JP4851937B2 - β2アドレナリン作動性受容体作動薬活性およびムスカリン受容体拮抗薬活性を有する化合物 - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は、β2アドレナリン作動性受容体作動薬活性およびムスカリン受容体拮抗薬活性を有する新規化合物に関する。本発明は、そうした化合物を含む薬学的組成物、そうした化合物を製造するためのプロセスおよび中間体、ならびに肺障害を治療するためにそうした化合物を使用する方法にも関する。
喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの肺障害は、一般には気管支拡張薬で治療される。広く一般に用いられている気管支拡張薬の一類は、アルブテロール、フォルモテロールおよびサルメテロールなどのβ2アドレナリン作動性受容体(アドレナリン受容体)作動薬からなる。これらの化合物は、一般には吸入により投与される。気管支拡張薬のもう1つの類は、イプラトロピウムおよびチオトロピウムなどのムスカリン受容体拮抗薬(抗コリン作動性化合物)からなる。典型的には、これらの化合物も吸入により投与される。
本発明は、β2アドレナリン作動性受容体作動薬活性とムスカリン受容体拮抗薬活性の両方を有することが判明した新規化合物を提供する。こうした化合物は、肺障害を治療するための治療薬として有用であると予想される。本発明の一定の化合物は、ドーパミンD2受容体に対して親和性を有することも判明した。
G1およびG2の一方は、NHを表し、他方は、S、NH、OまたはCH2を表し;
Wは、OまたはNWaを表し;この場合、Waは、水素または(1−4C)アルキルであり;
各R1は、(1−4C)アルキル、(2−4C)アルケニル、(2−4C)アルキニル、(3−6C)シクロアルキル、シアノ、ハロ、−OR1a、−C(O)OR1b、−SR1c、−S(O)R1d、−S(O)2R1eおよび−NR1fR1gから独立して選択され;この場合、R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1fおよびR1gの各々は、独立して、水素、(1−4C)アルキルまたはフェニル−(1−4C)アルキルであり;
各R2は、(1−4C)アルキル、(2−4C)アルケニル、(2−4C)アルキニル、(3−6C)シクロアルキル、シアノ、ハロ、−OR2a、−C(O)OR2b、−SR2c、−S(O)R2d、−S(O)2R2eおよび−NR2fR2gから独立して選択され;この場合、R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2fおよびR2gの各々は、独立して、水素、(1−4C)アルキルまたはフェニル−(1−4C)アルキルであり;
各R3は、(1−4C)アルキル、(2−4C)アルケニル、(2−4C)アルキニル、(3−6C)シクロアルキル、シアノ、ハロ、−OR3a、−C(O)OR3b、−SR3c、−S(O)R3d、−S(O)2R3eおよび−NR3fR3gから独立して選択され;または2個のR3基が、連結して(1−3C)アルキレン、(2−3C)アルケニレンまたはオキシラン−2,3−ジイルを形成し;この場合、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3fおよびR3gの各々は、独立して、水素または(1−4C)アルキルであり;
R4は、4から28個の炭素原子を含有し、ハロ、酸素、窒素および硫黄から独立して選択される1から10個のヘテロ原子を場合によっては含有する二価炭化水素基を表すが、但し、R4が結合している2個の窒素原子間の最短鎖内の隣接原子の数が、4から16の範囲内であることを条件とし;
R5は、水素または(1−4C)アルキルを表し;
R6は、水素またはヒドロキシルを表し;
各R7aおよびR7bは、水素、(1−4C)アルキル、ヒドロキシおよびフルオロから独立して選択され;
aは、0であるか、1から3の整数であり;
bは、0であるか、1から3の整数であり;
cは、0であるか、1から4の整数であり;
dは、0であるか、1から5の整数であり;および
mは、0であるか、1から3の整数である)
の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物もしくは立体異性体に関する。
(a)式1の化合物またはその塩を式2の化合物と反応させる段階;
(b)式3の化合物またはその塩を式4の化合物と反応させる段階;
(c)式5の化合物を式6の化合物と結合させる段階;
(d)R5が水素原子を表す式Iの化合物については、還元剤の存在下で式3の化合物を式7aもしくは7bまたはその水和物と反応させる段階;
(e)還元剤の存在下で式1の化合物を式8の化合物またはその水和物と反応させる段階;
(f)還元剤の存在下で式9の化合物を式10の化合物と反応させる段階;または
(g)還元剤の存在下で式11の化合物またはその水和物を式10の化合物と反応させる段階;ならびにその後、
一切の保護基を除去して、式Iの化合物を形成する段階
を含み、この場合、式1〜11の化合物は、そこで定義するとおりである。
その組成物の側面のうちの1つの側面において、本発明は、式Iの新規化合物またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物もしくは立体異性体に関する。これらの化合物は、1つまたはそれ以上のキラル中心を含むことがあり、従って、そうしたキラル中心が存在する場合、本発明は、他に指示がない限り、ラセミ混合物;純粋な立体異性体(すなわち、エナンチオマーまたはジアステレオマー);立体異性体富化混合物などに関する。特定の立体異性体が、本明細書において示されていない場合、他に指示がなければ、本発明の組成物中に少量の他の立体異性体が存在し得る(但し、全体としてのその組成物の使用効果が、そうした他の異性体の存在により消去されないことを条件とする)ことは、当業者には理解されるであろう。
以下の置換基および値は、本発明の様々な側面および実施形態の代表例を提供するためのものである。これらの代表値は、そうした側面および実施形態をさらに定義および説明するためのものであり、他の実施形態を排除するためのものではなく、本発明の範囲を限定するためのものでもない。これに関連して、特定の値または置換基が好ましいという表現は、特に他の指定がない限り、いかなる点においても本発明から他の値または置換基を排除するためのものではない。
G1が、NHであり、G2が、Sである;
G1が、NHであり、G2が、NHである;
G1が、NHであり、G2が、Oである;
G1が、NHであり、G2が、CH2である;
G1が、Sであり、G2が、NHである;
G1が、Oであり、G2が、NHである;および
G1が、CH2であり、G2が、NHである。
d、e、f、g、hおよびiは、各々、独立して、0および1から選択され;
R4a、R4b、R4cおよびR4dは、各々、独立して、(1−10C)アルキレン、(2−10C)アルケニレンおよび(2−10C)アルキニレンから選択され、この場合、各アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンは、非置換であるか、(1−4C)アルキル、フルオロ、ヒドロキシ、フェニルおよびフェニル(1−4C)−アルキルから独立して選択される1から5個の置換基で置換されており;
A1およびA2は、各々、独立して、(3−7C)シクロアルキレン、(6−10C)アリーレン、−O−(6−10C)アリーレン、(6−10C)アリーレン−O−、(2−9C)ヘテロアリーレン、−O−(2−9C)へテロアリーレン、(2−9C)ヘテロアリーレン−O−および(3−6C)へテロシクレンから選択され、この場合、各シクロアルキレンは、非置換であるか、(1−4C)アルキルから独立して選択される1から4個の置換基で置換されており、および各アリーレン、ヘテロアリーレンまたはヘテロシクレン基は、非置換であるか、ハロ、(1−4C)アルキル、(1−4C)アルコキシ、−S−(1−4C)アルキル、−S(O)−(1−4C)アルキル、−S(O)2−(1−4C)アルキル、−C(O)O(1−4C)アルキル、カルボキシ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから独立して選択される1から4個の置換基で置換されており;
Qは、結合、
Qa、Qb、Qc、Qd、Qe、Qf、Qg、Qh、Qi、QjおよびQkは、各々、独立して、水素、(1−6C)アルキル、A3および(1−4C)アルキレン−A4からなる群より選択され、この場合のアルキル基は、非置換であるか、フルオロ、ヒドロキシおよび(1−4C)アルコキシから独立して選択される1から3個の置換基で置換されており;または窒素原子およびそれらが結合している基R4bもしくはR4cと一緒に、4〜6員アザシクロアルキレン基を形成し;
A3およびA4は、各々、独立して、(3−6C)シクロアルキル、(6−10C)アリール、(2−9C)ヘテロアリールおよび(3−6C)ヘテロシクリルから選択され、この場合、各シクロアルキルは、非置換であるか、(1−4C)アルキルから独立して選択される1から4個の置換基で置換されており、各アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、ハロ、(1−4C)アルキルおよび(1−4C)アルコキシから独立して選択される1から4個の置換基で置換されている)
の二価の基である。
R4aは、(1−10C)アルキレン、例えば−(CH2)−、−(CH2)2−、−(CH2)3であり;A2は、(6−10C)アリーレン、例えばフェン−1,4−イレンもしくははフェン−1,3−イレン、または(2−9C)ヘテロアリーレン、例えばチエン−2,5−イレンもしくはチエン−2,4−イレンであり;ならびにR4dは、(1−10C)アルキレン、例えば−(CH2)−、−(CH2)2−、−(CH2)3−である)
の二価の基である。この実施形態における二価炭化水素基の特定の値の例は、−(CH2)−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−;−(CH2)−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−;−(CH2)2−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)2−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−;−(CH2)2−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−;−(CH2)3−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)3−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−;−(CH2)3−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−;−(CH2)4−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)4−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−および−(CH2)4−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−である。
Qは、−O−または−N(Qk)−であり;Qkは、水素または(1−3C)アルキル、例えばメチルまたはエチルであり;R4aは、(1−10C)アルキレン、例えば、−(CH2)−、−(CH2)2−、−(CH2)3であり;A2は、(6−10C)アリーレン、例えばフェン−1,4−イレンもしくはフェン−1,3−イレン、または(2−9C)ヘテロアリーレン、例えばチエン−2,5−イレンもしくはチエン−2,4−イレンであり;ならびにR4dは、(1−10C)アルキレン、例えば−(CH2)−、−(CH2)2−、−(CH2)3−である)
の二価の基である。この実施形態における二価炭化水素基の特定の値の例は、−(CH2)2−O−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)2−O−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−;−(CH2)2−O−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−;−(CH2)3−O−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)3−O−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−;−(CH2)3−O−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−;−(CH2)2−NH−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)2−NH−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−;−(CH2)2−NH−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−;−(CH2)3−NH−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)−;−(CH2)3−NH−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)2−および−(CH2)3−NH−(フェン−1,4−イレン)−(CH2)3−である。
である。R4についてのこの式において、dおよびgは、1であり、e、f、hおよびiは、0であり;ならびにR4aは、−(CH2)m−であり、R4cは、−(CH2)n−であり、Qは、−C(O)NH−である。mの特定の値は、2または3であり、nの特定の値は、4、5または6である。
である。R4についてのこの式において、d、hおよびiは、1であり、e、fおよびgは、0であり;ならびにR4aは、−(CH2)o−であり、A2は、フェン−1,4−イレンであり、R4dは、−(CH2)p−であり、Qは、−C(O)NH−である。oの特定の値は、2または3であり、pの特定の値は、1または2である。この実施形態において、フェン−1,4−イレン基は、本明細書においてA2について定義するとおり、場合によっては置換されていてもよい。
である。R4についてのこの式において、d、g、hおよびiは、1であり、eおよびfは、0であり;ならびにR4aは、−(CH2)q−であり、R4cは、−(CH2)r−であり、A2は、1,4−フェニレンであり、R4dは、−(CH2)s−であり、Qは、−C(O)NH−である。qの特定の値は、2または3であり、rの特定の値は、1または2であり、sの特定の値は、1または2である。この実施形態において、フェン−1,4−イレン基は、本明細書においてA2について定義するとおり、場合によっては置換されていてもよい。
である。R4についてのこの式において、dおよびgは、1であり、e、f、hおよびiは、0であり;ならびにR4aは、−(CH2)t−であり、R4cは、−(CH2)u−であり、Qは、−NHC(O)−である。tの特定の値は、2または3であり、uの特定の値は、4、5または6である。
である。R4についてのこの式において、d、hおよびiは、1であり、e、fおよびgは、0であり;ならびにR4aは、−(CH2)v−であり、A2は、1,4−フェニレンであり、R4dは、−(CH2)w−であり、Qは、−NHC(O)−である。vの特定の値は、2または3であり、wの特定の値は、1または2である。この実施形態において、フェン−1,4−イレン基は、本明細書においてA2について定義するとおり、場合によっては置換されていてもよい。
である。R4についてのこの式において、d、g、hおよびiは、1であり、eおよびfは、0であり;ならびにR4aは、−(CH2)x−であり、R4cは、−(CH2)y−であり、A2は、1,4−フェニレンであり、R4dは、−(CH2)z−であり、Qは、−NHC(O)−である。xの特定の値は、2または3であり、yの特定の値は、1または2であり、zの特定の値は、1または2である。この実施形態において、フェン−1,4−イレン基は、本明細書においてA2について定義するとおり、場合によっては置換されていてもよい。
−(CH2)7−;
−(CH2)8−;
−(CH2)9−;
−(CH2)10−;
−(CH2)11−;
−(CH2)2C(O)NH(CH2)5−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(CH2)5−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2NHC(O)(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2NHC(O)NH(CH2)5−;
−(CH2)3NHC(O)NH(CH2)5−;
−(CH2)2C(O)NHCH2(シクロヘクス−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)(シクロペント−1,3−イレン)−;
−(CH2)2NHC(O)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
1−[−(CH2)2C(O)](ピペリジン−4−イル)(CH2)2−;
−(CH2)2NHC(O)NH(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)(シス−シクロペント−1,3−イレン)−;
−(CH2)2NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
1−[−(CH2)2NHC(O)](ピペリジン−4−イル)(CH2)2−;
−CH2(フェン−1,4−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)CH2−;
(CH2)2C(O)NHCH2(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NHCH2(ピリド−2,6−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(シス−シクロヘクス−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)(シス−シクロペント−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)C*H(CH3)−((S)−異性体);
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)C*H(CH3)−((R)−異性体);
2−[(S)−(−CH2−](ピロリジン−1−イル)C(O)(CH2)4−;
2−[(S)−(−CH2−](ピロリジン−1−イル)C(O)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(4−クロロフェン−1,3−イレン)CH2−;
−CH2(2−フルオロフェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(4−メチルフェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(6−クロロフェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−クロロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2,6−ジクロロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)NHCH2(フェン−1,3−イレン)CH2−;
4−[−CH2−](ピペリジン−1−イル)C(O)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(CH2CH3)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
1−[−(CH2)2NHC(O)](ピペリジン−4−イル)−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2NHC(O)(チエン−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(3−ニトロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)−;
1−[−CH2(2−フルオロフェン−1,3−イレン)CH2](ピペリジン−4−イル)−;
5−[−(CH2)2NHC(O)](ピリド−2−イル)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)3(チエン−2,5−イレン)(CH2)3−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−CH2(フェン−1,2−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
1−[−CH2(2−フルオロフェン−1,3−イレン)CH2](ピペリジン−4−イル)(CH2)2−;
1−[−CH2(2−フルオロフェン−1,3−イレン)CH2](ピペリジン−4−イル)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(3−クロロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−(CF3O−)フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)3(フェン−1,3−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2S(O)2NH(CH2)5−;
−CH2(フェン−1,3−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−ヨードフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−クロロ−5−メトキシフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−クロロ−6−メチルフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)S(O)2(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−ブロモフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)3(フェン−1,4−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)3(フェン−1,2−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
1−[−CH2(2−フルオロフェン−1,3−イレン)CH2](ピペリジン−4−イル)(CH2)3−;
−(CH2)2C(O)NH(2−メトキシフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)5NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
4−[−(CH2)2−](ピペリジン−1−イル)(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)CH(CH3)CH2−;
−(CH2)2−(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−フルオロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,3−イレン)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2C(O)NH(2,5−ジフルオロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
1−[−CH2(ピリド−2,6−イレン)CH2](ピペリジン−4−イル)CH2−;
−(CH2)3NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2NH(ナフト−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)3O(フェン−1,4−イレン)CH2−;
1−[−(CH2)3](ピペリジン−4−イル)CH2−;
4−[−(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)3(フェン−1,4−イレン)NHC(O)(CH2)2−;
−(CH2)3O(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
2−[−(CH2)2](ベンズイミダゾール−5−イル)CH2−;
−(CH2)2−(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(CH2)2−;
−(CH2)2−(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(CH2)4−;
−(CH2)2−(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(CH2)5−;
4−[−(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(CH2)2−;
−(CH2)2NHC(O)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)(CH2)2(シス−シクロヘクス−1,4−イレン)−;
−(CH2)2C(O)NH(2,3,5,6−テトラフルオロフェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2,6−ジヨードフェン−1,4−イレン)CH2−;
4−[−(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(CH2)3−;
4−[−(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(CH2)4−;
4−[−(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(CH2)5−;
−(CH2)2C(O)NHCH2(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)NHCH2(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(2−メチルフェン−1,4−イレン)CH2−;
1−[−(CH2)3O(フェン−1,4−イレン)(CH2)2](ピペリジン−4−イル)CH2−;
−(CH2)2C(O)NHCH2(フェン−1,3−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2O(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)CH2O(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)CH2O(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(フル−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)(チエン−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2O(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)CH2O(フェン−1,2−イレン)CH2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)CH2O(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)CH2O(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(フル−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(チエン−2,5−イレン)CH2−;
4−[(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)CH2O(フェン−1,2−イレン)CH2−;
4−[(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)CH2O(フェン−1,3−イレン)CH2−;
4−[(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)CH2O(フェン−1,4−イレン)CH2−;
4−[(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(フル−2,5−イレン)CH2−;
4−[(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)(チエン−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)CH2O(フェン−1,2−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)CH2O(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)CH2O(フェン−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)(フル−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2(フェン−1,4−イレン)NHC(O)(チエン−2,5−イレン)CH2−;
−(CH2)2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)NHC(O)(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−(CH2)3O(フェン−1,3−イレン)CH2−;
−CH2CH(OH)CH2NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)4NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)CH2NHC(O)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2NHC(O)CH2−;
−(CH2)2C(O)NHCH2(トランス−シクロヘクス−1,4−イレン)CH2−;
−(CH2)2NHC(O)(CH2)5−;
−(CH2)2O(フェン−1,3−イレン)O(CH2)2−;
−(CH2)2O(フェン−1,2−イレン)O(CH2)2−;
−CH2(フェン−1,2−イレン)O(フェン−1,2−イレン)CH2−;
−(CH2)2C(O)NH(CH2)6−;
−(CH2)3(フェン−1,4−イレン)(CH2)3−;
−(CH2)3(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)4(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)3(フラン−2,5−イレン)(CH2)3−;
−(CH2)2N(CH3)C(O)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
4−[−(CH2)2](ピペリジン−1−イル)C(O)NH(フェン−1,4−イレン)(CH2)2−;
−(CH2)3(フェン−1,3−イレン)(CH2)3−;
−(CH2)3(テトラヒドロフラン−2,5−イレン)(CH2)3−;および
−(CH2)2O(フェン−1,4−イレン)C(O)(CH2)2−。
以下の亜属の式および群は、本発明の様々な側面および実施形態の代表例を提供するためのものであり、故に、他に指示がない限り、他の実施形態を排除するためのものではなく、本発明の範囲を限定するためのものでもない。
aが、0であるか、1から3の整数であり;
各R1が、(1−4C)アルキル、(2−4C)アルケニル、(2−4C)アルキニル、(3−6C)シクロアルキル、シアノ、ハロ、−OR1a、−C(O)OR1b、−SR1c、−S(O)R1d、−S(O)2R1eおよび−NR1fR1gから独立して選択され;
R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1fおよびR1gの各々が、独立して、水素または(1−4C)アルキルであり;
bが、0であるか、1から3の整数であり;
各R2が、(1−4C)アルキル、(2−4C)アルケニル、(2−4C)アルキニル、(3−6C)シクロアルキル、シアノ、ハロ、−OR2a、−C(O)OR2b、SR2c、−S(O)R2d、−S(O)2R2eおよび−NR2fR2gから独立して選択され;
R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2fおよびR2gの各々が、独立して、水素または(1−4C)アルキルであり;
Wが、そのピペリジン環の窒素原子を基準にして3または4位に結合しており、およびOまたはNWaを表し;
Waが、水素または(1−4C)アルキルであり;
cが、0であるか、1から4の整数であり;
各R3が、(1−4C)アルキル、(2−4C)アルケニル、(2−4C)アルキニル、(3−6C)シクロアルキル、シアノ、ハロ、−OR3a、−C(O)OR3b、−SR3c、−S(O)R3d、−S(O)2R3eおよび−NR3fR3gからなる群より独立して選択される炭素上の置換基であり;
R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3fおよびR3gの各々が、独立して、水素または(1−4C)アルキルであり;
R4が、式:
d、e、f、g、hおよびiは、各々、独立して、0および1から選択され;
R4a、R4b、R4cおよびR4dは、各々、独立して、(1−10C)アルキレン、(2−10C)アルケニレンおよび(2−10C)アルキニレンからなる群より選択され、この場合、各アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基は、非置換であるか、(1−4C)アルキル、フルオロ、ヒドロキシ、フェニルおよびフェニル(1−4C)−アルキルからなる群より独立して選択される1から5個の置換基で置換されており;
A1およびA2は、各々、独立して、(3−7C)シクロアルキレン、(6−10C)アリーレン、(2−9C)ヘテロアリーレンおよび(3−6C)へテロシクレンから選択され、この場合、各シクロアルキレンは、非置換であるか、(1−4C)アルキルから独立して選択される1から4個の置換基で置換されており、および各アリーレン、ヘテロアリーレンまたはヘテロシクレン基は、非置換であるか、ハロゲン、(1−4C)アルキルおよび(1−4C)アルコキシからなる群より独立して選択される1から4個の置換基で置換されており;
Qは、結合、−O−、−C(O)O−、−OC(O)−、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(Qa)C(O)−、−C(O)N(Qb)−、−N(Qc)S(O)2−、−S(O)2N(Qd)−、−N(Qe)C(O)N(Qf)−、−N(Qg)S(O)2N(Qh)−、−OC(O)N(Qi)−、−N(Qj)C(O)O−および−N(Qk)からなる群より選択され;
Qa、Qb、Qc、Qd、Qe、Qf、Qg、Qh、Qi、QjおよびQkは、各々、独立して、水素、(1−6C)アルキル、A3および(1−4C)アルキレン−A4からなる群より選択され、この場合のアルキル基は、非置換であるか、フルオロ、ヒドロキシおよび(1−4C)アルコキシから独立して選択される1から3個の置換基で置換されており;または窒素原子およびそれらが結合している基R4bもしくはR4cと一緒に、4〜6員アザシクロアルキレン基を形成し;
A3およびA4は、各々、独立して、(3−6C)シクロアルキル、(6−10C)アリール、(2−9C)ヘテロアリールおよび(3−6C)ヘテロシクリルから選択され、この場合、各シクロアルキルは、非置換であるか、(1−4C)アルキルから独立して選択される1から4個の置換基で置換されており、各アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、ハロゲン、(1−4C)アルキルおよび(1−4C)アルコキシから独立して選択される1から4個の置換基で置換されているが、但し、
R4が結合している2個の窒素原子間の最短鎖内の隣接原子の数が、4から14の範囲内であることを条件とし;
R5が、水素または(1−4C)アルキルを表し;
R6が、水素またはヒドロキシルを表し;ならびに
G1およびG2の一方が、NHを表し、他方が、S、NH、OまたはCH2を表す、
式Iaの化合物またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物もしくは立体異性体を包含する。
(a)疾病または医学的状態の発生を予防すること、すなわち、患者の予防的治療;
(b)疾病または医学的状態を改善すること、すなわち、患者における疾病または医学的状態を除去することまたは退行させること;
(c)疾病または医学的状態を抑制すること、すなわち、患者における疾病または医学的状態の発現を遅らせることまたは阻止すること;あるいは
(d)患者における疾病または医学的状態の症状を緩和すること
が含まれる。
本発明の化合物は、以下の一般法および手順を用いて、または当業者に容易に入手できる他の情報を用いて、容易に入手できる出発原料から製造することができる。本明細書では本発明の特定の実施形態を示すまたは説明することになるであろうが、本明細書において説明する方法を使用して、または当業者には周知の他の方法、試薬および出発原料を使用することにより本発明のすべての実施形態および側面を製造できることは、当業者にはわかるであろう。典型的なまたは好ましいプロセス条件(すなわち、反応温度、時間、反応体のモル比、溶媒、圧力など)が与えられている場合でも、別様に述べられていなければ、他のプロセス条件を使用できることも、理解されるであろう。最適な反応条件は、使用される特定の反応体または溶媒に依存して変化し得るが、通常の当業者は、そうした条件を常用の最適化手順によって容易に決めることができる。
(a)式1:
(d)R5が水素原子を表す式Iの化合物については、還元剤の存在下、式3の化合物を式7aもしくは7b:
の化合物と反応させる段階;
(f)式9:
(g)還元剤の存在下、式11:
の化合物またはその水和物を式10の化合物と反応させる段階;ならびにその後、
一切の保護基P1、P2、P3、P4、P5a、P5b、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12またはP13を除去して、式Iの化合物を生じさせる段階;および場合によってはその薬学的に許容される塩を形成する段階
を含むプロセスによって製造することができる。
の化合物の脱保護によって製造することができる。実例として、ベンジル基は、例えば水素またはギ酸アンモニウムおよびVIII族金属触媒、例えば炭素担持パラジウム、を使用する還元により容易に除去することができる。Wが、NWaを表す場合、その水素化反応は、パールマン触媒(すなわち、Pd(OH)2)を使用して適便に行われる。
の化合物を脱保護することによって製造することができる。例えば、t−ブトキシカルボニル基は、トリフルオロ酢酸でその保護化合物を処理することによって除去することができる。
の化合物と反応させることによって製造することができる。典型的に、この反応は、アセトニトリル、DMFまたはそれらの混合物などの不活性希釈剤中、約0℃から約100℃の範囲の温度で、反応が実質的に完了するまで式1の化合物を式16の化合物と接触させることによって行われる。
の化合物と反応させることによって製造することができる。典型的に、この反応は、式3の化合物の製造に用いたものに類似した方法、その後のXQa’中の一切の保護基の除去によって行われる。
の化合物と反応させることによって製造することができる。典型的に、この反応は、式3の化合物の精製に用いたものに類似した方法、その後のXQb’中の一切の保護基の除去によって行われる。
の化合物と反応させることによって製造することができる。
(h)式25:
を含むプロセスによって製造される。
本発明の化合物は、典型的には薬学的組成物または調合物の形態で患者に投与される。こうした薬学的組成物は、吸入投与方式、経口投与方式、経鼻投与方式、局所投与方式(経皮投与方式を含む)および非経口投与形式をはじめとする(しかし、これらに限定されない)、許容されるあらゆる投与経路によって患者に投与することができる。
(調合例A)
吸入による投与のためのドライパウダーは、次のように製造する:
ドライパウダー吸入装置において使用するためのドライパウダー調合物は、次のように製造する:
(代表手順):本発明の超微粉砕化合物のラクトースに対するバルク調合比が1:200である薬学的組成物を製造する。この組成物を、1投薬あたり約10μgと約100μgの間の本発明の化合物を送り出すことができるドライパウダー吸入装置に詰める。
定量噴霧式吸入器での吸入による投与のためのドライパウダーは、次のように製造する:
(代表手順):200mLの脱塩水に溶解した0.2gのレシチンから形成された溶液に、本発明の化合物10gを平均粒径10μm未満の超微粉砕粒子として分散させることにより、5重量%の本発明の化合物および0.1重量%のレシチンを含有する懸濁液を製造する。この懸濁液を噴霧乾燥させ、得られた材料を超微粉砕して、平均直径1.5μm未満を有する粒子にする。それらの粒子を加圧1,1,1,2−テトラフルオロエタンとともにカートリッジに装填する。
定量噴霧式吸入器において使用するための薬学的組成物は、次のように製造する:
(代表手順):100mLの脱塩水に溶解した0.5gのトレハロースおよび0.5gのレシチンから形成されたコロイド溶液に、本発明の化合物5gを平均粒径10m未満の超微粉砕粒子として分散させることによって、5%の本発明の化合物、0.5%のレシチンおよび0.5%のトレハロースを含有する懸濁液を製造する。この懸濁液を噴霧乾燥させ、得られた材料を超微粉砕して、平均直径1.5μm未満を有する粒子にする。それらの粒子を加圧1,1,1,2−テトラフルオロエタンとともにキャニスタに装填する。
ネブライザ吸入器において使用するための薬学的組成物は、次のように製造する:
(代表手順):ネブライザにおいて使用するための水性エーロゾル調合物は、クエン酸で酸性化した1mLの0.9%塩化ナトリウム溶液に0.1mgの本発明の化合物を溶解することによって製造する。この混合物を攪拌し、活性成分が溶解するまで超音波処理する。NaOHをゆっくりと添加することにより、この溶液のpHを3から8の範囲の値に調整する。
経口投与用の硬質ゼラチンカプセルは、次のように製造する:
経口投与用の懸濁液は、次のように製造する:
注射用調合物は、次のように製造する:
本発明の化合物は、β2アドレナリン作動性受容体作動薬活性とムスカリン受容体拮抗薬活性の両方を有し、そのためこうした化合物は、β2アドレナリン作動性受容体またはムスカリン受容体によって媒介される医学的状態、すなわちβ2アドレナリン作動性受容体作動薬またはムスカリン受容体拮抗薬での治療により改善される医学的状態、の治療に有用であると予想される。こうした医学的状態には、例として、可逆性気道閉塞を随伴する肺障害または疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(例えば、慢性で喘鳴を伴う気管支炎および気腫)、喘息、肺線維症などが挙げられる。治療することができる他の状態には、早産、うつ病、うっ血性心不全、皮膚病(例えば、炎症性、アレルギー性、乾癬性および増殖性皮膚病)、消化酸度を低下させることが望ましい状態(例えば、消化性、胃潰瘍形成)ならびに筋肉消耗病が挙げれる。
AC アデニリルシクラーゼ
Ach アセチルコリン
ATCC 米国微生物系統保存機関
BSA ウシ血清アルブミン
cAMP 3’−5’サイクリックアデノシン一リン酸
CHO チャイニーズハムスター卵巣
cM5 クローン化チンパンジーM5受容体
DCM ジクロロメタン(すなわち、塩化メチレン)
DIPEA N,N−ジイソプロピルエチルアミン
dPBS ダルベッコリン酸緩衝食塩水
DMEM ダルベッコ変性イーグル培地
DMSO ジメチルスルホキシド
EDTA エチレンジアミン四酢酸
Emax 最大有効度
EtOAc 酢酸エチル
EtOH エタノール
FBS ウシ胎仔血清
FLIPR 蛍光イメージングプレートリーダー
Gly グリシン
HATU ヘキサフルオロリン酸O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’−N’−テトラメチルウロニウム)
HBSS ハンクス緩衝食塩水
HEK ヒト胎児腎細胞
HEPES 4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペリジンエタンスルホン酸
hM1 クローン化ヒトM1受容体
hM2 クローン化ヒトM2受容体
hM3 クローン化ヒトM3受容体
hM4 クローン化ヒトM4受容体
hM5 クローン化ヒトM5受容体
HPLC 高性能液体クロマトグラフィー
IBMX 3−イソブチル−1−メチルキサンチン
%Eff %有効度
PBS リン酸緩衝食塩水
PyBOP ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリピロリジノホスホニウム
rpm 毎分回転数
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン。
(実施例1)
ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{9−[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)−エチルアミノ]ノニル}ピペリジン−4−イルエステル・ビス(トリフルオロ酢酸)塩
(段階1 − ビフェニル−2−イルカルバミン酸ピペリジン−4−イルエステル)
ビフェニル−2−イソシアネート(97.5g、521mmol)および4−ヒドロキシ−1−ベンジルピペリジン(105g、549mmol)、両方ともウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrichから市販されている、を70℃で12時間、共に加熱し、この間、ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−ベンジルピペリジン−4−イルエステルの形成をLCMSによりモニターした。その後、その反応混合物を50℃に冷却し、エタノール(1L)を添加し、その後、6Mの塩酸(191mL)をゆっくりと添加した。その後、その反応混合物を周囲温度に冷却し、ギ酸アンモニウム(98.5g、1.56mol)を添加し、その溶液を20分間、窒素ガスで激しくバブリングした。その後、パラジウム(活性炭担持10重量%(乾燥基準))(20g)を添加した。その反応混合物を40℃で12時間加熱し、その後、Celiteのパッドに通して濾過した。その後、溶媒を減圧下で除去し、1Mの塩酸(40mL)をその粗製残留物に添加した。水酸化ナトリウム(10N)を添加して、pHを12に調整した。水性層を酢酸エチル(2x150mL)で抽出し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、その後、減圧下で溶媒を除去して、表題化合物(155g、収率100%)を得た。
アセトニトリル(100mL)中のビフェニル−2−イルカルバミン酸ピペリジン−4−イルエステル(5g、16.9mmol)、9−ブロモ−1−ノナノール(4.9g、22mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(8.8mL、50.7mmol)の溶液を12時間、60℃に加熱した。この反応混合物を冷却し、濃縮乾固した。残留物をジクロロメタン(50mL)に溶解し、この溶液を0.05N HCl(50mL)およびブラインで洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させて、表題化合物(6g、収率81%)を生じさせ、それをさらに精製せずに次の段階で使用した。
ジクロロメタン(100mL)中の段階2の生成物(6g、13.7mmol)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(7.15m、41.1mmol)およびジメチルスルホキシド(20mL)の溶液を0℃に冷却した。15分後、その冷却反応混合物にピリジン・三酸化硫黄(6.54g、41.1mmol)を2回で添加した。0℃で2時間後、水(50mL)で反応を停止させた。その後、有機層を水(3x50mL)で洗浄して、表題化合物(5.8g)を生じさせ、それをさらに精製せずに次の段階で使用した。
(a)7−アセトニトリル−2,4−ジメトキシベンゾチアゾール
表題化合物は、J.Weinstock et al.,J.Med.Chem.,1987,30,1166−1176に記載されている手順を用いて調製した。Weinstockの1172頁の手順に従い、および2−メトキシ−5−メチルフェニルチオ尿素(Lancaster Synthesis,Ltd., Windham, New Hampshire)を使用し、2,4−ジメトキシベンゾチアゾール−7−アセトニトリルの合成を次のように少々変更して表題化合物を調製した:(1)2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(Aldrich, Milwaukee, WI)を過酸化ベンゾイルの代わりに用い、(2)その反応混合物を150−Wのタングステンランプで照射する代わりに窒素下で30分還流させ、その後、その反応混合物を10℃に冷却し、濾過した。
表題化合物は、J.Weinstock et al.,J.Med.Chem.,1987,30,1166−1176の1173頁に記載されている手順を用いて調製した。
段階3の生成物(91mg、0.35mmol)を、ジクロロメタン(1.75mL)中の段階4(153mg、0.35mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.061mL、0.35mmol)の混合物に添加し、得られた混合物を室温で2時間攪拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(88mg、0.42mmol)を添加し、その混合物を室温で12時間攪拌した。この時、LCMS(10−90)分析により反応の完了が判定された。その後、この反応混合物を6N塩化アンモニウム溶液(2mL)で反応停止させ、有機層を分離した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物(145mg)を得た。
ジクロロメタン(1mL)中の段階5の生成物(138mg、0.21mmol)の溶液を−10℃に冷却し、ジクロロメタン(1.1mL)中の10M三臭化ホウ素を添加した。10分後、氷浴を取り外し、その反応混合物を放置してゆっくりと室温に温めた。3時間後、MS分析により反応の完了が判定された。その後、この反応混合物をメタノール(1mL)で反応停止させ、真空下で濃縮した。残留物をHPLC(5−35)によって精製して、表題化合物(9.8mg、純度98%)を得た。
(実施例2)
ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−{[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)エチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル)エチル]−ピペリジン−4−イルエステル・ビス(トリフルオロ酢酸)塩
(段階1 − N−(4−ヒドロキシエメチルフェニル)アクリルアミド)
p−アミノベンジルアルコール(12.31g、100mmol)を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(35mL、200mmol)を含有する、ジクロロメタン(200mL)とテトラヒドロフラン(20mL)の混合物に溶解した。その後、得られた均質溶液を0℃に冷却し、反応混合物の内部温度を20℃未満に保ちながら30分間にわたって塩化アクリロイル(8.2mL、100mmol)を一滴ずつ添加した。その反応混合物を0℃で約60分間攪拌した。反応混合物を氷冷1M塩酸(0.6L)に注入し、有機層を分離し、蒸発乾固させて、主としてビスアシル化副生成物からなる粗製材料(5g)を得た。その後、その酸性水性層を酢酸エチル(2x200mL)で抽出し、酢酸エチル層を併せ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を生じさせた。その残留物を酢酸エチルと粉砕することによって表題化合物(10.5g、純度98.5%)を生じさせた。ジクロロメタン層から得た粗製材料の粉砕により、追加2gの表題化合物を得た。
段階1の生成物(10g、57mmol)および実施例1の段階1からのビフェニル−2−イルカルバミン酸ピペリジン−4−イルエステル(17.8g、60mmol)をメタノール(100mL)とジクロロメタン(100mL)の混合物に溶解し、得られた混合物を18時間、55℃で加熱した(還流)。その後、溶媒の大部分を減圧下で除去し、得られた残留物を酢酸エチル(200mL)と粉砕して固体を得、それを濾過によって単離した。その固体を真空下で乾燥させて、表題化合物(25g)を得た。
段階2の生成物(20g、42.3mmol)を、DMSO(18mL,254mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(37mL、211.5mmol)を含有する無水ジクロロメタン(200mL)に溶解した。得られた均質溶液を−20℃に冷却し、その後、反応混合物の内部温度を−10℃未満に維持しながら、30分にわたって三酸化硫黄・ピリジン複合体(20.2g)を少しずつ添加した。その後、この反応混合物を−10℃で約30分間攪拌した。その後、その反応混合物を1M塩酸(100mL)と水(500mL)の氷冷混合物(この混合物は、約6のpHを有した)に注入した。その混合物をジクロロメタン(300mL)で抽出し、ジクロロメタン層をブライン(200mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。溶媒を除去している間に多少の沈殿が観察された。生じた濃厚スラリーに酢酸エチル(100mL)を添加した。生じた固体を濾過によって単離し、真空下で乾燥せて、表題化合物(11g、HPLCによる純度99%)を得た。減圧下でスラリー溶媒を除去して、追加の固体得、それを濾過によって単離し、真空下で乾燥させて表題化合物(5.4g、HPLCによる純度96%)を得た。
段階3の生成物(163mg、0.35mmol)を、ジクロロメタン(1.75mL)中の実施例1、段階4の生成物(100mg、0.38mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.067mL、0.38mmol)の混合物に添加し、得られた混合物を室温で2時間攪拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(122mg、0.58mmol)を添加し、得られた混合物を室温で約2時間、攪拌した。この反応混合物を6N塩化アンモニウム(2mL)で反応停止させ、有機層を分離した。その有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、表題化合物を固体(127mg)として得た。
ジクロロメタン(1mL)中の段階4の生成物(127mg、0.19mmol)の溶液を−10℃に冷却し、ジクロロメタン(0.94mL)中の三臭化ホウ素の1M溶液を添加した。10分後、氷浴を取り外し、その反応混合物を放置してゆっくりと室温に温めた。3時間後、MS分析により反応の完了が判定された。この反応混合物を、メタノール(1mL)をゆっくりと添加することにより反応停止させ、その後、真空下で濃縮した。その後、HPLC(5−35)を使用してその残留物を精製して、表題化合物を粉末として得た(11.7mg、純度98%)。
3−[4−(3−ビフェニル−2−イルウレイド)ピペリジン−1−イル]−N−(4−{[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)エチルアミノ]メチル}−フェニル)プロピオンアミド
(段階1 − N−1,1’−ビフェニル−2−イル−N’−4−ピペリジニル尿素)
(a)N−1,1’−ビフェニル−2−イル−N’−4−(1−ベンジル)ピペリジニル尿素
ビフェニル−2−イソシアネート(50g、256mmol)を周囲温度でアセトニトリル(400mL)に溶解した。0℃で冷却後、アセトニトリル(400mL)中の4−アミノ−N−ベンジルピペリジン(48.8g、256mmol)の溶液を5分にわたって添加した。直ちに沈殿が観察された。15分後、アセトニトリル(600mL)を添加し、得られた粘稠混合物を12時間、35℃で攪拌した。固体を濾過し、冷アセトニトリルで洗浄し、その後、真空下で乾燥させて、表題化合物(100g、収率98%)を得た。
段階(a)の生成物(20g、52mmol)を無水メタノールと無水DMFの混合物(3:1 v/v、800mL)に溶解した。塩酸水溶液(0.75mLの37%濃縮溶液、7.6mmol)を添加し、その溶液を20分間、窒素ガスで激しくバブリングした。パールマン触媒(Pd(OH)2、5g)を窒素流下で添加した後、その反応混合物を水素雰囲気(バルーン)下に置いた。反応混合物を4日間、攪拌させておき、その後、Celiteのパッドに2回通して、触媒を除去した。その後、減圧下で溶媒を除去して、表題化合物(13g、収率85%)を得た。
(a)2−(4−ニトロフェニル)−[1,3]−ジオキソラン
ディーン・スターク装置、還流冷却器および攪拌機を装着した三つ口丸底フラスコ内で、p−ニトロベンズアルデヒド(101.5g、672mmol)、エチレングリコール(112mL、2.0mol)およびp−トルエンスルホン酸(12.8g、67.2mmol、10%mol)をトルエン(800mL)に懸濁させ、その後、120℃で4時間加熱した。この反応混合物を室温に冷却し、トルエンを減圧下で除去した。重炭酸ナトリウム飽和水溶液(800mL)を添加し、得られたスラリーを室温で15分間攪拌し、その後、濾過し、真空下で乾燥させて、表題化合物(121.8g)を固体として得た。
段階(a)の生成物(10g、51mmol)を、テトラヒドロフラン(50mL)とエタノール(50mL)の混合物に溶解し、その後、酸化白金触媒(PtO2)(116mg、0.51mmol)を使用して18時間、50psiで水素化した。この反応混合物をCeliteに通して濾過し、その後、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物(8g)を得、それをさらに精製せずに次の段階で使用した。
段階(b)の生成物(8g、48.5mmol)およびトリエチルアミン(10.1mL、72.75mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解した。得られた均質溶液を0℃に冷却し、塩化アクリロイル(4.81mL、58.2mmol)を一滴ずつ添加した。この反応混合物を0℃で1時間攪拌し、その後、水(100mL)で反応停止させた。有機層を水(50mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、ジクロロメタンの大部分を除去した。酢酸エチル(100mL)をその残留物に添加し、生じた沈殿を濾過によって回収し、その後、真空下で乾燥させて、表題化合物(8.5g)を得た。
段階1の生成物(543mg、1mmol)を、メタノール(3mL)とジクロロメタン(3mL)中の段階2の生成物(385mg、1.7mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を加熱して12時間還流させた。その後、この反応混合物を冷却し、真空下で濃縮した。残留物を酢酸エチルと粉砕し、生じた沈殿を濾過によって単離して、表題化合物(731mg)を固体として得た。
メタノール中の段階3の生成物(731mg、1.4mmol)の溶液に1M塩酸(2mL)を添加し、得られた混合物を室温で2時間、攪拌した。その後、この粗製反応混合物を真空下で濃縮し、その後、ジクロロメタンで希釈した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム(2x5mL)で洗浄し、次にブライン(5mL)で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物(600mg)を油として得た。
実施例1、段階4の生成物(131mg、0.58mmol)を、ジクロロメタン(1mL)とメタノール(1mL)の混合物中の段階4の生成物(183mg、0.39mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.102mL、0.58mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を30分間、室温で攪拌した。30分後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(123mg、0.58mmol)を添加し、室温で攪拌を継続した。2時間後、この反応混合物を6N塩化アンモニウム水溶液(2mL)で反応停止させ、有機層を分離した。その有機層を飽和重炭酸ナトリウム(2x5mL)で洗浄し、次にブライン(5mL)で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、その後、真空下で濃縮して、表題化合物(169mg)を固体として得た。
ジクロロメタン(1.2mL)中の段階5からの生成物(169mg、0.25mmol)の溶液を氷/アセトン浴内で冷却した。約10分後、反応混合物を氷/アセトン浴内で攪拌しながらその反応混合物にジクロロメタン(1.2mL)中の三臭化ホウ素の1.0M溶液をゆっくりと添加した。30分後、反応混合物をその氷浴から取り出し、ゆっくりと室温に温めた。15時間後、反応混合物をメタノール(2mL)でゆっくりと反応停止させ、真空下で濃縮した。その反応物を小規模HPLCで精製して、表題化合物(8.7mg、純度71%)を得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−{2−[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)エチルアミノ]エチル}フェニルカルバモイル)エチル]−ピペリジン−4−イルエステル・ビス(トリフルオロ酢酸)塩)
(段階1 − 3−[(4−ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)ピペリジン−1−イル]プロピオン酸)
(a)3−[(4−ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)ピペリジン−1−イル]プロピオン酸メチル
3−ブロモプロピオン酸メチル(553μL、5.07mmol)を、50℃でアセトニトリル(34mL)中の実施例1、段階1からの生成物(1.00g、3.38mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(1.76mL、10.1mmol)の攪拌溶液に添加し、その反応混合物を50℃で一晩、加熱した。その後、減圧下で溶媒を除去し、残留物をジクロロメタン(30mL)に溶解した。得られた溶液を重炭酸ナトリウム飽和水溶液(10mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その粗製残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物(905mg、収率70%)を得た。
テトラヒドロフラン(12mL)と水(12mL)の50%混合物中の段階(a)の生成物(902mg、2.37mmol)および水酸化リチウム(171mg、7.11mmol)の攪拌溶液を30℃で一晩加熱し、その後、濃塩酸で酸性化した。得られた混合物を凍結乾燥させて、表題化合物(収率〜100%、多少、塩化リチウムを含有)を得た。
4−アミノフェネチルアルコール(0.092mg、0.67mmol)(Sigma Aldrich)を、N,N−ジメチルホルムアミド(3.3mL)中の段階1の生成物(226mg、0.61mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.161mL、0.67mmol)の溶液に添加した。得られた混合物を室温で45分間、攪拌した。その後、HATU(257mg、0.67mmol)を添加し、その反応混合物を室温で12時間攪拌した。その後、反応混合物を真空下でその容量の半分に濃縮し、その後、ジクロロメタンで希釈した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム(2x5mL)で洗浄し、次にブライン(5mL)で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物(299mg)を得た。
ジクロロメタン(3mL)中の段階2の生成物(295mg、0.61mmol)の溶液を氷/水浴内で−5℃に冷却した。ジメチルスルホキシド(0.258mL、0.36mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.316mL、1.8mmol)を添加し、その反応混合物を10分間、−5℃で攪拌した。その後、反応混合物の温度を−5℃に維持しつつ、攪拌しながらピリジン・三酸化硫黄複合体(289mg、1.8mmol)を添加した。2時間後、MS分析により判定したところ、反応は完了していた。その後、この反応混合物を水(5mL)で反応停止させ、有機層を水(3x5mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物(176mg)を固体として得た。
段階3の生成物(176mg、0.36mmol)を、ジクロロメタン(2mL)中の実施例1、段階4の生成物(106mg、0.47mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を室温で1時間攪拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(84mg、0.40mmol)を添加し、得られた混合物を室温で約2時間、攪拌した。この反応混合物を6N塩化アンモニウム(5mL)で反応停止させた。有機層を分離し、飽和重炭酸ナトリウム(2x5mL)で洗浄し、次にブライン(5mL)で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物を固体(207mg)として得た。
ジクロロメタン(1.5mL)中の段階4の生成物(207mg、0.30mmol)の溶液を氷/水浴内で5℃に冷却した。約10分後、ジクロロメタン(0.90mL、0.90mmol)中の三臭化ホウ素の1.0M溶液をその反応混合物に添加した。約5.5時間後、氷浴から反応混合物を取り出し、室温で攪拌した。12時間後、その反応混合物を濃縮乾固し、HPLCによって精製して、表題化合物(8mg、純度99%)をビス(トリフルオロ酢酸)塩として得た。
(N−1,1’−ビフェニル−2−イル−N’−4−[1−(9−ヒドロキシノニル)]ピペリジニル尿素)
9−ブロモ−1−ノナノール(4.84g、21.7mmol)を、50℃でアセトニトリル(99mL)中の実施例3、段階1の生成物(5.8g、19.7mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(10.29mL、59.1mmol)の攪拌溶液に添加した。この反応混合物を50℃で8時間加熱した。その後、反応混合物を放置して冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタン(100mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(2x50mL)で洗浄し、乾燥させた(硫酸マグネシウム)。減圧下で溶媒を除去した。その粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール:アンモニア系)によって精製して、表題化合物(7.1g、16.2mmol、収率82%)を生じさせた。
(N−1,1’−ビフェニル−2−イル−N’−4−[1−(9−オキソノニル)]ピペリジニル尿素)
ジメチルスルホキシド(490μL、6.9mmol)、続いてジイソプロピルエチルアミン(324μL、3.45mmol)を、−10℃、窒素雰囲気下で、ジクロロメタン(11.5mL)中の調製1の生成物(500mg、1.15mmol)の溶液に添加した。この反応混合物を−15℃で15分間攪拌し、その後、三酸化臭素・ピリジン複合体を少しずつ添加した(549mg、3.45mmol)。この反応混合物を−15℃で1時間攪拌し、その後、水(10mL)を添加した。その後、有機相を分離し、水(10mL)で洗浄し、乾燥させた(硫酸マグネシウム)。減圧下で溶媒を除去して、表題化合物(475mg、1.09mmol、収率95%)を得た。
(N,N−(ジ−t−ブトキシカルボニル)−9−ブロモノニルアミン)
N,N−ジメチルホルムアミド(0.28mL)中のジ−t−ブトキシカルボニルアミン(3.15g、14.5mmol)の溶液を約10分間、0℃に冷却した。水素化ナトリウム、鉱物油中60%(0.58g、14.5mmol)を添加し、その反応混合物を0℃で10分間、攪拌した。反応混合物を氷浴から取り出し、30分間、放置して室温に温めた。その後、この反応混合物を冷却して0℃に戻し、ジメチルホルムアミド(100mL)中の1,9−ジブロモノナン(2.46mL、12.1mmol)の溶液を添加した。その反応混合物を一晩、室温で攪拌した。24時間後、MS分析は、反応が完了していることを示した。この反応混合物を濃縮乾固し、酢酸エチル(100mL)で希釈した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム(2x100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、減圧下で濃縮して、粗製生成物を生じさせ、それを、ヘキサン中の5%酢酸エチルを使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た。
(ビフェニル−2−カルバミン酸1−(9−ジ−t−ブトキシカルボニルアミノ)ノニル]ピペリジン−4−イルエステル)
アセトニトリルとN,N−ジメチルホルムアミド(1:1)の混合物(50mL)を、実施例1、段階1の生成物(3.0g、10.1mmol)、調製3の生成物(5.1g、12.2mmol)およびトリエチルアミン(1.42mL、10.1mmol)に添加した。この反応混合物を周囲温度で24時間攪拌し、LCMS分析によりモニターした。その後、その反応混合物を濃縮し、酢酸エチル(50mL)で希釈した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム(2x50mL)およびブライン(50mL)で洗浄した。その後、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、6.5gの粗製油を生じさせた。この油を、1:1 ヘキサン/酢酸エチルを使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物(3g)を生じさせた。
(ビフェニル−2−カルバミン酸1−(9−アミノノニル)ピペリジン−4−イルエステル)
トリフルオロ酢酸(11mL)を、ジクロロメタン(56mL)中の調製4の生成物(7.2g、11.3mmol)の溶液に添加した。2時間後、LCMS分析は、反応が完了していることを示した。その後、この反応混合物を濃縮乾固し、酢酸エチル(75mL)で希釈した。その後、混合物のpHが14に達するまで、水酸化ナトリウム(1N)を添加した。その後、有機相を回収し、飽和重炭酸ナトリウム(2x50mL)およびブライン(50mL)で洗浄した。その後、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物(5.5g)を生じさせた。
(ビフェニル−2−カルバミン酸1−(9−オキソノニル)ピペリジン−4−イルエステル)
((a)9−ブロモノナナール)
マグネチックスターラー、添加漏斗および温度調節器を装着した100mL丸底フラスコに、窒素下で、9−ブロモノナノール(8.92g、40mmol)およびジクロロメタン(30mL)を添加した。得られた混合物を5℃に冷却し、水(10mL)中の重炭酸ナトリウム(0.47g、5.6mmol)および臭化カリウム(0.48g、4mmol)の溶液を添加した。2,2,6,6−テトラメチル−1−ピペリジニルオキシフリーラジカル(TEMPO)(63mg、0.4mmol)を添加し、その後、氷冷浴で温度を約8℃(+/−2℃)に維持するような速度で、添加漏斗により、10から13%漂白液(27mL)を(約40分かけて)一滴ずつ添加した。漂白液の添加完了後、温度を約0℃に維持しながらその混合物を30分間攪拌した。水(10mL)中の重亜硫酸ナトリウム(1.54g)の溶液を添加し、得られた混合物を室温で30分間攪拌した。その後、その混合物の層を分離し、乳白色の水性層をジクロロメタン(1x20mL)で抽出した。その後、併せたジクロロメタン層を水(1x30mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧下で濃縮して、表題中間体(8.3g、収率94%)を得、それをさらに精製せずに次の段階で使用した。
100mLの丸底フラスコに、9−ブロモノナナール(7.2g、32.5mmol)、メタノール(30mL)およびオルトギ酸トリメチル(4mL、36.5mmol)を添加した。ジオキサン中の4N塩酸の溶液(0.2mL、0.8mmol)を添加し、得られた混合物を3時間、還流させた。その後、この反応混合物を室温に冷却し、固体重炭酸ナトリウム(100mg、1.2mmol)を添加した。得られた混合物を減圧下でその元の容量の4分の1に濃縮し、その後、酢酸エチル(50mL)を添加した。有機層を水(2x40mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧下で濃縮して、表題中間体(8.44g(収率97%))を液体として得、それをさらに精製せずに次の段階でセ使用した。
50mL三つ口丸底フラスコに、ビフェニル−2−イルカルバミン酸ピペリジン−4−イルエステル(1g、3.38mmol)およびアセトニトリル(10mL)を添加して、スラリーを作った。このスラリーに、9−ブロモ−1,1−ジメトキシノナン(1.1g、1.3mmol)およびトリエチルアミン(0.57g、4.1mmol)を添加し、得られた混合物を65℃で6時間加熱した(出発原料が5%未満になるまでHPLCにより反応をモニターした)。その後、この反応混合物を室温に冷却し、この時、混合物は、濃厚スラリーになった。水(5mL)を添加し、その混合物を濾過して、目の粗いガラスフィルタで固体を回収した。この固体を、アセトニトリル(10mL)と水(5mL)の予混合溶液で洗浄し、その後、アセトニトリル(10mL)と水(2mL)の別の予混合溶液で洗浄した。得られた固体を空気乾燥させて、表題中間体(1.37g、84%、LC,1H NMRにより純度>96%)を白色の固体として得た。
マグネチックスターラーを具備する500mL丸底フラスコにビフェニル−2−イルカルバミン酸1−(9,9−ジメトキシノニル)ピペリジン−4−イルエステル(7.7g、15.9mmol)を添加し、その後、アセトニトリル(70mL)および1M塩酸水溶液(70mL)を添加した。得られた混合物を室温で1時間攪拌し、その後、ジクロロメタン(200mL)を添加した。その後、この混合物を15分間攪拌し、その後、層を分離した。有機層を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、減圧下で濃縮して、表題中間体(6.8g)を得た。
(2−(N−ベンジルオキシカルボニル−N−メチルアミノ)エタナール)
((a) 2−(N−ベンジルオキシカルボニル−N−メチルアミノ)エタノール)
THF(20mL)中のクロロギ酸ベンジル(19g、111.1mmol)を、0℃でTHF(100mL)および炭酸ナトリウム水溶液(100mL)中の2−(メチルアミノ)エタノール(10g、133.3mmol)の攪拌溶液に15分かけて1滴ずつ添加した。その反応混合物を0℃で12時間攪拌し、その後、EtOAc(2x200mL)で抽出した。有機層を炭酸ナトリウム水溶液(200mL)で洗浄し、乾燥させ(炭酸カリウム)、減圧下で溶媒を除去して、表題化合物(22.5g、収率97%)を得た。
DMSO(71mL、1mol)およびDIPEA(87.1mL、0.5mol)を、−10℃でジクロロメタン(200mL)中の段階(a)の生成物(20.9g、0.1mol)の攪拌溶液に添加した。この反応混合物を−10℃で15分間攪拌し、その後、三酸化硫黄・ピリジン複合体(79.6g、0.5mol)を添加し、得られた混合物を1時間攪拌した。この反応混合物を1M塩酸(200mL)の添加で反応停止させた。有機層を分離し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(炭酸カリウム)、減圧下で溶媒を除去して、表題化合物(20.7g、収率〜100%)を得た。
(ビフェニル−2−カルバミン酸1−[2−(メチルアミノ)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
MeOH(200mL)中の調製7の生成物(20.7g、100mmol)および実施例1、段階1の生成物(25g、84.7mmol)の攪拌溶液に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(21.2g、100mmol)を添加した。この反応混合物を12時間、周囲温度で攪拌し、その後、2M塩酸で反応停止させ、減圧下で溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル(200mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(100mL)およびブライン(50mL)で洗浄し、その後、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、減圧下で溶媒を除去した。この粗製残留物をカラムクロマトグラフィー(50%−90% EtOAc/へキサン)によって精製して、ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(ベンジルオキシカルボニル−メチルアミノ)エチル]ピペリジン−4−イルエステルを油として得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{2−[(6−ブロモヘキサノイル)メチルアミノ]エチル}ピペリジン−4−イルエステル)
塩化6−ブロモヘキサノイル(3.23mL、21.1mmol)を、ジクロロメタン(170mL)中の調製8の生成物(6.2g、17.6mmol)およびDIPEA(6.13mL、35.2mmol)の攪拌溶液に添加した。この反応混合物を1時間攪拌し、その後、EtOAc(250mL)で希釈し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(2x200mL)およびブライン(200mL)で洗浄し、その後、乾燥させた(硫酸マグネシウム)。減圧下で溶媒を除去して、表題化合物(6.6g、収率73%)を得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−(アミノメチル)フェニルカルバモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
DMF(6.8mL)中の4−(N−t−ブトキシカルボニルアミノメチル)アニリン(756mg、3.4mmol)、実施例4、段階1の生成物(1.5g、4.08mmol)およびHATU(1.55g、4.08mmol)の攪拌溶液に、DIPEA(770μL、4.42mmol)を添加した。この反応混合物を50℃で一晩攪拌し、その後、減圧下で溶媒を除去した。得られた残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(10mL)で洗浄した。その後、有機相を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、減圧下で溶媒を除去した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(5−10%MeOH/DCM)によって精製して固体を得、それをTFA/DCM(25%、30mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。その後、減圧下で溶媒を除去し、その粗製残留物をジクロロメタン(30mL)に溶解し、1N水酸化ナトリウム(15mL)で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、減圧下で溶媒を除去して表題化合物(1.5g、2段階終えて94%)を得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−(2−t−ブトキシカルボニルアミノエチル)ピペリジン−4−イルエステル)
50℃でアセトニトリル(67.6mL)中の実施例1、段階18(2.00g、6.76mmol)およびDIPEA(3.54mL、20.3mmol)の攪拌溶液に、臭化2−t−ブトキシカルボニルアミノエチル(1.82g、8.11mmol)を添加し、その反応混合物を一晩、50℃に加熱した。その後、減圧下で溶媒を除去し、残留物をジクロロメタン(60mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(30mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去した。その粗製残留物をカラムクロマトグラフィー(5%MeOH/DCM)によって精製して、表題化合物を個体として生じさせた(2.32g、収率78%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−(2−アミノエチル)ピペリジン−4−イルエステル)
調製11の生成物をTFA/DCM(25%、52mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、その粗製残留物をジクロロメタン(30mL)に溶解し、1N水酸化ナトリウム(15mL)で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物(1.61g、収率90%)を得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−アミノメチルベンジルアミノ)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
DMF(2mL)中の調製12の生成物(339mg、1mmol)、4−(t−ブトキシカルボニルアミノメチル)安息香酸(301mg、1.2mmol)およびHATU(456mg、1.2mmol)の攪拌溶液に、DIPEA(226μL、1.3mmol)を添加した。この反応混合物を室温で一晩攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(10mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去した。その粗生成物をTFA/DCM(25%、10mL)に溶解し、この混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、その粗製残留物をジクロロメタン(15mL)に溶解し、1N水酸化ナトリウム(5mL)で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得た(472mg、2段階終えて〜100%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−(2−アミノエチル)ピペリジン−4−イルエステル)
臭化2−t−ブトキシカルボニルアミノエチル(1.22g、5.44mmol)を、アセトニトリル(24mL)中の実施例1、段階1の生成物(1.46g、4.95mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(1.03mL、5.94mmol)の溶液に添加した。この反応混合物を65℃で12時間攪拌した。この時、MS分析は、反応が完了していることを示した。その反応混合物を濃縮乾固し、その後、ジクロロメタン(10mL)を添加した。トリフルオロ酢酸をこの混合物に添加し、その混合物を室温で4時間攪拌した。この時、MS分析は、反応が完了していることを示した。その後、この混合物をその容量の半分に濃縮し、pHが14に調整されるまで1N水酸化ナトリウムを添加した。有機層をブラインで洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮して、1.6gの表題化合物を固体として得た。
(1−[1−(9−ベンジルアミノノニル)ピペリジン−4−イル]−3−ビフェニル−2−イル尿素)
N−ベンジルアミン(0.903mL、8.30mmol)を、メタノール(25mL)中の調製2の生成物(2.40g、5.52mmol)の溶液に添加し、得られた反応混合物を周囲温度で攪拌した。10分後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(1.75g、8.30mmol)をこの反応混合物に添加した。反応の進行をHPLC分析によって追跡した。周囲温度で2時間後、水(5mL)で反応を停止させ、その後、真空下でその容量の半分に濃縮した。この反応混合物をジクロロメタン(15mL)で希釈し、1N水酸化ナトリウム(2x10mL)で洗浄し、次にブライン(5mL)で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物を生じさせた。
(2−ベンジルオキシ−5−(2−ブロモアセチル)安息香酸メチルエステル)
((a)2−ベンジルオキシ−5−アセチル安息香酸メチルエステル)
2Lフラスコ内で、5−アセチルサリチル酸メチル(100g、0.515mol)を、還流状態で、窒素雰囲気下、アセトニトリル(1L)に溶解した。15分以上一滴ずつ炭酸カリウム(213.5g、1.545mol)を添加した。添加漏斗を使用し、15分にわたって臭化ベンジル(67.4mL、0.566mol)を添加した。この反応物を9時間、85℃に加熱し、その後、濾過し、アセトニトリル(100mL)ですすいだ。この溶液を減圧下で約300mLの量に濃縮し、水(1L)と酢酸エチル(1L)とで分配した。有機層を飽和塩化ナトリウム(250mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム(75g)を使用して乾燥させ、その後、濾過し、酢酸エチル(100mL)ですすいだ。有機層を濃縮して、2−ベンジルオキシ−5−アセチル安息香酸メチルエステルを固体として得た(収率100%)。
500mLフラスコ内で、窒素雰囲気下、段階(a)の生成物(10.0g、35.2mmol)をクロロホルム(250mL)に溶解した。クロロホルム(50mL)に溶解した臭素(1.63mL、31.7mmol)を、添加漏斗を使用して30分にわたって添加した。この反応混合物を2.5時間攪拌し、その後、濃縮して固体を得た。その固体を穏やかに多少加熱しながらトルエン(150mL)に溶解し、その後、エチルエーテル(150mL)を添加して、表題化合物を結晶質固体として生じさせた(収率55%)。
(5−[2−(ベンジル−{9−[4−(3−ビフェニル−2−イルウレイド)ピペリジン−1−イル]ノニル}アミノ)アセチル]−2−ベンジルオキシ安息香酸メチルエステル)
調製16の生成物(371mg、1.00mmol)を、ジメチルスルホキシド(4.5mL)中の調製15の生成物(448mg、0.85mmol)の溶液に添加し、その後、炭酸カリウム(234mg、1.7mmol)を添加した。この反応混合物を40℃で6時間攪拌した。この時、HPLC分析により、調製15の生成物は、もはや観察されなかった。この反応混合物を周囲温度に冷却し、濾過し、その後、エタノール(4mL)で希釈した。臭化水素酸ナトリウム(63mg、1.7mmol)をこの反応混合物に添加し、反応物を周囲温度で24時間攪拌した。その反応混合物を0.5M塩化アンモニウム(5mL)で反応停止させ、酢酸エチル(2x10mL)で抽出した。併せた有機層を飽和重炭酸ナトリウム(10mL)で洗浄し、次にブライン(5mL)で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。その粗製残留物をシリカゲルでのクロマトグラフィー(クロロホルム中の3%メタノール)によって精製して、表題化合物を得た。
(1−[1−(9−{ベンジル−[2−(4−ベンジルオキシ−3−ヒドロキシメチルフェニル)−2−ヒドロキシエチル]アミノ}ノニル)ピペリジン−4−イル]−3−ビフェニル−2−イル尿素)
テトラヒドロフラン(1.00mL)中の調製17の生成物(163mg、0.20mmol)の溶液を0℃に冷却した。水素化アルミニウムリチウム(THF中1.0M;0.50mL、0.50mmol)をこの混合物に一滴ずつ添加した。1時間後、その反応混合物を水(1mL)で反応停止させ、酢酸エチル(2mL)で希釈した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、有機抽出物を併せ、濃縮して表題化合物を得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{2−[((1R,3S)−3−アミノシクロペンタンカルボニル)アミノ]エチル}ピペリジン−4−イルエステル)
DMF(5mL)中の調製14の生成物(318mg、0.94mmol)、(1R,3S)−3−t−ブトキシカルボニルアミノシクロペンタカルボン酸(258mg、1.1mmol)およびHATU(428mg、1.1mmol)の攪拌溶液に、DIPEA(245μL、1.09mmol)を添加した。この反応混合物を室温で一晩攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(10mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(5−10%MeOH/DCM)によって精製し、その後、トリフルオロ酢酸/DCM混合物(1mL/5mL)に溶解し、室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、1M水酸化ナトリウム(10mL)で洗浄し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減少させて、表題化合物を生じさせた(167mg、収率39%)。
(4−(t−ブトキシカルボニルアミノメチル)−2−クロロフェニルアミン)
ジクロロメタン(30mL)中の4−アミノメチル−2−クロロフェニルアミン(940mL、6mmol)および二炭酸ジ−t−ブチル(1.44g、6.6mmol)の攪拌溶液を室温で4時間攪拌した。この時、LCMSにより反応が完了していると判定された。その後、この反応混合物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液(15mL)で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。得られた橙色の固体を酢酸エチルから再結晶させて、表題中間体を白色の固体として得た(収率〜100%)。
(N−[4−(t−ブトキシカルボニルアミノメチル)−2−クロロフェニル]アクリルアミド)
ジエチルエーテル(35mL)と1M水酸化ナトリウム(35mL)の混合物中の調製20の生成物(1.54g、6.0mmol)の攪拌溶液に、塩化アクリロイル(687μL、8.45mmol)を一滴ずつ添加した。1時間後、有機層を分離し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去して、表題中間体を白色の固体として得た(1.8g、収率98%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−(t−ブトキシカルボニルアミノメチル)−2−クロロフェニルカルバモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
ジクロロメタンとメタノールの混合物(12mL、1:1)中の実施例1、段階1の生成物(1.04g、3.5mmol)および調製21の生成物(1.19g、3.85mmol)の溶液を60℃で12時間加熱した。この反応混合物を放置して冷却し、溶媒を減圧下で除去した。この粗製材料をカラムクロマトグラフィー(5−10%MeOH/DCM)によって精製して、表題中間体を白色の固体として得た(2.00g、収率94%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−アミノメチル−2−クロロフェニルカルバモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
調製22の生成物(2.00g、3.3mmol)の溶液をジクロロメタン(24mL)およびTFA(8mL)中で1時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。この粗製反応混合物をジクロロメタン(30mL)に溶解し、1M水酸化ナトリウム(2x30mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去して、表題中間体を油性白色固体として得た(1.46g、収率88%)。
(2−クロロエタンスルホン酸(5−t−ブトキシカルボニルアミノ)ペンチルアミド)
0℃でジクロロメタン(22mL)中の5−(t−ブトキシカルボニルアミノ)ペンチルアミン(1.00g、4.94mmol)およびトリエチルアミン(689μLg、4.94mmol)の攪拌溶液に、塩化2−クロロ−1−エタンスルホニル(470μL、4.50mmol)を添加した。この反応混合物を2時間、室温で攪拌し、その後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(15mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(収率100%)、それをさらに精製せずに次の段階で使用した。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(5−t−ブトキシカルボニルアミノペンチルスルファモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
ジクロロメタンおよびメタノール(22mL、1:1)中の実施例1、段階1の生成物(1.33g、3.5mmol)および調製24の生成物(1.62g、4.94mmol)の溶液を60℃で5時間加熱した。この反応混合物を放置して室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。この粗製残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(10mL)で洗浄した。その後、有機層を乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去した。その粗製残留物をカラムクロマトグラフィー(5−10%MeOH/DCM)によって精製して、表題中間体を白色の固体として得た(1.6g、55%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(5−アミノペンチルスルファモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
調製25の生成物(1.6g、2.72mmol)をジクロロメタン(21mL)およびTFA(7mL)中で1時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。この粗製反応混合物をジクロロメタン(30mL)に溶解し、1M水酸化ナトリウム(2x30mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、その後、溶媒を減圧下で除去して、表題中間体を油性白色固体として得た(1.19g、収率90%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{2−[(4−ホルミルベンゼンスルホニル)メチルアミノ]エチル}ピペリジン−4−イルエステル)
ジクロロメタン(5mL)中の調製8の生成物(350mg、1mmol)およびトリエチルアミン(167μL、1.2mmol)の攪拌溶液に塩化4−ホルミルベンゼンスルホニル(225mg、1.1mmol)を添加した。室温で1時間後、MSによると反応は完了しており、その後、この反応混合物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液(5mL)で洗浄した。その後、有機層を乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去して、表題中間体を得た(323mg、収率62%)。
(塩酸(3−アミノメチルフェニル)メタノール)
((a)(3−t−ブトキシカルボニルメチルフェニル)メタノール)
ボラン硫化ジメチル(2.05mL、21.6mmol)を、テトラヒドロフラン(24mL)中の3−(t−ブトキシカルボニルアミノメチル)安息香酸(1.81g、7.20mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を室温で3時間攪拌した。その後、この反応混合物を酢酸エチル(20mL)で希釈し、層を分離した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物を黄色の油として得た(1.71g)。
段階(a)の生成物(1.71g、7.2mmol)にジオキサン中の4M塩酸溶液(9mL、36mmol)を添加し、得られた混合物を室温で1時間攪拌した。その後、この反応混合物を濃縮し、残留物をジエチルエーテル(50mL)で希釈し、濾過して、表題化合物を白色の固体として得た(1.09g)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{2−[3−(3−ヒドロキシメチルベンジル)ウレイド]エチル}ピペリジン−4−イルエステル)
N,N−ジメチルホルムアミド中の調製12の生成物(760mg、2.24mmol)の0.2M溶液を、N,N−ジメチルホルムアミド(11mL)中の1,1’−カルボニルジイミダゾール(364mg、2.24mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.31mL、2.24mmol)の溶液に一滴ずつ添加し、得られた混合物を室温で2時間攪拌した。ジイソプロピルエチルアミン(0.31mL、2.24mmol)および調製28の生成物(578mg、3.4mmol)を添加し、この混合物を50℃で12時間攪拌した。その後、その反応混合物を濃縮乾固し、残留物をジクロロメタン(20mL)で希釈し、この溶液を飽和重炭酸ナトリウム(2x)、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物を生じさせた(1.12g)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{2−[3−(3−ホルミルベンジル)ウレイド]エチル}ピペリジン−4−イルエステル)
ジクロロメタン(11.1mL)中の調製29の生成物(1.12g、2.23mmol)の溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン(1.17mL、6.70mmol)およびジメチルスルホキシド(0.949mL、13.4mmol)を添加した。10分後、ピリジン・三酸化硫黄複合体(1.06g、6.70mmol)を添加し、得られた混合物を0℃で2時間攪拌した。その後、水(15mL)で反応を停止させ、有機層を冷水(3x)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物を黄色のクリスプとして生じさせた(609mg)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[(E)−3−(4−ニトロフェニル)アリル]ピペリジン−4−イルエステル)
実施例1、段階1の生成物(2.96g、0.01mmol)およびp−ニトロシンナムアルデヒド(1.77g、0.01mmol)を50mLのジクロロメタン中で2時間攪拌した。トリアセトキシ臭化水素酸ナトリウム(6.33g、0.03mmol)を添加し、得られた混合物を2時間攪拌した。その後、10mLの水で反応を停止させ、この混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム(2x)、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物を黄色の泡沫として生じさせた(3.8g、収率80%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[3−(4−アミノフェニル)プロピル]ピペリジン−4−イルエステル)
調製31の生成物(2.5g、5.4mmol)を100mLのエタノールに溶解し、得られた溶液を窒素で30分間パージした。その後、窒素で脱気しながら、炭素担持パラジウム(2.5g;50% w/w 水;10%Pd;1.1mmol Pd)を添加した。その後、この混合物を、水素がもはや消費されなくなるまで(〜30分)、水素(50psi)下に置いた。その後、この混合物を窒素でパージし、Celiteに通して濾過し、濃縮した。残留物を酢酸エチルに溶解し、この混合物を飽和重炭酸ナトリウム(2x)、ブラインで洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、濃縮して、表題化合物を生じさせた(2.08g、収率90%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−フルオロ−3−(4−ヒドロキシメチルピペリジン−1−イルメチル)ベンジル]ピペリジン−4−イルエステル)
実施例1、段階1の生成物(500mg、1.69mmol)、2,6−ビス(ブロモメチル)−1−フルオロベンゼン(476mg、1.69mmol)、ピペリジン−4−イルメタノール(195mg、1.69mmol)および炭酸カリウム(466mg、3.37mmol)をアセトニトリル(5mL)に懸濁させ、室温で18時間攪拌した。その後、この反応混合物を濃縮し、残留物をジクロロメタン/水に溶解した。層を分離し、有機層を水(2x)、ブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濃縮した。この粗製材料を、3%メタノール/クロロホルムで溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の泡沫として得た(282mg)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−フルオロ−3−(4−ホルミルピペリジン−1−イルメチル)ベンジル]ピペリジン−4−イルエステル)
調製33の生成物(282mg、0.53mmol)をジクロロメタンに溶解し、この混合物にジイソプロピルエチルアミン(280μL、1.6mmol)およびジメチルスルホキシド(115μL、1.6mmol)を添加した。その反応混合物を窒素下で−15℃に冷却し、ピリジン・三酸化硫黄複合体(255mg、1.6mmol)を添加し、得られた混合物を40分間攪拌した。その後、水で反応を停止させ、層を分離した。有機層をNaH2PO4水溶液(1Mx3)、ブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濃縮して、表題化合物を泡沫として生じさせた(253mg)。
(2−[4−(3−ブロモプロポキシ)フェニルエタノール)
アセトニトリル(62.0mL)中の4−ヒドロキシフェネチルアルコール(4.37g、31.0mmol)および炭酸カリウム(6.55g、47.0mmol)の溶液に1,3−ジブロモプロパン(31.0mg、316mmol)を添加した。この反応混合物を12時間、70℃に加熱し、その後、室温に冷却し、濾過し、真空下で濃縮した。得られた油を、4:1のへキサンと酢酸エチルの混合物を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物(6.21g)を白色の固体として得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{3−[4−(2−ヒドロキシエチル)フェノキシ]プロピル}ピペリジン−4−イルエステル)
アセトニトリル(21.5mL)中の調製35の生成物(1.11g、4.30mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.90mL、5.10mmol)の溶液に、実施例1、段階1の生成物(1.27g、4.30mmol)を添加し、得られた混合物を60℃で12時間攪拌した。その後、この反応混合物をジクロロメタン(20mL)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム(25mL)、飽和塩化ナトリウム(25mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物を生じさせた(1.98g、純度85%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{3−[4−(2−オキソエチル)フェノキシ]プロピル}ピペリジン−4−イルエステル)
調製36の生成物(723mg、1.53mmol)およびジクロロメタン(75mL)の溶液を約5℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン(798mL、4.58mmol)およびジメチルスルホキシド(649mg、9.l5mmol)を添加した。その後、ピリジン・三酸化硫黄(728mg、4.58mmol)を添加し、得られた混合物を5℃で45分間攪拌した。その後、この反応混合物をジクロロメタン(20mL)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム(25mL)、飽和塩化ナトリウム(25mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して、表題化合物を生じさせた(604mg)。
(4−ヨードフェニル酢酸メチル)
MeOH(200mL)中の4−ヨードフェニル酢酸(5.0g、19.1mmol)の攪拌溶液に、ジオキサン中の4N塩酸(10mL)を添加した。この反応混合物を24時間、室温で攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(5.17g、収率98%)、それをさらに精製せずに使用した。
([4−(4−ヒドロキシブト−1−イニル)フェニル]酢酸メチル)
ジエチルアミン(100mL)中の調製38の生成物(4.5g、16.3mmol)の攪拌溶液に、ブト−3−イン−1−オール(1.9mL、32.6mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(500mg、1.63mmol)およびCuI(154mg、0.815mmol)を添加し、得られた混合物を17時間、室温で攪拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジエチルエーテル(200mL)に溶解し、この溶液を濾過して塩を除去した。その後、溶媒を減圧下で除去し、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(60%EtOAc/へキサン)によって精製して、表題中間体を得た(3.03g、収率91%)。
([4−(4−ヒドロキシブチル)フェニル]酢酸メチル)
メタノール(50mL)中の調製39の生成物(2.8g、12.8mmol)の攪拌溶液を窒素でフラッシュし、その後、炭素担持10%パラジウム(400mg、20% wt/wt)を添加した。その後、反応フラスコの真空下への配置および水素でのフラッシュを交互に行うサイクルを数回行い、その後、水素下で14時間攪拌した。この反応混合物を窒素でフラッシュし、その後、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(2.75g、収率97%)、それをさらに精製せずに使用した。
((4−{4−[4−(ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)ピペリジン−1−イル]ブチル}フェニル)酢酸メチル)
((a){4−[4−(トルエン−4−スルホニルオキシ)ブチル]フェニル}酢酸メチル)
THF(100mL)中の調製40の生成物(2.6g、12.5mmol)の攪拌溶液にDABCO(2.6g、25.0mmol)を添加し、その後、塩化p−トルエンスルホニル(2.44g、13.75mmol)を添加した。この反応混合物を室温で23時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン(200mL)に溶解した。その後、有機層を水(2X100mL)、1N塩酸(100mL)、塩化ナトリウム飽和水溶液(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得、それをさらに精製せずに使用した。
段階(a)の粗生成物に、DMF(50mL)、ジイソプロピルエチルアミン(3.0mL、17.3mmol)および調製8の生成物(2.4g、8.1mmol)を添加した。この反応混合物を室温で18時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得た(3.5g、収率86.3%)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{4−[4−(2−ヒドロキシエチル)フェニル]ブチル}ピペリジン−4−イルエステル)
THF(100mL)中の調製41の生成物(2.0g、4.0mmol)の攪拌溶液に、DIBAL(24mL、24mmol、THF中1.0M)を一滴ずつ添加した。添加完了後、その反応混合物を3時間攪拌し、その後、メタノールをゆっくりと添加することにより(ガスの発生が終わるまで)、反応を停止させた。その後、この混合物を30分間攪拌し、酢酸エチル(200mL)および1N水酸化ナトリウム水溶液(200mL)を添加した。有機層を分離し、塩化ナトリウム飽和水溶液(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(1.3g、収率69%)、それをさらに精製せずに使用した。
(3−[5−(2−エトキシカルボニルビニル)チオフェン−2−イル]アクリル酸エチル)
THF(200mL)中の水素化ナトリウム(2.1g、53mmol、鉱物油中60%)の攪拌溶液に、トリエチルホスホノアセテート(10mL、50mmol)をゆっくりと添加した。水素ガスの発生がが観察され、ガスの発生が終わるまで(約30分間)反応物を攪拌した。この反応混合物に2,5−チオフェンジカルボキシアルデヒド(3g、21mmol)を添加し、反応混合物を1時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン(200mL)に溶解した。有機層を水(100mL)、1N塩酸水溶液(100mL)、塩化ナトリウム飽和水溶液(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(5.8g、収率98%)、それをさらに精製せずに使用した。
(3−[5−(2−エトキシカルボニルエチル)チオフェン−2−イル]プロピオン酸エチル)
メタノール(200mL)中の調製43の生成物(5.8g、21mmol)の攪拌溶液を窒素でフラッシュし、炭素担持10%パラジウム(576mg、10% wt/wt)を添加した。反応フラスコの真空下への配置および水素でのフラッシュを交互に行うサイクルを3回行い、その後、その反応混合物を水素下で1時間攪拌した。その後、この混合物を窒素でフラッシュし、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(5.8g、収率99%)、それをさらに精製せずに使用した。
(3−[5−(3−ヒドロキシプロピル)チオフェン−2−イル]プロパン−1−オール)
−78℃でTHF(300mL)中のDIBAL(88mL、88mmol、シクロヘキサン中1.0M)の攪拌溶液に、調製44の生成物(5.0g、17.6mmol)を一滴ずつ添加した。添加完了後、その反応混合物を30分かけて室温に温め、その後、1N塩酸水溶液(200mL)をゆっくりと添加することによって反応を停止させた。ジクロロメタン(400mL)を添加し、層を分離した。水性層をジクロロメタン(4x100mL)で洗浄し、併せた有機層を塩化ナトリウム飽和水溶液(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得(3.0g、収率85%)、それをさらに精製せずに使用した。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{3−[5−(3−ヒドロキシプロピル)チオフェン−2−イル]プロピル}ピペリジン−4−イルエステル)
((a)トルエン−4−スルホン酸3−[5−(3−ヒドロキシプロピル)チオフェン−2−イル]プロピルエステル)
THF(20mL)中の調製45の生成物(423mg、2.1mmol)の攪拌溶液に、DABCO(420mg、4.2mmol)を添加し、その後、塩化p−トルエンスルホニル(442mg、2.3mmol)を添加した。この反応混合物を室温で2時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン(200mL)に溶解した。有機層を水(2x100mL)、塩化ナトリウム飽和水溶液(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得、それをさらに精製せずに使用した。
段階(a)の生成物に、アセトニトリル(20mL)、ジイソプロピルエチルアミン(0.5mL、2.8mmol)および実施例1、段階1の生成物(626mg、2.11mmol)を添加した。この反応混合物を20時間、50℃に加熱し、その後、室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(5%MeOH/0.6%NH3(水溶液)を伴うDCM))によって精製して、表題化合物を得た(450mg、収率44%)。
(4−アミノ−5−クロロ−2−メトキシ安息香酸メチル)
0℃でトルエン(9mL)とメタノール(1mL)の混合物中の4−アミノ−5−クロロ−2−メトキシ安息香酸(1.008g、5.0mmol)の溶液に、(トリメチルシリル)ジアゾメタン(ヘキサン中2.0M、3.0mL、6.0mmol)を一滴ずつ添加した。その後、この反応混合物を室温に温め、16時間攪拌した。反応混合物の明黄色が消えるまで酢酸を添加することにより、過剰の(トリメチルシリル)ジアゾメタンを反応停止させた。その後、混合物を真空下で濃縮して、表題化合物をオフホワイトの固体として得、それをさらに精製せずに使用した。
(4−アクリロイルアミノ−5−クロロ−2−メトキシ安息香酸メチル)
調製47の粗生成物をジクロロメタン(10mL、0.5M)およびトリエチルアミン(2.1mL、15mmol)に添加した。この混合物を0℃に冷却し、攪拌しながら塩化アクリロイル(812μL、10mmol)を一滴ずつ添加した。2時間後、0℃でメタノール(約2mL)を添加することによって反応を停止させ、得られた混合物を室温で15分間攪拌し、その後、真空下で濃縮した。ジクロロメタン(30mL)および水(30mL)をその残留物に添加し、この混合物を入念に混合した。層を分離し、水性層をジクロロメタン(20mL)で抽出した。有機層を併せ、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、溶媒を真空下で除去して、表題化合物を褐色の泡沫状固体として得、それをさらに精製せずに使用した。
(4−{3−[4−(ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)ピペリジン−1−イル]プロピオニルアミノ}−5−クロロ−2−メトキシ安息香酸メチル)
調製48の粗生成物に、実施例1、段階1の生成物(1.33g、4.5mmol)およびTHF(22.5mL)とメタノール(2.5mL)の混合物を添加した。攪拌しながら16時間この混合物を50℃で加熱し、その後、真空下で溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフ(シリカゲル;EtOAc)に付して、表題化合物(0.82g、Rf=0.4、段階3を終えて収率29%)をオフホワイトの泡沫状固体として得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(2−クロロ−4−ヒドロキシメチル−5−メトキシフェニルカルバモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
0℃でTHF(4.5mL)とメタノール(0.5mL)の混合物中の調製49の生成物(0.82mg、1.45mmol)の溶液に、水素化ホウ素リチウム(32mg、1.45mmol)を添加した。この反応混合物を放置して室温に温め、41時間攪拌した。その後、泡立ちがもはや観察されなくなるまで0℃で1N塩酸水溶液を添加することにより、反応を停止させ、この混合物を10分間攪拌した。真空下で溶媒を除去し、残留物をアセトニトリル(約2mL)に溶解した。この溶液を分取RP−HPLC(勾配:0.05%TFAを伴う水中、2から50%アセトニトリル)によって精製した。適切な画分を回収し、併せ、凍結乾燥させて、表題化合物をトリフルオロ酢酸塩として得た。この塩を酢酸イソプロピル(10mL)および1N水酸化ナトリウム水溶液(10mL)で処理し、有機層を回収し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、溶媒を真空下で除去して、表題化合物(161mg、収率21%)を白色の泡沫状固体として得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(2−クロロ−4−ホルミル−5−メトキシフェニルカルバモイル)エチル]ピペリジン−4−イルエステル)
ジクロロメタン(3mL)中の調製50の生成物(161mg、0.3mmol)の溶液にジメチルスルホキシド(213μL、3.0mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(261μL、1.5mmol)を添加した。この混合物を−20℃に冷却し、三酸化硫黄・ピリジン複合体(238mg、1.5mmol)をゆっくりと添加した。30分後、水(約3mL)を添加することにより、この反応混合物を反応停止させた。層を分離し、有機層を乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、真空下で溶媒を除去して、表題化合物を淡黄色の固体として得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−[1,3]ジオキソラン−2−イルフェニルカルバモイル)−エチル]−4−メチルピペリジン−4−イルエステル)
ビフェニル−2−イルカルバミン酸4−メチルピペリジン−4−イルエステル(2.73g、8.79mmol)とN−(4−[1,3]ジオキソラン−2−イル−フェニル)アクリルアミド(2.05g、8.80mmol)の混合物を、窒素下で1時間、100mLのメタノール/ジクロロメタン(1:1)中、50℃で加熱した。その後、その溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮して、表題化合物を得た。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−ホルミルフェニルカルバモイル)エチル]−4−メチルピペリジン−4−イルエステル)
調製52の生成物を40mLのメタノールに再び溶解し、25mLの1N塩酸水溶液を添加した。得られた混合物を室温で一晩攪拌し、有機溶媒を減圧下で除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、有機層を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、溶媒を減圧下で除去した。この生成物をジクロロメタンと粉砕して、表題化合物を白色の粉末として得た(2.47g)。
(ビフェニル−2−イルカルバミン酸(R)−(1−アザビシクロ[3.2.1]オクト−4−イル)エステル)
イソシアン酸2−ビフェニル(1.00g、5.12mmol)および塩酸(R)−(−)−3−キヌクリジノール(921mg、5.63mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(2.06mL)とともに110℃で12時間加熱した。この反応混合物を冷却し、酢酸エチル(15mL)で希釈し、その後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(2x10mL)で洗浄した。有機層を1M塩酸(3x20mL)で抽出し、併せた水性抽出物を炭酸カリウムでpH8〜9に塩基性化した。その後、水性層を酢酸エチル(3x20mL)で抽出し、併せた有機層を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を黄色の油として得た(1.64g、収率99%)。
(臭化(R)−4−(ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)−1−(9−ブロモノニル)−1−アゾニアビシクロ[3.2.1]オクタン)
アセトニトリル(18.8mL)中の調製54の生成物(1.21g、3.76mmol)およびトリエチルアミン(1.05mL、7.52mmol)の攪拌溶液に、1,9−ジブロモノナン(994μL、4.89mmol)を添加し、その反応混合物を50℃で4時間加熱した。その後、この反応混合物を冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、有機層を重炭酸ナトリウム飽和水溶液(10mL)で洗浄し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(10%メタノール/ジクロロメタン、0.5%水酸化アンモニウム)によって精製して、表題化合物を得た(1.04g、1.97mmol、収率52%)。
(臭化(R)−1−(9−N,N−ジ(t−ブトキシカルボニル)アミノノニル)−4−(ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)−1−アゾニアビシクロ[3.2.1]オクタン)
0℃、窒素雰囲気下でN,N−ジメチルホルムアミド(10mL)中の水素化ナトリウム(鉱物油中60%分散物)(126mg、3.15mmol)の攪拌溶液に、N,N−ジメチルホルムアミド(5mL)中のイミノジカルボン酸ジ−t−ブチル(513mg、2.36mmol)を添加した。この反応混合物を室温で15分間攪拌し、その後、それを0℃に冷却し、N,N−ジメチルホルムアミド(5mL)中の調製55の生成物(1.05g、1.97mmol)を添加した。この反応混合物を12時間にわたって放置して室温に温め、その後、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得、それをさらに精製せずに使用した。
(臭化(R)−1−(9−アミノノニル)−4−(ビフェニル−2−イルカルバモイルオキシ)−1−アゾニアビシクロ[3.2.1]オクタン)
調製56の生成物(1.31g、1.97mmol)をジクロロメタン(15mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(5mL)をゆっくりと添加した。この反応混合物を室温で1時間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタン(20mL)に溶解し、1M水酸化ナトリウム水溶液(20mL)に溶解した。有機層を1M塩酸(3x20mL)で抽出し、併せた水性抽出物を炭酸カリウムで塩基性化し、ジクロロメタン(3x20mL)で抽出した。併せた有機層を乾燥させ(硫酸マグネシウム)、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得た(210mg、2段階を終えて収率23%)。
ヒトβ1、β2またはβ3アドレナリン作動性受容体を発現する細胞の培養および前記細胞からの膜の作成
クローン化ヒトβ1、β2またはβ3アドレナリン作動性受容体をそれぞれ安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統を、500μg/mLゲネチシンの存在下、10%FBSを含有するHams F−12培地で、ほぼ集密になるまで増殖させた。その細胞単層をPBS中の2mM EDTAで浮かせた。1,000rpmでの遠心分離により細胞をペレットにし、細胞ペレットを−80℃で冷凍保存するか、使用するために直ちに膜を作製した。β1およびβ2受容体を発現する膜を作製するために、細胞ペレットを溶解バッファ(10mM HEPES/HCl、10mM EDTA、4℃でpH7.4)に再び懸濁させ、氷上で密着Dounce型ガラスホモジナイザー(30ストローク)を使用してホモジネートした。よりプロテアーゼ感受性が大きいβ3受容体を発現する膜については、細胞ペレットを、50mLのバッファにつき「2mM EDTA含有完全プロテアーゼ阻害カクテル錠(Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets with 2mM EDTA)」の錠剤(Roche Catalog No.1697498、Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、 IN)1個を補足した溶解バッファ(10mM Tris/HCl、pH7.4)中でホモジネートにした。そのホモジネートを20,000xgで遠心分離し、上記のような再懸濁および遠心分離により得られたペレットを溶解バッファで1回洗浄した。その後、最終ペレットを氷冷結合アッセイバッファ(75mM Tris/HCl pH7.4、12.5mM MgCl2、1mM EDTA)に再び懸濁させた。Lowry et al.,1951,Journal of Biological Chemistry,193,265;およびBradford,Analytical Biochemistry,1976,72,248−54に記載されている方法により、その膜懸濁液の蛋白質濃度を決定した。すべての膜は、アリコートで、−80℃で冷凍保存するか、直ちに使用した。
ヒトM1、M2、M3およびM4ムスカリン受容体を発現する細胞の培養および前記細胞からの膜の作成
クローン化ヒトhM1、hM2、hM3およびhM4ムスカリン受容体をそれぞれ安定して発現するCHO細胞系統を、10%FBSおよび250μg/mLゲネチシンを補足したHAM’s F−12培地で、ほぼ集密になるまで増殖させた。これらの細胞は、5%CO2、37℃のインキュベータで増殖させ、dPBS中の2mM EDTAで浮かせた。650xgでの5分の遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレットを−80℃で冷凍保存するか、使用するために直ちに膜を作製した。膜を作製するために、細胞ペレットを溶解バッファに再び懸濁させ、Polytron PT−2100組織破砕装置(Kinematica AG;20秒x2回)でホモジネートした。粗製膜を4℃で15分間、40,000xgで遠心分離した。その後、膜ペレットを再懸濁バッファで再懸濁させ、Plytron組織破砕装置で再びホモジネートした。Lowry et al.,1951,Journal of BioChemistry,193,265に記載されている方法により、その膜懸濁液の蛋白質濃度を決定した。すべての膜は、アリコートで、−80℃で冷凍保存するか、直ちに使用した。既製のhM5受容体膜のアリコートをPerkin Elmerから直接購入し、使用するまで−80℃で保存した。
ヒトβ1、β2またはβ3アドレナリン作動性受容体についての放射リガンド結合アッセイ
結合アッセイは、96ウエルマイクロタイタプレートにおいて、アッセイバッファ(75mM Tris/HCl 25℃でpH7.4、12.5mM MgCl2、1mM EDTA、0.2%BSA)中、10〜15μgのヒトβ1、β2またはβ3アドレナリン作動性受容体含有膜蛋白を用い、全アッセイ量100μLで行った。放射リガンドのKd値を決定するための飽和結合試験は、β1およびβ2受容体のための[3H]−ジヒドロアールプレノロール(NET−720、100Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences Inc.、Boston、MA)、ならびに[125I]−(−)−ヨードシアノピンドロール(NEX−189、220Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences Inc.、Boston、MA)を使用し、0.01nMから20nMの範囲内の10または11の異なる濃度で行った。試験化合物のKi値を決定するための置換アッセイは、10pMから10μMの範囲の10または11の異なる試験化合物濃度のために、1nMの[3H]−ジヒドロアールプレノロールおよび0.5nMの[125I]−(−)−ヨードシアノピンドロールを用いて行った。非特異的結合は、10μMプロパノロールの存在下で判定した。アッセイ物を1時間37℃でインキュベートし、その後、0.3%ポリエチレンイミンに予浸した、β1およびβ2受容体についてはGF/Bガラス繊維フィルタプレート、またはβ3受容体についてはGF/Cガラス繊維フィルタプレート(Packard BioScience Co.、Meriden、 CT)での急速濾過により結合反応を停止させた。フィルタプレートを濾過バッファ(75mM Tris/HCl 4℃でpH7.4、12.5mM MgCl2、1mM EDTA)で3回洗浄して、未結合の放射活性を除去した。その後、プレートを乾燥させ、50μLのMicroscint−20液体シンチレーション液(Packard BioScience Co.、Meriden、 CT)を添加し、プレートをPackard Topcount 液体シンチレーションカウンタ(Packard BioScience Co.、Meriden、 CT)でカウントした。結合データは、一部位競合の3変数モデルを使用するGraphPad Prism Software package(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)での非線形回帰分析により解析した。10μMプロパノロールの存在下で判定した非特異的結合についての値に曲線最小値を固定した。試験化合物のKi値は、Cheng−Prusoff式(Cheng,Y and Prusoff WH.,Biochemical Pharmacology,1973,22,23,3099−108)を使用して、観察IC50値および放射リガンドのKd値から計算した。
(ムスカリン受容体に対するリガンド結合アッセイ)
クローン化ヒトムスカリン受容体に対する放射リガンド結合アッセイは、96ウエルマイクロタイタプレートにおいて全アッセイ量100μLで行った。hM1、hM2、hM3、hM4またはhM5ムスカリン受容体サブタイプのいずれかを安定して発現するCHO細胞膜は、同様のシグナル(cpm)を得るために、アッセイバッファで次の特異的ターゲット蛋白質濃度(μg/ウエル)に希釈した:hM1については10μg、hM2については10〜15μg、hM3については10〜20μg、hM4については10〜20μg、およびhM5については10〜12μg。膜は、アッセイプレートに添加する前に、Polytron組織破砕装置を使用して(10秒)、簡単にホモジネートした。放射リガンドのKD値を決定するための飽和結合試験は、0.001nMから20nMの範囲の濃度で、塩化L−[N−メチル−3H]スコポラミンメチル([3H]−NMS)(TRK666、84.0Ci/mmol、Amersham Pharmacia Biotech、Buckinghamshire、England)を使用して行った。試験化合物のKi値を決定するための置換アッセイは、1nMの[3H]−NMSおよび11の異なる試験化合物濃度を用いて行った。最初、試験化合物を希釈バッファ中400μMの濃度に溶解し、その後、希釈バッファで系列的に5倍希釈して、10pMから100μMの範囲の最終濃度にした。アッセイプレートへの添加の順序および量は、次のとおりである:25μLの放射リガンド、25μLの希釈試験化合物、そして50μLの膜。アッセイプレートを60分間、37℃でインキュベートした。結合反応は、1%BSAで前処理したGF/Bガラス繊維フィルタプレート(PerkinElmer Inc.、Wellesley、MA)での急速濾過によって停止させた。フィルタプレートを洗浄バッファ(10mM HEPES)で3回洗浄して、未結合の放射活性を除去した。その後、プレートを空気乾燥させ、50μLのMicrosint−20液体シンチレーション液(PerkinElmer Inc.、Wellesley、MA)を各ウエルに添加した。その後、PerkinElmer Topcount 液体シンチレーションカウンタ(PerkinElmer Inc.、Wellesley、MA)でカウントした。結合データは、一部位競合モデルを使用するGraphPad Prism Software package(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)での非線形回帰分析により解析した。試験化合物のKi値は、Cheng−Prusoff式(Cheng,Y;Prusoff WH.(1973) Biochemical Pharmacology,22(23):3099−108)を使用して、観察IC50値および放射リガンドのKd値から計算した。Ki値をpKi値に変換して、幾何平均および95%信頼区間を決定した。その後、これらの基本統計量をデータ報告のためにKi値に逆変換した。
ヒトβ1、β2またはβ3アドレナリン作動性受容体を異種発現するCHO細胞系統における全細胞cAMPフラッシュプレートアッセイ
cAMPアッセイは、[125I]−cAMPでのFlashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System(NEN SMP004、PerkinElmer Life Sciences Inc.、Boston、MA)を製造業者のインストラクションに従って使用するラジオイムノアッセイで行った。β受容体作動薬力価(EC50)を判定するために、クローン化ヒトβ1、β2またはβ3アドレナリン作動性受容体を安定して発現するCHO−K1細胞系統を、10%FBSおよびゲネチシン(250μg/mL)を補足したHAM’s F−12培地で、ほぼ集密になるまで増殖させた。細胞をPBSですすぎ、2mM EDTAまたはTrypsin−EDTA溶液(0.05%トリプシン/0.53mM EDTA)を含有するdPBS(ダルベッコリン酸緩衝食塩水、CaCl2およびMgCl2不含)中で剥離させた。Coulter セルカウンタで細胞をカウントした後、細胞を1,000rpmで遠心分離し、予め室温に温めておいたIBMX含有刺激バッファ(PerkinElmer Kit)に再び懸濁させて、細胞数1.6x106から2.8x106/mLの濃度にした。1ウエルあたり約60,000から80,000個の細胞をこのアッセイでは使用した。試験化合物(DMSO中、10mM)を、Beckman Biomet−2000において0.1%BSAを含有するPBSで希釈し、100μMから1pMの範囲の11の異なる濃度で試験した。反応物を10分間、37℃でインキュベートし、[125I]−cAMPを含有する冷検出バッファ(NEN SMP004、PerkinElmer Life Sciences Inc.、Boston、MA)100μLを添加することにより反応を停止させた。生産されたcAMPの量(pmol/ウエル)は、製造業者のユーザーマニュアルに記載されているとおり、サンプルおよびcAMP標準について観測されたカウントを基に計算した。データは、S字関数式を用いるGraphPad Prism Software package(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)での非線形回帰分析により解析した。Cheng−Prusoff式(Cheng,Y and Prusoff WH.,Biochemical Pharmacology,1973,22,23,3099−108)を使用して、EC50値を計算した。
(ムスカリン受容体サブタイプに対する拮抗作用の機能アッセイ)
(A.cAMP蓄積の作動薬媒介抑制の阻害)
このアッセイでは、試験化合物の機能力価は、hM2受容体を発現するCHO−K1細胞におけるフォルスコリン媒介cAMP蓄積のオキソトレモリン抑制を阻害する試験化合物の能力を測定することにより決定する。cAMPアッセイは、125I−cAMPでのFlashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System(NEN SMP004B、PerkinElmer Life Sciences Inc.、Boston、MA)を製造業者のインストラクションに従って使用するラジオイムノアッセイ形式で行う。細胞をdPBSで1回すすぎ、上記の細胞培養および膜形成セクションにおいて説明したようにTrypsin−EDTA溶液(0.05%トリプシン/0.53mM EDTA)で浮かせた。剥離した細胞を50mL dPBS中で5分間、650xgで遠心分離することにより2回洗浄する。その後、細胞ペレットを10mL dPBSに再び懸濁させ、Coulter Z1 Dual Particle Counter(Beckman Coulter,Fullerton,CA)でカウントする。細胞を650xgで5分間、再び遠心分離し、刺激バッファに再び懸濁させて、細胞数1.6x106〜2.8x106/mLの濃度にする。
第二の機能アッセイでは、試験化合物の機能力価を、hM2受容体を発現するCHO−K1細胞におけるオキソトレモリン刺激[35S]GTPγS結合を阻害する化合物の能力を測定することにより判定する。
Gq蛋白質に結合しているムスカリン受容体サブタイプ(M1、M3およびM5受容体)は、作動薬が受容体に結合すると、ホスホリパーゼC(PLC)経路を活性化する。結果として、活性化PLCは、ホスファチルイノシトールジホスフェート(PIP2)をジアシルグリセロール(DAG)およびホスファチジル−1,4,5−トリホスフェート(IP3)に加水分解し、その結果として細胞内貯蔵、すなわち小胞体および筋小胞体、からのカルシウム放出を生じさせる。FLIPR(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)アッセイは、遊離カルシウムと結合したときに蛍光を発するカルシウム感受性染料(Fluo−4AM、Molecular Probes,Eugene,OR)を使用することにより、細胞内カルシウムのこの増加を利用する。この蛍光事象は、ヒトM1およびM3ならびにチンパンジーM5受容体でクローン化した細胞の単層からの蛍光の変化を検出するFLIPRによって、現時間で測定される。拮抗薬の力価は、細胞内カルシウムの作動薬媒介増加を抑制する拮抗薬の能力によって決定することができる。
(ヒトβ2アドレナリン作動性受容体を内在発現する肺上皮細胞で全細胞cAPMフラッシュプレートアッセイ)
内在レベルのβ2アドレナリン作動性受容体を発現する細胞系統において作動薬の力価および有効度(固有活性)を判定するために、ヒト肺上皮細胞系統(BEAS−2B)を使用した(ATCC CRL−9609、American Type Culture Collection,Manassas,VA)(January B,et al.,British Journal of Pharmacology,1998,123,4,701−11)。細胞は、無血清完全培地(エピネフリンおよびレチノイン酸を含有するLHC−9 MEDIUM、cat#181−500、Bioscurce International、Camarillo、CA)において集密度75〜90%まで増殖させた。アッセイの前日、培地をLHC−8(エピネフリンおよびレチノイン酸を不含、cat#141−500、Bioscurce International、Camarillo、CA)に切り替えた。cAMPアッセイは、[125I]−cAMPでのFlashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System(NEN SMP004、PerkinElmer Life Sciences Inc.、Boston、MA)を製造業者のインストラクションに従って使用するラジオイムノアッセイ形式で行った。アッセイ当日、細胞をPBSですすぎ、PBS中の5mM EDTAでかき落とすことにより浮かせ、カウントした。細胞を1,000rpmでの遠心分離によりペレットにし、予め37℃に温めておいた刺激バッファに細胞数600,000/mLの最終濃度で再び懸濁させた。このアッセイでは、細胞は、細胞数100,000から120,000/ウエルの最終濃度で使用した。試験化合物は、Beckman Biomek−2000においてアッセイバッファ(75mM Tris/HCl 25℃でpH7.4、12.5mM MgCl2、1mM EDTA、0.2%BSA)で系列希釈した。このアッセイでは10μMから10pMの範囲の11の異なる濃度で試験化合物を試験した。反応物を10分間、37℃でインキュベートし、100μLの氷冷検出バッファの添加により反応を停止させた。プレートを封止し、4℃で一晩インキュベートし、翌朝、Topcount シンチレーションカウンタ(Packard BioScience Co.、Meriden、 CT)でカウントした。反応物1mLあたりの生産cAMP量は、製造業者のユーザーズマニュアルに記載されているとおり、サンプルおよびcAMP標準について観測されたカウントを基に計算した。データは、S字形用量−反応に関する4変数モデルを用いるGraphPad Prism Software package(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)での非線形回帰分析により解析した。
(アセチルコリン誘発またはヒスタミン誘発気管支収縮のモルモットモデルにおける気管支保護時間)
これらのインビボアッセイを使用して、ムスカリン受容体拮抗薬活性とβ2アドレナリン作動性受容体作動薬活性の両方を示す試験化合物の気管支保護効果を評価する。アセチルコリン誘発気管支収縮モデルにおいてムスカリン受容体拮抗薬を単離するために、動物たちには、アセチルコリンを投与する前に、プロパノロール、β受容体活性を遮断する化合物、を投与する。ヒスタミン誘発気管支収縮モデルにおける気管支保護時間は、β2アドレナリン作動性受容体作動薬活性を反映する。
(a)肺抵抗(RL、cm H2O/mL 毎秒)を、「圧の変化」対「流量の変化」の比から計算する。ACh(60μg/分、IH)に対するRL反応を、ビヒクルグループおよび試験化合物グループについてコンピュータ計算する。各前処置時点でのビヒクル処置動物における平均Ach反応を計算し、使用して、対応する前処理時間における各試験化合物用量でのACh反応の阻害%をコンピュータ計算する。「RL」についての阻害用量−反応曲線を、GraphPad Prism、バージョン3.00、Windows(登録商標)用(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して4変数ロジスティック方程式にあてはめて、気管支保護ID50(ACh(60μg/分)気管支収縮薬反応を50%阻害するために必要な用量)を概算する。使用した方程式は、次のとおりである:
C1 = C2の前のAchまたはヒスタミンの濃度
C2 = 肺抵抗(RL)を少なくとも2倍増大させるAchまたはヒスタミンの濃度
R0 = ベースラインRL値
R1 = C1後のRL値
R2 = C2後のRL値)。
(モルモットにおける換気変化を測定するためのアイントホーフェンモデル)
試験化合物の気管支拡張薬活性を、麻酔したモルモットモデル(アイントホーフェンモデル)において評価する。これは、気道抵抗の代用測定として換気圧を用いる。例えば、Einthoven(1892)Pfugers Arch.51:367−445;およびMohammed et al.(2000)Pulm Pharmacol Ther.13(6):287−92参照。このモデルにおいて、メタコリン(MCh)およびヒスタミン(His)誘発気管支収縮に対する保護効果を判定することにより、ムスカリン受容体拮抗薬活性およびβ2受容体作動薬活性を評価する。
(吸入モルモット唾液分泌アッセイ)
体重200〜350gのモルモット(Charles River、Wilmington、MA)を、到着後、少なくとも3日間、施設内モルモットコロニーに順化させる。試験化合物またはビヒクルを、パイ形投薬チャンバ(R+S Molds、San Carlos、CA)内で10分間にわたって吸入(IH)により投薬する。試験溶液を滅菌水に溶解し、5.0mLの投薬溶液を充填したネブライザを使用して配給する。30分間、この吸入チャンバ内にモルモットを拘束する。この時間中、モルモットは、約110平方cmの面積に拘束される。この空間は、動物たちが自由に回転し、自身で位置を変え、毛づくろいできるには充分である。20分の順化後、22psiの圧力で押し流される、LC Star Nebulizer Set(Model 22F51、PARI Respiratory Equipment、Inc.Midlothian、VA)から発生するエーロゾルに暴露する。噴霧療法が完了したら、モルモットを処置後1.5、6、12、24、48および72時間の時点で評価する。
(クローン化ヒトドーパミンD2S受容体における放射リガンド競合結合アッセイ)
このアッセイでは、トランスフェクトしたCHO細胞におけるヒトドーパミンD2S受容体に対する試験化合物の結合親和性を、放射リガンド結合アッセイ(Grady et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9762(1989))を使用して判定する。
Claims (3)
- R4が、−(CH2)4−、−(CH2)5−、−(CH2)6−、−(CH2)7−、−(CH2)8−、−(CH2)9−、または−(CH2)10−である、請求項1に記載の化合物。
- ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−{9−[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)−エチルアミノ]ノニル}ピペリジン−4−イルエステル;
ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−{[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)−エチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル)エチル]−ピペリジン−4−イルエステル;および
ビフェニル−2−イルカルバミン酸1−[2−(4−{2−[2−(4−ヒドロキシ−2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾチアゾール−7−イル)−エチルアミノ]エチル}フェニルカルバモイル)エチル]−ピペリジン−4−イルエステル
から選択される請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
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