培养液，37℃200r/min培养，离心收菌，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序，命名为MBP-HisSUMO-Cap重组质粒；
(4)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白表达及SDS-PAGE电泳鉴定
将重组表达菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃振荡培养约2h，当菌液OD600为0.6～1.0时，加入IPTG进行诱导表达，6000r/min离心5min收菌，1×PBS悬浮洗涤3遍，对菌体进行SDS-PAGE电泳分析；
(5)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白纯化
取适量直链淀粉树脂，上柱，制备蛋白纯化层析柱，并采用5倍柱体积的过柱缓冲液Buffer C平衡树脂柱3次，上清裂解液与直链淀粉树脂4℃结合6h，控制流速，并将流穿液重复上柱结合1～2次；然后用15倍柱体积的过柱缓冲液Buffer C洗涤杂蛋白，最后用8倍柱体积的10mmoL/L的麦芽糖缓冲液洗脱目的蛋白，收集流穿液，测定各流穿液OD280值，SDS-PAGE分析，并收集含有目的蛋白的流穿液，PBS缓冲液超滤置换。
优选地，步骤(1)中，所述引物的基因序列如下：
上游引物：5’-CGGAATTCCACCACCACCACCACCATGGTAGCGGT--3’，划下横线处为EcoRI限制性酶切位点；
下游引物5’-AACTGCAGTTACGGGTTCAGCGGCGGATCTTTC-3’，划下横线处为Pst I限制性酶切位点。
优选地，步骤(2)中，所述目的片段的大小为1047bp。
优选地，步骤(3)中，所述酶切的反应体系为40μL：PCR凝胶回收产物或pMAL-C4x空载体各30μL，10×K Buffer 4μL，EcoR I 3μL，Pst I 3μL。
优选地，步骤(3)中，所述连接反应所用的连接酶为T4，连接反应的条件为16℃连接过夜，反应体系：pMAL-C4x载体酶切产物6μL，目的片段酶切产物2μL，T4连接酶1μL，T4Buffer 1μL，总体积为10μL。
优选地，步骤(4)中，所述IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导反应的条件为37℃诱导6h。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明以PCV2b亚型Cap蛋白编码基因的优化序列为目的片段，采用PMAL-C4x原核表达***可溶性表达MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白，并对其进行纯化和免疫原性分析。表达的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白可进一步被SUMO酶切割，使其完全处于自然状态，进而为PCV2b病毒样颗粒(VLPs)的体外组装和诊断试剂盒的开发奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PCV2b-Cap-PUC57片段PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000DNA分子质量标准；1：阴性对照；2：PCV2-Cap-PUC57基因PCR扩增产物。
图2是本发明实施例提供的重组质粒MBP-HisSUMO-Cap的PCR鉴定结果图，图中，M：DL2000DNA分子质量标准；1：阴性对照；2：MBP-HisSUMO-Cap重组质粒。
图3是本发明实施例提供的重组质粒MBP-HisSUMO-Cap的酶切鉴定结果图，图中，M1：DL10000DNA分子质量标准；M2：DL2000DNA分子质量标准；1：重组质粒MBP-HisSUMO-Cap；2：重组质粒EcoR I、Pst I双酶切产物。
图4是本发明实施例提供的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白表达的SDS-PAGE分析结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：pMAL-C4x空载体；2：MBP-HisSUMO-Cap(BL21)诱导前菌体；3：MBP-HisSUMO-Cap(BL21)诱导超声裂解后沉淀；4：MBP-HisSUMO-Cap(BL21)诱导超声裂解上清液；5：MBP-HisSUMO-Cap(BL21)诱导后菌体；6：纯化后MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白。
图5是本发明实施例提供的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白纯化的SDS-PAGE分析结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1：MBP-HisSUMO-Cap(BL21)诱导超声裂解上清液；2：第一次流穿液；3-9：C1-C7洗脱液。
图6是本发明实施例提供的洗脱液蛋白浓度。
图7是本发明实施例提供的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白Western blot结果图，M：蛋白分子质量标准；1-3：pMAL-C4x空载体；2-4：MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白。
图8是本发明实施例提供的免疫抗血清Western blot结果图，图中，M：蛋白分子质量标准；1，3，5：MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白；2，4，6：pMAL-C4x空载体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料与方法
1、材料
(1)主要试剂
感受态大肠杆菌BL21(DE3)、DH5α由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存，DNA Marker、蛋白Marker、EcoR I、Pst I限制性酶、Ex-TaqDNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；pMAL-C4x载体、直链淀粉树脂、兔抗MBP-tag多克隆抗体购自美国NEB公司；PCV2b阳性猪血清购自美国VMRD公司；质粒小量制备试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒均购自美国AxyPrep公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄西林购自北京索莱宝生物科技公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG、山羊抗兔IgG、完全/不完全弗氏佐剂购于德国SIGMA公司；蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司；PCV2b-Cap-PUC57重组质粒由Invitrogen公司(上海)合成；其他试剂为国产分析纯。
(2)实验动物
SPF级Balb/C小鼠，12只，雄性，6周龄，体重17～20g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，动物合格证号：SCXK(甘)-2015-0001。
2、方法
(1)引物设计与合成
以PCV2毒株(CAU0673)基因组为参考序列，HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57质粒为模板，设计特异性引物，其基因序列如下：
上游引物：5’-CGGAATTCCACCACCACCACCACCATGGTAGCGGT--3’，划下横线处为EcoRI限制性酶切位点；
下游引物5’-AACTGCAGTTACGGGTTCAGCGGCGGATCTTTC-3’，划下横线处为Pst I限制性酶切位点，引物由西安擎科生物科技有限公司合成。
(2)PCR扩增
以HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57重组质粒为模板，PCR扩增体系为50μL：即Ex-TaqMix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 21μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增反应后，扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，并凝胶回收目的片段，-20℃保存。
(3)MBP-HisSUMO-Cap重组质粒的构建与鉴定
采用EcoR I和PstI分别双酶切pMAL-C4x空载体和PCR凝胶回收产物，反应体系为40μL：即PCR凝胶回收产物或pMAL-C4x空载体各30μL，10×K Buffer 4μL，EcoR I 3μL，PstI 3μL，振荡混匀，37℃水浴12h；酶切产物经T4连接酶16℃连接过夜，反应体系：pMAL-C4x载体酶切产物6μL，目的片段酶切产物2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体积为10μL；取连接产物热击转化于DH5α和BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LA平板，37℃培养12h，挑取单菌落接种于LB培养液，37℃200r/min培养，离心收菌，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并送GENEWIZ(金唯智)公司测序，命名为MBP-HisSUMO-Cap重组质粒。
(4)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白表达及SDS-PAGE电泳鉴定
将重组表达菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃振荡培养约2h，当菌液OD600为0.6～1.0时，分别设置不同诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间，摸索优化表达条件，诱导条件分别为：终浓度为0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L的IPTG，诱导温度为16℃、28℃、37℃，诱导时间为6h、12h、24h；6 000r/min离心5min收菌，1×PBS悬浮洗涤3遍，对菌体进行SDS-PAGE电泳分析，同时以未诱导的菌体及pMAL-C4x空载体作为阴性对照；适量过柱缓冲液BufferC(1mmoL/L Tris-HCl，0.2moL/L NaCl和1mmoL/L EDTA)悬浮诱导后菌体，功率200W，工作3s，间隔3s，冰浴超声裂解20min，10 000r/min离心10min收集上清裂解液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白的表达方式。
(5)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白纯化
按照直链淀粉树脂使用说明书，取适量直链淀粉树脂，上柱，制备蛋白纯化层析柱，并采用5倍柱体积的过柱缓冲液Buffer C平衡树脂柱3次，上清裂解液与直链淀粉树脂4℃结合6h，控制流速，并将流穿液重复上柱结合1～2次；然后用15倍柱体积的过柱缓冲液Buffer C洗涤杂蛋白，最后用8倍柱体积的10mmoL/L的麦芽糖缓冲液洗脱目的蛋白，收集流穿液，测定各流穿液OD280值，SDS-PAGE分析，并收集含有目的蛋白的流穿液，PBS缓冲液超滤置换。
(6)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白Western blot分析
纯化的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至2张聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加PCV2b阳性猪血清(1:100稀释)、兔抗MBP-tag多克隆抗体(1：2000稀释)于4℃摇床孵育过夜，1×PBST缓冲液洗涤PVDF膜5次，10min/次；再分别加HRP标记的兔抗猪IgG(1：6000稀释)和山羊抗兔IgG(1：5000稀释)于室温摇床孵育1h，1×PBST缓冲液洗PVDF膜5次，避光显色1min，暗室曝光，同时设pMAL-C4x空载体为阴性对照。
(7)动物免疫
选取4只健康的Balb/C小鼠，放血致死，制备空白对照血清。选取8只健康的Balb/C小鼠，分为2组，每组4只，即MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白组、PBS组，背部多点皮下注射。MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白组免疫剂量及程序为：首次免疫时，采用MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白与完全弗氏佐剂等量乳化，免疫剂量为50μg/只；加强免疫时，采用MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白与不完全弗氏佐剂等量乳化，免疫剂量为50μg/只。PBS组免疫剂量及程序为：首次免疫剂量为0.2mL/只，加强免疫剂量为0.2mL/只。两个试验组均免疫4次，每次间隔14d，最后一次加强免疫后7d，放血致死制备血清，-20℃保存。
(8)免疫抗血清Western blot分析
MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白经SDS-PAGE分离后，转印至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭，分别以制备的2种小鼠抗血清和空白对照血清为一抗(1：500稀释)，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗(1：6 000稀释)进行Western blot分析，其他操作方法与上述(6)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白Western blot分析相同，同时设pMAL-C4x空载体作为阴性对照。
3、结果与分析
(1)PCR扩增结果
以HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57重组质粒为模板，其PCR扩增结果如图1所示，扩增获得1条约1 047bp的目的片段，与预期结果相符合。
(2)MBP-HisSUMO-Cap重组质粒鉴定结果
构建的MBP-HisSUMO-Cap重组质粒经PCR鉴定，获得1047bp目的片段，而阴性对照无目的条带，如图2所示；重组质粒经EcoR I、Pst I酶切鉴定，获得1047bp的目的基因片段和6645bp的pMAL-C4x载体片段，而阴性对照无目的条带，如图3所示。
(3)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白表达结果
在不同诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间下，对Cap蛋白进行诱导表达，其SDS-PAGE结果如图4所示。表明MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白主要以可溶性方式表达，蛋白相对分子质量约为81000，与理论值一致；在不同诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度下，目的蛋白表达量差异不显著。因此，选择终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃，诱导6h，作为本试验的诱导表达条件。
(4)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白纯化结果
MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白纯化后其SDS-PAGE结果如图5所示，蛋白浓度的变化情况如表1所示，根据表1绘制洗脱液蛋白浓度变化图如图6所示。结合表1与图5、图6可知，直链淀粉树脂纯化的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白主要存在于C2流穿液，其中在C1～C4阶段出现较集中的洗脱峰。
表1流穿液蛋白浓度
Figure BDA0002324057160000091
(5)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白Western blot分析结果
表达的MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜，用PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP-tag多克隆抗体检测融合蛋白的反应原性。结果如图7所示，可以看出在蛋白相对分子质量约为81000处出现特异性的目标显色条带，而pMAL-C4x空载体处无特异性条带。因此，MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP-tag多克隆抗体均发生特异性反应，具有较好的反应原性。
(6)免疫抗血清Western blot分析结果
免疫抗血清Western blot分析结果如图8所示，由图可知，MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白组在蛋白相对分子质量约为81000处出现特异性的目标显色条带，PBS组和空白血清对照组未出现目标显色条带，而pMAL-C4x空载体处均无特异性条带。表明MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白免疫小鼠抗血清与MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白发生特异性反应，MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白具有较好的免疫原性。
4、结论
Cap蛋白作为PCV2的衣壳蛋白，其N端富含碱性氨基酸，序列高度保守，前41个氨基酸是Cap蛋白的核定位信号肽序列，第69～83位和第117～131位氨基酸是Cap蛋白的两个主要特异性抗原表位。该蛋白免疫原性好，是主要的抗原蛋白，与病毒致病性密切相关，是开发PCV2诊断试剂盒和基因亚单位疫苗的重要靶点。pMAL系列载体含有mal E信号序列，引导融合蛋白穿过胞质膜，进入周质，实现蛋白的可溶性表达，进而有利于形成二硫键，促进蛋白折叠。麦芽糖结合蛋白(MBP)作为重要的标签蛋白，可融合在蛋白的N端或C端，增强细菌中过表达融合蛋白的溶解性，屏蔽毒性蛋白。同时，该纯化技术采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂或变性剂对蛋白活性的影响。本发明成功构建了pMAL-MBP-HisSUMO-Cap重组表达载体，可溶性诱导表达出MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白，蛋白相对分子大小约为81000，纯化后的融合蛋白与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP-tag多克隆抗体、小鼠抗血清均发生特异性反应，具有较好的免疫原性。因此，该MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白可用于PCV2b疫苗和诊断制剂的研发，为PCV2b的防控和诊断奠定了理论基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
以PCV2毒株CAU0673基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，进而在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，在此基础上，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-PCV2b-Cap基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57重组质粒为模板，设计特异性引物，
(2)PCR扩增
以HisSUMO-PCV2b-Cap-PUC57重组质粒为模板进行PCR扩增反应，所述PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 21μL；反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，并凝胶回收目的片段，-20℃保存；
(3)MBP-HisSUMO-Cap重组质粒的构建与鉴定
采用EcoR I和PstI分别双酶切pMAL-C4x空载体和PCR凝胶回收产物，振荡混匀，37℃水浴12h；酶切产物进行连接反应，取连接产物热激转化于DH5α和BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LA平板，37℃培养12h，挑取单菌落接种于LB培养液，37℃200r/min培养，离心收菌，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序，命名为MBP-HisSUMO-Cap重组质粒；
(4)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白表达及SDS-PAGE电泳鉴定
将重组表达菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃振荡培养约2h，当菌液OD600为0.6～1.0时，加入IPTG进行诱导表达，6000r/min离心5min收菌，1×PBS悬浮洗涤3遍，对菌体进行SDS-PAGE电泳分析；
(5)MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白纯化
取适量直链淀粉树脂，上柱，制备蛋白纯化层析柱，并采用5倍柱体积的过柱缓冲液Buffer C平衡树脂柱3次，上清裂解液与直链淀粉树脂4℃结合6h，控制流速，并将流穿液重复上柱结合1～2次；然后用15倍柱体积的过柱缓冲液Buffer C洗涤杂蛋白，最后用8倍柱体积的10mmoL/L的麦芽糖缓冲液洗脱目的蛋白，收集流穿液，测定各流穿液OD280值，SDS-PAGE分析，并收集含有目的蛋白的流穿液，PBS缓冲液超滤置换。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物的基因序列如下：
上游引物：5’-CGGAATTCCACCACCACCACCACCATGGTAGCGGT--3’，划下横线处为EcoR I限制性酶切位点；
下游引物5’-AACTGCAGTTACGGGTTCAGCGGCGGATCTTTC-3’，划下横线处为Pst I限制性酶切位点。
3.如权利要求1所述的猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(2)中，所述目的片段的大小为1047bp。
4.如权利要求1所述的猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶切的反应体系为40μL：PCR凝胶回收产物或pMAL-C4x空载体各30μL，10×K Buffer 4μL，EcoR I 3μL，Pst I 3μL。
5.如权利要求4所述的猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(3)中，所述连接反应所用的连接酶为T4，连接反应的条件为16℃连接过夜，反应体系：pMAL-C4x载体酶切产物6μL，目的片段酶切产物2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体积为10μL。
6.如权利要求1所述的猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(4)中，所述IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导反应的条件为37℃诱导6h。
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